本發(fā)明屬于已知上市藥物原料藥改進(jìn)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高質(zhì)量的低分子量肝素鈣原料（又可以稱為“那曲肝素鈣”原料），可用于制備現(xiàn)有低分子量肝素鈣的水針、粉針等制劑。

背景技術(shù)：

低分子量肝素（又稱低分子肝素，low molecular weight heparin，LMWH）是一類以未分級(jí)肝素為起始物料經(jīng)過(guò)分級(jí)或降解而得到的具有較低分子量的低聚糖混合物。它具有抗Xa活性，可抑制體內(nèi)、體外血栓和動(dòng)靜脈血栓的形成，但不影響血小板聚集和纖維蛋白原與血小板的結(jié)合。它是20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)出來(lái)的抗凝藥，是由普通肝素(亦稱未分級(jí)肝素，unfractionated heparin，UFH)裂解而得。由于LMWH較UFH在低水平抗凝作用時(shí)能產(chǎn)生良好而持久的抗血栓作用，副作用較小，可用于防治深部靜脈血栓、肺栓塞、播散性血管內(nèi)凝血等疾病，因此低分子肝素成為心血管藥物的研究熱點(diǎn)。在臨床應(yīng)用上，低分子量肝素制劑具有分子小、易吸收、生物利用度高、半衰期長(zhǎng)、量效關(guān)系明確、低抗凝、高抗栓和出血副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)代替了肝素制劑的應(yīng)用。

1993年5月，LMWH首次在美國(guó)被應(yīng)用于普通的抗凝血治療，其已經(jīng)成為世界各國(guó)預(yù)防靜脈血栓栓塞癥(VTE)的標(biāo)準(zhǔn)藥物。由于LMWH是由肝素經(jīng)化學(xué)降解或酶降解得到的較低分子量的組分，LMWH具有與肝素相同的母體結(jié)構(gòu)，是一種由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸交替組成的黏多糖硫酸脂。目前，我國(guó)臨床使用LMWH制劑廠家很多，包括進(jìn)口的、合資企業(yè)的及本國(guó)化制劑。例如，低分子肝素鈣有英國(guó)葛蘭素史克集團(tuán)生產(chǎn)的那曲肝素鈣(商品名:速碧林)、浙江杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥生產(chǎn)的依諾肝素鈉(商品名:克賽)、天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的低分子量肝素鈣、瑞典法瑪西亞普強(qiáng)公司生產(chǎn)的達(dá)肝素鈉(商品名:法安明)和海南通用同盟制藥有限公司生產(chǎn)的LMWH-Ca(商品名：尤尼舒，現(xiàn)由江蘇大同盟藥業(yè)生產(chǎn))等等。

低分子量肝素鈣（又稱低分子肝素鈣，有時(shí)也被稱為那曲肝素鈣，LMWH-Ca）是LMWH中重要的一種。它在體內(nèi)外均能延緩或阻止血液凝固，其抗凝機(jī)理復(fù)雜，對(duì)凝血的各個(gè)環(huán)節(jié)均有作用，包括抑制凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?、抑制凝血酶活性、妨礙纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白、防止血小板凝聚。低分子量肝素鈣還可降低血脂，降低LDL和VLDL，升高HDL，改變血液黏滯度，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)血液流動(dòng)，改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)等作用。由于它是以鈣鹽形式在體內(nèi)發(fā)揮作用，經(jīng)皮下注射后，在血液循環(huán)中緩慢擴(kuò)散，不會(huì)減少局部細(xì)胞間毛細(xì)血管的鈣膠質(zhì)，也不改變血管通透性，幾乎無(wú)肝素鈉皮下注射引起局部出血的副作用，適用于預(yù)防和治療血栓-血栓栓塞性疾病以及血栓形成，肝素鈣還具有較明顯的抗腎素和抗醛固酮活性，因而也可用于人工腎、人工肝和體外循環(huán)使用。

LMWH的制備工藝較為特殊，追溯LMWH的研究歷史，法國(guó)塞諾菲自上世紀(jì)五十年代開(kāi)始，累計(jì)申請(qǐng)的專利多達(dá)200余項(xiàng)。國(guó)內(nèi)也有很多企業(yè)一直致力于LMWH原料和制劑的研究，因裂解方法的不同得到不同的種類的LMWH。這些報(bào)道諸如，CN101649008A公開(kāi)了一種低分子量肝素鈉鹽的生產(chǎn)工藝，它是由以低分子量肝素鈉粗品為原料生產(chǎn)低分子肝素鈉的工藝，包括：制備肝素鈉溶液、降解液、中和液、收集沉淀物、制低分子肝素鈉粗品、制低分子肝素鈉精品等工藝步驟。CN101519459A公開(kāi)了一種低分子量肝素鈉(鈣)的生產(chǎn)工藝，包括：取肝素鈉溶液，加入亞硝酸鈉溶液，進(jìn)行裂解；堿調(diào)節(jié)裂解液，再用陰離子交換柱吸附雜質(zhì)；洗滌，得到超低分子肝素鈉(鈣)；用超濾膜過(guò)濾，再用乙醇得到沉淀物；經(jīng)脫鹽，脫水后，再沉淀，經(jīng)冷凍干燥后制得成品超低分子肝素鈉(鈣)。CN101012289A公開(kāi)了一種肝素鈣生產(chǎn)工藝。它是由低分子肝素鈉轉(zhuǎn)變而來(lái)，包括解聚、還原、轉(zhuǎn)鈣，過(guò)濾、濃縮等步驟。然而，這些制備方法過(guò)程都過(guò)于繁瑣，良莠不齊。

不僅如此，藥用LMWH的生產(chǎn)和管理是非常嚴(yán)格的。英國(guó)藥典1993版開(kāi)始收載了這類品種的通則要求：重均分子量在8000以下，小于8000的級(jí)分不少于60%；抗Xa因子與抗IIa因子活性比不小于1.5。隨著不同生產(chǎn)工藝的應(yīng)用，各工藝產(chǎn)品體現(xiàn)出各自的特點(diǎn)，如存在著不同的末端結(jié)構(gòu)、分子量及其分布、抗Ⅹa因子活性、抗Ⅱa因子活性、抗Ⅹa因子與抗Ⅱa因子活性比，其藥理作用和臨床適應(yīng)癥也有所不同。EP7.0和BP2010收載了5種不同工藝的LMWH，分別是達(dá)肝素鈉（Dalteparin sodium）、依諾肝素鈉（Enoxaparin sodium）、那曲肝素鈣（Nadroparin calcium）、帕肝素鈉（Parnaparin sodium）和汀肝素鈉（Tinzaparin sodium，又名汀扎肝素）。后續(xù)的版本及其他國(guó)家采用的標(biāo)準(zhǔn)也基本上在此基礎(chǔ)上建立的，BP2010收載的五種LMWH的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與制備工藝見(jiàn)下表1。

表1：BP2010收載的五種低分子量肝素的比較

我國(guó)LMWH的藥品標(biāo)準(zhǔn)也基本上等同這些標(biāo)準(zhǔn)，但在細(xì)節(jié)上還是存在一些差距。例如，低分子量肝素鈣（WS1-(X-147)-2005Z）規(guī)定“本品系用肝素鈉經(jīng)亞硝酸裂解，精制而得的硫酸氨基葡聚糖的鈣鹽。其重均分子量小于8000，分子量小于8000的組份不少于總量的60%，按干燥品計(jì)算，每1mg中抗Xa因子效價(jià)不得少于70IU；抗Xa因子效價(jià)與抗IIa因子效價(jià)比值不得少于1.5”。其中，分子量與分子量分布的要求為，照分子排阻色譜法（中國(guó)藥典2005年版二部，附錄V H）測(cè)定，重均分子量應(yīng)小于8000，重均分子量小于8000的組份不得少于總量的60%。顯然，在重均分子量3600-5000（4300）和抗Xa因子效價(jià)上，存在明顯的差距。海南通用同盟制藥有限公司是國(guó)內(nèi)最早研究低分子量肝素鈣（LMWH-Ca）的企業(yè)之一，也是目前國(guó)內(nèi)主要的LMWH-Ca生產(chǎn)企業(yè)。經(jīng)過(guò)測(cè)定，目前國(guó)內(nèi)的低分子量肝素鈣各個(gè)廠家在重均分子量上仍然與國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)存在差異，表現(xiàn)在重均分子量會(huì)高于5000；此外，活性指標(biāo)上也存在一些問(wèn)題。雖然這也符合目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但顯然對(duì)于藥品質(zhì)量的提高非常不利的。經(jīng)過(guò)充分研究，在確保生物活性等其他指標(biāo)不變的前提下，我們得到了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種低分子量肝素鈣原料藥，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。提供一種活性高、重均分子量更合理、且工藝簡(jiǎn)單的低分子量肝素鈣及其低分子肝素鈣制品。

一種低分子量肝素鈣原料，其特征在于：制備方法包括：肝素鈉的準(zhǔn)備、酸性樹(shù)脂酸化、亞硝酸鈉裂解、氧化鈣中和、無(wú)水氯化鈣乙醇溶液醇沉、過(guò)濾干燥；

其中，亞硝酸鈉裂解中，裂解液的溶劑為終濃度15％以上的乙醇溶液（v/v）；亞硝酸鈉與肝素鈉的用量比（w/w）為2.0％以上。

優(yōu)選地，裂解液的溶劑為終濃度20％以上的乙醇溶液（v/v）；更優(yōu)選地，裂解液的溶劑為終濃度25％或30％以上的乙醇溶液（v/v）。過(guò)高的乙醇終濃度也是不利的，通常不宜高于40％乙醇溶液（v/v）。

優(yōu)選地，亞硝酸鈉與肝素鈉的用量比（w/w）為2.5％以上；更優(yōu)選地，亞硝酸鈉與肝素鈉的用量比（w/w）為3.0％或大于3.5％以上。過(guò)高的亞硝酸鈉用量也是不利的，通常亞硝酸鈉與肝素鈉的用量比（w/w）應(yīng)該為4.0％以下。

所述的酸性樹(shù)脂酸化中，用酸性樹(shù)脂調(diào)節(jié)肝素鈉溶液的pH值為2.0~2.4。

所述的氧化鈣中和中，緩慢加入氧化鈣，調(diào)節(jié)溶液PH值為6.0-6.5；所述的氯化鈣乙醇溶液醇沉：加入8-12%無(wú)水氯化鈣乙醇溶液。

此外，在氧化鈣中和步驟中，還可包括加入硼氫化鈉溶液中和未反應(yīng)的亞硝酸鈉后，再進(jìn)行過(guò)濾。即，加入適量硼氫化鈉溶液快速攪拌，并取樣檢測(cè)無(wú)亞硝酸根離子。

所述的酸性樹(shù)脂為強(qiáng)陽(yáng)離子酸性樹(shù)脂。

一種制備低分子量肝素鈣原料的方法，包括上述步驟并按照工藝邏輯順序組合而成。

一種低分子量肝素鈣制劑，由上述低分子量肝素鈣原料制備而成；所述制劑的劑型選自水針、粉針或輸液。

所述水針處方（規(guī)格1ml：5000IU）工藝如下：低分子量肝素鈣5000000anti-XaIU、注射用水加至1000ml、鹽酸或NaOH適量、分裝成1000瓶。

示例性的低分子量肝素鈣原料及其制備方法如下，其特征在于：

（1）酸化：取20.0㎏的注射用水，加入5.0㎏肝素鈉，攪拌溶解，加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂（6N鹽酸預(yù)處理好的）調(diào)節(jié)溶液的pH值為2.0~2.4，pH合格后繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)；過(guò)濾除去樹(shù)脂。（2）裂解：在攪拌下，稱取100g亞硝酸鈉，溶于10Kg的50％乙醇溶液中，加入到除去樹(shù)脂的溶液中，加畢攪拌反應(yīng)2小時(shí)，放入冰箱中低溫繼續(xù)裂解48小時(shí)；（3）中和：將裂解液自冰箱中取出，緩慢加入氧化鈣，調(diào)節(jié)溶液PH值為6.0-6.5，加入硼氫化鈉溶液中和未反應(yīng)的亞硝酸鈉后過(guò)濾；（4）醇沉：加入10%無(wú)水氯化鈣乙醇溶液，重量相當(dāng)于裂解液的2.5－3倍，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，停止攪拌靜置10小時(shí)；（5）甩濾、烘干：將上清液抽出，然后將沉淀物加入離心機(jī)進(jìn)行甩濾，甩濾結(jié)束后，真空烘干，溫度60℃,真空度0.08Mpa；時(shí)間約5小時(shí)；所得白色結(jié)晶性粉末為低分子量肝素鈣。

具體實(shí)施方式

一、測(cè)定方法

低分子量肝素鈣原料的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-147)-2005Z，低分子量肝素鈣。本品系用肝素鈉經(jīng)亞硝酸裂解，精制而得的硫酸氨基葡聚糖的鈣鹽。其重均分子量小于8000，分子量小于8000的組份不少于總量的60%，按干燥品計(jì)算，每1mg中抗Xa因子效價(jià)不得少于70IU；抗Xa因子效價(jià)與抗IIa因子效價(jià)比值不得少于1.5。其中，抗Xa因子效價(jià)測(cè)定方法如下：

溶液配制：三羥甲基氨基甲烷－氯化鈉緩沖液[ Tris-NaCl（pH7.4）]，取三羥甲基氨基甲烷6.08 g、氯化鈉8.77 g，加水500 ml使溶解，加牛血清白蛋白10 g，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.4，加水稀釋至1 000 ml，備用。三羥甲基氨基甲烷－乙二胺四醋酸二鈉緩沖液[Tris-EDTA（pH8.4）]取氯化鈉5.12 g、三羥甲基氨基甲烷3.03 g 和乙二胺四醋酸二鈉1.4 g，加水250 ml 使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至8.4，加水稀釋至500 ml，備用。標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液的配制 用Tris-Nacl緩沖液（pH7.4）分別將標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T）稀釋成4個(gè)不同濃度的溶液， 各劑量間的劑距比一般為1：0.7～1：0.6， 該濃度應(yīng)在1og 劑量-反應(yīng)的線性范圍內(nèi)，一般為1 ml 中含0.025IU ～ 0.21 IU?？鼓福ˋT III） 溶液，以三羥甲基氨基甲烷-氯化鈉緩沖液（pH7.4） 制成1 ml 中含1 IU AT III 的溶液[1]，備用。發(fā)色底物S2765 溶液 用水制成0.003 mol/L 的溶液，臨用前加三羥甲基氨基甲烷－乙二胺四醋酸二鈉緩沖液（pH8.4） 稀釋至0.0005 mol/L，備用。牛血Ⅹa 溶液（FⅩa） 溶液 用三羥甲基氨基甲烷－氯化鈉緩沖液（pH7.4）， 配制FXa

溶液，調(diào)試其濃度,使之在用0.9％氯化鈉溶液代替標(biāo)準(zhǔn)品的抗Xa 因子試驗(yàn)中， 于405 nm 的波長(zhǎng)處的吸收值在0.6 ～ 0.7，備用。

測(cè)定法：取小試管16支，分別標(biāo)記T1、T2、T3、T4及S1、S2、S3、S4。各濃度平行做兩管。每管分別加入4種濃度的供試品（T）或標(biāo)準(zhǔn)品（S）稀釋液50微升，及抗凝血酶溶液50微升，混勻，不得產(chǎn)生氣泡。按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4順序排列，37℃平衡1分鐘，加發(fā)色底物溶液250微升，混合37℃準(zhǔn)確保溫4分鐘后，各加入30％醋酸溶液375微升終止反應(yīng)。用1cm光程的半微量比色池，以三羥甲基氨基甲烷－氯化鈉緩沖液（pH7.4）為空白，在405nm的波長(zhǎng)測(cè)定每管的吸光度。以三羥甲基氨基甲烷－氯化鈉緩沖液（pH7.4）代替供試品溶液（平行做兩管）同法操作作為空白對(duì)照管，在16支管開(kāi)始和結(jié)尾時(shí)，分別測(cè)定空白對(duì)照管的吸光度。兩者的吸光度不得有顯著性差異。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液（或供試品溶液）濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別做線型回歸，按生物檢定法（中國(guó)藥典2005版二部附錄XIV）中的量反應(yīng)平行線原理4×4法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。平均可信限率（FL％）不得大于15％。

2、亞硝酸鹽的測(cè)定：取亞硝酸鈉0.750g(按干燥品計(jì)算，溶液則換算為干燥品計(jì)算)，加水溶解，稀釋至100ml，搖 勻，精密量取1ml，加水稀釋成100ml，搖勻，再精密量取1ml，加水稀 釋成50ml，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液，每1ml相當(dāng)于1μg的NO2-。取低分子量肝素鈣0.20g，加水10ml溶解后置納氏比色管中，加對(duì) 氨基苯磺酰胺的稀鹽酸溶液(1→100，即1克加入到100ml，下同)1ml 及鹽酸萘乙二胺溶液(0.1→100)1ml，產(chǎn)生的粉紅色比10ml標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸 鹽溶液(0.2ml標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液，加9.8ml無(wú)亞硝酸鹽的水)用同一方 法處理后產(chǎn)生的顏色更淺，則說(shuō)明低分子量肝素鈣的亞硝酸鹽含量小于2ppm。同法，根據(jù)稀釋倍數(shù)的不同可以測(cè)定，1、4、6、8、10 ppm的情況。

3、鈣 取本品約0.4g，精密稱定，加水100ml使溶解，加氫氧化鈉試液15ml與鈣紫紅素指示劑0.1g，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色。每1ml乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于2.004mg的Ca，按干燥品計(jì)算，本品鈣含量應(yīng)為9.5%～11.5%。

4、重均分子量 照分子排阻色譜法（中國(guó)藥典2005年版二部，附錄V H）測(cè)定，重均分子量應(yīng)小于8000，重均分子量小于8000的組份不得少于總量的60%。以對(duì)照品計(jì)算準(zhǔn)確的重均分子量，并以BP規(guī)定的3600-5000（4300）作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

5、鈉離子含量測(cè)定：采用火焰光度法測(cè)定。

二、工藝的改進(jìn)

1、改進(jìn)的基礎(chǔ)

示例性的改進(jìn)基礎(chǔ)是我公司在先專利文獻(xiàn)的工藝。（1）酸化：取30.0㎏的注射用水加入到50L經(jīng)滅菌處理的潔凈的不銹鋼桶中，然后稱取5.0㎏經(jīng)檢驗(yàn)合格的肝素鈉，攪拌下加入不銹鋼桶中使其溶解。待全部溶解后加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂（6N鹽酸預(yù)先處理好）調(diào)節(jié)溶液的pH值為2.5~2.7，pH合格后繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)。過(guò)濾除去樹(shù)脂（適量水洗滌）。（2）裂解：在攪拌下，稱取50g亞硝酸鈉分次加入除去樹(shù)脂的溶液中，約0.5小時(shí)加完，加畢繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后停止攪拌，放入冰箱中低溫繼續(xù)裂解48小時(shí)。（3）中和：將裂解液自冰箱中取出，緩慢加入氧化鈣，調(diào)節(jié)溶液PH值為6.0-6.5后過(guò)濾。（4）醇沉：在攪拌罐中加入10%無(wú)水氯化鈣乙醇溶液。重量相當(dāng)于裂解液的3倍，攪拌下緩緩加入上步裂解液，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，停止攪拌靜置10小時(shí)。（5）甩濾、烘干：將上清液抽出，然后將沉淀物加入離心機(jī)進(jìn)行甩濾，甩濾結(jié)束后，真空烘干，溫度60℃,真空度0.08Mpa。時(shí)間約5小時(shí)。所得白色結(jié)晶性粉末為低分子量肝素鈣。得到低分子肝素鈣3000克。

經(jīng)過(guò)測(cè)定，抗Xa 因子134 IU/mg，亞硝酸鹽<4ppm，鈉/鈣離子含量比（wt％）1.5％，重均分子量為4978，其他指標(biāo)也均符合WS1-(X-147)-2005Z的規(guī)定。

二、改進(jìn)的方式

我們認(rèn)為，亞硝酸裂解是決定低分子肝素的重均分子量及活性的關(guān)鍵因素。裂解的pH越低，裂解越徹底，但會(huì)大量增加<2000的片段，并降低活性；反之，pH越高，則重均分子量過(guò)大。裂解亞硝酸鈉的用量也至為重要，在pH值等其他條件不變的情況下，亞硝酸用量越多，裂解越徹底，但會(huì)大量增加<2000的片段，并降低活性；反之，亞硝酸用量過(guò)少，則達(dá)不到裂解的預(yù)期。

我們發(fā)現(xiàn)，用加入部分乙醇作為作為裂解液則可以很好的化解上述矛盾，而且能在較寬的范圍中獲得較好的重均分子量及活性的效果。一方面，乙醇的加入可以提高初始的pH至2.0-2.4，使得裂解徹底的同時(shí)，不會(huì)導(dǎo)致<2000的片段的明顯增加；另一方面，乙醇的加入可以提高亞硝酸鈉的用量至2.0％以上，使得裂解徹底的同時(shí)，不會(huì)導(dǎo)致<2000的明顯片段的增加。通過(guò)乙醇存在下的裂解反應(yīng)，控制pH2.0-2.4和亞硝酸鈉用量，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

實(shí)施例1：（1）酸化：取24.0㎏的注射用水加入到50L經(jīng)滅菌處理的潔凈的不銹鋼桶中，然后稱取5.0㎏肝素鈉，攪拌下加入不銹鋼桶中使其溶解；加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂（6N鹽酸預(yù)先處理好）調(diào)節(jié)溶液的pH值為2.0~2.4，pH合格后繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)；過(guò)濾除去樹(shù)脂（適量水洗滌樹(shù)脂）。（2）裂解：在攪拌下，稱取100g亞硝酸鈉溶于6Kg的50％乙醇（v/v）溶液中，加入到除去樹(shù)脂的溶液中，加畢攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后停止攪拌，放入冰箱中低溫繼續(xù)裂解48小時(shí)；（3）中和：將裂解液自冰箱中取出，緩慢加入氧化鈣，調(diào)節(jié)溶液PH值為6.0-6.5，加入硼氫化鈉溶液中和未反應(yīng)的亞硝酸鈉后過(guò)濾；（4）醇沉：在攪拌罐中加入10%無(wú)水氯化鈣乙醇溶液，重量相當(dāng)于裂解液的3倍，攪拌下緩緩加入上步裂解液，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，停止攪拌靜置10小時(shí)；（5）甩濾、烘干：將上清液抽出，然后將沉淀物加入離心機(jī)進(jìn)行甩濾，甩濾結(jié)束后，真空烘干，溫度60℃,真空度0.08Mpa；時(shí)間約5小時(shí)；所得白色結(jié)晶性粉末為低分子量肝素鈣。得到低分子量肝素鈣2500克。

實(shí)施例2：（1）酸化：取20.0㎏的注射用水加入到50L經(jīng)滅菌處理的潔凈的不銹鋼桶中，然后稱取5.0㎏肝素鈉，攪拌下加入不銹鋼桶中使其溶解；加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂（6N鹽酸預(yù)先處理好）調(diào)節(jié)溶液的pH值為2.0~2.4，pH合格后繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)；過(guò)濾除去樹(shù)脂（適量水洗滌樹(shù)脂）。（2）裂解：在攪拌下，稱取100g亞硝酸鈉溶于10Kg的50％乙醇（v/v）溶液中，加入到除去樹(shù)脂的溶液中，加畢攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后停止攪拌，放入冰箱中低溫繼續(xù)裂解48小時(shí)；（3）中和：將裂解液自冰箱中取出，緩慢加入氧化鈣，調(diào)節(jié)溶液PH值為6.0-6.5，加入硼氫化鈉溶液中和未反應(yīng)的亞硝酸鈉后過(guò)濾；（4）醇沉：在攪拌罐中加入10%無(wú)水氯化鈣乙醇溶液。重量相當(dāng)于裂解液的3倍，攪拌下緩緩加入上步裂解液，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，停止攪拌靜置10小時(shí)；（5）甩濾、烘干：將上清液抽出，然后將沉淀物加入離心機(jī)進(jìn)行甩濾，甩濾結(jié)束后，真空烘干，溫度60℃,真空度0.08Mpa；時(shí)間約5小時(shí)；所得白色結(jié)晶性粉末為低分子量肝素鈣。得到低分子量肝素鈣2850克。

實(shí)施例3：（1）酸化：取19.0㎏的注射用水加入到50L經(jīng)滅菌處理的潔凈的不銹鋼桶中，然后稱取5.0㎏肝素鈉，攪拌下加入不銹鋼桶中使其溶解；加入強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂（6N鹽酸預(yù)先處理好）調(diào)節(jié)溶液的pH值為2.0~2.4，pH合格后繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)；過(guò)濾除去樹(shù)脂（適量水洗滌樹(shù)脂），緩慢加入1L乙醇。（2）裂解：在攪拌下，稱取100g亞硝酸鈉溶于10Kg的50％乙醇（v/v）溶液中，加入到除去樹(shù)脂的溶液中，加畢攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后停止攪拌，放入冰箱中低溫繼續(xù)裂解48小時(shí)；（3）中和：將裂解液自冰箱中取出；緩慢加入氧化鈣，調(diào)節(jié)溶液PH值為6.0-6.5，加入硼氫化鈉溶液中和未反應(yīng)的亞硝酸鈉后過(guò)濾；（4）醇沉：在攪拌罐中加入10%無(wú)水氯化鈣乙醇溶液。重量相當(dāng)于裂解液的2.5-3倍，攪拌下緩緩加入上步裂解液，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，停止攪拌靜置10小時(shí)；（5）甩濾、烘干：將上清液抽出，然后將沉淀物加入離心機(jī)進(jìn)行甩濾，甩濾結(jié)束后，真空烘干，溫度60℃,真空度0.08Mpa；時(shí)間約5小時(shí)；所得白色結(jié)晶性粉末為低分子量肝素鈣。得到低分子量肝素鈣2950克。

實(shí)施例4 檢驗(yàn)和比較

（1）從產(chǎn)率來(lái)看，實(shí)施例1的產(chǎn)率比較低，得率僅為50％?？赡芘c乙醇濃度較低有關(guān)，在酸濃度較高（pH較低）、且亞硝酸鈉用量較大的情況下，肝素鈉被過(guò)渡裂解，從而使得產(chǎn)率較低。相應(yīng)地，實(shí)施例2和3 比較高，與改進(jìn)之前的工藝相當(dāng)。

（2）抗Xa 因子上，實(shí)施例1的101 IU/mg，而實(shí)施例2和3分別為115 IU/mg和112 IU/mg。相對(duì)而言，實(shí)施例2和3的活性更高。

（3）重均分子量，以那曲肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。實(shí)施例1的小分子片段較多，重均分子量為3720，而實(shí)施例2和3分別為3951和4095。

綜上，實(shí)施例2和3的獲得產(chǎn)品更接近那曲肝素鈣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這有利于該產(chǎn)品保持與國(guó)外制劑及其標(biāo)準(zhǔn)的一致性。本發(fā)明通過(guò)一定濃度范圍的乙醇存在下，實(shí)現(xiàn)了較低pH區(qū)域及較高用量的亞硝酸裂解，制備得到符合標(biāo)準(zhǔn)的低分子量肝素鈣制劑。

實(shí)施例5：注射劑處方和制備工藝

處方（規(guī)格1ml：5000IU）：低分子量肝素鈣5000000anti-XaIU、注射用水加至1000ml、鹽酸或NaOH適量、分裝成1000瓶。

此為注射液的配方，不含有其它輔料。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，低分子肝素鈣本身存在較好的緩沖能力，故無(wú)須選擇其它pH緩沖劑。

制備工藝：1.1 安瓿的洗滌，安瓿經(jīng)超聲波清洗注射用水沖淋,壓縮空氣吹干后,進(jìn)入隧道烘箱滅菌，備用。1.2 配液，稱取處方量的低分子肝素鈣，加入處方量的注射用水，攪拌使其完全溶解，用0.5M的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值5.0～8.0，經(jīng)用0.45μm微孔濾膜精濾；0.22um的濾膜除菌過(guò)濾，取濾液送檢，合格后待用。1.3 分裝，將經(jīng)洗凈滅菌后的空安瓿和檢驗(yàn)合格的藥液傳入分裝間，調(diào)試分裝機(jī)正常后按注射液的分裝規(guī)程進(jìn)行分裝，分裝同時(shí)熔封。1.4 檢漏：檢漏剔除破損不合格品。最終，成品檢驗(yàn)符合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)。