本發(fā)明屬于酶的基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及通過易錯(cuò)PCR技術(shù)體外定向進(jìn)化獲得酶活提高的磷脂酶B突變體，及利用其制備甘油磷脂酰膽堿以及油脂脫膠的方法。
背景技術(shù)：
：：磷脂酶B(PLB)廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中，具有水解酶和溶血磷脂酶-轉(zhuǎn)酰基酶的活性。水解酶的活性可清除磷脂和溶血磷脂中的脂肪酸，轉(zhuǎn)?；富钚詣t將游離脂肪酸轉(zhuǎn)移到溶血磷脂而生成磷脂。甘油磷脂酰膽堿(L-alphaglycerylphosphorylcholine,L-α-GPC)由膽堿、甘油和磷酸鹽組成，是合成乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的前體。在治療人體大腦的精神混亂和神經(jīng)混亂方面具有重要的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值，如治療阿爾茨海默氏癥、小腦性共濟(jì)失調(diào)、精神分裂癥和雙相情感障礙等，但是就作為藥用原料及相關(guān)研究而言需要較高純度的L-α-GPC。然而遺憾的是天然L-α-GPC的含量較少，故制備純度高、質(zhì)量好的甘油磷脂酰膽堿產(chǎn)品具有重要意義。酶法制備甘油磷脂酰膽堿是指在一定條件下，利用PLB能夠水解磷脂Sn-1和Sn-2位脂肪酸?；淖饔么呋字Ｄ憠A反應(yīng)生成甘油磷脂酰膽堿，該方法相比化學(xué)合成具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品得率高、質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。酶法脫膠是油脂精煉過程的第一步，其主要目的是脫除毛油中的膠質(zhì)。毛油中的膠質(zhì)指的是磷脂、糖、蛋白質(zhì)和其他粘液質(zhì)的混合物，但主要成分是指磷脂，因此脫膠也常被稱為脫磷。PLB能將Sn-1和Sn-2位的酯鍵都水解，生成相應(yīng)的甘油酰磷脂，與溶血磷脂相比，甘油酰磷脂具有更強(qiáng)的親水性，通過水合作用可以方便地除去，因此被應(yīng)用到酶法脫膠中。酶法脫膠因其反應(yīng)條件溫和、適用范圍廣、精煉得率高、污染物排放少等特點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注。酶分子體外定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。通常手段是利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造出分子的多樣性，結(jié)合靈敏、高通量的篩選技術(shù)，從而能夠在短時(shí)間內(nèi)得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預(yù)期特征的結(jié)構(gòu)酶，與此不同，需要事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)制等因素，并根據(jù)這些因素有的放矢做對(duì)其DNA進(jìn)行改造的是定點(diǎn)突變。其中，易錯(cuò)PCR是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)，利用Taq酶不具備3’→5’校對(duì)功能，同時(shí)改變反應(yīng)體系中Mn2+、Mg2+和各種dNTP的濃度，以一定的頻率向目的基因隨機(jī)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因發(fā)生隨機(jī)突變。然而，經(jīng)一次突變的基因一般很難獲得滿意的結(jié)果，由此又發(fā)展出連續(xù)易錯(cuò)PCR(SequentialError-pronePCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行易錯(cuò)，使每一次獲得的小突變不斷進(jìn)行積累而產(chǎn)生重要的有益突變。因此，具有獨(dú)有的優(yōu)勢。畢赤酵母屬于單細(xì)胞低等真核生物，是表達(dá)外源基因比較理想的工具。它除了具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，還因?yàn)楹刑赜械膹?qiáng)有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動(dòng)子，可用甲醇嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)。另外，培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機(jī)鹽。能夠?qū)ν庠吹鞍谆蜻M(jìn)行穩(wěn)定遺傳，且作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。同釀酒酵母等傳統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究最重要的工具和模型。此外，畢赤酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)不但具有外源基因的翻譯后加工能力和蛋白的折疊加工及適度糖基化等優(yōu)點(diǎn)，而且，經(jīng)該系統(tǒng)得到的全細(xì)胞催化劑可以重復(fù)利用從而降低生產(chǎn)成本。在本發(fā)明中，野生型磷脂酶B基因及其突變體基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，得到產(chǎn)高活力磷脂酶B，純化后應(yīng)用到油脂脫膠中，并與磷脂酰膽堿反應(yīng)，催化制備甘油磷脂酰膽堿。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的在于提供一種磷脂酶B突變體，以及利用其制備甘油磷脂酰膽堿及應(yīng)用到油脂脫膠中的方法，磷脂酶B突變體的酶活比野生型磷脂酶B的酶活提高了25％。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)路線概述如下：通過基本的分子生物學(xué)技術(shù)手段獲得野生型的磷脂酶B基因(SEQIDNO：1)，之后由易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)野生型磷脂酶B基因隨機(jī)突變，得到突變體基因(SEQIDNO：3)，構(gòu)建重組載體，并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，得到磷脂酶B突變體。通過發(fā)酵、提取等技術(shù)獲得磷脂酶B突變體，并由磷脂酶B突變體催化磷脂酰膽堿制備甘油磷脂酰膽堿及在油脂脫膠中的應(yīng)用。在本發(fā)明中采用如下定義：1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸殘基的公認(rèn)IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認(rèn)IUPAC命名法。2.磷脂酶B突變體的標(biāo)識(shí)采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示磷脂酶B突變體中突變的氨基酸。如Leu25Ala，表示位置25的氨基酸由野生型磷脂酶B的Leu替換成Ala。位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：2中野生型磷脂酶B的氨基酸序列編號(hào)。核苷酸的變化同樣采用“原始核苷酸位置替換的核苷酸”來表示，位置編號(hào)對(duì)應(yīng)SEQIDNO：1中野生型磷脂酶B的核苷酸序列編號(hào)。在本發(fā)明中，plb表示野生型磷脂酶B的基因序列，即原始序列(如SEQIDNO：1所示)，plbm則表示磷脂酶B突變體的基因序列(如SEQIDNO：3所示)；PLB表示野生型磷脂酶B(其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示)，PLBM表示磷脂酶B突變體(其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示)磷脂酶B堿基氨基酸PLB第73位為T、第74位為T第25位為LeuPLBM第73位為G、第74位為C第25位為Ala所述的磷脂酶B突變體的表達(dá)宿主為畢赤酵母GS115，表達(dá)載體為pPIC9K；所述的磷脂酶B突變體的宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115，展示載體為pPIC9K-Flo。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟具體如下：1、通過易錯(cuò)PCR對(duì)來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)TCCC31028的野生型磷脂酶B基因進(jìn)行隨機(jī)突變，得到磷脂酶B突變體編碼基因；2、分別含有磷脂酶B突變體基因和野生型磷脂酶B基因的畢赤酵母重組菌株及以此制備磷脂酶B的過程包括如下步驟：(1)將擴(kuò)增得到的野生型磷脂酶B編碼基因plb和易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變獲得的磷脂酶B突變體編碼基因plbm進(jìn)行酶切，將得到的plb和plbm基因分別與表達(dá)載體pPIC9K通過連接得到新的重組載體；(2)將重組載體轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，得到的重組菌株經(jīng)過遺傳霉素篩選和磷脂酶B的酶活測定，得到野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體的高產(chǎn)菌株；(3)之后進(jìn)行發(fā)酵，制備野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體。3、分別含有plb和plbm的畢赤酵母細(xì)胞表面展示重組菌株及以此制備高活力磷脂酶B全細(xì)胞催化劑的過程包括如下步驟：(1)將擴(kuò)增得到的plb和plbm進(jìn)行酶切，將得到的plb和plbm分別與畢赤酵母展示載體pPIC9K-Flo通過連接得到新的重組載體；(2)將重組載體轉(zhuǎn)化入宿主菌株畢赤酵母GS115中，得到畢赤酵母細(xì)胞表面展示磷脂酶B重組菌株。(3)將重組菌株發(fā)酵后制備酵母細(xì)胞表面展示野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體全細(xì)胞催化劑。4、利用本發(fā)明所述野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體生產(chǎn)甘油磷脂酰膽堿的方法：每200mg磷脂酰膽堿底物，添加200mg磷脂酶B酶粉或100mg磷脂酶B全細(xì)胞催化劑，反應(yīng)溫度20-45℃，反應(yīng)pH4-8，反應(yīng)4-16h，隨后通過萃取獲得甘油磷脂酰膽堿：(1)將磷脂酰膽堿、CaCl2溶于pH4.0-pH5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，或pH5.5–7.0的bis-Tris–HCl緩沖液，或pH7.0–8.0的Tris–HCl緩沖液中；(2)加入磷脂酶B，在20到45℃下反應(yīng)4-24h。5、利用本發(fā)明所述野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體進(jìn)行油脂脫膠的方法：(1)將經(jīng)過酸處理過的植物油調(diào)至pH到4.5-6.0；(2)加入磷脂酶B和一定量的去離子水脫膠1-5h；(3)將脫膠后的植物油升溫至95℃，滅酶10min；(3)進(jìn)行膠質(zhì)分離，得到脫膠油。附圖說明：圖1為本發(fā)明野生型磷脂酶B基因的PCR擴(kuò)增電泳圖其中：M為DNAMarker，1為plb基因；圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm酶切驗(yàn)證圖其中：M為DNAMarker，1為pPIC9K-plb經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切；2為pPIC9K-plbm經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切。圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm酶切驗(yàn)證圖其中：M為DNAMarker，1為pPIC9K-Flo-plb經(jīng)過SnaBI和EcoRI雙酶切；2為pPIC9K-Flo-plbm經(jīng)過SnaBI和EcoRI雙酶切。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不只限于這些實(shí)施例，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1：野生型磷脂酶B基因的獲得1.野生型磷脂酶B基因plb來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)TCCC31028，提取其基因組DNA，其中釀酒酵母基因組DNA的提取步驟如下：(1)從培養(yǎng)菌體的平板上挑取一環(huán)菌接種于50mL適當(dāng)培養(yǎng)基中，30℃，250r/min培養(yǎng)16-18h。(2)之后取1mL培養(yǎng)液于1.5mLEP管中，12000r/min離心2min，倒上清，用200μL裂解液重懸，加入石英砂，振蕩20-30min。(3)加入裂解液500uL，12000r/min離心5min，取上清。(4)加入等體積的Tris平衡酚：氯仿＝1：1，混合均勻，12000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一EP管中。(5)反復(fù)抽提兩次，直至無蛋白層出現(xiàn)，最后再用等體積氯仿抽提一次。(6)加入等體積的異丙醇沉淀DNA，12000r/min離心5min，棄去上清，用500μL75％乙醇洗滌2次，每次吹打后12000r/min離心5min。(7)將EP管倒置于濾紙或置于55℃金屬浴中，晾干至無酒精味后用TE緩沖液或滅菌水溶解，-20℃保存。2.設(shè)計(jì)plb的擴(kuò)增引物，序列如下：上游P1(SEQIDNo：5)：5’-CCGGAATTCGCAGATTCGTCGTCCACTAC-3’下游P2(SEQIDNo：6)：5’-ATAAGAATGCGGCCGCAATTAGTCCAAATAATGCTGTTATG-3’PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50μL，其組成為：2×LAbuffer25μLdNTPs(2.5mmol/L)2μL上游引物P1(20μmol/L)5μL下游引物P2(20μmol/L)5μL釀酒酵母基因組DNA2μLLATaqDNA聚合酶0.5μLddH2O10.5μL總體積50μL擴(kuò)增程序的設(shè)置為：a.預(yù)變性:95℃5min；b.變性：95℃30s；c.退火：75℃45s；d.延伸：72℃2min；e.b-d反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；f.延伸:72℃10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可以看到野生型磷脂酶B基因的條帶，共2064bp(見圖1)，再由小量DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到了野生型磷脂酶B基因，即plb。實(shí)施例2：磷脂酶B突變體基因plbm的獲得1.基于易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)突變?cè)谝族e(cuò)PCR反應(yīng)體系中，以P1和P2作為上下游引物，以plb為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR，獲得plbm.其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，70℃退火40s，72℃延伸2min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。2.將磷脂酶B易錯(cuò)PCR產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體pET28a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，接種于每孔含200μLLB液體培養(yǎng)基(含30μg/mL的Kan)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃條件下200r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6，向每個(gè)孔中加入IPTG(終濃度1mmol/L)，在16℃下誘導(dǎo)16h，4℃下4000r/min離心15min后收集菌體，重懸于15mL預(yù)冷的pH為5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，用低溫超高壓連續(xù)流動(dòng)細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，破碎結(jié)束后，在4℃下12000r/min離心45min，收集上清液獲得粗酶液，隨后進(jìn)行酶活力檢測。3.酶活力檢測(1)磷脂酶B酶活測定原理在40℃條件下,1,2-bis(heptanoylthio)Glycerophosphocholine被PLB水解釋放出的巰基與5.5′-二硫代硝基苯甲酸(5.5-dithio-nitroben-zoicacid,DTNB)結(jié)合,產(chǎn)生黃色化合物,在410nm吸光度增加,可據(jù)此計(jì)算出酶的活力。(2)磷脂酶B酶活測定方法①基礎(chǔ)液：0.2mol/L，pH＝5.5醋酸-醋酸鈉緩沖液90ml，加入20mmol/LCaCl2，5mmol/LDTNB各20ml，充分混勻；②工作液：5mmol/L1,2-bis(heptanoylthio)Glycerophosphocholine1ml加基礎(chǔ)液15ml，充分混勻；③對(duì)照液：蒸餾水1ml，加基礎(chǔ)液15ml，充分混勻。磷脂酶B的測定步驟：混勻，40℃溫育10min，測410nm波長A值，空白調(diào)零。酶活力計(jì)算磷脂酶B酶活力(U/mL)＝73.5×(A測定孔-A對(duì)照孔)(3)酶活力定義為以1,2-bis(heptanoylthio)Glycerophosphocholine為底物，在40℃，pH＝5.5的條件下，每分鐘產(chǎn)生1nmol游離巰基的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，記為U/mL。(4)磷脂酶B酶活的測定測定原始磷脂酶B和易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的酶活，PLBM的酶活比突變前提高了25％。4.序列測定測序(北京華大生物工程公司)結(jié)果表明，此時(shí)擴(kuò)增得到的包含Leu25Ala的磷脂酶B突變體基因plbm，見序列3。實(shí)施例3：構(gòu)建畢赤酵母游離表達(dá)重組菌1、野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體表達(dá)載體pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm的構(gòu)建將plb和plbm分別與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K經(jīng)過EcoRI和NotI雙酶切，隨后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，選擇Ampr的陽性轉(zhuǎn)化子，菌落培養(yǎng)后提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證成功(見圖2)，即得到重組表達(dá)載體pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm。2.構(gòu)建野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體表達(dá)重組菌株(1)質(zhì)粒DNA的線性化在轉(zhuǎn)化畢赤酵母之前，用SalI限制性內(nèi)切酶對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm進(jìn)行線性化酶切。(2)線性化質(zhì)粒pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm電轉(zhuǎn)至畢赤酵母①將感受態(tài)細(xì)胞分別與線性化質(zhì)粒pPIC9K-plb和pPIC9K-plbm加入到1.5mL預(yù)冷的離心管中，吹打混勻，隨后加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；②對(duì)電轉(zhuǎn)杯冰浴10min，隨后電轉(zhuǎn)化；③電擊后，立即加入1mL預(yù)冷的1mol/L的山梨醇溶液于電轉(zhuǎn)杯中，并將電轉(zhuǎn)液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中；④30℃靜置培養(yǎng)1-2h，吸取畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)液200μL涂布在MD培養(yǎng)基上。(3)陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定及磷脂酶B高產(chǎn)菌株的篩選①涂有電轉(zhuǎn)液的MD平板在30℃培養(yǎng)2-3d；②挑取轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組，稀釋100倍后作為模板進(jìn)行PCR。另以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pPIC9K的畢赤酵母GS115/pPIC9K作為對(duì)照，確定陽性轉(zhuǎn)化子。③確定陽性轉(zhuǎn)化子后，先挑取在含不同濃度遺傳霉素抗性平板上單菌落比較大的高遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化子，隨后分別測定挑選出的轉(zhuǎn)化子的磷脂酶B酶活，從而得到磷脂酶B的高產(chǎn)菌株GS115/pPIC9K-plb和GS115/pPIC9K-plbm。實(shí)施例4：畢赤酵母細(xì)胞表面展示磷脂酶B重組菌的構(gòu)建1.重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm的構(gòu)建將擴(kuò)增得到的plb和plbm分別與畢赤酵母表面展示表達(dá)載體pPIC9K-Flo經(jīng)過SnaBI和EcoRI雙酶切，隨后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)中，選擇Ampr的陽性轉(zhuǎn)化子，菌落培養(yǎng)后提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證成功后(見圖3)，即得到重組表達(dá)載體pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm。2.畢赤酵母重組菌的構(gòu)建將測序驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體pPIC9K-Flo-plb和pPIC9K-Flo-plbm經(jīng)SalI線性化后，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，MD平板篩選重組子，獲得畢赤酵母細(xì)胞表面展示磷脂酶B重組菌GS115/pPIC9K-Flo-plb和GS115/pPIC9K-Flo-plbm。實(shí)施例5：磷脂酶B在畢赤酵母游離表達(dá)重組菌中的表達(dá)及制備①挑取YPD平板上的畢赤酵母重組菌GS115/pPIC9K-plb和GS115/pPIC9K-plbm接種至50ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)24h；②以2％的接種量轉(zhuǎn)接至BMGY培養(yǎng)基中，30℃，250r/min培養(yǎng)約24h，隨后4000r/min離心5min得到菌體，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基；③繼續(xù)培養(yǎng)，30℃，250r/min，每隔12h補(bǔ)加250μL甲醇。在培養(yǎng)5天后，離心得上清，即得到磷脂酶B的粗酶液；野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體重組菌發(fā)酵后粗酶液的酶活分別為191.3U/ml和239.1U/ml。④然后采用分級(jí)鹽析法沉淀酶蛋白，收集蛋白質(zhì)沉淀，溶解后，透析除鹽，再經(jīng)離子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得磷脂酶B純酶酶粉。實(shí)施例6：畢赤酵母細(xì)胞表面展示磷脂酶B全細(xì)胞催化劑的制備①挑取YPD平板上的畢赤酵母重組菌GS115/pPIC9K-Flo-plb和GS115/pPIC9K-Flo-plbm接種至50ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)24h；②以1％的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，30℃，250r/min培養(yǎng)約24h，隨后4000r/min離心5min得到菌體，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基；③繼續(xù)培養(yǎng)，30℃，250r/min，每隔12h補(bǔ)加250μL甲醇。在培養(yǎng)5天后，離心收集取菌體，用過膜水沖洗1-2次，經(jīng)真空冷凍干燥制得畢赤酵母細(xì)胞表面展示高活力磷脂酶B細(xì)胞催化劑。野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體細(xì)胞催化劑酶活分別為268和337U/(g·干細(xì)胞)。實(shí)施例7：以野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體制備甘油磷脂酰膽堿底物為200mg的磷脂酰膽堿，催化劑為實(shí)施例5或?qū)嵤├?制備的畢赤酵母游離表達(dá)的或畢赤酵母表面展示的野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體，濃度分別為酶粉200mg，全細(xì)胞催化劑為100mg，酶激活劑為10mmol/L的CaCl2，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)pH5.5(磷脂酰膽堿、CaCl2溶于pH5.5的bis-Tris–HCl緩沖液)，在磁力攪拌器攪拌作用下反應(yīng)24h，隨后通過萃取獲得甘油磷脂酰膽堿。其中野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體酶粉催化制備甘油磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)化率分別為11％、18％，野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體全細(xì)胞催化劑轉(zhuǎn)化率分別為15％、26％。實(shí)施例8：野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體應(yīng)用于油脂脫膠準(zhǔn)確稱取100g植物油放于250ml的具塞錐形瓶中，水浴加熱到70℃，加入0.13ml濃度為45％的檸檬酸溶液，10000r/min均質(zhì)1min,在70℃條件下繼續(xù)攪拌(500r/min)反應(yīng)25min,隨后將溫度降至50℃，加入濃度為4％的氫氧化鈉溶液，將反應(yīng)體系的pH調(diào)至5.0，在500r/min攪拌5min后，加入3ml去離子水和800mg實(shí)施例5制備的酶粉或400mg實(shí)施例6制備的全細(xì)胞催化劑，10000r/min均質(zhì)1min,而后在溫度為40℃條件下繼續(xù)攪拌(500r/min)反應(yīng)5h，酶反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系溫度升至95℃，滅酶10min，隨后迅速轉(zhuǎn)入離心機(jī)10000r/min離心10min,收集上層油層進(jìn)行磷含量及脫磷率分析。其中畢赤酵母游離表達(dá)野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體酶粉使植物油的磷含量分別降至10mg/kg、5mg/kg，畢赤酵母表面展示野生型磷脂酶B和磷脂酶B突變體全細(xì)胞催化劑使植物油的磷含量分別降至8mg/kg、3mg/kg。SEQUENCELISTING<110>天津科技大學(xué)<120>一種新型磷脂酶B及其應(yīng)用<130>1<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2064<212>DNA<213>釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）TCCC31028<400>1gcagattcgtcgtccactactggtgatggttatgctccatcaataattccttgtcccagt60gatgatacctctttagttagaaacgcgtctggcttatctaccgctgaaactgattggtta120aagaaaagagatgcgtacactaaagaagctttacattccttcttaagcagagctacttct180aacttcagtgacacttctttgctatccactcttttcagtagtaactcttccaatgtaccc240aaaattggtattgcatgctctggtggtggttatcgtgccatgttgggtggtgctggtatg300attgctgctatggacaatcgtactgatggtgctaacgagcatggtcttggtggtttacta360caaagttccacgtatctatcgggtttgtccggtggtaactggttgactggtactttggca420tggaacaattggacctctgtacaggaaattgtagaccatatgagtgagagcgattccatc480tggaatatcacgaaatccattgtgaaccctggtggctctaatttgacctacacaattgaa540agatgggagtccattgtacaagaagtgcaggctaagtctgatgcaggcttcaatatatct600ttgtcggatttgtgggcccgtgcactttcttacaacttctttccaagcttgccagatgct660ggctccgctttgacttggtcctctttgagagatgttgatgtgttcaaaaacggtgaaatg720cctttaccaattactgttgcagatggtagatacccaggtaccaccgtgataaacttgaat780gccactcttttcgagttcactccatttgaaatgggttcttgggatccttctttgaacgct840tttacggatgtgaaatatctaggtaccaacgttacaaatggtaaaccggtcaacaaggat900caatgcgtttctggttacgataatgctggatttgtaattgccacatccgccagtttattc960aacgaattttccctggaagcttccacttcgacctattataaaatgattaatagttttgcc1020aacaagtacgttaacaacctatcccaagatgacgatgatattgcaatttacgctgcaaat1080ccattcaaggatacagaatttgttgaccgcaattacacttccagtattgttgatgccgat1140gatttgtttttagttgatggtggtgaggacggccaaaatttgccgttggttccactaatc1200aagaaggaacgtgacttggatgtggtgttcgcattggatatatccgacaatactgatgaa1260tcatggccaagtggtgtgtgcatgacgaacacttatgagcgccagtattctaagcaaggt1320aaaggaatggctttcccatatgttccagacgttaacaccttccttaacttgggcttaact1380aataagccaacgttttttggttgtgatgcaaaaaatttgacggacttggagtatattcca1440cctttagttgtatatatcccaaacacaaaacattcattcaatggtaaccaaagtactttg1500aagatgaactacaatgttacagaacgtcttggaatgatcagaaatggttttgaagctgct1560acaatgggcaactttacggatgactctaactttttaggttgcataggttgtgccatcatt1620agacgtaagcaagaaagcctaaatgccaccttgccccctgaatgtaccaaatgttttgcg1680gattactgctggaacggcacactaagtacctcagctaatcctgaactatcgggaaatagt1740acgtatcaaagcggtgctattgcctctgcaatctctgaggctactgacggtattccaata1800acggctctcttaggttcatcaacctccggaaatactacatcaaactcaacaacctcgact1860tcatcaaatgtcacttctaactcaaactcttcgtcaaatacaactttaaactcaaattct1920tcatcctcttcaatttcttcctctacagctcgttcttcttcctctacggcaaacaaagcg1980aatgctgcggctatttcctatgcgaacactaatactctaatgagtttgttaggtgccata2040acagcattatttggactaatttag2064<210>2<211>687<212>PRT<213>釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）TCCC31028<400>2AlaAspSerSerSerThrThrGlyAspGlyTyrAlaProSerIleIle151015ProCysProSerAspAspThrSerLeuValArgAsnAlaSerGlyLeu202530SerThrAlaGluThrAspTrpLeuLysLysArgAspAlaTyrThrLys354045GluAlaLeuHisSerPheLeuSerArgAlaThrSerAsnPheSerAsp505560ThrSerLeuLeuSerThrLeuPheSerSerAsnSerSerAsnValPro65707580LysIleGlyIleAlaCysSerGlyGlyGlyTyrArgAlaMetLeuGly859095GlyAlaGlyMetIleAlaAlaMetAspAsnArgThrAspGlyAlaAsn100105110GluHisGlyLeuGlyGlyLeuLeuGlnSerSerThrTyrLeuSerGly115120125LeuSerGlyGlyAsnTrpLeuThrGlyThrLeuAlaTrpAsnAsnTrp130135140ThrSerValGlnGluIleValAspHisMetSerGluSerAspSerIle145150155160TrpAsnIleThrLysSerIleValAsnProGlyGlySerAsnLeuThr165170175TyrThrIleGluArgTrpGluSerIleValGlnGluValGlnAlaLys180185190SerAspAlaGlyPheAsnIleSerLeuSerAspLeuTrpAlaArgAla195200205LeuSerTyrAsnPhePheProSerLeuProAspAlaGlySerAlaLeu210215220ThrTrpSerSerLeuArgAspValAspValPheLysAsnGlyGluMet225230235240ProLeuProIleThrValAlaAspGlyArgTyrProGlyThrThrVal245250255IleAsnLeuAsnAlaThrLeuPheGluPheThrProPheGluMetGly260265270SerTrpAspProSerLeuAsnAlaPheThrAspValLysTyrLeuGly275280285ThrAsnValThrAsnGlyLysProValAsnLysAspGlnCysValSer290295300GlyTyrAspAsnAlaGlyPheValIleAlaThrSerAlaSerLeuPhe305310315320AsnGluPheSerLeuGluAlaSerThrSerThrTyrTyrLysMetIle325330335AsnSerPheAlaAsnLysTyrValAsnAsnLeuSerGlnAspAspAsp340345350AspIleAlaIleTyrAlaAlaAsnProPheLysAspThrGluPheVal355360365AspArgAsnTyrThrSerSerIleValAspAlaAspAspLeuPheLeu370375380ValAspGlyGlyGluAspGlyGlnAsnLeuProLeuValProLeuIle385390395400LysLysGluArgAspLeuAspValValPheAlaLeuAspIleSerAsp405410415AsnThrAspGluSerTrpProSerGlyValCysMetThrAsnThrTyr420425430GluArgGlnTyrSerLysGlnGlyLysGlyMetAlaPheProTyrVal435440445ProAspValAsnThrPheLeuAsnLeuGlyLeuThrAsnLysProThr450455460PhePheGlyCysAspAlaLysAsnLeuThrAspLeuGluTyrIlePro465470475480ProLeuValValTyrIleProAsnThrLysHisSerPheAsnGlyAsn485490495GlnSerThrLeuLysMetAsnTyrAsnValThrGluArgLeuGlyMet500505510IleArgAsnGlyPheGluAlaAlaThrMetGlyAsnPheThrAspAsp515520525SerAsnPheLeuGlyCysIleGlyCysAlaIleIleArgArgLysGln530535540GluSerLeuAsnAlaThrLeuProProGluCysThrLysCysPheAla545550555560AspTyrCysTrpAsnGlyThrLeuSerThrSerAlaAsnProGluLeu565570575SerGlyAsnSerThrTyrGlnSerGlyAlaIleAlaSerAlaIleSer580585590GluAlaThrAspGlyIleProIleThrAlaLeuLeuGlySerSerThr595600605SerGlyAsnThrThrSerAsnSerThrThrSerThrSerSerAsnVal610615620ThrSerAsnSerAsnSerSerSerAsnThrThrLeuAsnSerAsnSer625630635640SerSerSerSerIleSerSerSerThrAlaArgSerSerSerSerThr645650655AlaAsnLysAlaAsnAlaAlaAlaIleSerTyrAlaAsnThrAsnThr660665670LeuMetSerLeuLeuGlyAlaIleThrAlaLeuPheGlyLeuIle675680685<210>3<211>2064<212>DNA<213>人工序列<400>3gcagattcgtcgtccactactggtgatggttatgctccatcaataattccttgtcccagt60gatgatacctctgcagttagaaacgcgtctggcttatctaccgctgaaactgattggtta120aagaaaagagatgcgtacactaaagaagctttacattccttcttaagcagagctacttct180aacttcagtgacacttctttgctatccactcttttcagtagtaactcttccaatgtaccc240aaaattggtattgcatgctctggtggtggttatcgtgccatgttgggtggtgctggtatg300attgctgctatggacaatcgtactgatggtgctaacgagcatggtcttggtggtttacta360caaagttccacgtatctatcgggtttgtccggtggtaactggttgactggtactttggca420tggaacaattggacctctgtacaggaaattgtagaccatatgagtgagagcgattccatc480tggaatatcacgaaatccattgtgaaccctggtggctctaatttgacctacacaattgaa540agatgggagtccattgtacaagaagtgcaggctaagtctgatgcaggcttcaatatatct600ttgtcggatttgtgggcccgtgcactttcttacaacttctttccaagcttgccagatgct660ggctccgctttgacttggtcctctttgagagatgttgatgtgttcaaaaacggtgaaatg720cctttaccaattactgttgcagatggtagatacccaggtaccaccgtgataaacttgaat780gccactcttttcgagttcactccatttgaaatgggttcttgggatccttctttgaacgct840tttacggatgtgaaatatctaggtaccaacgttacaaatggtaaaccggtcaacaaggat900caatgcgtttctggttacgataatgctggatttgtaattgccacatccgccagtttattc960aacgaattttccctggaagcttccacttcgacctattataaaatgattaatagttttgcc1020aacaagtacgttaacaacctatcccaagatgacgatgatattgcaatttacgctgcaaat1080ccattcaaggatacagaatttgttgaccgcaattacacttccagtattgttgatgccgat1140gatttgtttttagttgatggtggtgaggacggccaaaatttgccgttggttccactaatc1200aagaaggaacgtgacttggatgtggtgttcgcattggatatatccgacaatactgatgaa1260tcatggccaagtggtgtgtgcatgacgaacacttatgagcgccagtattctaagcaaggt1320aaaggaatggctttcccatatgttccagacgttaacaccttccttaacttgggcttaact1380aataagccaacgttttttggttgtgatgcaaaaaatttgacggacttggagtatattcca1440cctttagttgtatatatcccaaacacaaaacattcattcaatggtaaccaaagtactttg1500aagatgaactacaatgttacagaacgtcttggaatgatcagaaatggttttgaagctgct1560acaatgggcaactttacggatgactctaactttttaggttgcataggttgtgccatcatt1620agacgtaagcaagaaagcctaaatgccaccttgccccctgaatgtaccaaatgttttgcg1680gattactgctggaacggcacactaagtacctcagctaatcctgaactatcgggaaatagt1740acgtatcaaagcggtgctattgcctctgcaatctctgaggctactgacggtattccaata1800acggctctcttaggttcatcaacctccggaaatactacatcaaactcaacaacctcgact1860tcatcaaatgtcacttctaactcaaactcttcgtcaaatacaactttaaactcaaattct1920tcatcctcttcaatttcttcctctacagctcgttcttcttcctctacggcaaacaaagcg1980aatgctgcggctatttcctatgcgaacactaatactctaatgagtttgttaggtgccata2040acagcattatttggactaatttag2064<210>4<211>687<212>PRT<213>人工序列<400>4AlaAspSerSerSerThrThrGlyAspGlyTyrAlaProSerIleIle151015ProCysProSerAspAspThrSerAlaValArgAsnAlaSerGlyLeu202530SerThrAlaGluThrAspTrpLeuLysLysArgAspAlaTyrThrLys354045GluAlaLeuHisSerPheLeuSerArgAlaThrSerAsnPheSerAsp505560ThrSerLeuLeuSerThrLeuPheSerSerAsnSerSerAsnValPro65707580LysIleGlyIleAlaCysSerGlyGlyGlyTyrArgAlaMetLeuGly859095GlyAlaGlyMetIleAlaAlaMetAspAsnArgThrAspGlyAlaAsn100105110GluHisGlyLeuGlyGlyLeuLeuGlnSerSerThrTyrLeuSerGly115120125LeuSerGlyGlyAsnTrpLeuThrGlyThrLeuAlaTrpAsnAsnTrp130135140ThrSerValGlnGluIleValAspHisMetSerGluSerAspSerIle145150155160TrpAsnIleThrLysSerIleValAsnProGlyGlySerAsnLeuThr165170175TyrThrIleGluArgTrpGluSerIleValGlnGluValGlnAlaLys180185190SerAspAlaGlyPheAsnIleSerLeuSerAspLeuTrpAlaArgAla195200205LeuSerTyrAsnPhePheProSerLeuProAspAlaGlySerAlaLeu210215220ThrTrpSerSerLeuArgAspValAspValPheLysAsnGlyGluMet225230235240ProLeuProIleThrValAlaAspGlyArgTyrProGlyThrThrVal245250255IleAsnLeuAsnAlaThrLeuPheGluPheThrProPheGluMetGly260265270SerTrpAspProSerLeuAsnAlaPheThrAspValLysTyrLeuGly275280285ThrAsnValThrAsnGlyLysProValAsnLysAspGlnCysValSer290295300GlyTyrAspAsnAlaGlyPheValIleAlaThrSerAlaSerLeuPhe305310315320AsnGluPheSerLeuGluAlaSerThrSerThrTyrTyrLysMetIle325330335AsnSerPheAlaAsnLysTyrValAsnAsnLeuSerGlnAspAspAsp340345350AspIleAlaIleTyrAlaAlaAsnProPheLysAspThrGluPheVal355360365AspArgAsnTyrThrSerSerIleValAspAlaAspAspLeuPheLeu370375380ValAspGlyGlyGluAspGlyGlnAsnLeuProLeuValProLeuIle385390395400LysLysGluArgAspLeuAspValValPheAlaLeuAspIleSerAsp405410415AsnThrAspGluSerTrpProSerGlyValCysMetThrAsnThrTyr420425430GluArgGlnTyrSerLysGlnGlyLysGlyMetAlaPheProTyrVal435440445ProAspValAsnThrPheLeuAsnLeuGlyLeuThrAsnLysProThr450455460PhePheGlyCysAspAlaLysAsnLeuThrAspLeuGluTyrIlePro465470475480ProLeuValValTyrIleProAsnThrLysHisSerPheAsnGlyAsn485490495GlnSerThrLeuLysMetAsnTyrAsnValThrGluArgLeuGlyMet500505510IleArgAsnGlyPheGluAlaAlaThrMetGlyAsnPheThrAspAsp515520525SerAsnPheLeuGlyCysIleGlyCysAlaIleIleArgArgLysGln530535540GluSerLeuAsnAlaThrLeuProProGluCysThrLysCysPheAla545550555560AspTyrCysTrpAsnGlyThrLeuSerThrSerAlaAsnProGluLeu565570575SerGlyAsnSerThrTyrGlnSerGlyAlaIleAlaSerAlaIleSer580585590GluAlaThrAspGlyIleProIleThrAlaLeuLeuGlySerSerThr595600605SerGlyAsnThrThrSerAsnSerThrThrSerThrSerSerAsnVal610615620ThrSerAsnSerAsnSerSerSerAsnThrThrLeuAsnSerAsnSer625630635640SerSerSerSerIleSerSerSerThrAlaArgSerSerSerSerThr645650655AlaAsnLysAlaAsnAlaAlaAlaIleSerTyrAlaAsnThrAsnThr660665670LeuMetSerLeuLeuGlyAlaIleThrAlaLeuPheGlyLeuIle675680685<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>5ccggaattcgcagattcgtcgtccactac29<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>6ataagaatgcggccgcaattagtccaaataatgctgttatg41當(dāng)前第1頁1 2 3