本發(fā)明涉及植物內(nèi)生真菌產(chǎn)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高效產(chǎn)紫杉醇真菌棘孢曲霉tax-6及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是21世紀(jì)威脅人類健康的三大殺手之一，據(jù)全國腫瘤登記中心調(diào)查顯示，自2013年以來我國每年新發(fā)癌癥病例超過300萬人，因此尋找高效抗癌藥物的任務(wù)也迫在眉睫。紫杉醇（taxol）最初是從紅豆杉屬（taxusspp.）植物中分離得到的一種具有獨特抗癌作用的二萜類化合物，它作用于細胞微管，通過與微管蛋白n端第31位氨基酸和第217~231位氨基酸結(jié)合，誘導(dǎo)和穩(wěn)定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合速度，使維管束不能與微管組織中心相互連接，導(dǎo)致有絲分裂異常或停止，組織癌細胞增殖。它具有很高的開發(fā)利用價值，是目前世界主流的抗癌藥物之一。

據(jù)who組織統(tǒng)計：世界癌癥的年并發(fā)人數(shù)達到1000多萬并還在以每年20%的速度遞增，要治療這些癌癥患者每年需要4000~4600kg紫杉醇，而全世界每年可生產(chǎn)紫杉醇300~500kg，預(yù)計消耗紅豆杉樹皮越700t，即使全球紅豆杉資源采伐完畢也僅能滿足一時之需。因此尋求紫杉醇的新資源是目前研究的重點。

近20多年來，科研工作者先后開發(fā)出了以下幾種紫杉醇獲取的新途徑：紫杉醇全合成、半合成，細胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵等。化學(xué)合成過程復(fù)雜，收率太低，不僅需要昂貴的化學(xué)試劑且反應(yīng)難以控制，與工業(yè)要求相去甚遠；而由于植物細胞遺傳與生理的不穩(wěn)定性、細胞間的不一致性使得在培養(yǎng)工程中高產(chǎn)細胞系不能實現(xiàn)高產(chǎn)率，而且易發(fā)生遺傳變異產(chǎn)生其他代謝物，另外植物細胞培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜，對反應(yīng)器要求高，阻礙了通過細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的實現(xiàn)。相較之下，1991年美國蒙大拿州立大學(xué)植物病理系化學(xué)家andrestierle博士從短葉紅豆杉皮部分分離得到了一株能產(chǎn)紫杉醇的真菌taxomycesandreanae。紫杉醇野生菌的發(fā)現(xiàn)為紫杉醇資源提供了一種新途徑。由于微生物可在發(fā)酵罐中進行，容易擴大生產(chǎn)，有利于實現(xiàn)工業(yè)化。因此，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇被認為是最有可能一勞永逸的解決資源保護和降低醫(yī)療成本的方法。

自stierle博士開啟了這扇大門以來，全世界大量的研究者投入到了此研究領(lǐng)域。1996年strobel等從西藏紅豆杉中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生小孢擬盤多毛孢（pestalotiopsismicrospora），這種真菌產(chǎn)紫杉醇的量為50μg/l；以及尼泊爾盤端角（seimatoantleriumnepalense），其產(chǎn)量為62~80μg/l；從南方紅豆杉中分離得到了一株瘤座菌屬（tuberculariasp.）真菌，紫杉醇產(chǎn)量為185.4μg/l。產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的宿主廣泛，目前全世界以獲得了近百種產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，它被認為是最有希望實現(xiàn)紫杉醇資源可持續(xù)利用的方法之一。然而目前該技術(shù)的瓶頸在于篩選出的內(nèi)生真菌產(chǎn)量偏低，達不到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株新的高效產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌棘孢曲霉tax-6。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用該產(chǎn)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌棘孢曲霉tax-6液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一株高效產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，其分類命名為棘孢曲霉tax-6（aspergillusaculeatinus）tax-6，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2016614，保藏日期為2016年11月3日，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。

所述的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌棘孢曲霉tax-6在制備紫杉醇的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，制備紫杉醇的方法為液態(tài)發(fā)酵。

所述的應(yīng)用，制備微生物油脂的原料為pda培養(yǎng)基。

所述的液態(tài)發(fā)酵為：從4℃冰箱中取出保存有aspergillusaculeatinustax-6的pda平板，于28℃生化培養(yǎng)箱中，活化菌種2-3天；在滅菌臺上，向已活化過的平板中加無菌水，用接種針輕輕地將菌絲上孢子刮于無菌水中，混勻，無菌過濾，制成孢子懸液，用無菌槍頭吸取孢子懸液，接種到含有100mlpdb液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，接種好的錐形瓶放置于120rpm、30℃搖床中培養(yǎng)。

所述的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選6-12天，最優(yōu)選7天。

所述的應(yīng)用，從發(fā)酵液中提取紫杉醇的方法為：用四層紗布過濾發(fā)酵液取液體部分，加入正己烷萃取，保留水相；用等體積的二氯甲烷萃取發(fā)酵液中的紫杉醇，萃取數(shù)次，合并有機相；將得到的有機相蒸干得固體產(chǎn)物，用二氯甲烷溶解得到的固體產(chǎn)物，再蒸干后加入甲醇溶解獲得紫杉醇甲醇溶液。其中，正己烷萃取一次，萃取20min。二氯甲烷萃取3次，每次30min。

棘孢曲霉tax-6是從安徽省曼地亞紅豆杉樹皮中分離篩選所得，如圖5所示，菌株tax-6中心部分是黃褐色的孢子，周圍一圈為白色的菌絲。孢子是單一、透明的球狀，直徑在40-50μm；分身孢子梗是平滑的圓柱形，直徑為8-15μm。

提取棘孢曲霉tax-6菌株的基因組dna，使用真菌通用引物its1和its4進行pcr擴增，將得到的pcr堿基序列（seqidno.1所示）在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行同源序列分析，所得結(jié)果被鑒定為一株新的棘孢曲霉，命名為棘孢曲霉（aspergillusaculeatinus）tax-6。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的篩選出了一種全新的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌棘孢曲霉tax-6，通過液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇，在培養(yǎng)7天之后紫杉醇的產(chǎn)量達到334.92μg/l，具有發(fā)酵培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量高的優(yōu)點，具有很好的工業(yè)化前景。本發(fā)明利用紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇，即低價獲得了高效抗癌藥物又保護了紅豆杉這一珍稀物種，具有很好的實用性。

附圖說明

圖1是aspergillusaculeatinustax-6的發(fā)酵產(chǎn)物及紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖；

圖2是aspergillusaculeatinustax-6的發(fā)酵產(chǎn)物的hplc-ms圖；

圖3是紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc-ms圖；

圖4是aspergillusaculeatinustax-6的紫杉醇產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間變化結(jié)果圖。

圖5是aspergillusaculeatinustax-6在pda培養(yǎng)基上生長3天后的生長形態(tài)及掃面電鏡圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：從4℃冰箱中取出保存有aspergillusaculeatinustax-6的pda平板于28℃生化培養(yǎng)箱中，活化菌種2-3天。在滅菌臺上，向已活化過的平板中加20ml左右的無菌水，用接種針輕輕地將菌絲上孢子刮于無菌水中，混勻，無菌過濾，制成孢子懸液（約1×10⁷spores/ml）。用無菌槍頭吸取2ml的孢子懸液接種到含有100mlpda固體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，接種好的錐形瓶放置于120rpm、30℃搖床中培養(yǎng)。

紫杉醇的提?。河盟膶蛹啿歼^濾發(fā)酵液取液體部分，加入10ml正己烷萃取20min去除其中脂肪酸等雜質(zhì)，保留水相。用等體積的二氯甲烷萃取發(fā)酵液中的紫杉醇，萃取3次每次30min，合并有機相。將得到的有機相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45℃下蒸干，用5ml二氯甲烷溶解粘在壁上的不溶物，將5ml二氯甲烷蒸干并加入1ml甲醇定容，最后的產(chǎn)物過微孔濾膜保存在液相瓶中。

aspergillusaculeatinustax-6的發(fā)酵產(chǎn)物及紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖如圖1所示，可以看出，aspergillusaculeatinustax-6的發(fā)酵產(chǎn)物（圖a）在9.963±0.01min處有明顯響應(yīng)，與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（圖b）的出峰時間一致，初步判斷能產(chǎn)紫杉醇。

aspergillusaculeatinustax-6的發(fā)酵產(chǎn)物的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜，如圖2所示，aspergillusaculeatinustax-6的發(fā)酵產(chǎn)物的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜顯示，以na⁺轟擊后，發(fā)酵產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品（圖3）具有一樣的特征峰（（m+na）⁺=876），進一步說明aspergillusaculeatinustax-6可以產(chǎn)紫杉醇。

aspergillusaculeatinustax-6的紫杉醇產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間變化結(jié)果，如圖4所示，可以看出，紫杉醇在第5天開始快速積累，并且在第7天達到最大值334.92μg/l之后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。而真菌生物質(zhì)量呈現(xiàn)出一個緩慢上升最終逐漸趨于平穩(wěn)的狀態(tài)。

sequencelisting

<110>南京林業(yè)大學(xué)

<120>一株高效產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌棘孢曲霉tax-6及其應(yīng)用

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