本發(fā)明屬于可降解生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

通常的化學(xué)療法中，藥物以常規(guī)制劑給藥后自由分布于人體全身，只有少部分能夠到達病灶部位，分布在非病灶部位的藥物不但造成一定副作用，也極大減弱治療效果。(Tacar O,Sriamornsak P,Dass CR.The Journal of pharmacy and pharmacology.2013；65:157-70.)因此，制備一種能夠使得化療藥物在原位注射并且在病灶部位緩慢釋放的材料，具有重要的臨床意義。

近些年，可注射水凝膠基于其優(yōu)良的藥代動力學(xué)以及多種可實踐的優(yōu)點，如易于注射、極大減少病患痛苦、藥物包埋率高和藥物定點釋放等優(yōu)點，在藥物轉(zhuǎn)運應(yīng)用中得到了廣泛的關(guān)注和深度的研究。其中基于海洋無毒天然生物材料殼聚糖(CS)及其改性的衍生物，制備可注射水凝膠的案例并不少見。(Ta HT,Dass CR,Larson I,Choong PFM,Dunstan DE.Biomaterials.2009；30:3605-13；Ruel-Gariépy E,Shive M,Bichara A,et al.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2004,57(1):53-63.L.Zhao,L.Zhu,F.Liu,C.Liu,D.Shan,Q.Wang,Int.J.Pharmacol.2011；410；83–91.)。然而，近些年基于殼聚糖及其衍生物的可注射水凝膠存在著以下的不足：第一，由于易受到外力擠壓、體液侵蝕以及其他化學(xué)物質(zhì)的侵入而受損,從而造成凝膠中形成微觀裂紋,這些裂紋的傳播會影響凝膠結(jié)構(gòu)的完整性和力學(xué)性能,進而縮短凝膠植入體壽命,危及病人健康和安全；第二，由于人體體液在不同環(huán)境下pH會有輕微浮動，如胃液約1～3，腸道組織約為5～7，而偶有出現(xiàn)的癌癥腫瘤部位的酸堿值約在6以下，這些pH的浮動會對用作藥物控釋的水凝膠造成結(jié)構(gòu)損傷和毀壞，從而極大影響藥物的傳遞；第三，常見的水凝膠制備過程中，各種有機化學(xué)試劑屢見不鮮，一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠及其制備方法，該方法工藝簡單，在制備的過程中不需要加入額外的化學(xué)試劑，無需純化，安全無毒，即用即配，同時制得的水凝膠具有優(yōu)良的自愈合和pH響應(yīng)性能。

為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

包括以下步驟：

(1)將N-羧乙基殼聚糖配制成N-羧乙基殼聚糖溶液；

(2)將PEGDA聚合物配置成PEGDA聚合物溶液；

(3)將N-羧乙基殼聚糖溶液和PEGDA聚合物溶液混合進行交聯(lián)反應(yīng)，得到擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠；其中，CEC聚合物和PEGDA聚合物的質(zhì)量比為(12～20)：(5～40)。

進一步地，步驟(1)中N-羧乙基殼聚糖用去離子水配置成質(zhì)量濃度為3～5％的N-羧乙基殼聚糖溶液。

進一步地，步驟(1)中N-羧乙基殼聚糖的制備步驟具體包括：按質(zhì)量體積比為4g:(5～6)mL，將殼聚糖和丙烯酸加入去離子水中，在40～60℃下反應(yīng)，反應(yīng)時間不少于65h，得到N-羧乙基殼聚糖。

進一步地，殼聚糖和加入的去離子水的比為4g：(150～200)mL。

進一步地，步驟(2)中PEGDA聚合物用去離子水配置成質(zhì)量濃度為5～40％的PEGDA聚合物溶液。

進一步地，步驟(2)中PEGDA聚合物的制備步驟具體包括：在氮氣氣氛、惰性氣體或真空環(huán)境下，將聚乙二醇、對甲?；郊姿岷?-二甲氨基吡啶加入溶劑中進行反應(yīng)，10～30min后加入N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)總時間為18～36h，得到PEGDA聚合物；其中，聚乙二醇、對甲?；郊姿帷?-二甲氨基吡啶和N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺的質(zhì)量比是4.89：(1.47～1.55)：(0.073～0.085)：(2.02～3.02)。

進一步地，聚乙二醇的平均分子量為2000；溶劑為四氫呋喃。

進一步地，步驟(3)中的交聯(lián)溫度為25～40℃，交聯(lián)時間為30～150秒。

利用如上所述的制備方法制得的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，其結(jié)構(gòu)式為:

其中，x:y＝50.87:25.39。

如傷所述擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠在包埋抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明針對現(xiàn)有殼聚糖為基礎(chǔ)的可注射水凝膠所存在的易于破損、無pH響應(yīng)性、有機化學(xué)試劑使用繁復(fù)等缺點，提供了種基于綠色方法制備的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備方法，該方法以水溶性聚合物CEC(N-羧乙基殼聚糖)作為水凝膠的主要原料，羧乙基殼聚糖(CEC)是一種對天然高分子改性得到的產(chǎn)物，在保持殼聚糖原來的優(yōu)點(天然無毒可降解、止血抗菌、安全可靠、廉價易得)的基礎(chǔ)上，增大了其在水中的溶解性，在食品、衛(wèi)生、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景；將CEC聚合物溶液和PEGDA聚合物溶液混合，PEGDA聚合物作為交聯(lián)劑，其上含有醛基，可以和CEC快速相互交聯(lián)，形成基于動態(tài)希夫堿鍵且擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠(CEC/PEGDA)。本發(fā)明的制備方法簡單，在制備的過程中不需要加入額外的化學(xué)試劑，無需純化，安全無毒，同時操作方便、原料成本低。

本發(fā)明可注射水凝膠具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明中由于羧乙基殼聚糖(CEC)和PEGDA之間交聯(lián)是通過動態(tài)希夫堿鍵的作用，常態(tài)下的亞胺鍵在水凝膠內(nèi)部的斷裂與生成是一種動態(tài)平衡，由于水凝膠網(wǎng)絡(luò)中同時存在以希夫堿為交聯(lián)點的網(wǎng)絡(luò)和未交聯(lián)的反應(yīng)活性基團，賦予該水凝膠的自愈合性能，同時這種自愈合性能是“自主性的”,不需外界的環(huán)境刺激；

(2)本發(fā)明中由于羧乙基殼聚糖(CEC)和PEGDA之間交聯(lián)是通過動態(tài)希夫堿鍵的作用，在弱酸性環(huán)境下，希夫堿鍵會因為氨基質(zhì)子化斷裂，造成水凝膠部分孔徑變大，有利于包埋的藥物釋放，因而表現(xiàn)出明顯的pH響應(yīng)性能；

(3)實驗結(jié)果證明：本發(fā)明方法制得的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠(CEC/PEGDA)具有優(yōu)良的自愈合性能，作為藥物載體具有明顯的pH響應(yīng)性能，即在模擬腫瘤部位的弱酸性環(huán)境中和模擬正常體液的弱堿性環(huán)境中藥物釋放量存在顯著差異，體外細胞培養(yǎng)表明，本發(fā)明制得的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠(CEC/PEGDA)，在作為抗癌藥物鹽酸阿霉素的藥物載體時，對人肝癌細胞(HepG2)有明顯的殺滅作用，而沒有包埋藥物的空白凝膠對此癌細胞并無毒性作用；同時，該方法制備的水凝膠能夠顯著促進成纖維細胞(L929)的粘附、增殖，顯示出良好較強的生物相容性，因此在藥物運輸領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

進一步地，本發(fā)明使用得交聯(lián)劑PEGDA是對生物相容性良好的聚乙二醇(PEG)進行端基醛基化之后得到的一種高分子，聚乙二醇(PEG)本身作為一種生物惰性的親水高分子，擁有很好的生物相容性，免疫相容性良好，同時易于修飾，已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)臨床使用。醛基的引入，使得CEC可以和修飾過的PEG快速交聯(lián)，形成基于動態(tài)希夫堿鍵的自愈合水凝膠。

進一步地，本發(fā)明中合成CEC聚合物和CEC/PEGDA水凝膠均采用去離子水作為溶劑，沒有額外的化學(xué)溶劑引入，無需純化，安全無毒，合成PEGDA聚合物使用較少量的有機溶劑長時間全部揮發(fā)，不存在任何殘留。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明中殼聚糖(CS)，CEC，PEGDA和CEC/PEGDA的FT-IR圖。

圖2為本發(fā)明制得的CEC/PEGDA可注射水凝膠流變學(xué)性能(存儲模量-時間曲線)。

圖3(a)是本發(fā)明制得的水凝膠CEC/PEGDA在流變儀測定的存儲模量，耗損模量-應(yīng)力曲線圖；圖3(b)是本發(fā)明制得的水凝膠CEC/PEGDA在流變儀測定的存儲模量，耗損模量-時間曲線圖。

圖4為本發(fā)明制得的水凝膠在不同pH值的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中釋放抗癌藥物鹽酸阿霉素(Dox)的釋放曲線。

圖5(a)是CEC聚合物和PEGDA聚合物質(zhì)量比為4：10的水凝膠(CEC/PEGDA10)原始孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，圖5(b)是該水凝膠在pH值為7.4的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后水凝膠孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，圖5(c)是該水凝膠在pH值為5.5的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后水凝膠孔徑的掃描電子顯微鏡圖片；

圖5(d)是CEC聚合物和PEGDA聚合物質(zhì)量比為4：20的水凝膠(CEC/PEGDA20)原始孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，圖5(e)是該水凝膠在pH值為7.4的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后水凝膠孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，圖5(f)是該水凝膠在pH值為5.5的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后水凝膠孔徑的掃描電子顯微鏡圖片；

圖5(g)是CEC聚合物和PEGDA聚合物質(zhì)量比為4：30的水凝膠(CEC/PEGDA30)原始孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，圖5(h)是該水凝膠在pH值為7.4的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后水凝膠孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，圖5(i)是該水凝膠在pH值為5.5的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后水凝膠孔徑的掃描電子顯微鏡圖片，比例尺是250μm。

圖6(a)是水凝膠和成纖維細胞L929共同培養(yǎng)2天細胞存活數(shù)目統(tǒng)計圖；圖6(b)是不同載藥量的水凝膠，空白水凝膠與人肝癌細胞HepG2共同培養(yǎng)2天的存活數(shù)目統(tǒng)計圖。

【具體實施方式】

本發(fā)明致力于制備一種擁有良好自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠，作為藥物控釋載體。以海洋無毒天然生物材料殼聚糖(Chitosan)為基礎(chǔ)，對其進行改性，得到水溶性聚合物CEC(N-羧乙基殼聚糖)作為水凝膠的主要原料，殼聚糖因為具有良好的生物相容性和生物可降解性，是一類重要的用于形成生物醫(yī)用材料的原料，尤其是用于水凝膠的制備。聚乙二醇(PEG)本身作為一種生物惰性的親水高分子，擁有很好的生物相容性，免疫相容性良好，同時易于修飾，已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)臨床使用，也是一種經(jīng)典的用于生物醫(yī)用材料的原料，將生物相容性良好的聚乙二醇(PEG)和對甲酰基苯甲酸在室溫下進行反應(yīng)，得到作為交聯(lián)劑的PEGDA聚合物。因此，在本發(fā)明中，利用改性過的水溶性殼聚糖衍生物羧乙基殼聚糖(CEC)和修飾過的聚乙二醇聚合物(PEGDA)交聯(lián)反應(yīng)得到的這種利于綠色方法制備的擁有良好自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠(CEC/PEGDA),不僅具備以往殼聚糖可注射凝膠擁有的良好性能(安全無毒、易于注射、減少病患痛苦、藥物包埋率高和藥物定點釋放)，又賦予其自愈合以及pH響應(yīng)性能這兩種實用性極強的性能，同時無額外有機化學(xué)試劑的添加也是該凝膠制備的一大特色，因此該種方法制備的可注射水凝膠是藥物控制釋放的可降解生物醫(yī)用材料是極佳選擇。

一種擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：按質(zhì)量體積比為4g:(5～6)mL將殼聚糖和丙烯酸加入去離子水中在40～60℃下反應(yīng)，去離子水的添加量以能夠溶解殼聚糖和丙烯酸為準(zhǔn)，殼聚糖和去離子水的比為4g：(150～200)mL，65h之后得到CEC聚合物，優(yōu)選反應(yīng)65～75h；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol),苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：在氮氣氣氛、惰性氣體或真空環(huán)境下，室溫下將聚乙二醇(PEG)、對甲?；郊姿岷?-二甲氨基吡啶在無水的四氫呋喃溶劑中進行反應(yīng)，10～30min后加入N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，反應(yīng)總時間為18～36h，得到PEGDA聚合物；聚乙二醇采用平均分子量為2000的聚乙二醇。4-二甲氨基吡啶和N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺的作用分別是催化和除水，聚乙二醇、對甲?；郊姿帷?-二甲氨基吡啶和N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺的比是4.89g：(1.47～1.55)g：(0.073～0.085)g：(2.02～3.02)g。

3)基于綠色方法制備的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成400μL濃度為3～5wt％的CEC聚合物溶液，將PEGDA聚合物用去離子水配置成100μL濃度為5wt％～40wt％的PEGDA聚合物溶液，兩種溶液混合，25～40℃相互交聯(lián)30～150秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠。

本發(fā)明制備的水凝膠CEC/PEGDA具有優(yōu)良的自愈合性能，具體是指在水凝膠受到破損時，無需外界刺激可以自主愈合。本發(fā)明制備的水凝膠CEC/PEGDA在弱酸性環(huán)境下，交聯(lián)的結(jié)構(gòu)部分斷裂，水凝膠部分孔徑變大，使得包埋的藥物釋放，因而表現(xiàn)出明顯的pH響應(yīng)性能。

步驟1)和3)中CEC聚合物的合成溶劑為去離子水，水凝膠CEC/PEGDA的制備也只使用去離子水作為唯一溶劑，該方法視為一種綠色制備工藝。

本發(fā)明擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠在包埋抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中腫瘤包括肝癌，膀胱癌，甲狀腺癌，卵巢癌，乳腺癌，支氣管肺癌(未分化小細胞性和非小細胞性)、軟組織肉瘤，成骨肉瘤等，本發(fā)明中主要展示肝癌的治療。

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將5.84mL的丙烯酸加入到裝有200mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至50℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)3天，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.47g的對甲?；郊姿岷?.075g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)20分鐘，隨后加入2.52g的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)18小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成4％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成10％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在37℃下相互交聯(lián)約90秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，記為CEC/PEGDA10。

實施例2

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將5.84mL的丙烯酸加入到裝有200mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至50℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)3天，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.47g的對甲?；郊姿岷?.075g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)20分鐘，隨后加入2.52g的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)18小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成4％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成15％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在37℃下相互交聯(lián)約80秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠,記為CEC/PEGDA15。

實施例3

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將5.84mL的丙烯酸加入到裝有200mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至50℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)3天，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.47g的對甲酰基苯甲酸和0.075g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)20分鐘，隨后加入2.52g的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)18小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成4％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成20％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在37℃下相互交聯(lián)約75秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，記為CEC/PEGDA20。

實施例4

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將5.84mL的丙烯酸加入到裝有200mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至50℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)3天，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.47g的對甲?；郊姿岷?.075g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)20分鐘，隨后加入2.52g的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)18小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成4％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成25％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在37℃下相互交聯(lián)約50秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，記為CEC/PEGDA25。

實施例5

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將5.84mL的丙烯酸加入到裝有200mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至50℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)3天，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.47g的對甲?；郊姿岷?.075g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)20分鐘，隨后加入2.52g的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)18小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成4％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成30％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在37℃下相互交聯(lián)約35秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，記為CEC/PEGDA30。

實施例6

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將5.00mL的丙烯酸加入到裝有150mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至40℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)65h，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.50g的對甲酰基苯甲酸和0.073g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，真空環(huán)境下室溫反應(yīng)10分鐘，隨后加入2.02g的N,N'-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)25小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成3％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成5％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在25℃下相互交聯(lián)約150秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，記為CEC3/PEGDA5。

實施例7

1)CEC(N-羧乙基殼聚糖)聚合物的制備：將6.00mL的丙烯酸加入到裝有180mL的去離子水的圓底燒瓶中，升溫加熱至60℃，隨后加入4g的殼聚糖粉末，攪拌反應(yīng)75h，用1M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9～10，生成羧酸鹽；反應(yīng)溶液用平均分子量8000的透析膜在去離子水中透析2天，去除多余的鹽，產(chǎn)物在-80℃冷凍，使用冷凍干燥機兩到三天后得到凍干產(chǎn)物；

2)PEGDA(Dibenzaldehyde-Terminated Poly(ethyleneglycol)，苯甲醛封端的聚乙二醇)聚合物的制備：將4.89g的聚乙二醇(PEG2000)、1.55g的對甲?；郊姿岷?.08g的4-二甲氨基吡啶加入到100mL的圓底燒瓶中，Ar環(huán)境下室溫反應(yīng)30分鐘，隨后加入3.02g的N,N’-二環(huán)己基碳酰亞胺，氮氣環(huán)境下室溫反應(yīng)36小時，得到PEGDA聚合物，反應(yīng)產(chǎn)物用乙醚洗滌3次，離心，室溫干燥做后用；

3)擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠的制備：將CEC聚合物用去離子水配制成5％的CEC聚合物溶液400μL，將PEGDA聚合物用去離子水配置成40％的PEGDA聚合物溶液100μL，兩種溶液混合，渦旋振蕩10秒鐘，在40℃下相互交聯(lián)約30秒，即可得到可自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠，記為CEC5/PEGDA40。

本發(fā)明的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠(CEC/PEGDA)，性能穩(wěn)定，穩(wěn)定性隨著交聯(lián)劑PEGDA濃度的增加而增加。同時自愈合性能在定性定量測試中均表現(xiàn)良好，作為藥物載體具有明顯的pH響應(yīng)性能，而且該方法制備的水凝膠能夠顯著促進成纖維細胞(L929)的粘附、增殖，顯示出良好較強的生物相容性，下面結(jié)合實驗數(shù)據(jù)詳細分析。

本發(fā)明合成的聚合物和該水凝膠的結(jié)構(gòu)式(CEC/PEGDA)及合成路線如下所示。

其中本發(fā)明制得的CEC的結(jié)構(gòu)式如下式A所示，其中x:y＝50.87:25.39：

本發(fā)明制得的PEGDA的結(jié)構(gòu)式如下式B所示：

本發(fā)明制得的CEC/PEGDA的結(jié)構(gòu)式如下式C所示：

本發(fā)明制得的CEC的合成路線如下所示：

本發(fā)明制得的PEGDA的合成路線如下所示：

本發(fā)明制得的CEC/PEGDA的合成路線如下所示：

圖1是實施例1～5制得的CEC和PEGDA聚合物以及CEC/PEGDA水凝膠在傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜圖(FT-IR)，分析圖譜可得：在聚合物PEGDA中新形成位于1723cm^-1處的峰是由C＝O的伸縮振動引起，說明醛基成功接枝在PEG末端，表明聚合物PEGDA的成功合成；在殼聚糖鏈上1656cm^-1和1593cm^-1處分別屬于酰胺鍵和NH₂鍵，而在聚合物CEC上新形成的1573cm^-1處的峰則歸屬于羧基的不對稱伸縮振動，表明丙烯酸成功接枝于殼聚糖鏈上。在水凝膠CEC/PEGDA的紅外圖譜上新出現(xiàn)的位于1644cm^-1的峰則是聚合物CEC貢獻的氨基和聚合物PEGDA貢獻的醛基相互反應(yīng)形成希夫堿的特征振動。以上的FT-IR結(jié)果證明水凝膠CEC/PEGDA的形成，以及聚合物CEC和聚合物PEGDA的成功合成。

圖2為本發(fā)明制得的CEC/PEGDA可注射水凝膠流變學(xué)性能。通過存儲模量(G’)和耗損模量(G”)對時間(t)的模式進行測量。圖中分別展示的實施例1,3,5制得的水凝膠樣品的存儲模量和時間的關(guān)系曲線。顯而易見的是，隨著交聯(lián)劑PEGDA的濃度增高，水凝膠樣品的存儲模量不斷增高，實施例5中，當(dāng)PEGDA的濃度增加至30％時，其水凝膠樣品的存儲模量高達25kPa。這些結(jié)果說明，依照此發(fā)明方法制得的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠的可以達到一個較高的強度，從而擁有一個比較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)以及穩(wěn)定的機械性能。

圖3(a)和圖3(b)是用流變恢復(fù)測試對水凝膠進行的自愈合性能的測試，包括存儲模量，耗損模量-應(yīng)力曲線和存儲模量，耗損模量-時間曲線。選擇實施例3制備的水凝膠樣品加以說明。發(fā)現(xiàn)該水凝膠樣品在施加外力71.92％時達到該凝膠的膠狀和溶液狀的臨界位點，如圖3(a)。當(dāng)給其施加300％的應(yīng)變力，水凝膠的存儲模量低于其耗損模量，水凝膠結(jié)構(gòu)坍塌，而當(dāng)應(yīng)變力減少至1％時，水凝膠的存儲模量又迅速回升，水凝膠結(jié)構(gòu)又恢復(fù)正常，如此反復(fù)改變外力5次，水凝膠依舊可以表現(xiàn)出良好的自愈合性能，說明該水凝膠的自愈合性能穩(wěn)定且優(yōu)良，如圖3(b)。

圖4為本發(fā)明制得的擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的可注射水凝膠在不同pH值的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中釋放抗癌藥物鹽酸阿霉素(Dox)的釋放曲線。從圖4中可以看出，pH＝5.5的弱酸性環(huán)境下鹽酸阿霉素的累積釋放率遠高于pH＝7.4的弱堿性環(huán)境，尤其是48小時之后在弱酸性環(huán)境中鹽酸阿霉素的累積釋放率接近弱堿性環(huán)境的2倍，該結(jié)果表明該水凝膠擁有良好的pH響應(yīng)性能，尤其是抗癌藥物的釋放，在弱酸性腫瘤環(huán)境下，該水凝膠不僅可以達到藥物緩釋的效果同時又可以達到一個較大有效的藥物釋放率從而達到良好的治療效果。

從圖5的掃描電子顯微鏡圖片(SEM)中可以觀察到，水凝膠CEC/PEGDA10，CEC/PEGDA20，CEC/PEGDA30未浸泡的原始孔徑分別為128.35±15.01μm,94.87±10.73μm,91.47±9.83μm，分別如圖5(a)、圖5(d)和圖5(g)所示；水凝膠CEC/PEGDA10，CEC/PEGDA20，CEC/PEGDA30在pH值為7.4的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后的孔徑分別為192.97±9.29μm,141.03±8.017μm,128.27±10.20μm，分別如圖5(b)、圖5(e)和圖5(h)所示。水凝膠CEC/PEGDA10，CEC/PEGDA20，CEC/PEGDA30在pH值為5.5的生理溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)中進浸泡后的孔徑分別為238.16±6.01μm,202.62±7.65μm,184.40±9.47μm,分別如圖5(c)、圖5(f)和圖5(i)所示。水凝膠在堿性環(huán)境中浸泡的水凝膠樣品(圖5(b)、圖5(e)和圖5(h))的孔徑小于在弱酸性環(huán)境中的樣品(圖5(c)、圖5(f)和圖5(i))的孔徑，同時在兩種環(huán)境的磷酸鹽溶液中凝膠均會溶脹且孔徑均大于原始未溶脹的凝膠(圖5(a)、圖5(d)和圖5(g))，凝膠孔徑比較大時有利于包埋的藥物的釋放，這個結(jié)果很好的解釋了藥物在酸性環(huán)境下釋放更快的現(xiàn)象。

圖6(a)和圖6(b)為成纖維細胞(L929)和人肝癌細胞(HepG2)在CEC/PEGDA水凝膠表面的細胞粘附和增殖的數(shù)目統(tǒng)計。從圖6(a)中可以看出，成纖維細胞在與水凝膠CEC/PEGDA共同培養(yǎng)細胞的2天之內(nèi)，細胞增殖良好，顯示出良好較強的生物相容性，該材料無毒無害可以很好的用做生物醫(yī)療材料。從圖6(b)中可以看出,在包埋藥物的水凝膠載體與人肝癌細胞共同培養(yǎng)之后，癌細胞基本被殺滅，存活量極小與等同濃度的抗癌藥物直接注射殺滅癌細胞效果相當(dāng)，而沒有載藥的空白凝膠對癌細胞并無任何殺傷效果，說明該水凝膠作為藥物載體包埋藥物可以很好控釋藥物并且達到預(yù)期效果，是新型藥物載體理想的選擇。

本發(fā)明中所制備的一種擁有自愈合和pH響應(yīng)性能的新型可注射水凝膠，制備過程簡單，無額外有機溶劑添加，是一種綠色環(huán)保方法制備的水凝膠，同時該水凝膠具有良好的自愈合以及pH響應(yīng)性能，作為藥物載體可以達到理想的藥物控釋以及pH響應(yīng)釋放的效果，且生物穩(wěn)定性和生物相容性良好，無毒無害，是藥物轉(zhuǎn)運有著很好的應(yīng)用前景。