本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種應(yīng)用于高通量測序同時檢測t細(xì)胞和b細(xì)胞免疫組庫的引物組合及試劑盒。
背景技術(shù)：
：t、b細(xì)胞基因座上大量的v(可變區(qū))、d(多變區(qū))、j(連接區(qū))基因片段在t、b細(xì)胞受體的形成中會產(chǎn)生各種多樣性重組。這種v-d-j基因的重組賦予了每一種t、b細(xì)胞自己獨(dú)特的t、b細(xì)胞受體(tcr、bcr)，從而使得每一個tcr和bcr的序列能有效的成為一個t、b細(xì)胞克隆的唯一生物標(biāo)志物。由于tcr和bcr基因的最大特點(diǎn)是v、d、j基因片段的隨機(jī)重組，所以，針對未知基因序列，很難設(shè)計一個上游引物用于識別tcr、bcr基因的5’端序列，所以也無法利用pcr技術(shù)擴(kuò)增tcr、bcr基因和測序。而另外一種tcr測序方法，多重引物pcr的方法，只能測序tcr基因中的部分序列信息，這樣使得測序基因信息不完整。另外，多重引物pcr方法的引物是根據(jù)已知v，j基因設(shè)計的，這種測序結(jié)果只局限于野生型的已知基因。但在癌癥病人中，癌細(xì)胞的基因突變是很常見的，如果白血病癌細(xì)胞的bcr或tcr產(chǎn)生了突變，那么已知序列的引物就有可能無法識別突變后的基因，對檢測結(jié)果來說，就容易造成假陰性。并且，多重引物pcr的免疫組庫測序方法，僅僅對tcr或者bcr測序，就已經(jīng)需要幾十對的引物，如果同時檢測tcr和bcr的話，龐大的引物數(shù)量會讓整個pcr擴(kuò)增的效率和特異性變得很差。所以，目前還沒有一個技術(shù)可以在一次實驗操作中同時檢測tcr和bcr，利用我們的方法(單對引物法)可以同時檢測多個樣本的tcr和bcr，節(jié)約實驗時間和試劑、人工成本。該技術(shù)可以應(yīng)用在免疫基因組學(xué)的研究中，不僅能夠檢測淋巴惡性腫瘤治療后的微小殘留病，還能夠評判hsc移植后的免疫重建、食物過敏、免疫性疾病的檢測等等。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種應(yīng)用于高通量測序同時檢測t細(xì)胞和b細(xì)胞免疫組庫的引物組合及試劑盒，基于高通量測序同時構(gòu)建t細(xì)胞受體和b細(xì)胞受體文庫構(gòu)建的cdna接頭和單對引物，通過從接頭的上游引物到c區(qū)的下游引物，同時獲得tcr和bcr基因序列的全長信息。本發(fā)明中引物組合能有效的擴(kuò)增tcr基因的全序列，使tcr二代測序文庫構(gòu)建效率高效。試劑盒為用戶提供了簡單便捷的使用方法，效率穩(wěn)定。能同時完成tcr和bcr的建庫，建庫的對象和組合(不同的鏈)。解決以上技術(shù)問題的一種應(yīng)用于高通量測序同時檢測t細(xì)胞和b細(xì)胞免疫組庫的引物組合，其特征在于：所述引物組合包括xcr3’oligo(dt)引物，xcr5’oligo接頭，xcr5’端接頭引物，tcr-alpha鏈c區(qū)引物，tcr-beta鏈c區(qū)引物，bcr-heavy鏈c區(qū)引物中的iga、igg和igm，bcr-light鏈c區(qū)引物中的kappa和lambda，以及標(biāo)簽上下游引物；每種引物序列如下：xcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’；xcr5’oligo接頭：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’；xcr5’端接頭引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’；tcr-alpha鏈c區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt3’；tcr-beta鏈c區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’；bcr-heavy鏈c區(qū)引物：iga：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc3’；igg：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac3’；igm：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac3’；bcr-light鏈c區(qū)引物：kappa:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc3’；lambda:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg3’；標(biāo)簽上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’；標(biāo)簽tcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’；標(biāo)簽bcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index3]tacgcgatatcgct3’；其中，所述index1為atctatcg、tcaggtga、cactagtt、gaattgcc、atgtacaa、gattcagt、ctgttcgt或tatacggc中的一種；index2為tagctact、attatagc、cccgtact、gggtataa、agcaggtg、tatacgta、cacctagt或gttgctac中的一種；index3為taatcgct、atattacc、cctatact、ggatgaaa、agtctttg、tagtggta、cacgatgt或gtatgaac中的一種；本發(fā)明中的一種應(yīng)用于高通量測序同時檢測t細(xì)胞和b細(xì)胞免疫組庫的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包含有如權(quán)利要求1或2所述的引物組合。本發(fā)明中的優(yōu)化方案中所述試劑盒還包括pcr緩沖液、q5high-fidelity2xmastermix、去核酸酶水、ampurexpbeads和70％乙醇。進(jìn)一步優(yōu)化方案中，所述試劑盒包括：(1)pcr緩沖液：9.5μl；(2)陽性對照rna(1μg/μl)：10μl；(3)10μmtcr3’oligo(dt)引物：1.1μl；(4)10μmtcr5’端接頭引物：2.2μl；(5)10μmtcrc區(qū)引物和10μmbcrc區(qū)引物：各1.1μl；(6)q5high-fidelity2xmastermix：55μl；(7)10μm標(biāo)簽上游引物：2.2μl；(8)10μmtcr標(biāo)簽下游引物和10μmbcr標(biāo)簽下游引物：各1.1μl；(9)去核酸酶水：105μl；(10)ampurexpbeads：88μl；(11)70％乙醇：165μl。所述pcr緩沖液由以下體系組成：試劑盒的制備為購買原料，然后組裝成試劑盒。按照所需要比例，裝入試管，封裝成試劑盒。比如一個試劑盒可以分為做96個樣本，48個樣本兩種規(guī)格等等。利用本發(fā)明中的引物組合及試劑盒，從而高通量測序同時檢測t細(xì)胞和b細(xì)胞免疫組庫，檢測方法包括如下步驟：(1)獲取人血液樣本10ml于edta抗凝管；(2)利用淋巴細(xì)胞分離液ficoll-1077(美國sigma公司#10771)進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(pbmc)的分離；淋巴細(xì)胞分離液的作用在于可以從全血里分離淋巴細(xì)胞，因為t細(xì)胞為我們檢測對象，t細(xì)胞屬于淋巴細(xì)胞的一種，分離后的細(xì)胞群所獲得的rna是除去了紅細(xì)胞、血小板等細(xì)胞的rna的。所以建庫使用的總rna內(nèi)含t細(xì)胞rna模板純度更高。(3)利用trizol的方法提取pbmc的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)；trizol的方法提取rna,步驟如下：收獲細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，加入1mltrizol，混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000g×10min，棄上清。加入1ml75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃離心，7500g×5min，棄上清。自然風(fēng)干，加入50ul的depch2o溶解，得到淋巴細(xì)胞總rna。(4)rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，并同時在cdna5’端添加接頭,用于后面pcr擴(kuò)增時5’端引物結(jié)合；在反轉(zhuǎn)錄時，同時添加接頭，可以最小化rna在多步反應(yīng)過程中的丟失。rna在操作中穩(wěn)定性極差，非常容易降解，少量的步驟可以最大程度上減少降解，同時也節(jié)約了可用于擴(kuò)增的cdna制備時間。接頭即cdna5‘端的核酸接頭,xcr5’oligo接頭。(5)pcr1:通過1條上游引物、2條或2條以上的下游引物的方式擴(kuò)增重組tcr和bcrcdna；(6)pcr2和純化：為pcr1產(chǎn)物(擴(kuò)增后的tcr序列)添加illumina高通量測序儀的上機(jī)接頭和標(biāo)簽，同時為增加更多的上機(jī)基因量再次擴(kuò)增；pcr反應(yīng)結(jié)束后，利用磁珠進(jìn)行dna純化。pcr產(chǎn)物一般都含有過量的引物、taqdna酶及dntp。這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的文庫質(zhì)檢、測序反應(yīng)等過程，純化可以去除這些影響后續(xù)實驗的副產(chǎn)物。同時，純化的過程也是一個片段大小篩選的過程，本發(fā)明中的dna片段是在700bp左右，可利用不同體積的磁珠與pcr產(chǎn)物混合，磁珠/dna不同的體積比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠體積，可以成功去掉pcr擴(kuò)增時的錯誤(誤差)片段和引物雙聚體，讓我們的測序上機(jī)文庫只有我們的測序目標(biāo)dna片段，使得測序結(jié)果更加準(zhǔn)確，減少誤差。如圖3所示，通過文庫質(zhì)檢只發(fā)現(xiàn)了一個片段的峰。(7)進(jìn)行高通量測序：將所得的cdna文庫通過illuminamiseq平臺進(jìn)行測序，測序模式為pe300，文庫變性濃度為2nm，上機(jī)濃度為20pm，并通過生物信息學(xué)分析高通量測序結(jié)果；通過本發(fā)明的xcr5’端接頭、pcr引物以及測序文庫制備方法獲得的上百萬條的tcr和bcr序列，該技術(shù)可以應(yīng)用在免疫基因組學(xué)的研究中，不僅能夠檢測淋巴惡性腫瘤治療后的微小殘留病，還能夠評判hsc移植后的免疫重建、食物過敏、免疫性疾病的檢測等等。本發(fā)明中所述步驟(4)中按照以下比例混合每一個rna樣本：試劑體積1x(μl)，rna8，tcr3’oligo(dt)引物(10μm)1，孵化于72℃3分鐘，接著4℃1分鐘。按照以下比例制備pcr反應(yīng)緩沖液混合pcr反應(yīng)緩存液與rna樣本，按照下面反應(yīng)程序開始cdna反轉(zhuǎn)錄42℃60分鐘70℃10分鐘4℃永久反應(yīng)結(jié)束后，就可獲得已在5’端添加了接頭的總cdna(如圖1)。所述步驟(5)中具體步驟如下：按照以下比例制備反應(yīng)體系：按照上述的反應(yīng)體系制備反應(yīng)體系，混合上述5樣試劑于pcr試管，混勻，離心數(shù)秒，把管壁上的液體殘留離心于管底。放置試管于pcr擴(kuò)增儀中，按照上述反應(yīng)程序開始運(yùn)行。所述步驟(5)中pcr1反應(yīng)程序為:95℃3分鐘；95℃30秒；65℃1分鐘，25循環(huán)；72℃1分鐘；4℃永久。所述步驟(6)中具體步驟如下：按照以下比例制備反應(yīng)體系：所述步驟(6)中pcr2反應(yīng)程序為:94℃3分鐘；94℃30秒；55℃30秒，18循環(huán)；72℃20分鐘，72℃1分鐘，4℃永久。所述步驟(6)中具體純化步驟如下：(1)添加80μlampurexpbeads進(jìn)入pcr2反應(yīng)產(chǎn)物，混勻。(2)在室溫孵化10分鐘。c、放置磁珠-pcr2產(chǎn)物混合物試管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丟棄。(3)添加150μl70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丟棄。(4)重復(fù)第四步2次。(5)打開試管蓋，等待5分鐘，待磁珠風(fēng)干，沒有任何乙醇?xì)埩粲谠嚬軆?nèi)。(6)把試管從磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打懸浮磁珠。(7)把試管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，轉(zhuǎn)移上清液于新的試管中。上清液里就包含了純化之后的pcr2產(chǎn)物。本發(fā)明基于高通量測序技術(shù)，tcr測序單對引物的文庫構(gòu)建方法，通過在獲得t細(xì)胞rna后，在進(jìn)行rna至cdna反轉(zhuǎn)錄的同時，給cdna的5’端添加一個接頭，從而通過這個已知序列的接頭設(shè)計tcr擴(kuò)增上游引物，再配合tcr基因3’端c區(qū)基因(不變區(qū))設(shè)計下游引物，從而達(dá)到擴(kuò)增整個tcr序列全長基因的目的。因此，提供一種基于高通量測序技術(shù)同時構(gòu)建t細(xì)胞受體和b細(xì)胞受體檢測手段是十分有意義的，有效的節(jié)約實驗時間和試劑、人工成本。本發(fā)明提供基于高通量測序同時構(gòu)建tcr和bcr文庫的接頭，引物及方法的有益效果為：同時獲得了人tcr(alpha鏈或beta鏈)和bcr(heavy鏈或light鏈)全基因序列；本發(fā)明在高通量測序平臺的基礎(chǔ)上，通過同時對人tcr和bcr基因測序結(jié)果進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，獲得了tcr和bcr在vdj重組時的基因偏好性，vdj基因組合信息，免疫組克隆種類信息，免疫組多樣性信息，免疫組的所有cdr1、cdr2、cdr3的核酸序列和氨基酸序列信息，基因上的突變信息，等。正是這些因素形成數(shù)量龐大且種類多樣的免疫組庫。附圖說明圖1本發(fā)明中rna反轉(zhuǎn)錄cdna示意圖圖2為本發(fā)明中利用兩次pcr擴(kuò)增tcr和bcrcdna并添加測序上機(jī)接頭示意圖圖3為本發(fā)明中測序文庫質(zhì)檢結(jié)果。圖4為本發(fā)明中tcr測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析比對，找出每條序列的信息(部分)圖5為本發(fā)明中bcr測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析比對，找出每條序列的信息(部分)具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，引物是通過美國invitrogen公司合成的:實施例1利用本發(fā)明中的引物組合及試劑盒進(jìn)行高通量測序檢測，從而同時檢測t細(xì)胞受體和b細(xì)胞受體，具體步驟包括如下步驟：(一)獲取人血液樣本10ml于edta抗凝管；(二)利用淋巴細(xì)胞分離液ficoll-1077(美國sigma公司#10771)進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(pbmc)的分離；(三)利用trizol的方法提取pbmc的總rna，所用試劑為rnazolrt(美國mrc公司#rn190)；(四)利用2.0fluorometer(美國thermofisherscientific公司#q32866)，配合rnahsassaykit試劑盒(美國thermofisherscientific公司#q32852)測定rna濃度，然后用于反轉(zhuǎn)錄rna；(五)rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，并在cdna5’端添加接頭用于后面pcr擴(kuò)增時5’端引物結(jié)合，具體步驟如下，所使用到的試劑：xcr3’oligo(dt)引物(10μm)5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液(250mmtris-hcl(ph8.3),375mmkcl,15mmmgcl2)二硫蘇糖醇，dtt(20mm)美國thermoscientific#r0861dntpmix(10mm)美國invitrogen#18427088rnaseout(40u/μl)美國invitrogen#10777019xcr5’oligo接頭(10μm)superscriptiirt(200u/μl)美國invitrogen#18064022按照以下比例混合每一個rna樣本：試劑體積1x(μl)rna8xcr3’oligo(dt)引物(10μm)1孵化于72℃3分鐘，接著4℃1分鐘。按照以下比例制備pcr反應(yīng)緩沖液試劑體積1x(μl)5x反轉(zhuǎn)錄緩沖液3.5dtt(20mm)1dntp(10mm)1rnaseout1xcr5’oligo接頭(10μm)1superscriptiirt1混合pcr反應(yīng)緩存液與rna樣本，按照下面反應(yīng)程序開始rna反轉(zhuǎn)錄42℃60分鐘70℃10分鐘4℃永久反應(yīng)結(jié)束后，就可獲得已在5’端添加了接頭的總cdna(如圖1)(六)pcr(pcr1)。通過“單對”引物的方式，或通過1條上游引物、2條或2條以上的下游引物的方式，同時擴(kuò)增重組tcr和bcrcdna，具體步驟如下：所使用到的試劑：q5high-fidelity2xmastermix(美國neb#m0492l)xcr5’端接頭引物(上游引物)tcrc區(qū)引物(下游引物)bcrc區(qū)引物(下游引物)去核酸酶水(美國thermoscientificam9914g)按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr1反應(yīng)程序為:(七)pcr(pcr2)。為pcr1產(chǎn)物(擴(kuò)增后的tcr與bcr序列)添加illumina高通量測序儀的上機(jī)接頭和標(biāo)簽，同時為增加更多的上機(jī)基因量再次擴(kuò)增。具體步驟如下：所使用到的試劑：q5high-fidelity2xmastermix(美國neb#m0492l)標(biāo)簽上游引物標(biāo)簽tcr下游引物標(biāo)簽bcr下游引物去核酸酶水(美國thermoscientificam9914g)按照以下比例制備反應(yīng)體系：pcr2反應(yīng)程序為:(八)pcr2產(chǎn)物純化。上述pcr反應(yīng)結(jié)束后，利用磁珠進(jìn)行dna純化，具體步驟如下：所使用到的試劑：agencourtampurexpbeads(美國beckman#a63882)具體純化步驟如下：1.添加80μlampurexpbeads進(jìn)入pcr2反應(yīng)產(chǎn)物，混勻。2.在室溫孵化10分鐘。3.放置磁珠-pcr2產(chǎn)物混合物試管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丟棄。4.添加150μl75％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丟棄。5.重復(fù)第四步2次。6.打開試管蓋，等待5分鐘，待磁珠風(fēng)干，沒有任何乙醇?xì)埩粲谠嚬軆?nèi)。7.把試管從磁力架上取下，并添加50μl去核酸酶水，利用移液器吹打懸浮磁珠。8.把試管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，轉(zhuǎn)移上清液于新的試管中。上清液里就包含了純化之后的pcr2產(chǎn)物。(九)文庫純化結(jié)束后，利用agilent2100bioanalyzer(美國agilent公司#g2939aa)檢測文庫的純度和大小，使用的試劑盒是agilentdna1000kit(美國agilent公司#5067-1504)，檢測結(jié)果如圖3所示，文庫大小在768bp左右的范圍，并且文庫純度相當(dāng)高，并未見到其他非特異性擴(kuò)增序列。(十)利用2.0fluorometer(美國thermofisherscientific公司#q32866)，配合dsdnahsassaykit試劑盒(美國thermofisherscientific公司#q32851)測定dna文庫濃度，并送公司進(jìn)行高通量測序。將所得的cdna文庫通過illumina平臺(美國illumina公司)進(jìn)行測序，測序模式為pe300，文庫變性濃度為2nm，上機(jī)濃度為20pm，并通過生物信息學(xué)分析高通量測序結(jié)果。材料及試劑說明健康自愿受試者知情同意。非特殊說明，本發(fā)明采用的試劑均為市售商品，本發(fā)明實施例采用的數(shù)據(jù)庫均為公開的在線數(shù)據(jù)庫。具體地，本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄5’端接頭序列、引物序列如下(5’-3’)：反轉(zhuǎn)錄步驟xcr3’oligo(dt)引物：5’ttttttttttttttttttttga3’xcr5’oligo接頭：5’atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg3’pcr1步驟xcr5’端接頭引物：5’gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga3’tcr-alpha鏈c區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt3’tcr-beta鏈c區(qū)引物：5’tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag3’bcr-heavy鏈c區(qū)引物：iga：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc3’igg：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac3’igm：5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac3’bcr-light鏈c區(qū)引物：kappa:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc3’lambda:5’tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg3’。pcr2步驟標(biāo)簽上游引物：5’caagcagaagacggcatacgagat[index1]gtctcgtgggctgg3’標(biāo)簽tcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index2]tcgtcgccagcgtc3’標(biāo)簽bcr下游引物：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacac[index3]tacgcgatatcgct3’rg＝rna核苷酸標(biāo)簽引物中下劃線部分為illumina測序標(biāo)簽序列，[]內(nèi)序列可更換為下表序列，用于同時檢測多個樣本時，利用不同的index1-index2或者index1-index3組合和生物信息學(xué)算法區(qū)分多個樣本的t細(xì)胞受體(tcr)與b細(xì)胞受體(bcr)測序結(jié)果。引物設(shè)計：針對rna反轉(zhuǎn)錄時在5’端添加的接頭序列和tcr于bcrc區(qū)基因進(jìn)行分析，采用oligo7.36和primerpremier6.0對引物二聚體以及莖環(huán)錯配進(jìn)行分析，在5’端人工接頭設(shè)置了上游引物，針對c基因下游設(shè)計反向引物，擴(kuò)增tcr與bcr全長轉(zhuǎn)錄子區(qū)域序列，其中包含了tcr與bcr免疫組庫的fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4區(qū)域。采用本發(fā)明的pbmcrna5’端接頭、引物以及文庫構(gòu)建后，高通量測序得到大約幾百萬條tcr和bcr序列。測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析(生物信息分析采用bowtie2aligner(ver.2.1.0)，tcr和bcr數(shù)據(jù)庫匹配來源于國際免疫基因信息系統(tǒng)www.imgt.org)，部分分析比對結(jié)果如圖4、5所示。通過生物信息學(xué)分析，可以準(zhǔn)確的知道每條tcr和bcr序列的信息，氨基酸信息，條數(shù)以及所占比例。經(jīng)過tcr和bcr對比分析，本發(fā)明獲得了高通量測序序列tcr和bcr代表性克隆的統(tǒng)計分析結(jié)果，結(jié)果如圖4(tcr)和5(bcr)所示。上述結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法同時構(gòu)建tcr和bcr文庫能夠覆蓋tcr和bcr基因的多樣性信息，提高低拷貝數(shù)免疫細(xì)胞克隆的檢出率和節(jié)約時間、試劑和人工成本。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表sequencelisting<110>孫濤<120>一種應(yīng)用于高通量測序同時檢測t細(xì)胞和b細(xì)胞免疫組庫的引物組合及試劑盒<160>34<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工合成<220><223>xcr3’oligo(dt)引物<400>1ttttttttttttttttttttga22<210>2<211>32<212>dna<213>人工合成<220><223>xcr5’oligo接頭<400>2atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg32<210>3<211>57<212>dna<213>人工合成<220><223>xcr5’端接頭引物<400>3gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga57<210>4<211>62<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr-alpha鏈c區(qū)引物<400>4tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt62<210>5<211>62<212>dna<213>人工合成<220><223>tcr-beta鏈c區(qū)引物<400>5tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag62<210>6<211>55<212>dna<213>人工合成<220><223>bcr-heavy鏈c區(qū)引物-iga<400>6tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc55<210>7<211>55<212>dna<213>人工合成<220><223>igg<400>7tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac55<210>8<211>55<212>dna<213>人工合成<220><223>igm<400>8tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac55<210>9<211>57<212>dna<213>人工合成<220><223>bcr-light鏈c區(qū)引物-kappa<400>9tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc57<210>10<211>56<212>dna<213>人工合成<220><223>lambda<400>10tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg56<210>11<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>11caagcagaagacggcatacgagatatctatcggtctcgtgggctgg46<210>12<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>12caagcagaagacggcatacgagattcaggtgagtctcgtgggctgg46<210>13<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>13caagcagaagacggcatacgagatcactagttgtctcgtgggctgg46<210>14<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>14caagcagaagacggcatacgagatgaattgccgtctcgtgggctgg46<210>15<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>15caagcagaagacggcatacgagatatgtacaagtctcgtgggctgg46<210>16<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>16caagcagaagacggcatacgagatgattcagtgtctcgtgggctgg46<210>17<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>17caagcagaagacggcatacgagatctgttcgtgtctcgtgggctgg46<210>18<211>46<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽上游引物<400>18caagcagaagacggcatacgagattatacggcgtctcgtgggctgg46<210>19<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacactagctacttcgtcgccagcgtc51<210>20<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>20aatgatacggcgaccaccgagatctacacattatagctcgtcgccagcgtc51<210>21<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>21aatgatacggcgaccaccgagatctacaccccgtacttcgtcgccagcgtc51<210>22<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>22aatgatacggcgaccaccgagatctacacgggtataatcgtcgccagcgtc51<210>23<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>23aatgatacggcgaccaccgagatctacacagcaggtgtcgtcgccagcgtc51<210>24<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>24aatgatacggcgaccaccgagatctacactatacgtatcgtcgccagcgtc51<210>25<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>25aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacctagttcgtcgccagcgtc51<210>26<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽tcr下游引物<400>26aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttgctactcgtcgccagcgtc51<210>27<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>27aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacgatgttacgcgatatcgct51<210>28<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>28aatgatacggcgaccaccgagatctacactaatcgcttacgcgatatcgct51<210>29<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>29aatgatacggcgaccaccgagatctacacatattacctacgcgatatcgct51<210>30<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>30aatgatacggcgaccaccgagatctacaccctatacttacgcgatatcgct51<210>31<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>31aatgatacggcgaccaccgagatctacacggatgaaatacgcgatatcgct51<210>32<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>32aatgatacggcgaccaccgagatctacacagtctttgtacgcgatatcgct51<210>33<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>33aatgatacggcgaccaccgagatctacactagtggtatacgcgatatcgct51<210>34<211>51<212>dna<213>人工合成<220><223>標(biāo)簽bcr下游引物<400>34aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtatgaactacgcgatatcgct51當(dāng)前第1頁12