本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及擬南芥基因REM16的表達(dá)載體及其在調(diào)控植株開花期中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微絲解聚因子（ADF/cofilin）廣泛存在于真核細(xì)胞中，對(duì)維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞分裂及分化等起著非常重要的作用。前期研究表明，擬南芥微絲解聚因子ADF1表達(dá)量變化會(huì)影響植物的開花期，ADF1表達(dá)量的降低導(dǎo)致開花延遲。野生型擬南芥約在35±1天開花，有17片蓮座葉；而ADF1基因沉默植株開花較野生型延遲2周，蓮座葉數(shù)目增加至26片。其后，人們通過基因敲除深入解析ADF在植物生長發(fā)育中的分子功能。擬南芥adf4突變體具有更長的下胚軸和表皮細(xì)胞。擬南芥ADF9的突變體（adf9-1，adf9-2）植株的頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)，其花序的二級(jí)分枝數(shù)目少于野生型，但分枝的長度比野生型長；長日照生長條件下突變體開花時(shí)間早于野生型，同時(shí)蓮座葉數(shù)目比野生型少，而短日照生長條件下跟野生型相比沒有明顯差異。此外，ADF9能調(diào)控開花轉(zhuǎn)換時(shí)期相關(guān)基因的表達(dá)量。這些研究表明，ADF蛋白直接參與植物生長發(fā)育及花期調(diào)控，但其調(diào)控的目標(biāo)基因、參與的關(guān)鍵調(diào)控因子及分子調(diào)控機(jī)制等都不清楚。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了擬南芥基因REM16的表達(dá)載體及其在調(diào)控植株開花期中的應(yīng)用。本發(fā)明以擬南芥ADF1為誘餌，通過酵母雙雜交從擬南芥cDNA文庫中篩選得到了十幾個(gè)ADF1互作蛋白分子，獲得本發(fā)明所述的基因REM16(基因編號(hào)為AT3G53310)，并通過實(shí)驗(yàn)證明了其調(diào)控?cái)M南芥花期的功能。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種擬南芥基因REM16的過表達(dá)載體pCambia1300-221-HA，所述過表達(dá)載體pCambia1300-221-HA的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:2所示，所述過表達(dá)載體含有如序列表SEQIDNo:1所示的基因REM16，所述過表達(dá)載體pCambia1300-221-HA用于調(diào)控?cái)M南芥花期提前。進(jìn)一步的：將基因REM16和帶有XbaI和KpnI酶切位點(diǎn)的pCambia1300-221-HA載體分別進(jìn)行KpnI和XbaI的雙酶切，再按照基因片段和載體4：1的比例在T4連接酶的催化下進(jìn)行16℃過夜連接20h制得。本發(fā)明提供了一種擬南芥基因REM16的基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0，所述基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:3所示，所述基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0用于調(diào)控?cái)M南芥花期延遲。本發(fā)明還提供了擬南芥基因REM16在調(diào)控?cái)M南芥開花期中的應(yīng)用。進(jìn)一步的：所述調(diào)控開花期的擬南芥中含有如序列表SEQIDNo:1所示的過表達(dá)載體pCambia1300-221-HA或如序列表SEQIDNo:2所示的基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0。進(jìn)一步的：所述擬南芥基因REM16具有花期調(diào)控的功能，基因REM16過表達(dá)植株表現(xiàn)為早花性狀，基因REM16沉默植株表現(xiàn)為晚花性狀。進(jìn)一步的：所述基因REM16過表達(dá)植株開花時(shí)間比野生型植株早4-6天，蓮座葉數(shù)目比野生型少2片；而所述基因REM16沉默植株開花時(shí)間比野生型植株晚2-3天，蓮座葉數(shù)目和野生型沒有顯著變化。進(jìn)一步的：所述基因REM16過表達(dá)植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達(dá)量均高于野生型植株，春化途徑FLC的表達(dá)量低于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達(dá)量與野生型比沒有明顯差異。進(jìn)一步的：所述基因REM16沉默植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達(dá)量均低于野生型植株，春化途徑FLC的表達(dá)量高于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達(dá)量與野生型比沒有明顯差異。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明通過花序侵染法的方法獲得擬南芥基因REM16的過表達(dá)和基因沉默轉(zhuǎn)基因載體及其轉(zhuǎn)基因株系，通過研究過表達(dá)和基因沉默轉(zhuǎn)基因植株表型，并將其與相同條件下生長的野生型植株開花時(shí)間及蓮座葉數(shù)目進(jìn)行比較。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)分析證明，擬南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期調(diào)控的功能，過表達(dá)REM16基因引起轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中開花相關(guān)基因表達(dá)變化而促進(jìn)擬南芥提早開花，與野生型植株的開花時(shí)間相比表現(xiàn)為早花性狀；沉默REM16基因引起轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中開花相關(guān)基因表達(dá)變化而延遲擬南芥開花，與野生型植株相比表現(xiàn)為晚花性狀。通過分析轉(zhuǎn)基因株系開花相關(guān)基因的表達(dá)從而確定REM16基因調(diào)控開花的功能。本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)于植物花期調(diào)控具有重要意義。附圖說明圖1為野生型與突變體REM16基因表達(dá)量分析（**：P<0.01）。圖2為野生型與突變體開花時(shí)間及蓮座葉比較，其中：(a)為野生型與突變體開花時(shí)間比較；(b)為野生型與突變體開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)分析；(c)為野生型與突變體蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析(**：P<0.01)。圖3為野生型與突變體開花相關(guān)基因表達(dá)量分析(**：P<0.01)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中用到的試劑等購自TAKARA、Promega、Sigma等公司。實(shí)驗(yàn)中用到的LB培養(yǎng)基配方：0.5%酵母粉、1%NaCl、1%蛋白胨。其它試劑配方：見《分子克隆》第三版。實(shí)施例1、REM16基因的克隆1、擬南芥的種植擬南芥種子的表面消毒：將50粒待滅菌的擬南芥種子放入1.5ml離心管中，加入1ml75%的乙醇（含有0.03%體積比的TritonX-100）震蕩消毒1min，再用70%的乙醇震蕩消毒1min（兩次），最后用吸頭將種子吸到無菌濾紙上吹干，然后用無菌的牙簽將其點(diǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中，冰箱中4℃春化3d后取出置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下：16h光照/8h黑暗交替光照，溫度22℃，光強(qiáng)100μmol·m-2·s-1。然后，待光照生長7-10天將擬南芥幼苗移到土中，覆蓋保鮮膜3-7天揭膜，后于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，條件同光照培養(yǎng)箱。2、擬南芥總RNA提取(1)將擬南芥材料放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過程中要保證材料浸在液氮中；(2)等液氮揮發(fā)后，立即將100-200mg植物粉末轉(zhuǎn)入到1.5ml離心管中，然后迅速加入1mlTrizol提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫放置5min；(3)4℃，12,000rpm，離心11min，將0.8ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中；再加入0.2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫放置2-5min直到分層。(4)4℃，12,000rpm，離心11min，將0.4ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中；再加入0.4ml異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)15次混勻溶液，-20℃放置30mim。(5)4℃，12,000rpm，離心11min，棄上清，用0.9ml75%的乙醇洗滌沉淀兩次，4℃，12,000rpm，離心5min；(6)棄上清，開蓋于超凈工作臺(tái)中干燥RNA約2-5min，加入40μlRNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA10min；(7)用紫外分光光度計(jì)測RNA樣品的OD值和濃度，A260/A280達(dá)到1.8-2.0為佳；瓊脂糖凝膠電泳檢測的質(zhì)量。3、RNA的反轉(zhuǎn)錄詳見TaKaRa的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒（RR047A）說明書。4、PCR擴(kuò)增以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，PCR法擴(kuò)增基因片段。(1)PCR引物由上海桑尼生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成：引物REM16-For:5’-ATGGCTGACGATAGCGAAT-3’（SEQIDNo:4）；引物REM16-Rev:5’-TCAAGCATCTCTACGCAAGACATG-3’（SEQIDNo:5）。(2)PCR反應(yīng)體系組分體積(μl)/管10×PCRBuffer2.5dNTPMixture1擬南芥cDNA3正向引物（10μΜ）1反向引物（10μΜ）1rTaq0.15ddH2O18.5總體積25PCR反應(yīng)條件：94oC預(yù)變性5min；94oC變性30s，62oC退火30s，72oC延伸50s，27個(gè)循環(huán)；72oC延伸7min。5、PCR產(chǎn)物回收PCR反應(yīng)后1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（110V17min），后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果并拍照。然后參照TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0試劑盒說明書將PCR產(chǎn)物回收，回收到擬南芥基因REM16(AP2/B3-liketranscriptionalfactorfamilyprotein)，所述基因REM16CDS序列如序列表SEQIDNo:1所示。6、連接將以上回收得到的REM16基因片段通過TA克隆連接到克隆載體pMD18-TVector上，16oC過夜。連接體系如下：組分體積(μl)/管SolutionI5pMD18-TVector1DNA回收產(chǎn)物4總體積107、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)DH5α菌種的活化：從-80℃超低溫冰箱中取出保存的DH5α菌種，劃線后37℃倒置培養(yǎng)；(2)挑取單菌落接種于10mLLB（-）液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)12h；(3)按1:100取接種于50mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6；(4)將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，冰上放置10min，4℃，2500g離心5min，棄上清；(5)加入20mL預(yù)冷的0.1MMgCL2懸浮菌體，4℃，2500g離心5min，棄上清；(6)加入50mL預(yù)冷的0.1MCaCL2懸浮菌體，冰浴20min，4℃，2500g離心5min，棄上清；(7)加入10mL預(yù)冷的0.1MCaCL2懸浮菌體，再加入1mL甘油充分混勻，每個(gè)EP管分裝100μL后用液氮速凍于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(1)從-80℃超低溫冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化，將10μL重組質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，吸打混勻，冰浴30min；(2)42℃熱激90s，立即冰浴5min；(3)加入900μLLB（-）培養(yǎng)基，37℃，200rpm，1.5h；(4)4000g室溫離心5min，棄800μL上清，剩余液體重懸菌體，涂布于帶有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上，將平板于37℃正向放置30min至液體被吸收，倒置平板，于37℃培養(yǎng)12h過夜。8、重組質(zhì)粒的獲得及鑒定將TA克隆后挑單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽性菌液送樣到上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證，將測序正確的菌液提取質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2、35S::REM16CDS表達(dá)載體構(gòu)建1、目的基因的獲得引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)的體系和條件：（1）以測序正確的重組質(zhì)粒為模板，KpnI–REM16-For和XbaI-REM16Rev為引物PCR擴(kuò)增861bp的REM16全長基因編碼（CDS）序列，所用引物序列如下：KpnI-REM16-For：5’-CGGGGTACCCCGATGGCTGACGATAGCGAAT-3’（SEQIDNo:6）；XbaI-REM16-Rev：5’-GCTCTAGAGCTCAAGCATCTCTACGCAAGACATG-3’（SEQIDNo:7）；PCR反應(yīng)體系和條件同實(shí)施例1。2、表達(dá)載體的構(gòu)建將上一步的膠回收產(chǎn)物和帶有XbaI和KpnI酶切位點(diǎn)的pCambia1300-221-HA載體分別進(jìn)行KpnI和XbaI的雙酶切，再按照4:1的比例在T4連接酶的催化下進(jìn)行過夜連接。反應(yīng)體系及條件如下：酶切反應(yīng)體系和條件：組分體積(μL)/管XbaI1KpnI110×Mbuffer2膠回收產(chǎn)物/載體8ddH2O8總體積2037℃溫育2.5h，然后分別將酶切產(chǎn)物回收。通過T4連接酶將目的基因REM16片段與雙元載體pCambia1300-221-HA16℃過夜連接20h，連接體系如下：組分體積(μL)/管10×T4DNAligaseBuffer2.5RTE4酶切回收產(chǎn)物4pCambia1300-221-HA酶切回收產(chǎn)物1T4DNAligase1ddH2O1.5總體積10連接完成后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后挑單菌落搖菌提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和菌液PCR驗(yàn)證，將含有重組質(zhì)粒的陽性菌株送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序，得到的測序結(jié)果經(jīng)過NCBIblast分析，陽性質(zhì)粒中確實(shí)含有REM16的CDS序列。至此得到了35S::REM16CDS表達(dá)載體pCambia1300-221-HA（序列如SEQIDNo:2所示）。實(shí)施例3、REM16-RNAi載體構(gòu)建1、含有固定接頭（attB1，attB2）的目的片段的獲得將測序正確的包含目的片段REM16基因的18-T重組質(zhì)粒稀釋1000倍，以稀釋后的質(zhì)粒為模板，按照上述克隆條件，以加attB接頭的上下游引物為引物，克隆目的片段。凝膠回收目的片段。2、BP重組反應(yīng)體系和條件組分體積(μL)/管帶接頭的attB-PCR回收產(chǎn)物3pDONR221vector(150ng/μL)2BP酶2TEBuffer，PH8.0to1025℃培養(yǎng)20h，每個(gè)反應(yīng)加入1μlProteinaseK，37℃水浴10min。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，菌液PCR驗(yàn)證，提取陽性菌株質(zhì)粒。3、LR重組反應(yīng)體系和條件：組分體積(μL)/管Entryclone(上一步BP反應(yīng)質(zhì)粒)3pB7GWIWG2(II).0vector(150ng/μL)2LR酶2TEBuffer，PH8.0To1025℃培養(yǎng)20h，每個(gè)反應(yīng)加入1μlProteinaseK，37℃水浴10min。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，菌液PCR驗(yàn)證，提取陽性菌株質(zhì)粒，即為擬南芥基因REM16的基因沉默載體pB7GWIWG2(II).0（序列如SEQIDNo:3所示）。實(shí)施例4、擬南芥的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的篩選1、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)從超低溫冰箱中取保存的農(nóng)桿菌GV3101菌液用接種環(huán)劃板活化，獲單菌落；(2)用接種環(huán)挑取單菌落，接種于5ml液體YEP（-）培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)12h；(3)將液體培養(yǎng)物接種到新的液體YEP（-）培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6；(4)將菌液冰浴0.5h，4℃，5000rpm，5min；(5)棄上清，用10mL0.15M預(yù)冷的NaCl懸浮菌體，4℃，5000rpm，5min；(6)棄上清，用10mL20mM預(yù)冷的CaCl2重懸菌體，分裝成200μl/管于1.5mL離心管中，用液氮中迅速冷凍后于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?、將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（凍融法）(1)從-80℃超低溫冰箱中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上慢慢融化，加入10μl重組質(zhì)粒，冰浴0.5h，液氮中冷凍60s，后置于37℃水浴5min；(2)加入950μl液體YEP（-）培養(yǎng)基，28℃，200rpm，培養(yǎng)3h；(3)12000rpm，1min收集菌體，留取100μl上清液回溶菌體；(4)將菌液涂于LB（含抗生素）固體培養(yǎng)基上，先28℃正置培養(yǎng)0.5h，后倒置培養(yǎng)2-3天；(5)菌液PCR反應(yīng)驗(yàn)證。3、擬南芥的轉(zhuǎn)化參考Clough等人的擬南芥轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花浸染法。取驗(yàn)證過的陽性克隆菌于含有50mg/l利福平（Rif）和相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、220rpm震蕩培養(yǎng)至OD600至1.0-1.8。6000rpm離心5min收集菌體，用含有5%蔗糖，0.04%SilwetL-77侵染液懸浮菌體，此時(shí)OD600在0.8左右。將擬南芥花序浸到侵染液中10-15s。然后將侵染好的擬南芥植株放入暗箱中上面覆膜保濕，暗培養(yǎng)24h后放于培養(yǎng)室中長日照培養(yǎng)。4、轉(zhuǎn)基因植物的篩選及鑒定將侵染獲得的第一代種子命名為T1代，將擬南芥種子經(jīng)表面消毒后將鋪在1/2MS+30mg/l潮霉素(Hyg)或5mg/l草銨膦(PPT)培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱中春化處理3-4天，再于培養(yǎng)箱中16h光照/8h黑暗交替光照培養(yǎng)10天，陽性苗會(huì)一直存活并且顏色較綠，陰性苗會(huì)逐漸變黃致死。最后將陽性苗移栽到土中放于培養(yǎng)室中16h光照/8h黑暗交替光照培養(yǎng)至收獲T2代種子（單株收）。將收獲的T2代種子鋪抗性板進(jìn)行純合體鑒定，若陽性苗與陰性苗比例為3:1則為純合株系，按照之前的篩選方法再將純合的陽性苗移苗到土壤中在培養(yǎng)室培養(yǎng)至收獲的T3代種子（單株收），在抗性平板上篩選培養(yǎng)，此時(shí)幼苗應(yīng)該為全綠證明是純合體。在長日照生長10d的擬南芥幼苗，取幼苗提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將cDNA稀釋五倍作為模板，經(jīng)過熒光定量PCR技術(shù)的分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，REM16過表達(dá)植株中涉及REM16基因表達(dá)量顯著高于野生型植株，而REM16基因沉默植株中REM16基因表達(dá)量明顯低于野生型植株。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因植株表型以及不同REM16表達(dá)量影響開花相關(guān)基因的分析1、開花時(shí)間及蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析選取長日照條件下（16h光照/8h黑暗）生長正常的擬南芥野生型（WT）植株與突變體植株各40株，進(jìn)行開花時(shí)間及蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，由圖分析可知，生長至5周時(shí)，野生型（WT）擬南芥植株已完成由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，花朵開放，蓮座葉數(shù)目大約為10片；REM16過表達(dá)植株開花時(shí)間比野生型早4-6天，蓮座葉數(shù)目比野生型少約2片；而REM16基因沉默植株開花時(shí)間比野生型晚2-3天，蓮座葉數(shù)目和野生型沒有顯著變化。由此確定擬南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期調(diào)控的功能，過表達(dá)突變體表現(xiàn)為早花性狀，基因沉默突變體表現(xiàn)為晚花性狀。2、不同REM16基因的表達(dá)量影響開花相關(guān)基因表達(dá)的分析在長日照生長10d的擬南芥幼苗，取幼苗提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將cDNA稀釋五倍作為模板，經(jīng)過熒光定量PCR技術(shù)的分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，REM16過表達(dá)植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達(dá)量均高于野生型植株，春化途徑FLC的表達(dá)量低于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達(dá)量與野生型比沒有明顯差異，這與REM16過表達(dá)植株早花的表型相一致。REM16基因沉默植株中涉及光周期途徑GI、CO以及開花下游的開花整合子和花分生組織決定基因FT、LFY、AP1的表達(dá)量均低于野生型植株，春化途徑FLC的表達(dá)量高于野生型植株，赤霉素途徑RGA、RGL1的表達(dá)量與野生型比沒有明顯差異，這與REM16基因沉默植株晚花的表型相一致。以上證據(jù)表明REM16參與調(diào)控了部分開花相關(guān)基因的表達(dá)，并使得REM16過表達(dá)突變體表現(xiàn)為早花性狀，REM16基因沉默突變體表現(xiàn)為晚花性狀。以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。SEQUENCELISTING<110>青島農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>擬南芥基因REM16的表達(dá)載體及其在調(diào)控植株開花期中的應(yīng)用<130><160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>861<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctgacgatagcgaattgtatcctcgtttcttcaaagtgttcctcgttgaatcggct60tctgaatcgttgatgattccgttgccttttatggcatttcttgctgatccattgccaaag120acagtgaagctccaaggtcttggaggaaaactttggactgtgagcttgaagaaaataagc180ggagctgcgtatcttactagaggatggccaaaattcgcagaggaacatgagctgaagaac240ggagagttcatgacatttgtgtatgatggtcatcgtacctttgaagtgagtgtctttgat300cgttggggtagcaaagaggtcagagctgaaatacaagccataccactttctgattctgat360tctgattctgttgtggaagacgaaaaagactcaactgatgttgttgaagatgatgatgat420gaagatgaagatgaagatgaagatgatgatggtagctttgatgaagatgaagaaatcagc480cagagtctttatccgattgacgaagagactgcaaccgatgctgcagtttttgaagggaac540ttggacgtggaagctttaactaatccacactttccgactacgctcaagaacaggatttat600gaactgttgatcccagccaatgtggtgaaggataataaccttgaatttggttcatccatc660aagtacatcgatggagaaggaaccttagtagggctaagaggaaaatgggctgataagagg720gtttgcttcaaaggatgggacaggatttgcagaaggaacaggctcaaaaagcaccaagat780actgtcgaatgcgagcttcttcatgatgaccagaagatggttcattccatccgagtccat840gtcttgcgtagagatgcttga861<210>2<211>10221<212>DNA<213>人工序列<400>2gaattcccgatctagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcg60ctatattttgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaac120ccatctcataaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaa180cagaaattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaacttta240ttgccaaatgtttgaacgatcggggaaattcgagctcactagtggatcctcactaaagac300tagcataatctggaacatcataaggatacatcaatgatgcgtagtcaggcacgtcgtatg360ggtacataagactagcataatctggaacatcataaggatagcccccggggtcgacggtac420cccgctcgacgcgcctcgagatcctctagagtcccccgtgttctctccaaatgaaatgaa480cttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacg540tcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttt600tccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatct660tcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttccttttcc720actatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccggat780attaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttgata840tttttggagtagacaagtgtgtcgtgctccaccatgttgacgaagattttcttcttgtca900ttgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggcgagttctgttagg960tcctctatttgaatctttgactccatggcctttgattcagtgggaactacctttttagag1020actccaatctctattacttgccttggtttgtgaagcaagccttgaatcgtccatactgga1080atagtacttctgatcttgagaaatatatctttctctgtgttcttgatgcagttagtcctg1140aatcttttgactgcatctttaaccttcttgggaaggtatttgatttcctggagattattg1200ctcgggtagatcgtcttgatgagacctgctgcgtaagcctctctaaccatctgtgggtta1260gcattctttctgaaattgaaaaggctaatctggggacctgcaggcatgcaagcttagctt1320ggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaa1380tcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccga1440tcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttgga1500tcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcg1560ggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaa1620ggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaa1680agtactttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcag1740ccgtcttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagttacgcgacaggctgccgccctg1800cccttttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgcataaagtagaatacttgcgac1860tagaaccggagacattacgccatgaacaagagcgccgccgctggcctgctgggctatgcc1920cgcgtcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggc1980tgcaccaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggcc2040aggatgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctg2100gcccgcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggc2160ctgcgtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgccggccggccgcatggtgttg2220accgtgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaatcatcgaccgcacccggagc2280gggcgcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcccccgccctaccctcaccccg2340gcacagatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcg2400gctgcactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcgcacttgagcgcagcgaggaa2460gtgacgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtgaggacgcattgaccgaggcc2520gacgccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaacaagcatgaaaccgcaccagg2580acggccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcgaggcggagatgatcgcggccg2640ggtacgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccg2700gtttgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagc2760gccgccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctg2820cgtatatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgc2880tgtacttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgc2940cctgcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccg3000cgattgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgac3060gattgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgcc3120ccaggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggt3180gcagccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcg3240cattgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaagg3300cacgcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttga3360gtcccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttct3420tgaatcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaa3480atcaaaactcatttgagttaatga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