本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、食品工程及畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株、構(gòu)建方法和生產(chǎn)α-淀粉酶的方法。本發(fā)明生產(chǎn)的α-淀粉酶主要應(yīng)用于食品加工、飼料添加劑及紡織等行業(yè)。

背景技術(shù)：

α-淀粉酶又稱液化酶(1,4-α-D一葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1)以淀粉為底物，水解淀粉內(nèi)部1,4-α-D-葡萄糖苷鍵，致使糖苷鍵隨機(jī)斷裂，生成短鏈糊精和小分子糖類，從而使粘度迅速下降，達(dá)到淀粉液化的作用。α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造、食品加工、紡織退漿等行業(yè)，是最重要的的工業(yè)應(yīng)用酶制劑之一。

目前現(xiàn)有的α-淀粉酶在較低溫度下催化能力較差，催化效率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于，提出一種產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株、構(gòu)建方法和生產(chǎn)α-淀粉酶的方法，該菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶催化能力強(qiáng)，能在較低溫度快速催化。

產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株、構(gòu)建方法和生產(chǎn)α-淀粉酶的方法分為3項(xiàng)發(fā)明創(chuàng)造，每一項(xiàng)發(fā)明創(chuàng)造都具有相同的特定技術(shù)特征：產(chǎn)適冷α-淀粉酶，解決了在低溫下催化能力受限的問(wèn)題，屬于一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，可以作為一件申請(qǐng)?zhí)岢觥?/p>

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)取海泥，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)；

(2)進(jìn)行α-淀粉酶基因的篩選，得到含有α-淀粉酶基因的陽(yáng)性克隆；

(3)α-淀粉酶基因的克?。?/p>

a.基于篩選得到的α-淀粉酶基因的開(kāi)放閱讀框序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物A1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和引物A2 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，以含有α-淀粉酶基因的陽(yáng)性克隆提取的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；凝膠回收PCR產(chǎn)物，純化， 插入載體并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克??；提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，測(cè)序，確定重組質(zhì)粒的插入片段序列，確定PCR純化產(chǎn)物為α-淀粉酶基因；

b.測(cè)序正確后，將步驟a的PCR純化產(chǎn)物連接到pET-28(+)載體上得到二次擴(kuò)增模板，使用以下兩種引物對(duì)二次擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為α-淀粉酶基因，測(cè)序；

c.pET-20b載體和擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切并連接，擴(kuò)增產(chǎn)物α-淀粉酶基因插入載體pET-20b后得到帶有α-淀粉酶基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，再接種帶有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21于含有一定濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，篩選得到含有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21；

(3)對(duì)篩選得到的含有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21進(jìn)行質(zhì)粒提取，測(cè)序驗(yàn)證。

通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，通過(guò)α-淀粉酶篩選得到新的酶。所述的篩選的基因插入α-淀粉酶基因的表達(dá)載體。

產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(a)取海泥1g,利用試劑盒MO BIO的強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒( DNA Isolation Kit)提取宏基因組。通過(guò)物理和化學(xué)協(xié)同破碎細(xì)胞的方法，將釋放出來(lái)。通過(guò)過(guò)柱純化以獲得高質(zhì)量。宏基因組文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中使用EPICENTRE公司的CopyControl Fosmid Library Production Kits提供的質(zhì)粒pCC2FOS^TM Vector及宿主菌Escherichia coli EPI300，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)。

(b)取10uL文庫(kù)菌液用液體培養(yǎng)基稀釋到100uL，均勻涂布于α-淀粉酶篩選平板，37°培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)入4°保存，觀察菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈的即為α-淀粉酶陽(yáng)性克隆。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆挑出，液體培養(yǎng)，劃線于α-淀粉酶篩選平板上重復(fù)驗(yàn)證。

(c)基于找出的α-淀粉酶基因的開(kāi)放閱讀框序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物A1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游引物A2 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，PCR擴(kuò)增；凝膠回收PCR產(chǎn)物，純化，連接到載體上；(b)熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，送至上海公司測(cè)序，確定重組質(zhì)粒的插入片段序列，PCR純化產(chǎn)物為α-淀粉酶基因；

(d)測(cè)序正確后，將步驟(c)的PCR純化產(chǎn)物連接到pET-28(+)載體上得到二次擴(kuò)增模板，使用以下兩種引物對(duì)二次擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為α-淀粉酶基因，測(cè)序；

(e)pET-20b載體和擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切并連接，擴(kuò)增產(chǎn)物α-淀粉酶基因插入載體pET-20b后得到帶有α-淀粉酶基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，再接種帶有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21于含有一定濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，篩選得到含有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21；

(f)對(duì)篩選得到的含有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21進(jìn)行質(zhì)粒提取，測(cè)序驗(yàn)證。

所述液體種子培養(yǎng)基的組成為：淀粉，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸餾水1000mL。

上述步驟(c)中，PCR反應(yīng)體系為50μl，包括1μl DNA模板、5μl 10×PCR buffer、3μl 25mM MgCl₂、4μl dNTP mixture、1μl 20μM引物A1、1μl 20μM引物A2、0.25μl、5U/μl Taq酶和34.75μl滅菌ddH₂O；PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共28個(gè)循環(huán)；72℃5min。

產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株生產(chǎn)α-淀粉酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步驟：

(1)產(chǎn)酶培養(yǎng)

目標(biāo)基因α-淀粉酶的轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)在含有表達(dá)質(zhì)粒對(duì)應(yīng)抗生素的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，直到吸光值OD600達(dá)到0.6—0.8，然后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，環(huán)境溫度仍然控制在37℃；經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后,誘導(dǎo)細(xì)胞離心，上清液用于蛋白分離；

(2)硫酸銨沉淀

分別取50mL上述粗酶液，按終濃度分別為40％，50％，60％，70％W/V要求，分別加入不同質(zhì)量的硫酸銨，冰浴中持續(xù)攪拌充分沉淀后，低溫離心，棄去上清，沉淀物用10mmol/L,pH 5.5的醋酸緩沖液復(fù)溶，上清為所得粗酶液，測(cè)得上清液酶活；將粗酶液用20mmol/L,pH5.5的醋酸緩沖透析，除去殘留的硫酸銨；

(3)Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析

將上一步透析樣品上樣到含有10mmol/L,pH 5.5的醋酸緩沖液的sephadex G-100凝膠柱中，進(jìn)行sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析分離，用含0.2mo1/L NaCI的醋酸緩沖液A進(jìn)行洗脫，流速為1mL/min；將收集的樣品進(jìn)行活性測(cè)定，收集活性部分，透析脫鹽后，凍干濃縮，即為純化后的α-淀粉酶。

上述步驟(1)中，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為：可溶性淀粉，20g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；瓊脂，20g；蒸餾水，1000mL，pH 6.0～6.5；IPTG添加終濃度1mM。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明所構(gòu)建的的適冷α-淀粉酶菌株酶高產(chǎn)菌株，與當(dāng)前工業(yè)用酶的細(xì)菌菌株相比，發(fā)酵產(chǎn)酶周期短，酶活力高，產(chǎn)酶溫度低，因此該菌適用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)的特點(diǎn)；

(2)從本發(fā)明提取的α-淀粉酶的活力比活達(dá)101U/mL,與現(xiàn)有菌株相比，具有更高的催化能力；該酶最適反應(yīng)pH為6.0；該酶在的緩沖液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90％以上，體現(xiàn)了較好的pH穩(wěn)定性；最適反應(yīng)溫度為15-20℃；有耐Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺等金屬離子的良好特性，EDTA對(duì)酶活性影響甚微，該酶為非金屬離子纖維素酶，顯示了良好的特性，在紡織、食品加工和飼料等工業(yè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為構(gòu)建產(chǎn)α-淀粉酶菌株產(chǎn)α-淀粉酶SDS-PAGE圖；

圖2為本發(fā)明純化的α-淀粉酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，1-6為酶蛋白分子量為85Kdα-淀粉酶)；

圖3為pH對(duì)α-淀粉酶活的影響示意圖；

圖4為溫度對(duì)α-淀粉酶活的影響示意圖；

序列表為序列1為α-淀粉酶序列，序列2和3分別為引物A1和A2，序列4和5分別為引物F1和R1。

產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心申請(qǐng)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2016786，保藏日期為2016.12.26，分類命名為Escherichia coli BL21a/pET-20b(+)-α-amyZ1，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步揭示本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式：

本發(fā)明中所用培養(yǎng)基為：

液體種子培養(yǎng)基：淀粉，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸餾水1000mL。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為：可溶性淀粉，20g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；瓊脂，20g；蒸餾水，1000mL，pH 6.0～6.5。IPTG至終濃度1mM。溫度15℃。

實(shí)施例1

(a)取海泥1g,利用試劑盒MO BIO的強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒( DNA Isolation Kit)提取宏基因組。通過(guò)物理和化學(xué)協(xié)同破碎細(xì)胞的方法，將環(huán)境環(huán)境微生物DNA釋放出來(lái)，通過(guò)過(guò)柱純化以獲得高純度微生物DNA。宏基因組文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中使用EPICENTRE公司的CopyControl Fosmid Library Production Kits提供的質(zhì)粒pCC2FOS^TMVector及宿主菌Escherichia coli EPI300，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)。該部分為常規(guī)技術(shù)，故不作更詳細(xì)說(shuō)明。

(b)取10uL文庫(kù)菌液用液體培養(yǎng)基稀釋到100uL，均勻涂布于α-淀粉酶篩選平板，37°培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)入4°保存，觀察菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈的即為α-淀粉酶陽(yáng)性克隆。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性克隆挑出，液體培養(yǎng)，劃線于α-淀粉酶篩選平板上重復(fù)驗(yàn)證。該部分為常規(guī)技術(shù)，故不作更詳細(xì)說(shuō)明。

(c)以步驟(b)重復(fù)驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆(經(jīng)過(guò)測(cè)序，驗(yàn)證序列)提取的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為50μl，包括1μl DNA模板、5μl 10×PCR buffer、3μl MgCl₂(25mM)、4μl dNTP mixture(各2.5mM)、1μl A1(20μM)、1μl A2(20μM)、0.25μl Takara Taq酶(5U/μl)和34.75μl滅菌ddH₂O。引物為上游引物A1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和下游引物A2 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反應(yīng)條件順序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s(共28個(gè)循環(huán))；72℃5min。50μl PCR產(chǎn)物加6×上樣緩沖液8.3μl，1％瓊脂糖電泳。采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行。將洗脫下的DNA-20℃保存，送去測(cè)序。

(d)α-淀粉酶基因由金斯瑞生物技術(shù)公司(中國(guó)，南京)測(cè)序。之后，α-淀粉酶基因(即PCR產(chǎn)物)插入載體pET-20b(Novagen)中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，接種大腸桿菌BL21(DE3)于含有一定濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，測(cè)序，確定重組質(zhì)粒的插入片段序列，確定PCR純化產(chǎn)物為α-淀粉酶基因；

(e)測(cè)序正確后，將步驟c的PCR純化產(chǎn)物連接到pET-28(+)載體上得到二次擴(kuò)增模板，使用以下兩種引物對(duì)二次擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為α-淀粉酶基因，測(cè)序；

(f)pET-20b載體和擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切并連接，擴(kuò)增產(chǎn)物α-淀粉酶基因插入載體pET-20b后得到帶有α-淀粉酶基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，再接種帶有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21于含有一定濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，篩選得到含有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21；

(g)對(duì)篩選得到的含有α-淀粉酶基因的大腸桿菌BL21進(jìn)行質(zhì)粒提取，測(cè)序驗(yàn)證。

重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BIOMIGA，上海)用于質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物的純化。DNA限制和修飾酶購(gòu)自Takara公司(中國(guó)，大連)。DNA轉(zhuǎn)化通過(guò)GenePulser(Bio-Rad,USA)來(lái)實(shí)現(xiàn)。把克隆基因α-淀粉酶基因連接到pET-28(+)的表達(dá)載體上。然后，使用以下兩種引物對(duì)原始克隆進(jìn)行擴(kuò)充：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'。采用BamHI和HindIII實(shí)現(xiàn)雙酶切，擴(kuò)增子是插入到pET-28(+)向量轉(zhuǎn)換為大腸桿菌Origami(DE3)，然后淀粉酶基因的序列得到驗(yàn)證。

實(shí)施例2

從構(gòu)建菌種中提取適冷α-淀粉酶的方法：

1.產(chǎn)酶培養(yǎng)

目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化株生長(zhǎng)在含有表達(dá)質(zhì)粒對(duì)應(yīng)抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，直到吸光值OD600達(dá)到0.6—0.8，然后用1mM濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，環(huán)境溫度仍然控制在37℃。經(jīng)過(guò)6h后,誘導(dǎo)細(xì)胞用5000*g的離心機(jī)，進(jìn)行5min的離心分離。經(jīng)過(guò)離心后，上清液用于蛋白分離。

2.硫酸銨沉淀 分別取50mL上述粗酶液，按終濃度分別為40％，50％，60％，70％(W/V)要求，分別加入不同質(zhì)量的硫酸銨，冰浴中持續(xù)攪拌30min，充分沉淀后，8 000r/min低溫離心20min，棄去上清，沉淀物用適量的10mmol/L,pH 5.5的醋酸緩沖液復(fù)溶，上清為所得粗酶液。測(cè)得上清液酶活。在4℃層析柜中，將粗酶液用20mmol/L,pH5.5的醋酸緩沖透析12h，除去殘留的硫酸銨，中間更換兩次透析緩沖。

3.Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析

將上一步將透析樣品上樣到10mmol/L,pH 5.5的醋酸緩沖液平衡好的sephadex G-100凝膠柱中，進(jìn)行sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析分離(1.6cm X60cm)，用含0.2mo1/L NaCI的醋酸緩沖液A進(jìn)行洗脫，流速為1mL/min，1min收集1管。將收集的樣品進(jìn)行活性測(cè)定，收集活性部分，透析脫鹽后，凍干濃縮。即為純化后的α-淀粉酶。

酶活測(cè)定方法：

取10mL 1％的馬鈴薯淀粉溶液(pH 4.0)放入一支試管內(nèi)，于40℃預(yù)熱10min后，加入1mL的發(fā)酵酶液，搖勻，精確保溫10min。用移液管吸取1mL反應(yīng)液置于盛有10mL,0.1mol/L HCl的試管中，再取0.5mL混合液體于盛有10mL碘液的試管中，搖勻，并立即用分光光度計(jì)于660nm處測(cè)定吸光度。用同樣方法測(cè)定空白值，但不加發(fā)酵液，加1.0mL的蒸餾水。以蒸餾水作為參比液。

酶活定義：1個(gè)酸性α-淀粉酶單位相當(dāng)于在pH 4.0，溫度40℃，1min將濃度為1％的馬鈴薯淀粉溶液的顯藍(lán)強(qiáng)度降低1％時(shí)所需酶量。

酶活＝[(D0一D)×100/D0×10]×稀釋倍數(shù)

D0為空白吸光度，D為樣品吸光度，100為系數(shù)(％)，10為反應(yīng)時(shí)間(min)。

取粗酶液測(cè)定酶的活力，經(jīng)測(cè)定α-淀粉酶分別22.6U/mL。

分別對(duì)粗酶液、樣品前處理液和經(jīng)Sephadex G-100柱層析后的樣品進(jìn)行總酶活力的測(cè)定，如表1所示，結(jié)果表明α-淀粉酶純化后得率，得率較高，且酶活在純化過(guò)程中較為穩(wěn)定。

表1α-淀粉酶活力測(cè)定

實(shí)施例3

構(gòu)建α-淀粉酶菌株中提取的α-淀粉酶的相關(guān)性質(zhì)：

1.酶蛋白分子量的測(cè)定

用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳按常規(guī)方法進(jìn)行。分離膠、濃縮膠濃度分別為12％和5％，電極緩沖液為pH8.3Tris-Gly緩沖，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖3所示。電泳后用GEL-DOC2000(Bio-Rad)進(jìn)行凝膠掃描。運(yùn)用掃描系統(tǒng)自帶軟件Quantity One進(jìn)行分子量測(cè)定，測(cè)得α-淀粉酶蛋白分子量為85Kd。

2.酶的最適pH

利用上述酶活測(cè)定方法測(cè)定α-淀粉酶活力，如表1所示。作用的最適溫度為10-20℃(圖4),酶活性分別保留85％以上?？梢?jiàn)該酶有潛力應(yīng)用于中溫條件下淀粉液化加工行業(yè)。

3.酶的pH穩(wěn)定性

提取后的α-淀粉酶溶解于不同pH緩沖液中，15℃條件下放置2h后，測(cè)定α-淀粉酶相對(duì)活力，如附圖3所示。結(jié)果表明該α-淀粉酶在較寬的pH范圍內(nèi)顯示了高度的穩(wěn)定性，在的緩沖液中能保持其最高酶活85％以上，顯示了良好的pH穩(wěn)定性，在紡織、造紙以及食品加工行業(yè)有良好的應(yīng)用潛力。

4.酶的最適反應(yīng)溫度

純酶分別放置于不同溫度下反應(yīng)30min，測(cè)定其酶活如圖4所示。該酶作用的最適溫度為10-20℃(圖4),酶活性分別保留85％以上?？梢?jiàn)該酶有潛力應(yīng)用于中溫條件下淀粉液化加工行業(yè)。

5.金屬離子對(duì)α-淀粉酶活力的影響

在三個(gè)濃度水平lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L探討Na⁺、K⁺、Li⁺—價(jià)金屬離子；Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺二價(jià)金屬離子；Fe³⁺三價(jià)金屬離子以及EDTA對(duì)α-淀粉酶活力的影響。4℃下放置30min，65℃條件下反應(yīng)30min，并檢測(cè)α-淀粉酶活力。以不加金屬離子的酶活為對(duì)照測(cè)定酶的相對(duì)活力。結(jié)果低濃度(lmmol/L)的金屬離子存在條件下，大部分金屬離子可明顯促進(jìn)α-淀粉酶活力，中等濃度(5mmol/L)的金屬離子存在條件下,大部分金屬離子可提高α-淀粉酶活力。此外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的EDTA對(duì)酶活力影響不大。表明該酶符合紡織、造紙以及食品加工行業(yè)應(yīng)用的基本要求。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化、均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 南京曉莊學(xué)院

<120> 產(chǎn)適冷α-淀粉酶菌株、構(gòu)建方法和生產(chǎn)α-淀粉酶的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2082

<212> DNA

<213> 海泥α-淀粉酶基因

<400> 1

atgtatgaactgctgccgggtaaaacccacccgattggcgctacggtggaagatggcggtgttaatttttgcctgtactgtgacgaacgtagtacctccgttgaactgctgctgtttgaacagcataacgcgctggaaccgtatgaaattatccgcttcgatccgctgatccatcgtagcttttacttctggcacatttttgtcaaaggtctgccggagaaaacccactatgcctaccgtgtgggcggtccgtttcagccggaaaatggcctggttttcgatccgcagaaagtcctgattgacccgtatagcaaaggtatcaattgctctctgtggcagcgcaacgatgcatgtaaagctggcgacaacctgcacacctctatgcgtagctgcgtgctgaaactgacggattatgactggcagggtgattctccgccgaaccatcacctgaacgaaagtatcatctacgaaatgaacgtgggcggttttaccaaaagtccgacgtccggtgttaaacatccgggcacctatgcgggcattatcgagaaaattccgtacctgaccgcactgggcatcacggctgttgaactgctgccgatttttgaatttgaagatagcgaagtccgttacttcaacggtaacaaactggtgaactattggggctactccaccattaactttttcgccccgcattcaggttactgtgtgaatccgcaggaaggcaaccacctggatgaatttcgcgacctggttaaagcgctgcatcaagccgatattagcgtcatcctggacgtggtttttaaccataccgatgaaagtgaccaccgtggtccggtttattcctttaaaggcttcgccaacaactcatactactttctgatggataaacacaagaacttctactgcaactactctggctgtggtaatacgtttaaatgcaaccatccgattggcgagaaattcatcgtggattgtctggaatactgggtccgcgatatgcatgtggacggttttcgtttcgatgaaggcaccatcctggcccgtggcgacaatggtaacctgatcgcgaatccgccggtcgtgtgggccattgaactgtctgaacagctggccgatacgaaagttattgcagaagcgtgggacgcagaaggcggttatctggtcggtagttttccgggccaccgctgggcagaatggaacggtctgtaccgtgatgacctgcgcgattttgtgcgtggcaaagcaggtatgctgggcaccttcgctcgtcgcattacgggcagcgcggatatttatgaatcccagtacgaactgccgggtaattcaatcaacttcatcaactcgcatgatggcttcaccctgaatgacctggtcagctataaccataaacacaaccaggcaaatggtgaaaacaattcggatggcattgacaacaatcgtagctggaattgcggtgtggaaggcattacggataacccgcagatcaatatgctgcgtaaacgccaaattaagaactttgcggccatcctgatgctgagtaaaggtgttccgatgttcgtcgcgggtgatgaaatctgccgcacccagcagggtaacaataacgcatattgtcaggacaatgaactgtcgtggttcaactggcaagatgtggacacgaataaaagcatgttacagttttggcaacgcctgattgcattccgtaaagttcacccgcgtctgtttcgcaacaaatactacaactccgaaatcaacaaatcaggtctgtcggatattctgtggcatggctgcgaactgggtaaaccgggttggtatgatccgtcaggcctggcgctggccatgaccctgggtgaacgtgcggatggcgaagacattcatatcatgttcaacatgtactgggaaggcctggaatttgaactgccggatattgaaggcgagaaatggtatcgtgctattgatacctttctgagcagcccgctggatattgcgaaaacgggtgaagaaatcgtgcattcaggctcgcactataaagttaacgcgcgcagcgttgtcgtgctgattagcaagaaagatccgatttgctaa 2082

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggatcca atgaacaata tccggtac 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgaagctta gcatgtttgg cgaaaaat 28