本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及遺傳育種領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標(biāo)記R207及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈?guó)僅次于水稻的第二大糧食作物，歷年種植面積分別占耕地面積的22％～30％，糧食作物總面積的22％～27％，主要分布在河南、河北、山東、山西、陜西、江蘇、四川、安徽等省份；總產(chǎn)量為1億噸以上，約占糧食作物產(chǎn)量的22％，是我國(guó)約一半人口的主食，因此高產(chǎn)小麥品種的選育一直是育種家關(guān)注的重點(diǎn)。

小麥糧食產(chǎn)量主要由三大要素構(gòu)成，產(chǎn)量＝穗數(shù)*穗粒數(shù)*粒重。分蘗是禾本科作物中最重要的組成成分之一，它影響著分蘗的發(fā)生和形成，從而最終影響糧食的產(chǎn)量(Kebrom et al.Grasses provide new insights into regulation of shoot branching.Trends Plant Sci.2013,18:41-48；Hussien et al.Genetics of tillering in rice and barley.Plant Genome.2014,7:1-20)。，同時(shí)又是單子葉植物的一種特殊的分枝現(xiàn)象，具有重要的研究意義。

小麥分蘗遺傳研究總體進(jìn)展相對(duì)緩慢，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外工作主要圍繞分蘗基因QTL的分子標(biāo)記定位及其遺傳效應(yīng)開(kāi)展。部分分蘗突變體由單基因控制，因而一些學(xué)者將其作為質(zhì)量性狀來(lái)研究(Richards RA.A tiller inhibition gene in wheat and its affect on plant growth.Austr J Agric Res.1988,39:749-757；Duggan BL,Richards RA,Tsuyuzaki H.Environmental effects on the expression of the tiller inhibition(tin)gene in wheat.Funct Plant Biol,2002,29:45–53)。同時(shí)，也有很多學(xué)者將分蘗作為多基因控制的數(shù)量性狀來(lái)研究(Shaha MM,Gilla KS,Baenziger PS,Yen Y,Kaepplerc SM,Ariyarathne HM.Molecular mapping of loci for agronomic traits on chromosome 3A of bread wheat.Crop Sci.1999,39:1728-1732；謝玥，龍海，侯永翠，鄭有良.小麥寡分蘗材料H461分蘗性狀的遺傳分析.麥類作物學(xué)報(bào).2006,26:21-23；王巖.小麥永久F2群體構(gòu)建及株高和分蘗特性的QTL定位.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009；溫明星.望水白多分蘗、矮稈突變體的鑒定及相關(guān)QTL定位.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2010；Jinpeng Zhang,Jun Wu,Weihua Liu,Xiang Lu,Xinming Yang,Ainong Gao,Xiuquan Li,Yuqing Lu,Lihui Li.Genetic mapping of a fertile tiller inhibition gene,ftin,in wheat.Mol Breeding.2013,31:441-449)。迄今為止，已報(bào)道的分蘗相關(guān)主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色體，微效基因位于5A，3B，7B，1D、5D染色體，其中僅1A和3A上的tin基因研究較深入，完成了精細(xì)定位工作。

小麥材料H461相對(duì)于小麥品種川農(nóng)16(國(guó)審品種)具有寡分蘗、多穗粒數(shù)、多小穗數(shù)、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，鄭有良，蒲至恩，魏育明，李偉.穗數(shù)型小麥新品種川農(nóng)16與大穗型寡分蘗品系H461遺傳差異研究初報(bào).四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2003,21:94-9)，已定位到一個(gè)顯著降低分蘗數(shù)量且穩(wěn)定遺傳的基因位于2D染色體長(zhǎng)臂上(Wang,Zhiqiang,et al."Identification and validation of novel low-tiller number QTL in common wheat."Theoretical and Applied Genetics 129.3(2016):603-612.)。利用雜合自交家族法，結(jié)合表型和基因型成功創(chuàng)制Ltn3近等基因系B95-1/B95-2，近等基因系雜交構(gòu)建次級(jí)F2群體，開(kāi)發(fā)目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的多態(tài)性分子標(biāo)記，進(jìn)一步縮小基因區(qū)間，尋找共分離的分子標(biāo)記，促進(jìn)分蘗基因的圖位克隆，同時(shí)為小麥特異分蘗材料的創(chuàng)制及株型育種提供新基因資源，進(jìn)一步利用分子標(biāo)記輔助選擇，將增強(qiáng)分蘗預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，提高株型育種效率，加速實(shí)現(xiàn)增加小麥單產(chǎn)的目標(biāo)。

分子標(biāo)記輔助選擇，不依賴于表現(xiàn)型選擇，即不受環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán)境互作等多種因素的影響，而是直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，因而能大大提高育種效率。競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)，可在廣泛的基因組DNA樣品中，對(duì)SNP和特定位點(diǎn)上的Indel進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因檢測(cè)。這種檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性好、高通量、快速、檢測(cè)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。因此，篩選出與分蘗基因共分離的，且適用于熒光定量PCR平臺(tái)KASP技術(shù)的分子標(biāo)記，不僅能對(duì)小麥分蘗基因進(jìn)行選擇，有效調(diào)控小麥分蘗發(fā)生，塑造合理的分蘗發(fā)生群體，同時(shí)提高了選擇通量、速度和準(zhǔn)確性，解決了大規(guī)模推廣應(yīng)用的技術(shù)瓶頸，對(duì)規(guī)模化改良小麥育種群體質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標(biāo)記R207及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標(biāo)記R207，標(biāo)記R207位于小麥2D染色體長(zhǎng)臂上，核苷酸序列如下：5’-GGCATCTACATTCGCGTTCNTGCCTGCAGCGGTCAGTCTGATCACCAG-3’；其中，N為C或T。

本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記R207在小麥育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在鑒定寡分蘗小麥品種中的應(yīng)用。包括以下步驟：

1)提取待測(cè)小麥的基因組DNA；

2)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，基于KASP檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；

3)采用熒光檢測(cè)儀分析PCR產(chǎn)物，進(jìn)行基因分型。

其中，步驟2)的引物序列如下：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分別連有不同的熒光探針；

所述熒光探針的序列如下：

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結(jié)合FAM熒光基團(tuán))

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結(jié)合HEX熒光基團(tuán))

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去離子水加至總量為10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，體積比為2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，將濃度為100μM的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5體積比混合。

熒光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃變性20s，65℃退火延伸60s，循環(huán)10次，每次退火延伸溫度降低1℃；94℃變性20s，57℃退火延伸60s，循環(huán)30次；37℃60s，采集熒光信號(hào)。

步驟3)分析PCR產(chǎn)物的具體方法如下：

含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461相同的熒光信號(hào)，而不含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461明顯不同的熒光信號(hào)。

本發(fā)明還提供一套基于KASP技術(shù)檢測(cè)所述分子標(biāo)記R207的引物組合，所述引物組合包括：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分別連有不同的熒光探針；

所述熒光探針的序列如下：

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結(jié)合FAM熒光基團(tuán))

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結(jié)合HEX熒光基團(tuán))

本發(fā)明還提供所述引物組合在小麥分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種鑒定小麥寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記的方法，以待測(cè)植株樣品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行基因型分型，將與近等基因系-寡分蘗植株分為同一類型的植株鑒定為含有小麥寡分蘗基因Ltn3的植株。

本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記R207在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述基因?yàn)楣逊痔Y基因Ltn3。

本發(fā)明還提供上述方法在小麥品種改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次公開(kāi)了基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)平臺(tái)精確檢測(cè)小麥H461寡分蘗基因Ltn3的分子標(biāo)記R207，其為共顯性標(biāo)記，檢測(cè)準(zhǔn)確高效，通量高，擴(kuò)增方便穩(wěn)定。

本發(fā)明提供的分子標(biāo)記R207與寡分蘗基因Ltn3共分離，可用于分子標(biāo)記輔助選擇，檢測(cè)結(jié)果表明，該分子標(biāo)記能準(zhǔn)確跟蹤所述小麥寡分蘗基因，預(yù)測(cè)小麥的分蘗特性，進(jìn)而方便進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種。利用本發(fā)明提供的分子標(biāo)記及檢測(cè)方法能夠加強(qiáng)分蘗預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，提高特異株型育種的成功率，加速實(shí)現(xiàn)增加小麥單產(chǎn)的目標(biāo)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中小麥寡分蘗基因Ltn3在2D染色體上的位置及與分子標(biāo)記R207之間的連鎖遺傳圖譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中B95-1×B95-2的部分次級(jí)F2群體植株用KASP引物做基因型分型的結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中次級(jí)F2群體的重組子鑒定及基因Ltn3定位情況。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中利用基于KASP設(shè)計(jì)的引物，對(duì)B95-1、B95-2、F1、H461、川農(nóng)16及川麥107做基因型分型的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

實(shí)施例1小麥寡分蘗基因Ltn3及分子標(biāo)記R207的獲得

本發(fā)明與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標(biāo)記R207是通過(guò)以下方法獲得的：

(1)利用近等基因系寡分蘗小麥B95-1作為父本本，以近等基因系多分蘗小麥B95-2為母本本雜交，得到雜種F1，F(xiàn)1代單株自交獲得F2，獲得含有986個(gè)單株的次級(jí)F2群體。

(2)用CTAB法提取所述的親本，F(xiàn)1植株和次級(jí)F2群體的各單株的DNA，從數(shù)據(jù)庫(kù)http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下載獲得目標(biāo)區(qū)間內(nèi)scaffold序列信息，設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)親本B95-1和B95-2進(jìn)行DNA擴(kuò)增測(cè)序，通過(guò)DNAMAN 6.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，尋找差異位點(diǎn)，對(duì)差異位點(diǎn)進(jìn)行KASP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)。獲得親本B95-1的帶型記為A，親本B95-2的帶型記為B，F(xiàn)1植株的帶型記為H。

(3)小麥成熟期田間鑒定所述次級(jí)F2群體植株的分蘗數(shù)。

(4)利用JoinMap4.0作圖軟件將獲得的所述次級(jí)F2群體基因型資料構(gòu)建小麥分子連鎖圖譜，尋找最優(yōu)的標(biāo)記數(shù)和標(biāo)記順序。

(5)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，用于后續(xù)篩選。利用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物7對(duì)(表1)。熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增引物長(zhǎng)度18～25bp，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度45-60bp，退火溫度57-62℃，GC含量在40％～60％之間。合成引物序列為：

正向引物1：F探針+擴(kuò)增引物序列

正向引物2：H探針+擴(kuò)增引物序列

反向引物：擴(kuò)增引物序列

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結(jié)合FAM熒光基團(tuán))

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結(jié)合HEX熒光基團(tuán))

表1 7對(duì)KASP引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

(6)競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)分析

a)親本之間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選：選取上述設(shè)計(jì)的7對(duì)引物，以親本B95-1和B95-2的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得1對(duì)效果良好的分子標(biāo)記引物，命名為R207-1/2/3(核苷酸序列分別如SEQ ID NO:2-4所示)。擴(kuò)增產(chǎn)物為具有多肽性的分子標(biāo)記R207，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

b)次級(jí)F2群體的KASP分析：用上述步驟獲得的具有多態(tài)性的分子標(biāo)記R207的PCR引物，擴(kuò)增親本B95-1、B95-2和次級(jí)F2群體植株的DNA，進(jìn)行基因型鑒定，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)。親本B95-1的類型記為A，擴(kuò)增片段大小長(zhǎng)47bp，單堿基差異位點(diǎn)為C。親本B95-2的類型記為B，擴(kuò)增片段長(zhǎng)47bp，單堿基差異位點(diǎn)為T。次級(jí)F2群體株系類型來(lái)源于B95-1的記為A，來(lái)源于B95-2的記為B，雜合記為H。

c)遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建：根據(jù)分子標(biāo)記R207的鑒定數(shù)據(jù)，結(jié)合已開(kāi)發(fā)的其他分子標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)，用作圖軟件JoinMap 4.0構(gòu)建遺傳高密度圖譜。并結(jié)合次級(jí)F2群體分蘗表型數(shù)據(jù)定位寡分蘗基因Ltn3與R207共分離。

小麥寡分蘗基因Ltn3在2D染色體上的位置及與分子標(biāo)記R207之間的連鎖遺傳圖譜見(jiàn)圖1。

B95-1×B95-2的部分次級(jí)F2群體植株用KASP引物做基因型分型的結(jié)果見(jiàn)圖2。

次級(jí)F2群體的重組子鑒定及基因Ltn3定位情況見(jiàn)圖3。

實(shí)施例2與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標(biāo)記R207的應(yīng)用

基于KASP檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)設(shè)計(jì)引物，對(duì)B95-1、B95-2、F1、H461、川農(nóng)16及川麥107做基因型分型檢測(cè)。

1、提取待測(cè)小麥三葉期的葉片基因組DNA；

2、以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，基于KASP檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；

3、采用熒光檢測(cè)儀分析PCR產(chǎn)物，進(jìn)行基因分型。

其中，步驟2的引物序列如下：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分別連有不同的熒光探針；

所述熒光探針的序列如下：

F探針：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可結(jié)合FAM熒光基團(tuán))

H探針：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可結(jié)合HEX熒光基團(tuán))

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去離子水加至總量為10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，體積比為2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，將濃度為100μM的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5體積比混合。

熒光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃變性20s，65℃退火延伸60s，循環(huán)10次，每次退火延伸溫度降低1℃；94℃變性20s，57℃退火延伸60s，循環(huán)30次；37℃60s，采集熒光信號(hào)。

分析PCR產(chǎn)物的具體方法如下：

含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461相同的熒光信號(hào)，而不含有小麥寡分蘗基因Ltn3的小麥品種均出現(xiàn)與小麥H461明顯不同的熒光信號(hào)?；蛐头中徒Y(jié)果見(jiàn)圖4。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 與小麥寡分蘗基因Ltn3共分離的分子標(biāo)記R207及其應(yīng)用

<130> KHP161119103.5Q

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 小麥

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n為c或t

<400> 1

ggcatctaca ttcgcgttcn tgcctgcagc ggtcagtctg atcaccag 48

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tggcatctac attcgcgttc c 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tggcatctac attcgcgttc t 41

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggtgatca gactgaccgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat t 21