本發(fā)明涉及工業(yè)生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種提高Vc二步產(chǎn)酸菌生產(chǎn)能力的方法。
背景技術(shù)：
維生素C(Vitamin C,簡(jiǎn)稱Vc)，又稱L-抗壞血酸(L-Ascorbic Acid)，是一種植物體內(nèi)常見、人類無(wú)法自身合成的維生素。Vc具有多種功能，廣泛應(yīng)用于藥品、食品、飼料和化妝品領(lǐng)域，市場(chǎng)需求巨大。Vc二步發(fā)酵法是目前工業(yè)上制備Vc前體—古龍酸的主要方法。Vc二步發(fā)酵系兩種菌的混合發(fā)酵，一種為產(chǎn)酸菌，通過(guò)酶催化山梨糖為古龍酸，俗稱“產(chǎn)酸”，但產(chǎn)酸菌自身不能單獨(dú)培養(yǎng)，需依賴另外一種伴生菌的存在才能生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)酸；另一種為伴生菌，伴生菌不產(chǎn)酸，但可為產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸提供保障。在發(fā)酵時(shí)兩種菌需要混和培養(yǎng)，并且相互間要保持一定的動(dòng)態(tài)平衡，才能較好地完成菌體生長(zhǎng)和糖酸轉(zhuǎn)化。但兩種菌的生物學(xué)特征不同，生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)需求也不一樣。所以，這種產(chǎn)酸菌對(duì)伴生菌的高度依賴性同時(shí)又伴有較強(qiáng)負(fù)面影響，如伴生菌與產(chǎn)酸菌間競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位等，常常使產(chǎn)酸菌的數(shù)量和活性受到壓制。所以，在培養(yǎng)或發(fā)酵時(shí)需要同時(shí)兼顧兩者的各自需求，實(shí)現(xiàn)起來(lái)十分不易。在實(shí)踐操作中，往往會(huì)顧此失彼，導(dǎo)致產(chǎn)酸菌和伴生菌間生長(zhǎng)失衡。因此，該工藝的過(guò)程可控性差、批次波動(dòng)大、整體收率低、生產(chǎn)能力難以進(jìn)一步提高。所以，處理好兩種菌在混和發(fā)酵時(shí)的相互關(guān)系，研發(fā)出一種操作簡(jiǎn)便、安全性高、發(fā)酵期短、回收率高、產(chǎn)品質(zhì)量好、成本低廉、綠色環(huán)保的Vc古龍酸發(fā)酵新技術(shù)，是目前Vc混菌工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域一個(gè)亟待解決的難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種提高Vc二步發(fā)酵產(chǎn)酸菌生產(chǎn)能力的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
一種提高Vc二步發(fā)酵產(chǎn)酸菌生產(chǎn)能力的方法，包括以下具體步驟：
(1)將伴生菌在種子培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)至穩(wěn)定末期，所得培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞破碎，制成活性蛋白液；其中，所述菌種細(xì)胞破碎的方法包括超聲、壓榨、研磨或酶解；
(2)將產(chǎn)酸菌的菌種懸液，接入內(nèi)含上述活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵獲得產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液；
(3)將所述產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液接入內(nèi)含上述活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行產(chǎn)酸菌發(fā)酵并對(duì)山梨糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，至發(fā)酵結(jié)束獲得古龍酸。
所述步驟(1)中種子培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量含量為0.5-1.2％，所述發(fā)酵至穩(wěn)定末期發(fā)酵液中伴生菌濃度為1-9×108CFU/ml。
所述步驟(2)中產(chǎn)酸菌的菌種懸液接入內(nèi)含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為體積含量的1-15％；所述產(chǎn)酸菌的菌種懸液中，產(chǎn)酸菌的濃度為1-9×109CFU/ml。
優(yōu)選所述步驟(2)中產(chǎn)酸菌的菌種懸液接入內(nèi)含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為體積含量的3-8％；所述產(chǎn)酸菌的菌種懸液中，產(chǎn)酸菌的濃度為4-9×109CFU/ml。
所述步驟(2)中，產(chǎn)酸菌的菌種懸液接入內(nèi)含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中活性蛋白液的體積含量為0.2-2.4％，優(yōu)選為1.2％。
所述步驟(3)中產(chǎn)酸菌的菌種懸液接入內(nèi)含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為體積含量的2-10％，優(yōu)選為5％；所述產(chǎn)酸菌的發(fā)酵種液中，產(chǎn)酸菌的濃度為1-9×109CFU/ml。
所述步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中活性蛋白液的體積含量為0.2-1.2％，優(yōu)選為0.5％。
所述步驟(3)中，在發(fā)酵中期時(shí)補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基體積含量0.05-0.5％的活性蛋白液；優(yōu)選補(bǔ)加體積含量為0.1-0.3％的活性蛋白液。
所述伴生菌選自巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、擲孢酵母或啤酒酵母中的一種或幾種；所述產(chǎn)酸菌選自生酮基古龍酸菌。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
本發(fā)明方法具備單菌種(即產(chǎn)酸菌)發(fā)酵的特征，可極大地提高發(fā)酵過(guò)程的可控性和生產(chǎn)效率，有著操作簡(jiǎn)便、安全性高、收率高、發(fā)酵周期短、產(chǎn)品質(zhì)量好、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，適合在Vc發(fā)酵制備古龍酸的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用；具體為：
(1)本發(fā)明改變Vc二步雙菌種混合發(fā)酵為單菌種發(fā)酵，排除產(chǎn)酸菌種對(duì)伴生菌的過(guò)度依賴。
(2)本發(fā)明中產(chǎn)酸菌和伴生菌各自單獨(dú)培養(yǎng)，排除混合培養(yǎng)時(shí)之間的干擾，最大程度地滿足各自的最佳需求，保障了活性蛋白的充足供應(yīng)，使新種液質(zhì)量得到大幅提升，保障發(fā)酵的快速啟動(dòng)及后續(xù)的高效進(jìn)行。
(3)本發(fā)明發(fā)酵過(guò)程中的管理和調(diào)節(jié)得以規(guī)范化和簡(jiǎn)便化，生產(chǎn)得以穩(wěn)定、高效進(jìn)行。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將有助于對(duì)本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。下述各實(shí)施例中的發(fā)酵條件，無(wú)需特殊限定，按照現(xiàn)階段通用的Vc發(fā)酵條件即可。
實(shí)施例1
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質(zhì)量含量為0.5％的種子培養(yǎng)基，接入150ml濃度為2×108CFU/ml的巨大芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達(dá)3.6×108CFU/ml，再以25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述活性蛋白液，接入內(nèi)含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐中，再接入400ml菌濃度為3×109CFU/ml的產(chǎn)酸菌懸液(產(chǎn)酸菌為生酮基古龍酸菌)，發(fā)酵至菌濃度達(dá)4.5×109CFU/ml，得到產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液。(3)取上述產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液15L接入內(nèi)含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)所獲活性蛋白液的500L發(fā)酵罐，對(duì)山梨糖進(jìn)行發(fā)酵至發(fā)酵結(jié)束，在發(fā)酵醪液中獲得古龍酸。
在同等條件下，采用實(shí)施例1的Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統(tǒng)的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高2個(gè)百分點(diǎn)，即收率為93％，發(fā)酵周期縮短6％。
實(shí)施例2
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質(zhì)量含量為0.5％的種子培養(yǎng)基，接入150ml菌濃度為2×108CFU/ml的巨大芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達(dá)3.6×108CFU/ml。25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述獲得活性蛋白液，接入內(nèi)含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入400ml菌濃度為3×109CFU/ml的產(chǎn)酸菌懸液(產(chǎn)酸菌為生酮基古龍酸菌)，發(fā)酵至菌濃度達(dá)4.5×109CFU/ml，得到產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液。
(3)取上述產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液15L接入內(nèi)含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐對(duì)山梨糖進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20小時(shí)至發(fā)酵中期，再補(bǔ)加500ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，至發(fā)酵結(jié)束，在發(fā)酵醪液中獲得古龍酸。
在同等條件下，采用實(shí)施例二的Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統(tǒng)的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高2.6個(gè)百分點(diǎn)，即收率為93.6％，發(fā)酵周期縮短8％。
實(shí)施例3
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質(zhì)量含量為0.6％的種子培養(yǎng)基，接入200ml濃度為3×108CFU/ml的蠟狀芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達(dá)5.5×108CFU/ml。25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述獲得的活性蛋白液，接入內(nèi)含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入400ml濃度為2.5×109CFU/ml的產(chǎn)酸菌懸液(產(chǎn)酸菌為生酮基古龍酸菌)，發(fā)酵至菌濃度達(dá)4×109CFU/ml，得到產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液。
(3)取上述產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液15L接入內(nèi)含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐，對(duì)山梨糖進(jìn)行發(fā)酵至結(jié)束，得到古龍酸。
在同等條件下，采用實(shí)施例三的Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統(tǒng)的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高3.2個(gè)百分點(diǎn)，即收率為94.2％，發(fā)酵周期縮短6％。
實(shí)施例4
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質(zhì)量含量為0.6％的種子培養(yǎng)基，接入200ml濃度為3×108CFU/ml的蠟狀芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達(dá)5.5×108CFU/ml。25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述獲得的活性蛋白液，接入內(nèi)含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入400ml菌濃度為2.5×109CFU/ml的產(chǎn)酸菌懸液，產(chǎn)酸菌為生酮基古龍酸菌，發(fā)酵至菌濃度達(dá)4×109CFU/ml，得到產(chǎn)酸菌發(fā)酵種液。
(3)取所述種液15L接入內(nèi)含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐對(duì)山梨糖進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20小時(shí)至發(fā)酵中期，再補(bǔ)加500ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，繼續(xù)發(fā)酵至結(jié)束，得到古龍酸。
在同等條件下，采用實(shí)施例四，Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統(tǒng)的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高3.5百分點(diǎn)，即收率為94.5％，發(fā)酵周期縮短8％。
實(shí)施例5
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質(zhì)量含量為0.5％的種子培養(yǎng)基，接入150ml菌濃度為3.5×108CFU/ml的蘇云金芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達(dá)9×108CFU/ml。再經(jīng)酶解得活性蛋白液。
(2)取30ml上述獲得的活性蛋白液，接入內(nèi)含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入300ml菌濃度為4×109CFU/ml的產(chǎn)酸菌懸液，產(chǎn)酸菌為生酮基古龍酸菌，發(fā)酵至菌濃度達(dá)9×109CFU/ml，得到種液。
(3)取所述種液12L接入內(nèi)含600L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.2L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的1000L發(fā)酵罐對(duì)山梨糖進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20小時(shí)至發(fā)酵中期，再補(bǔ)加300ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，至發(fā)酵結(jié)束，在發(fā)酵醪液中得到古龍酸。
在同等條件下，采用實(shí)施例五，Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統(tǒng)的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高2.7百分點(diǎn)，即收率為93.7％，發(fā)酵周期縮短6％。
實(shí)施例6
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質(zhì)量含量為1.2％的種子培養(yǎng)基，接入150ml菌濃度為5×107CFU/ml的啤酒酵母懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達(dá)1×108CFU/ml。經(jīng)研磨得活性蛋白液。
(2)取150ml上述獲得的活性蛋白液，接入內(nèi)含13L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入1L菌濃度為1×109CFU/ml的產(chǎn)酸菌懸液，產(chǎn)酸菌為生酮基古龍酸菌，發(fā)酵至菌濃度達(dá)2×109CFU/ml，得到產(chǎn)酸菌懸液。
(3)取所述種液30L接入內(nèi)含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及3.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐對(duì)山梨糖進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵20小時(shí)至發(fā)酵中期，再補(bǔ)加1700ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，得到古龍酸。
在同等條件下，采用實(shí)施例6維生素C二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統(tǒng)的維生素C二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高1.2百分點(diǎn)，即收率為92.2％，發(fā)酵周期縮短4％。
上述各實(shí)施例中培養(yǎng)基成分如下表。
表：上述各實(shí)施例的培養(yǎng)基情況如下
從上述實(shí)施例中可以看到，通過(guò)補(bǔ)加伴生菌活性蛋白，可使Vc二步發(fā)酵由產(chǎn)酸菌獨(dú)立完成，同時(shí)使發(fā)酵收率提高1.5至3.5個(gè)百分點(diǎn)，發(fā)酵周期縮短4至8小時(shí)，表明采用本發(fā)明方法提高了Vc二步發(fā)酵產(chǎn)酸菌生產(chǎn)能力。