本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及尿液核酸快速提取試劑盒。本發(fā)明還涉及使用磁珠法提取尿液中DNA的方法。

背景技術(shù)：

在現(xiàn)代疾病診斷當(dāng)中，核酸占據(jù)著非常重要的地位，其中DNA的作用更顯突出，尿液中提取DNA來進(jìn)行疾病檢測在現(xiàn)代疾病檢測中起著越來越重要的作用。在PCR分子診斷過程中，獲得的DNA的總拷貝數(shù)和質(zhì)量會直接影響到后續(xù)檢驗實驗的結(jié)果。而尿液樣本中的PCR抑制物含量高，含有尿素、尿酸等多種雜質(zhì)，這些雜質(zhì)對常規(guī)的核酸提取起到很大的抑制作用，使得核酸提取的效率極低。所以，從尿液中獲得有效、可靠的DNA是PCR分子診斷在尿液PCR應(yīng)用中的關(guān)鍵。

雖然傳統(tǒng)的酚氯仿提取核酸的方法能夠獲得質(zhì)量較好的核酸，但是其中用到的化學(xué)物質(zhì)卻有著不可忽視的毒性，而且整個提取過程耗時較長，浪費大量的時間和人力物力。進(jìn)一步來說，現(xiàn)在普及的柱提法核酸提取試劑也能獲得質(zhì)量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗費的時間同樣不可忽視。

除去毒性和時間的因素以外，這兩種試劑提取核酸的操作當(dāng)中免不了各種洗滌液的添加和丟棄，這個過程極其容易導(dǎo)致樣本之間的交叉污染。當(dāng)樣本量較多的情況下，還容易出錯，致使工作效率低下。所以，發(fā)明一種快速、高效和操作方便的DNA提取方法勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供尿液核酸快速提取試劑盒：操作簡單，可實現(xiàn)自動化提取，大幅減少了人工操作時間，提高了工作效率，降低了人為操作和實驗產(chǎn)生的誤差。

該試劑盒是由裂解結(jié)合液、蛋白酶K、結(jié)合液、磁珠、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液組成。其中裂解液中含有 Tris-HCl、鹽酸胍、氫氧化鈉、Nonidet P 40、異丙醇；洗滌液1含有 Tris-HCl、乙醇；洗滌液2中含有CaCl₂、乙醇；所述磁珠洗脫液中含有Tris-HCl、EDTA-2Na。

所述裂解液中：Tris-HCl的濃度為10mmol/L，pH為3.3；鹽酸胍的濃度為2.5mol/L；氫氧化鈉濃度為5mmol/L；NP-40的濃度為13%；異丙醇含量為33%。

所述洗滌液1中：Tris-HCl的濃度為60mmol/L，pH為7.5；乙醇的濃度為40%。

所述洗滌液2中：CaCl₂的濃度為5mmol/L；乙醇的濃度為80%。

所述洗脫液中：Tris-HCl的濃度為20mmol/L，pH為8；EDTA-2Na的濃度為2mmol/L。

所述試劑盒采用96孔預(yù)分裝深孔板模式，第1列和第7列預(yù)分裝的是裂解液；第2列和第8列預(yù)分裝的是洗滌液1；第3、4列和第9、10列預(yù)分裝的是洗滌液2；第5列和第11列預(yù)分裝的是磁珠；第6列和第12列預(yù)分裝的是洗脫液。

所述試劑盒采用熱封膜工藝進(jìn)行封裝，可有效防止96深孔板中的提取試劑漏液。

一種尿液核酸快速提取試劑盒的提取方法，包括以下步驟：

1：將96孔預(yù)分裝深孔板上下顛倒混勻，置于離心機(jī)中，1000rpm瞬時離心10秒，使液體落回至分裝板底部。

2：將96孔預(yù)分裝深孔板的封膜小心撕開，在預(yù)分裝板的第1列和第7列加入200μl的樣本和20μl的蛋白酶K。

3：將8孔磁套棒和96孔預(yù)分裝深孔板置于smart32核酸提取儀器中后，啟動程序開始提取。

4：提取結(jié)束后，第6列和第12列中即為核酸溶液。

本發(fā)明的主要優(yōu)勢在于：

（1）提高提取效率

與常規(guī)磁珠法提取試劑相比，本試劑盒中含有的裂解結(jié)合液，能夠強(qiáng)力快速裂解樣本釋放大量的DNA，并能夠抗拒尿液樣本中的抑制物質(zhì)干擾，同時對釋放出來的DNA進(jìn)行結(jié)合，一個步驟中完成裂解和結(jié)合兩大功能，確保高效地完成核酸捕獲。

（2）縮短提取時間

本試劑盒采用的是96孔預(yù)分裝深孔板模式，人工操作時間只有幾分鐘，32個樣本的提取全程能在40min以內(nèi)完成，相對于柱提法等傳統(tǒng)試劑，大大縮減了提取所需時間。

（3）自動化程度高，減少人為失誤和實驗誤差

本試劑盒采用的是96孔預(yù)分裝深孔板模式，除加樣外其他實驗操作均由儀器完成，大大解放了人力，并降低了操作中帶入的人為失誤和誤差。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明方法提取核酸時使用的96 孔深孔板的俯視圖；

圖2 為按照本發(fā)明方法向96孔深孔板各排中注入試劑的示意圖。

具體實施方式：

1.尿液核酸快速提取試劑盒的配制方法：

a.裂解結(jié)合液的配置：先在容量瓶中加入稱取的異硫氰酸胍并加入適量的滅菌純水進(jìn)行溶解，加入終濃度為10mmol/L、pH為3.3 Tris-HCl；加入終濃度為5mmol/L氫氧化鈉；待異硫氰酸胍全溶解后，加入終濃度為13% NP-40混勻，加入無菌水至所需體積。

b.洗滌液1的配置：先在容量瓶中加入少量無菌水，加入濃度為60mmol/L、pH為7.5的Tris-HCl；加入終濃度為40%乙醇；混勻，加入無菌水至所需體積。

c.洗滌液2的配置：先在容量瓶中加入少量無菌水，加入終濃度為5mmol/LCaCl₂；加入終濃度為80%乙醇；混勻，加入無菌水至所需體積。

d.洗脫液的配置：先在容量瓶中加入少量無菌水，加入終濃度為20mmol/L、pH為8.3 的Tris-HCl；加入終濃度為2mmol/L EDTA-2Na的；混勻，加入無菌水至所需體積。

第1列和第7列預(yù)分裝的是裂解結(jié)合液；第2列和第8列預(yù)分裝的是洗滌液1；第3、4列和第9、10列預(yù)分裝的是洗滌液2；第5列和第11列預(yù)分裝的是磁珠；第6列和第12列預(yù)分裝的是洗脫液。

e.往96 孔深孔板的第1列和第7列預(yù)分裝裂解結(jié)合液；第2列和第8列預(yù)分裝洗滌液1；第3、4列和第9、10列預(yù)分裝洗滌液2；第5列和第11列預(yù)分裝磁珠；第6列和第12列預(yù)分裝洗脫液。

f.封膜：在熱封儀上，利用熱封儀將96孔板封住。

2. 尿液核酸快速提取試劑盒的應(yīng)用

以HCMV陽性和陰性尿液為樣本，先將預(yù)分裝深孔板顛倒混勻后瞬時離心10秒，隨后小心撕開封膜，并在其第1列和第7列加入200μl的樣本和50μl的蛋白酶K。然后按照下面表格在核酸提取儀器上設(shè)置提取程序，然后進(jìn)行核酸提取。提取程序運(yùn)行完成后取出預(yù)分裝深孔板，其中第6列和第12列中的溶液即為核酸溶液。

3.實施例

兩種試劑盒對尿液樣本進(jìn)行核酸提取比較

以4個HCMV陽性尿液樣本和2個HCMV陰性尿液樣本為樣測試本，分別用本發(fā)明所述試劑盒和Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit試劑盒進(jìn)行核酸提取對比。

本發(fā)明所述試劑盒提取：按實施例2所述進(jìn)行核酸提??；Epigentek公司的試劑盒提?。簢?yán)格按照Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit試劑盒的說明書進(jìn)行核酸提取。

將本發(fā)明所述試劑盒和Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit提取的核酸進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如表1所示。從表中結(jié)果可以看到，本發(fā)明所述試劑盒的提取效率高。

表1為本試劑盒與Epigentek公司的FitAmp Urine DNA Isolation Kit提取效率比較結(jié)果。

表1