本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種純化分離蛋白抗體F(ab')₂和Fc片段的方法。

背景技術(shù)：

在生物制藥領(lǐng)域，單克隆抗體藥物包含同源單克隆抗體及重組單克隆抗體,在重組單克隆抗體中,其F(ab')₂和Fc片段來源于不同的兩個種屬之間，通過基因工程將兩個片段重組后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以生產(chǎn)抗體蛋白.在蛋白抗體結(jié)構(gòu)分析中，由于F(ab')₂和Fc片段其來源、功能及結(jié)構(gòu)的差異,各片段的結(jié)構(gòu)功能分析對整體蛋白的結(jié)構(gòu)功能判斷分析有重要指導(dǎo)意義。例如，由于蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用可引起F(ab')₂和Fc片段上的寡糖種類的差異，而抗體蛋白寡糖的種類對抗體結(jié)合活性，生物活性，藥物半衰期，電荷異構(gòu)性等有重要影響，是抗體蛋白質(zhì)量檢驗(yàn)中不可或缺的部分，因此需要對F(ab')₂和Fc片段進(jìn)行分離純化以便后續(xù)質(zhì)檢實(shí)驗(yàn)分析。由于F(ab')₂片段上寡糖種類復(fù)雜，寡糖末端鏈接的唾液酸對抗體電荷異構(gòu)有重要影響，且受到培養(yǎng)基基質(zhì)，培養(yǎng)條件等因素影響較多，F(xiàn)(ab')₂片段的分離純化對其后的分析尤為重要。

目前一般完整蛋白從酶解到分離純化為各片段的實(shí)驗(yàn)室流程分為蛋白酶解、蛋白A親和層析純化分離、樣品脫鹽濃縮及更換保存緩沖液。流程如下：(1)蛋白抗體經(jīng)過特異性酶解后，抗體分離為F(ab')₂和Fc片段。(2)酶解后抗體片段經(jīng)過蛋白A親和層析進(jìn)行分離純化。如圖1所示，各片段收集過程根據(jù)UV 280nm值信號變化開始和結(jié)束收集。圖中實(shí)線為UV280nm信號值變化曲線，虛線為緩沖液pH值變化曲線。使用平衡流動相(20mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4±01)平衡蛋白A親和層析柱后開始進(jìn)樣，由于F(ab')₂不能被吸附在蛋白A層析柱上，這部分片段將首先被沖洗出系統(tǒng)。信號上升時開始收集，信號降落到基線附近停止收集。更換流動相為50mM檸檬酸緩沖液(pH 3.8±0.1)將Fc片段從層析柱中洗脫，信號上升時開始收集，信號降落到基線附近停止收集。(3)抗體片段緩沖液置換及濃縮：經(jīng)過蛋白A親和層析分離純化的抗體片段使用超濾管或溶液置換裝置更換溶液緩沖液及樣品濃縮。使用10kDa超濾管在14000g高速離心去除分離純化緩沖液并濃縮至一定濃度以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析使用。

現(xiàn)有技術(shù)中的方法存在以下缺點(diǎn)：(1)耗時長。酶解后樣品需要經(jīng)過純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，并且純化分離后樣品體積大大增加，需要使用超濾裝置或溶液置換裝置進(jìn)行溶液更換及濃縮。并且，不同蛋白抗體分離純化不能同時進(jìn)行分離純化，純化時間隨樣品數(shù)量的增加而增加。純化后處理的超濾或者溶液置換隨樣品體積的增加而增加。根據(jù)樣品數(shù)量的不同,一般超濾或溶液置換的時間可由數(shù)十分鐘到數(shù)小時，甚至十?dāng)?shù)小時。(2)實(shí)驗(yàn)成本高。實(shí)驗(yàn)室需要配備純化系統(tǒng)，超高速離心機(jī)，超濾裝置或溶液置換裝置等實(shí)驗(yàn)儀器，實(shí)驗(yàn)使用流動相，超濾管，蛋白A親和層析填料等試劑耗材較多，均大大增加實(shí)驗(yàn)成本。(3)樣品及試劑消耗量大。為增加回收率，單次需至少使用2mg樣品進(jìn)行蛋白A親和層析，需使用較多量的酶進(jìn)行酶解分離。同時,純化分離及最后溶液置換步驟中要配制大量緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(4)對實(shí)驗(yàn)人員要求高。實(shí)驗(yàn)人員需要具備操作純化系統(tǒng)，超濾裝置或溶液置換裝置能力；實(shí)驗(yàn)人員需要具備有蛋白樣品處理，純化，超濾及溶液置換等經(jīng)驗(yàn)。人員數(shù)量及實(shí)驗(yàn)各綜合能力要求較高。(5)回收率及終樣品濃度難以控制。經(jīng)過純化分離及后續(xù)超濾濃縮后，由于樣品轉(zhuǎn)移次數(shù)較多，極容易造成樣品在處理過程中回收率降低，直接導(dǎo)致最后樣品濃度難以確認(rèn)，可對后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析造成影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種操作簡便、純化效率高、能夠快速、高效純化分離蛋白抗體F(ab')₂和Fc片段的方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種快速純化分離蛋白抗體F(ab')₂和Fc片段的方法，其包括蛋白酶解步驟和蛋白A磁珠純化步驟。

優(yōu)選地，所述蛋白酶解步驟的操作如下：

在66μg濃度為1mg/mL的抗體蛋白溶液中加入2μL濃度為67μg/μL的酶，混勻，37℃恒溫孵育2小時。待孵育結(jié)束后，室溫冷卻，加入32μL 0.02M PBS，混勻，得到抗體酶解樣品。如抗體蛋白量較多，為充分酶解可相應(yīng)延長孵育時間。

優(yōu)選地，所述蛋白A磁珠純化步驟的操作包括：

步驟1.取100-150μL蛋白A磁珠，去除磁珠保存液；使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，劇烈振蕩10秒，然后進(jìn)行磁珠吸附，移除第一上清液。

步驟2.添加100μL所述抗體酶解樣品與磁珠渦旋混勻，室溫振蕩孵育30-50分鐘。期間可渦旋或手動混勻以防止磁珠聚集沉淀。

步驟3.孵育結(jié)束，離心，待磁珠吸附。溶液澄清后移出第二上清液，由所述第二上清液中得到純化的F(ab')₂片段。

步驟4.使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，渦旋后離心，待磁珠吸附后移除第三上清液。此步驟優(yōu)選重復(fù)3次以上，更優(yōu)選重復(fù)3-5次。

步驟5.添加50μL 0.2M Glycine-HCl緩沖液，充分渦旋混勻，室溫靜置5-8分鐘。

步驟6.離心，待磁珠吸附，溶液澄清后移出第四上清液，由所述第四上清液中得到純化的Fc片段。

更優(yōu)選地，該方法還包括在獲得純化的Fc片段后，添加5μL 1M Tris于第四上清液中，中和Fc片段溶液pH以保存抗體片段。

本發(fā)明的方法利用抗體Fc片段可與蛋白A特異性吸附及磁場力的原理將抗體片段分離。首先使用包被有蛋白A的磁珠在堿性條件下特異性吸附已經(jīng)分離的Fc片段，然后將樣品置于磁力架上，磁珠將在磁場力聚集沉淀，而未被吸附的F(ab')₂片段將留在溶液中，使用移液槍移出含有F(ab')₂溶液并保存，最后在酸性條件下將吸附于磁珠上的Fc片段分離，使用磁力架將磁珠聚集沉淀，移出Fc片段溶液并保存。

該方案從完整蛋白到酶解分離純化最快可于3小時內(nèi)完成。利用F(ab')₂，F(xiàn)c特異性剪切酶將抗體片段分離，再使用商業(yè)化蛋白A/G包被磁珠(例如PureProteome^TM Magnetic beads，Millipore)對酶解溶液進(jìn)行分離純化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法可大大減少實(shí)驗(yàn)使用時間及實(shí)驗(yàn)費(fèi)用；樣品無需經(jīng)過純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，并且可同步進(jìn)行多品種蛋白抗體片段的分離純化；同時，抗體片段純化分離后無需再進(jìn)行超濾或溶液置換以更換保存溶液和樣品濃縮,包括酶解分離在內(nèi)，可使所有實(shí)驗(yàn)流程縮短至3小時.由于無需使用純化系統(tǒng)、親和層析填料、層析柱、超濾系統(tǒng)或溶液置換系統(tǒng)、高速離心機(jī)、超濾管等昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器及耗材，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本及儀器維護(hù)成本；蛋白A包被磁珠可重復(fù)利用至少三次，并且實(shí)驗(yàn)過程所有使用溶液體積均為微升級別，消耗極少量的蛋白樣品及緩沖溶液，同時無需配制純化流動相或保存緩沖液，進(jìn)一步簡化實(shí)驗(yàn)操作并降低成本。

由于樣品體積小且無需多次轉(zhuǎn)移，本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)過程中可對樣品的濃度進(jìn)行良好的控制，最后純化分離后的樣品濃度明確，可直接保存在洗出溶液中或進(jìn)行后續(xù)分析實(shí)驗(yàn)。

此外，此實(shí)驗(yàn)操作流程簡易，實(shí)驗(yàn)人員無需經(jīng)過大量專業(yè)培訓(xùn)即可完成操作，可以很好的規(guī)避操作人員在復(fù)雜實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的失誤。

附圖說明

圖1是現(xiàn)有技術(shù)中蛋白A親和層析分離F(ab')₂和Fc片段實(shí)驗(yàn)各監(jiān)視信號值變化標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

圖2是抗體片段的SDS-PAGE結(jié)果。

圖3是純化系統(tǒng)樣品分離純化時間信號圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。

本發(fā)明中磁珠分離步驟需要使用的試劑耗材如下:PBS溶液,pH 7.0-7.5；0.2M Glycine-HCl,pH 2.5-3.0；1M Tris,pH 8.5；蛋白A包被磁珠；磁力架；微孔板振蕩器。

本發(fā)明方法的具體實(shí)驗(yàn)操作流程見下(從完整蛋白到片段分離純化)：

一、蛋白酶解

1、在66μg抗體蛋白溶液(1mg/mL)中加入2μL(67μg/μL)酶，混勻，37℃恒溫孵育2小時(如抗體蛋白量較多，為充分酶解可相應(yīng)延長孵育時間)。

2、孵育結(jié)束，室溫冷卻。添加32μL 0.02M PBS至上述溶液中，混勻，得到抗體酶解樣品。

二、蛋白A磁珠純化

1、取出100-150μL商業(yè)化蛋白A磁珠(PureProteome^TM Magnetic beads，Millipore)放入新1.5mL離心管，根據(jù)說明去除磁珠保存液。使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，渦旋振蕩器劇烈振蕩10秒后將離心管置于磁力架，待磁珠吸附后，移液槍移出上清液。

2、添加抗體酶解樣品共100μL入磁珠離心管中，渦旋混勻，室溫振蕩孵育30-50分鐘。期間可渦旋或手動混勻以防止磁珠聚集沉淀。

3、孵育結(jié)束，離心，放置離心管于磁力架上待磁珠吸附。溶液澄清后使用移液槍移出上清液并保存在新1.5mL離心管①中。注意吸取樣品是不要碰觸磁珠。新離心管①中為純化F(ab')₂片段，濃度約為0.44mg/mL。

4、使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，渦旋后離心，放置于磁力架上，待磁珠吸附后移除上清液。此步驟重復(fù)3次或以上，優(yōu)選3-5次。

5、添加50μL 0.2M Glycine-HCl緩沖液，充分渦旋混勻，室溫靜置5-8分鐘。

6、離心，放于磁力架上，待磁珠吸附，移出上清液至新1.5mL離心管②中。此管樣品為純化Fc片段，濃度約為0.44mg/mL。

7、添加5μL 1M Tris于Fc片段溶液中，以中和溶液pH。

若重復(fù)使用磁珠，可向磁珠中添加100μL 0.2M Glycine-HCl緩沖液，充分渦旋混勻，室溫靜置3-5分鐘。離心后放于磁力架上，待磁珠吸附，移出上清液。添加500μL 0.02M PBS清洗三次磁珠后即可重復(fù)利用磁珠。

實(shí)施例

此實(shí)驗(yàn)方案可在3小時內(nèi)取得樣品并且可立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，根據(jù)方案制備抗體片段。使用12％分離膠對酶解后樣品及三次重復(fù)磁珠分離樣品進(jìn)行分析驗(yàn)證。圖2為抗體片段的SDS-PAGE結(jié)果。圖中,Lane1為分子量Marker(Thermo)，Lane2為抗體內(nèi)切酶，Lane3為完整IgG，Lane4為酶切IgG，Lane5、7、9為F(ab')₂片段，Lane6、8、10為Fc片段。對比Lane5和6可見該方案分離效果確實(shí)可靠，F(xiàn)(ab')₂片段可與Fc片段完全分離。同時，重復(fù)利用磁珠可見F(ab')₂分離效果依舊理想(Lane5、7、9)，而Fc片段被磁珠全部捕獲(Lane6、8、10)。

可見，本方法能將Fc片段完全從酶解混合樣品中分離出來，純化效率高，分離出的F(ab')₂片段樣品可以直接進(jìn)行后續(xù)檢測，為相關(guān)分析質(zhì)檢實(shí)驗(yàn)提供可靠有效的數(shù)據(jù)。

與現(xiàn)有的分離方法相比，該方法可減少大部分實(shí)驗(yàn)成本，無需純化系統(tǒng)，超濾裝置，超高速離心機(jī)等昂貴實(shí)驗(yàn)儀器，僅需購置蛋白A/G包被磁珠及磁力架即可完成實(shí)驗(yàn)，且磁珠可重復(fù)利用三次以上而未見分離效果降低。此外，該方法還可大幅度減少實(shí)驗(yàn)時間，可在3小時內(nèi)完成抗體酶解及純化分離，而現(xiàn)有技術(shù)中使用純化系統(tǒng)分離2mg樣品通常需要耗時約2小時(見圖3，為純化系統(tǒng)樣品分離純化時間信號圖)。分離后收集抗體樣品液體體積分別可達(dá)到10-40mL，根據(jù)超濾管體積大小，使用超濾離心進(jìn)行濃縮及溶液置換需要耗時5-6小時或更多。

此外，本方法操作簡便，步驟清晰明了。無需復(fù)雜的處理步驟，同時減少樣品轉(zhuǎn)移的次數(shù)，實(shí)驗(yàn)中酶解后樣品只需轉(zhuǎn)移一次，磁珠純化分離后即可收獲樣品，減少實(shí)驗(yàn)步驟繁復(fù)所增加的實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)人員失誤，減少樣品在實(shí)驗(yàn)過程中的損失。樣品收獲后即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存于緩沖液中，無需更換樣品保存緩沖液。如需增加樣品量可根據(jù)方案等比例調(diào)整磁珠使用量，精確可靠。