本公開涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基組合和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，主要分布于外周血中，能夠參與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)的生理過程?，F(xiàn)有研究表明，NK細(xì)胞是人體內(nèi)抗癌活性最強(qiáng)的細(xì)胞，可以釋放穿孔素在靶細(xì)胞表面形成穿孔，再通過顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，同時可以分泌大量的細(xì)胞因子作用于靶細(xì)胞，還可以通過進(jìn)一步激活其他種類免疫細(xì)胞攻擊靶細(xì)胞，并可以表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，使靶細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡。NK細(xì)胞免疫治療在臨床上已成為一種重要的治療手段。但是其在外周血中的數(shù)量僅占淋巴細(xì)胞總量的5％左右，如何實現(xiàn)NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)從而應(yīng)用于治療是關(guān)鍵的技術(shù)問題。現(xiàn)有的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增手段主要包括在培養(yǎng)基中添加動物血清、細(xì)胞因子或與其它細(xì)胞共同培養(yǎng)來刺激NK細(xì)胞的生長。但是動物血清成分較復(fù)雜，易給細(xì)胞培養(yǎng)帶來不安全因素；細(xì)胞因子的添加不當(dāng)容易引起NK細(xì)胞激活受體和抑制受體表達(dá)變化；同時，異體的細(xì)胞也往往存在醫(yī)學(xué)上的不安全性和倫理問題。因此，有必要開發(fā)一種高效、安全的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法從而為NK細(xì)胞的臨床治療應(yīng)用提供有力的技術(shù)保障。技術(shù)實現(xiàn)要素：本公開的目的是提供一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基組合及體外擴(kuò)增方法。為了實現(xiàn)上述目的，本公開提供一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基組合，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和活化適應(yīng)培養(yǎng)基；其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、慶大霉素和BSA；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成成分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、BSA、香菇多糖、靈芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培養(yǎng)基的組成成分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、BSA和細(xì)胞介素；所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和谷氨酰胺?？蛇x地，所述白細(xì)胞介素為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的至少一種。可選地，所述白細(xì)胞介素為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21?？蛇x地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：慶大霉素50-90IU/mL、BSA100-300μg/mL、RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：0.8-1.2。可選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、靈芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：1-1.4。可選地，所述增殖培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：1.2-1.6?？蛇x地，所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：胰島素1.5-3μg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：2-4。本公開的第二個方面還提供了一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括使用本公開的第一個方面所述的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基組合，所述方法包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)：將分離的單個核細(xì)胞接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天獲得基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)：將所述基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞；增殖培養(yǎng)：將所述誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天獲得增殖培養(yǎng)細(xì)胞；活化適應(yīng)：將所述增殖培養(yǎng)細(xì)胞接種于活化適應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5-1.5天?？蛇x地，所述接種的細(xì)胞密度為4.5×105個/mL-5.5×105個/mL。可選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)階段、誘導(dǎo)培養(yǎng)階段、增殖培養(yǎng)階段和活化適應(yīng)階段在免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中進(jìn)行，所述裝置包括細(xì)胞培養(yǎng)袋1和承載所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的承載臺3，該裝置還包括容納于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中的磁性浮球2以及在懸掛于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方并且能夠驅(qū)動所述磁性浮球2在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中移動的磁性懸掛驅(qū)動器4，所述磁性懸掛驅(qū)動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅(qū)動所述磁體片41在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方移動的懸掛驅(qū)動架42；所述細(xì)胞培養(yǎng)袋(1)中充有細(xì)胞培養(yǎng)液，述細(xì)胞培養(yǎng)液中含有培養(yǎng)基以及待擴(kuò)增的細(xì)胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養(yǎng)液液面上；所述磁體片(41)能夠在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋(1)上方往復(fù)移動，從而通過磁力的作用，驅(qū)動所述磁性浮球(2)在漂浮狀態(tài)下在培養(yǎng)液液面往復(fù)移動，所述磁性浮球(2)在培養(yǎng)液液面以下的部分能夠攪拌培養(yǎng)液，從而在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋(1)中模擬血液流動的體內(nèi)環(huán)境。通過上述技術(shù)方案，本公開所提供的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基能夠避免動物血清成分和異體細(xì)胞的添加，增加了細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的安全性。而且采用含有不同組分的培養(yǎng)基在細(xì)胞生產(chǎn)的特定階段進(jìn)行有針對性的培養(yǎng)，可以更好的滿足NK細(xì)胞在不同階段的生長需求，更有效的擴(kuò)增和活化NK細(xì)胞，培養(yǎng)獲得的NK細(xì)胞數(shù)量更多在臨床治療中也具有更高的活性。本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細(xì)說明，附圖說明附圖是用來提供對本公開的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構(gòu)成對本公開的限制。在附圖中：圖1是本公開的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中一種可選的實施方式的切向示意圖。圖2是本公開的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中一種可選的實施方式的俯視示意圖。圖3是本公開的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中一種可選的實施方式的部件示意圖。圖4是實施例和對比例NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)結(jié)果示意圖。圖5是實施例和對比例培養(yǎng)的NK細(xì)胞純度示意圖。圖6是實施例和對比例培養(yǎng)的NK細(xì)胞殺傷率結(jié)果示意圖。附圖標(biāo)記說明1細(xì)胞培養(yǎng)袋2磁性浮球3承載臺4磁性懸掛驅(qū)動器11進(jìn)氣口12出氣口13進(jìn)液口14出液口15人工瓣膜片31恒溫托盤32底座41磁體片42懸掛驅(qū)動架43懸臂431限位孔432驅(qū)動孔4310限位桿4311支撐架4320絲桿4321電動機(jī)具體實施方式以下結(jié)合附圖對本公開的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。本公開的第一個方面提供了一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基組合，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和活化適應(yīng)培養(yǎng)基；其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、慶大霉素和BSA；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成成分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、BSA、香菇多糖、靈芝多糖、茶多酚、大蒜素和紫杉醇；所述增殖培養(yǎng)基的組成成分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、BSA和白細(xì)胞介素；所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和谷氨酰胺。在本公開的具體實施過程中，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的不同階段依次先后使用所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和活化適應(yīng)培養(yǎng)基。在本公開的一種優(yōu)選的實施方式中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：慶大霉素50-90IU/mL，BSA100-300μg/mL，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：0.8-1.2。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的作用在于使得分離得到的單個核細(xì)胞能夠在培養(yǎng)的初始階段更快的適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境，從而能夠以較好的細(xì)胞生理狀態(tài)進(jìn)入后續(xù)的誘導(dǎo)和增殖過程，獲得適用于進(jìn)一步誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞。分離得到的單個核細(xì)胞可以在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1-2天?？蛇x的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還可以含有其他來自天然中藥物質(zhì)的提取物，所述天然中藥提取物可以為已經(jīng)證實對NK細(xì)胞的增殖有積極影響的中藥提取物種類，例如，所述中藥提取物包括但不限于人參多糖、人參皂苷、黃岑素、三七皂苷、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯、姜黃素、云芝多糖、沙苑子總黃酮、蟲草多糖、黃芪多糖、枸杞多糖、三葉青提取物等。本公開對于添加的天然中藥提取物的量沒有特別的限制，只要能夠有效的提高細(xì)胞的增殖數(shù)量和活性即可?？蛇x的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還可以含有細(xì)胞培養(yǎng)中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、氨基酸、無機(jī)鹽、抗生素等。在本公開的一種優(yōu)選的實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、香菇多糖50-80μg/mL、靈芝多糖50-80μg/mL、茶多酚20-40μg/mL、大蒜素20-40μg/mL、紫杉醇20-40μg/mL，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：1-1.4。更為優(yōu)選的，為了提高誘導(dǎo)培養(yǎng)效果，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：BSA120-260μg/mL、香菇多糖60-70μg/mL、靈芝多糖60-70μg/mL、茶多酚25-35μg/mL、大蒜素25-35μg/mL、紫杉醇25-35μg/mL，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：1-1.4。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用在于通過合理配比利用具有誘導(dǎo)激活作用的物質(zhì)，對NK細(xì)胞進(jìn)行激活，促使其分泌細(xì)胞因子進(jìn)而加快細(xì)胞的增殖。基礎(chǔ)培養(yǎng)后的細(xì)胞可以在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)2-4天獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞?？蛇x的，所述增殖培養(yǎng)基中還可以含有細(xì)胞培養(yǎng)中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、氨基酸、無機(jī)鹽、抗生素等?？蛇x的，所述增殖培養(yǎng)基還可以含有其它具有NK細(xì)胞刺激作用的細(xì)胞因子組分，例如腫瘤壞死因子、表皮生長因子、卵泡刺激因子等；所述白介素可以為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21中的一種或多種。在本公開的一種特別優(yōu)選的實施方式中，所述白細(xì)胞介素為IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：BSA100-300μg/mL、IL-125-15ng/mL、IL-155-15ng/mL、IL-185-15ng/mL和IL-215-15ng/mL，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：1.2-1.6。所述增殖培養(yǎng)基的作用在于通過合理配比和利用能夠促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的物質(zhì)實現(xiàn)細(xì)胞的大量體外增殖。誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞可以在所述增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)4-7天獲得增殖培養(yǎng)細(xì)胞。所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基還可以含有細(xì)胞培養(yǎng)中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、氨基酸、無機(jī)鹽、抗生素等。優(yōu)選的，所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基包括以下含量的各組分：胰島素1.5-3μg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM，RPMI-1640培養(yǎng)基與GT-T551培養(yǎng)基的體積比為1：2-4。所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基的作用在于為增殖培養(yǎng)后的NK細(xì)胞提供接近體內(nèi)條件的營養(yǎng)環(huán)境，使得NK細(xì)胞在臨床應(yīng)用時能夠更為有效的發(fā)揮生物學(xué)作用，增殖培養(yǎng)后的細(xì)胞可以在所述活化適應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5-1.5天。本公開的第二個方面提供一種NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括使用本公開第一個方面所述的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基組合，所述方法包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)：將分離的單個核細(xì)胞接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天獲得基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)：將所述基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞；增殖培養(yǎng)：將所述誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天獲得增殖培養(yǎng)細(xì)胞；活化適應(yīng)：將所述增殖培養(yǎng)細(xì)胞接種于活化適應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5-1.5天。在本公開的第二個方面中，每次進(jìn)行細(xì)胞接種的細(xì)胞密度為4.5×105個/mL-5.5×105個/mL。細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括在5％CO2，37℃的環(huán)境下進(jìn)行。其中，在所述增殖培養(yǎng)階段，優(yōu)選每兩天進(jìn)行一次細(xì)胞傳代并更換一次新鮮的增殖培養(yǎng)基，傳代可以利用本領(lǐng)域常規(guī)的NK細(xì)胞傳代方法進(jìn)行。在本公開的一種可選的實施方式中，所述分離的單個核細(xì)胞可以是通過如下方式得到的：采用人淋巴細(xì)胞分離液，利用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，可選的，所述淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.080。在本公開的一種可選的實施方式中，包括將所述PBMC細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選，從而得到NK細(xì)胞。本公開對于磁珠分選的方法沒有特別的限制，可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的NK細(xì)胞磁珠分選方式進(jìn)行。在本公開的一種優(yōu)選的實施方式中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)階段、誘導(dǎo)培養(yǎng)階段、增殖培養(yǎng)階段和活化適應(yīng)階段在免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中進(jìn)行，該裝置包括細(xì)胞培養(yǎng)袋1和承載所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的承載臺3，其中，該裝置還包括容納于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中的磁性浮球2以及在懸掛于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方并且能夠驅(qū)動所述磁性浮球2在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中移動的磁性懸掛驅(qū)動器4，所述磁性懸掛驅(qū)動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅(qū)動所述磁體片41在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方移動的懸掛驅(qū)動架42；所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中充有細(xì)胞培養(yǎng)液，述細(xì)胞培養(yǎng)液中含有培養(yǎng)基以及待擴(kuò)增的細(xì)胞；所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養(yǎng)液液面上；所述磁體片41能夠在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方往復(fù)移動，從而通過磁力的作用，驅(qū)動所述磁性浮球2在漂浮狀態(tài)下在培養(yǎng)液液面往復(fù)移動，所述磁性浮球2在培養(yǎng)液液面以下的部分能夠攪拌培養(yǎng)液，從而在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中模擬血液流動的體內(nèi)環(huán)境。其中，在使用狀態(tài)下，所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中充有細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液中含有培養(yǎng)基以及待擴(kuò)增的細(xì)胞，其中，所述培養(yǎng)基為本公開所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基或活化適應(yīng)培養(yǎng)基。所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養(yǎng)液液面上。所述磁體片41能夠在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方往復(fù)移動，從而通過磁力的作用，驅(qū)動所述磁性浮球2在漂浮狀態(tài)下在培養(yǎng)液液面往復(fù)移動，所述磁性浮球2在培養(yǎng)液液面以下的部分能夠發(fā)揮柔和地攪拌培養(yǎng)液的作用，從而在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中模擬血液流動的體內(nèi)環(huán)境，由此促進(jìn)待擴(kuò)增的細(xì)胞的生長和增殖。所述磁體片41可以為永磁體或電磁體。所述磁體片41的形狀可以設(shè)置為弧形，以維持所述磁性浮球2的穩(wěn)定?？蛇x地，所述懸掛驅(qū)動架42包括固定連接在所述磁體片41上的懸臂43；所述懸臂43上開設(shè)有至少一個限位孔431和至少一個設(shè)置有內(nèi)螺紋的驅(qū)動孔432；所述懸掛驅(qū)動架42還包括至少二個支撐架4311以及限位連接在所述支撐架4311上的限位桿4310和絲桿4320；所述限位桿4310可滑動地穿過所述限位孔431；所述絲桿4320上設(shè)置有與所述驅(qū)動孔432的內(nèi)螺紋匹配的外螺紋并螺旋穿過所述驅(qū)動孔432，且所述絲桿4320能夠通過繞軸線轉(zhuǎn)動驅(qū)動所述懸臂43沿所述限位桿4310滑動。其中，所述懸掛驅(qū)動架42可以不限于上述結(jié)構(gòu)，只要能驅(qū)動所述磁體片41移動即可。所述懸臂43和所述支撐架4311的高度可以設(shè)置為能夠按需要調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)。所述磁體片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以進(jìn)行合理地調(diào)節(jié)，只要能維持所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養(yǎng)液液面上且所述磁性浮球2在磁力作用下能夠移動即可。所述磁體片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以通過所使用的磁性材料的性能和數(shù)量的合理改變而得到合理調(diào)節(jié)。所述磁體片41的數(shù)量可以為一個或多個，所述磁性浮球2的數(shù)量也可以為一個或多個?？蛇x地，該裝置還包括能夠驅(qū)動所述絲桿4320進(jìn)行軸向轉(zhuǎn)動的電動機(jī)4321。所述電動機(jī)4321的轉(zhuǎn)速可以通過控制器進(jìn)行合理地控制，避免磁性浮球2的移動速度過快或過慢?？蛇x地，在該裝置的使用狀態(tài)下，所述磁性浮球2能夠不與所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的壁接觸。也就是說，所述磁體片41與所述磁性浮球2之間的磁力應(yīng)當(dāng)小于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2脫離培養(yǎng)液液面。同時，所述磁體片41與所述磁性浮球2之間的磁力與所述磁性浮球2的合力應(yīng)當(dāng)大于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2沉底?？蛇x地，在該裝置的使用狀態(tài)下，以所述磁性浮球2的體積計，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中的細(xì)胞培養(yǎng)液液面以上且剩余部分位于液面以下。這樣可以使得所述磁性浮球2便于移動，且具有較好的驅(qū)動液流的攪拌效果?？蛇x地，所述磁性浮球2的外殼為具有生物相容性的外殼，且所述磁性浮球2中設(shè)置有用于提供浮力的空腔。其中，生物相容性的外殼可以使用細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的常規(guī)生物相容性材料制成，例如使用聚乳酸塑料、納米羥基磷灰石材料和聚醚醚酮材料制成。用于提供浮力的空腔可以為一個或多個，空腔中可以填充輕質(zhì)材料，例如泡沫塑料。所述磁性浮球2中所使用的磁性材料可以為永磁體和/或軟磁體。可選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上開設(shè)有可封閉的進(jìn)氣口11、出氣口12、進(jìn)液口13和出液口14中的至少一者。其中，所述進(jìn)氣口11可以用于通入新鮮的培養(yǎng)用氣體(例如體積百分比分別為95％的空氣與5％的二氧化碳的混合氣體)。所述出氣口12可以實現(xiàn)培養(yǎng)用氣體的循環(huán)。通入新鮮的培養(yǎng)用氣體可以帶有高于大氣壓的壓力，所述出氣口12可以連接有限壓閥。進(jìn)液口13可以用于向所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1充入含有培養(yǎng)基以及待擴(kuò)增的細(xì)胞的培養(yǎng)液。所述出液口14可以用于排出舊的培養(yǎng)基或者排出培養(yǎng)擴(kuò)增后的培養(yǎng)液?？蛇x地，所述出氣口12和/或所述出液口14上設(shè)置有能夠阻止細(xì)胞通過的篩網(wǎng)。例如所述出液口14上可以設(shè)置有濾布，在開啟所述出液口14時，可以將廢舊培養(yǎng)基過濾排出而將細(xì)胞過濾留存在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1以內(nèi)。也可以從所述出液口14反向通入新鮮培養(yǎng)基而將濾布上的細(xì)胞反向沖洗至細(xì)胞培養(yǎng)袋1以內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增?？蛇x地，所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的內(nèi)部還設(shè)置有模擬血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述人工瓣膜片15可以適當(dāng)?shù)啬M生理狀態(tài)下的血管瓣膜，也可以適當(dāng)?shù)卦黾訑嚢枰毫餍Ч？蛇x地，所述承載臺3包括能夠維持細(xì)胞培養(yǎng)恒溫的恒溫托盤31和支撐所述恒溫托盤31的底座32。所述恒溫托盤31可以在15-40℃的溫度內(nèi)選擇一個溫度區(qū)間保持恒溫，從而使得細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增能夠脫離復(fù)雜的培養(yǎng)設(shè)備而獨立運(yùn)行。本公開提供的用于細(xì)胞體外擴(kuò)增的裝置所提供的擴(kuò)增條件優(yōu)于不進(jìn)行攪拌的培養(yǎng)擴(kuò)增條件，也優(yōu)于其他非懸浮式底部磁性攪拌的培養(yǎng)擴(kuò)增條件，能夠取得更好的擴(kuò)增效果。所述免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置能夠在體外模擬NK細(xì)胞的體內(nèi)增殖環(huán)境，實現(xiàn)模擬血管流動狀態(tài)的蠕動式非接觸攪拌，使得免疫細(xì)胞在培養(yǎng)過程中降低團(tuán)聚并充分吸收本公開所述的培養(yǎng)基中的養(yǎng)分并接受信號分子的刺激，提高擴(kuò)增的細(xì)胞收率以及細(xì)胞活性。以下結(jié)合實施例具體說明本公開的技術(shù)方案。實施例1按照表1中給出的培養(yǎng)基成分配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和活化適應(yīng)培養(yǎng)基備用。健康志愿者晨起空腹于肘靜脈抽取25mL外周血，加肝素抗凝；利用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，收集單個核細(xì)胞層，用PBS離心洗滌后計數(shù)A，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基對分離的單個核細(xì)胞進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/mL，在本公開所述的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，首先在5％CO2，37℃的環(huán)境下進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)1.5天獲得基礎(chǔ)培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞離心收集起來，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/mL，在5％CO2，37℃的環(huán)境下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)3天獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞離心收集起來，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/mL，在5％CO2，37℃的環(huán)境下進(jìn)行增殖培養(yǎng)6天(每兩天傳代換液一次)獲得增殖培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞離心收集起來，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/mL，在5％CO2，37℃的環(huán)境下，進(jìn)行活化適應(yīng)培養(yǎng)1天后收集活化后細(xì)胞并計數(shù)B，計算細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)用B除以A獲得的數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。將所述活化后細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后調(diào)整細(xì)胞密度后用流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，為細(xì)胞純度結(jié)果。結(jié)果如表5和圖4-5所示。以對數(shù)生長期的A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以所述活化后細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，按照1：1、10：1、20:1的效靶比將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合，同時設(shè)效應(yīng)細(xì)胞孔、靶細(xì)胞孔，每組均設(shè)3個平行孔，每孔終體積為200μl，37℃、5％，CO2培養(yǎng)箱中孵育，12h后每孔加入20μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測450nm時的OD值，計算NK細(xì)胞的殺傷率。結(jié)果如表6和圖6所示。本實施例中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的裝置為免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置，所述裝置包括細(xì)胞培養(yǎng)袋1和承載所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的承載臺3，該裝置還包括容納于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中的磁性浮球2以及在懸掛于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方并且能夠驅(qū)動所述磁性浮球2在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中移動的磁性懸掛驅(qū)動器4，所述磁性懸掛驅(qū)動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅(qū)動所述磁體片41在所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上方移動的懸掛驅(qū)動架42。所述懸掛驅(qū)動架42包括固定連接在所述磁體片41上的懸臂43；所述懸臂43上開設(shè)有一個限位孔431和一個設(shè)置有內(nèi)螺紋的驅(qū)動孔432；所述懸掛驅(qū)動架42還包括二個支撐架4311以及限位連接在所述支撐架4311上的限位桿4310和絲桿4320；所述限位桿4310可滑動地穿過所述限位孔431；所述絲桿4320上設(shè)置有與所述驅(qū)動孔432的內(nèi)螺紋匹配的外螺紋并螺旋穿過所述驅(qū)動孔432，且所述絲桿4320能夠通過繞軸線轉(zhuǎn)動驅(qū)動所述懸臂43沿所述限位桿4310滑動。電動機(jī)4321驅(qū)動所述絲桿4320進(jìn)行軸向轉(zhuǎn)動。所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1上開設(shè)有可封閉的進(jìn)氣口11、出氣口12、進(jìn)液口13和出液口14。所述出氣口12和所述出液口14上設(shè)置有能夠阻止細(xì)胞通過的篩網(wǎng)。所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的內(nèi)部還設(shè)置有模擬血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述承載臺3包括能夠維持細(xì)胞培養(yǎng)恒溫的恒溫托盤31和支撐所述恒溫托盤31的底座32。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，所述磁性浮球2不與所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1的壁接觸，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述細(xì)胞培養(yǎng)袋1中的細(xì)胞培養(yǎng)液液面以上且剩余部分位于液面以下。所述磁性浮球2的外殼為具有生物相容性的外殼，且所述磁性浮球2中設(shè)置有用于提供浮力的空腔。所述免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置的切向示意圖如圖1所示、俯視示意圖如圖2所示，懸掛驅(qū)動架部件示意圖如圖3所示。表1實施例2用實施例1的方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，所使用的各培養(yǎng)基的組成成分如表2所示。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。表2實施例3用實施例1的方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，所使用的各培養(yǎng)基的組成成分如表3所示。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。表3實施例4用實施例1的方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，增殖培養(yǎng)基中不添加IL-18。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。實施例5用實施例1的方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，培養(yǎng)不使用本公開所述的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置，改為在常規(guī)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。對比例1按照表4中給出的培養(yǎng)基成分配制培養(yǎng)基。健康志愿者晨起空腹于肘靜脈抽取25mL外周血，加肝素抗凝；利用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，收集單個核細(xì)胞層，用PBS離心洗滌后計數(shù)，用培養(yǎng)基對分離的單個核細(xì)胞進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/mL，在本公開所述的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在5％CO2，37℃的環(huán)境下培養(yǎng)12天，每兩天傳代換液一次，培養(yǎng)結(jié)束后檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度和殺傷率。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。表4對比例2用實施例1的方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，不進(jìn)行活化適應(yīng)培養(yǎng)。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度和殺傷率。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。對比例3用實施例1的方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，區(qū)別僅在于，培養(yǎng)基組合中不添加GT-T551培養(yǎng)基，僅使用RPMI-1640培養(yǎng)基。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度和殺傷率。檢測細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、純度結(jié)果如表5和圖4、5所示，NK細(xì)胞的殺傷率結(jié)果如表6和圖6所示。表5組別擴(kuò)增倍數(shù)(倍)純度(％)實施例118693.62實施例217292.27實施例317791.85實施例416290.43實施例516690.86對比例19376.21對比例212878.36對比例313683.47表6通過以上實施例可以看出，利用本公開所提供的NK細(xì)胞體外培養(yǎng)基組合和培養(yǎng)方法進(jìn)行NK細(xì)胞體外培養(yǎng)，擴(kuò)增倍數(shù)可以高達(dá)186倍，純度可以達(dá)到93.62％，效靶比20:1時殺傷率可以達(dá)到93％。并且，優(yōu)選在本公開所述的免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增裝置中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時，能獲得更高的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、純度和殺傷率。并且，優(yōu)選在增殖培養(yǎng)基中添加IL-18的情況下，能獲得更高的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、純度和殺傷率。并且，優(yōu)選培養(yǎng)基組合中含有GT-T551培養(yǎng)基時能獲得更高的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、純度和殺傷率。以上詳細(xì)描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本公開所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3