本發(fā)明涉及一種雙光子熒光探針，具體地說是一種苯并吲哚衍生物雙光子熒光探針及其制備方法和用途。

背景技術：

隨著雙光子技術的發(fā)展，雙光子熒光材料在生物學應用中優(yōu)勢引起了人們更多的關注。首先，具有生物特異性的雙光子熒光材料在使用過程中，激發(fā)光源位于近紅外區(qū)/紅外區(qū)，具有更強的穿透能力；其次，在雙光子熒光材料的激發(fā)范圍內，有效的避免了生物體自發(fā)熒光對材料本身發(fā)光性質的干擾；第三，雙光子熒光材料在激發(fā)時只有焦點附近的分子被激發(fā)，能夠明顯的減小激光對分子的損傷，降低光漂白。因此，低成本設計制備具有強雙光子熒光探針具有重要的科學意義和實用價值。

HSO₃^-作為常見的食品藥品添加劑，有防腐抑菌等重要作用，但這僅限于合適的濃度，過量使用HSO₃^-會引起哮喘、過敏、呼吸困難、蕁麻疹和腸胃不適等。因此，識別和檢測生物體內HSO₃^-得到了科研工作者的關注。研究者們已經報道許多簡便的檢測分析技術，例如紫外分光光度法，色譜法和電化學法。然而，這些檢測方法都存在復雜的樣品預處理、耗時、復雜的操作工序等缺點。此外，這些方法的檢測靈敏度低，即不能檢測低濃度的HSO₃^-。在HSO₃^-的識別過程中，雙光子熒光探針分子具有合成簡易，高靈敏度，易于監(jiān)測等優(yōu)點，同時這類熒光探針利用近紅外(NIR)波長的光作為激發(fā)源，為實時監(jiān)測提供了更高的空間分辨率，更長的觀測時間以及更深的組織穿透能力。

申請人對本申請的主題進行了如下的文獻檢索：

1、www.baidu.com網檢索結果：(2016/19/12)

2、中國期刊網檢索結果：

檢索方式一：

篇名-具有HSO₃^-識別功能的分子探針無相關文獻。

篇名-吲哚化合物雙光子光學材料無相關文獻。

檢索方式二：

全文-具有HSO₃^-識別功能的分子探針無相關文獻。

全文-吲哚化合物雙光子光學材料無相關文獻。

技術實現要素：

本發(fā)明旨在提供一種苯并吲哚衍生物雙光子熒光探針及其制備方法和用途，所要解決的技術問題是通過分子設計得到選擇性好、靈敏度高的識別HSO₃^-的吲哚衍生物，并可通過單雙光子熒光檢測識別。

本發(fā)明苯并吲哚衍生物雙光子熒光探針，簡稱L，結構式如下：

本發(fā)明苯并吲哚衍生物雙光子熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

1、中間體OT的合成

向50mL圓底燒瓶中加入2,3,3-三甲基苯并吲哚3.51g(10mmol)，室溫下加入碘甲烷2.8g(20mmol)，混合均勻后于室溫下攪拌反應24h，反應結束后有白色沉淀生成(若沉淀中含有少量雜質，則可用適量乙醇洗滌)，抽濾得白色固體3.3g即為中間體OT，產率94％。

2、目標產物L的合成

向100mL三口燒瓶中依次加入3.51g(10mmol)中間體OT、1.1g(10mmol)4-吡啶甲醛及30mL乙醇，攪拌下加入2滴催化劑六氫吡啶，然后升溫至60℃反應6h，反應結束后溶液變?yōu)樽霞t色，有紅色固體析出，抽濾得3.8g紅色固體即為目標產物L，產率86％。

本發(fā)明制備路線如下：

本發(fā)明苯并吲哚衍生物雙光子熒光探針的用途，可在定性檢測生物體內HSO₃^-時作為檢測試劑應用。

本發(fā)明設計制備的吲哚衍生物的雙光子熒光探針，是基于吡啶具有良好的平面結構，苯并吲哚與吡啶共軛橋聯，使得探針分子具有較大的共軛體系，有利于分子內電荷轉移(ICT)，產生強的光學效應；在吲哚衍生物中引入碘甲烷使其成鹽，以增強分子的水溶性，便于生物學方面的應用。HSO₃^-加入后，進攻共軛雙鍵，破壞了探針原有的共軛結構，使得電荷重新分布，ICT效應消失，從而引起熒光光譜的變化。該類探針在溫和的測試條件下表現出高選擇性、高靈敏度、取樣量少、可實時檢測等優(yōu)點。

本發(fā)明以具有較高的反應活性和良好的生物相容性的苯并吲哚基團作為主體，與4-吡啶甲醛反應，簡潔高效地制備了具有π共軛體系的吲哚類衍生物L，并對其進行識別陰離子活性篩選，結果表明L具有單一識別HSO₃^-的性質，且識別前后單雙光子熒光有明顯的變化，細胞實驗表明，L作為雙光子熒光探針可以穿透細胞膜，實現對細胞質外源性HSO₃^-的檢測。

與已有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現在：

1、L末端的吲哚和吡啶基團，選擇性好、靈敏度高，可以通過單光子熒光對HSO₃^-實現單一性定量識別，檢測限達到168nmol/L；在乙腈：PBS＝1：1(v/v)溶液中加入HSO₃^-后，L在570nm所表現出的特征發(fā)射峰逐漸降低，在470nm處有一個新峰的形成，單光子熒光發(fā)射峰強度增強(圖2)。識別后出現的新峰與化合物的特征峰之間的差值是100nm，其他陰離子均沒有以上現象(圖3)。

2、L可以通過雙光子熒光對HSO₃^-實現單一性識別；

當激光波長從680-920nm范圍內變化時，L的雙光子熒光最大發(fā)射峰位于620nm處，在乙腈：PBS＝1：1溶液中加入HSO₃^-后，同單光子熒光發(fā)射相比，雙光子熒光發(fā)射峰發(fā)生了明顯的紅移，熒光強度降低。在840nm作為激發(fā)波長時，L的最大有效雙光子吸收截面是13GM，識別后有效雙光子吸收截面是2GM(圖4)。

3、L具有吲哚鹽型小分子結構，在水中的溶解度大，有利于在生物體內的HSO₃^-檢測方面的應用；

4、本發(fā)明L與HSO₃^-結合后具有很好的細胞通透性，以840nm為激發(fā)波長時，當加入HSO₃^-后，觀察到被L著色的細胞質的雙光子熒光出現明顯淬滅現象(圖4)，這一研究結果的發(fā)現，對于生命科學研究方向具有重大的意義；

5、本發(fā)明L的制備是以苯并吲哚作原料，原料易得，成本低，合成步驟簡單，產率高達86％。

附圖說明

圖1是本發(fā)明目標產物L的電噴霧質譜，說明目標分子L被合成。

圖2是本發(fā)明目標產物L在乙腈/PBS溶液中對HSO₃^-響應的單光子熒光光譜，從圖中可以看出通過單光子熒光光譜可以實現L對HSO₃^-的單一識別。

圖3是本發(fā)明目標產物L在乙腈/PBS溶液中對混合陰離子識別前后的對比圖，從圖中可以看出在混合陰離子體系，L對HSO₃^-的識別效果并未受到影響。

圖4是本發(fā)明目標產物L在乙腈/PBS溶液中對HSO₃^-識別前后的雙光子吸收截面圖譜，插圖為L在乙腈/PBS溶液中對HSO₃^-識別前后的雙光子熒光圖，從圖中可以看出通過雙光子熒光和雙光子吸收截面的變化同樣可以實現L對HSO₃^-的單一識別。

圖5是本發(fā)明目標產物L加入HSO₃^-前后的雙光子熒光肝癌細胞成像研究結果，其中A、F是在使用405nm作為激發(fā)波長，450-490nm作為發(fā)射波長時的單光子顯影圖，B、G是在使用405nm作為激發(fā)波長，560-600nm作為發(fā)射波長時的單光子顯影圖，C、H是在使用820nm作為激發(fā)波長，610-650nm作為發(fā)射波長時的雙光子顯影圖，D、I是明場圖，E、J是L的比率顯影圖，所有圖均運用Image J軟件獲得。從圖5中可以看出L做為雙光子熒光探針可以穿透細胞膜，實現對細胞質外源性HSO₃^-的檢測。

具體實施方式

本實施例中苯并吲哚衍生物雙光子熒光探針的制備方法如下：

1、中間體OT的合成

向50mL圓底燒瓶中加入2,3,3-三甲基苯并吲哚3.51g(10mmol)，室溫下加入碘甲烷2.8g(20mmol)，混合均勻后于室溫下攪拌反應24h，反應結束后有白色沉淀生成(若沉淀中含有少量雜質，則可用適量乙醇洗滌)，抽濾得白色固體3.3g即為中間體OT，產率94％。

2、目標產物L的合成

向100mL三口燒瓶中依次加入3.51g(10mmol)中間體OT、1.1g(10mmol)4-吡啶甲醛及30mL乙醇，攪拌下加入2滴催化劑六氫吡啶，然后升溫至60℃反應6h，反應結束后溶液變?yōu)樽霞t色，有紅色固體析出，抽濾得3.8g紅色固體即為目標產物L，產率86％。

熔點:215-217℃。¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO),δ:8.84(d,J＝5.9Hz,2H),8.46(dd,J＝16.8,12.6Hz,2H),8.35(d,J＝9.0Hz,1H),8.26(d,J＝8.1Hz,1H),8.18(d,J＝9.0Hz,1H),8.13(d,J＝6.0Hz,1H),7.96(d,J＝16.7Hz,1H),7.85(dd,J＝11.3,4.1Hz,1H),7.78(t,J＝7.5Hz,1H),4.40-4.37(s,3H),2.03(s,6H).¹³C NMR(100MHz,d₆-DMSO),δ:173.1,149.7,144.5,137.9,133.8,133.5,132.6,128.6,125.8,125.6,124.2,120.7,52.9,32.6,27.7.ESI-MS:313.17.FT-IR(KBr):3414,2996,1616,1595,1550,1465,1417,1386,1350,11319,1236,1213,975,806,763,669,524.Anal.Calcd.for C₂₂H₂₁N₂I:C,60.01；H,4.81；N,6.36.Found:C,59.98；H,4.79；N,6.38.

3、細胞培養(yǎng)及染色：采用人體肝癌HepG2細胞、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24-36小時。染色前用PBS洗滌三次以除去培養(yǎng)基。在培養(yǎng)小皿中加入200μL的PBS后加入20μL的L無水DMSO溶液(1×10^-3mol/L)。避光孵育15分鐘后，用移液槍吸出溶液。PBS溶液洗滌三次后進行雙光子熒光顯微與成像。