本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的說是涉及一種異丁香酚單加氧酶操縱子基因及其重組載體和重組假單胞菌。
背景技術(shù)：
：香蘭素學(xué)名3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，也稱之為香草醛。目前香蘭素產(chǎn)品的主要用途有食品添加劑、醫(yī)藥中間體、飼料添加劑與其它(如電鍍增亮劑等)四個方面，各種用途的使用比例分別為食品添加劑接近50％、醫(yī)藥中間體接約20％、飼料添加劑約20％與其它用途約10％。作為食品添加劑，香蘭素可廣泛運(yùn)用在各種需要增加奶香氣息的調(diào)香食品中，如蛋糕、冷飲、巧克力、糖果、餅干、方便面、面包及各種炒貨產(chǎn)品中。除用作食品添加劑外，作為香料產(chǎn)品還廣泛應(yīng)用于日化香精與煙用香精的調(diào)配。香蘭素按原料與生產(chǎn)方法可以分為天然香蘭素與合成香蘭素二種。香蘭素天然存在于香莢蘭豆、秘魯香膏油、丁香花蕾油中，天然香蘭素主要來自于香莢蘭豆與利用天然原料通過生物技術(shù)合成二種途經(jīng)，僅在少量有特殊需要的場合使用，實(shí)際使用的香蘭素主要是合成香蘭素。大多數(shù)化學(xué)合成的香蘭素在純度、香氣、安全性等方面都亞于天然提取的香蘭素，并且化學(xué)工業(yè)廢棄物對環(huán)境存在很大的危害。隨著社會的發(fā)展，人們對高品質(zhì)綠色健康產(chǎn)品的追求，對安全性要求的提高，使得天然香蘭素供不應(yīng)求。因此，急切需要尋找一種生產(chǎn)天然安全的香精香料的方法。在生物技術(shù)不斷發(fā)展的今天，研究者將目光集中到如何將生物技術(shù)運(yùn)用于制備天然香精香料。在過去十幾年里，研究者報道以各種前體通過生物轉(zhuǎn)化的方式合成香蘭素，但都存在著原料成本高、反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率低、反應(yīng)步驟長、工藝步驟復(fù)雜，因此在工業(yè)化生產(chǎn)方面受到很大的限制。異丁香酚單加氧酶能夠?qū)⒍∠惴?、異丁香酚等底物轉(zhuǎn)化為香蘭素，是制備生物香蘭素的高效途徑。但目前現(xiàn)有已知的天然異丁香酚單加氧酶的野生型菌株，其菌株的產(chǎn)酶能力較弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，且由于野生型菌株其安全性不可預(yù)知，在生產(chǎn)食品及藥品用香蘭素時，難以獲得市場準(zhǔn)入許可，并且增加了食品藥品的安全風(fēng)險。另外，目前已知的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的基因工程重組菌株，其表達(dá)載體的宿主為大腸桿菌或者酵母菌，其對異丁香酚、阿魏酸、香蘭素等芳香酚、芳香醛等有機(jī)物的耐受性能較低，導(dǎo)致其表達(dá)效率及酶產(chǎn)量較低，進(jìn)而影響到香蘭素的產(chǎn)量。此外，異丁香酚單加氧酶基因的在大腸桿菌及酵母菌種的異源表達(dá)效率較低，并且需要添加對菌體有毒且價格昂貴的誘導(dǎo)劑，例如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)。另外，部分異丁香酚單加氧酶基因在大腸桿菌中表達(dá)時必需要添加Fe3+，F(xiàn)e2+等金屬離子伴侶，否則不具備異丁香酚單加氧酶活力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種異丁香酚單加氧酶操縱子基因，使得所述基因應(yīng)用于重組載體以及重組假單胞菌中后，能夠提高菌株對異丁香酚、阿魏酸、香蘭素等芳香酚、芳香醛等有機(jī)物的耐受性，進(jìn)而提高香蘭素產(chǎn)量，并且無需添加有毒的誘導(dǎo)劑即可生產(chǎn)；同時菌株生產(chǎn)的異丁香酚單加氧酶具有較高活性。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種異丁香酚單加氧酶操縱子基因，具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列或在SEQIDNO:1所示核苷酸序列基礎(chǔ)上依照假單胞菌的密碼子偏好性優(yōu)化后的核苷酸序列。針對以酵母或大腸桿菌作為異丁香酚單加氧酶重組表達(dá)載體宿主時，其重組表達(dá)載體宿主對異丁香酚、香草醛、阿魏酸等底物或產(chǎn)物的耐受性能較低的問題，以及異丁香酚單加氧酶操縱子基因異源表達(dá)效率較低的問題，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的異丁香酚單加氧酶操縱子基因，其包含了啟動子、調(diào)控因子基因和異丁香酚單加氧酶編碼基因，其中第1507個堿基至2943個堿基所在核酸序列為異丁香酚單加氧酶基因編碼序列，第382個堿基至第1332個堿基所在核酸序列為調(diào)控因子編碼基因序列。本發(fā)明還涉及根據(jù)假單胞菌的密碼子偏好性優(yōu)化的異丁香酚單加氧酶操縱子基因。所述的密碼子偏好性是指菌體對簡并性同義密碼子的偏好使用情況。由于編碼相同氨基酸的不同密碼子，在不同物種、不同生物體中使用的頻率并非完全地平均分布，也即絕大多數(shù)生物傾向于只利用這些密碼子中的一部分，該現(xiàn)象也稱密碼子的偏好性。其中那些被最頻繁利用的密碼子稱為最佳密碼子(optimalcodons)，而那些不被經(jīng)常利用的密碼子稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)，采用使用頻率較高的密碼子可能可以提高菌體的表達(dá)效率。所述的優(yōu)化方式為依據(jù)假單胞菌的密碼子使用頻率情況，將異丁香酚單加氧酶操縱子中的調(diào)控因子基因或者異丁香酚單加氧酶編碼基因中的使用頻率較低的同義密碼子所對應(yīng)的核苷酸三聯(lián)體，替換成具有較高使用頻率的同義密碼子所對應(yīng)的核苷酸三聯(lián)體，同時保證全長基因片段CG含量基本不變(優(yōu)化前后CG含量變動不超過5％，優(yōu)選的不超過1％)，同時盡量減少編碼基因?qū)?yīng)mRNA中反向上重復(fù)的序列出現(xiàn)的次數(shù)(invertedrepetitiveseq-uence)以減少可能發(fā)卡結(jié)構(gòu)(Hairpin)的數(shù)量。本發(fā)明中優(yōu)選惡臭假單胞菌KT2440密碼子偏好情況以及惡臭假單胞菌通用密碼子偏好情況，分別見表1和表2所示。上述優(yōu)化過程可以通過編寫任一一款實(shí)現(xiàn)上述功能的軟件實(shí)行，也可以采用公開的具有上述密碼子優(yōu)化功能的軟件實(shí)現(xiàn)，(例如http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/；http://www.jcat.de/；)。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明通過在線密碼子優(yōu)化軟件(http://www.jcat.de/)和OPTIMIZER針對異丁香酚單加氧酶編碼基因進(jìn)行隨機(jī)優(yōu)化，分別獲得了13條和8條，但是經(jīng)過構(gòu)建重組假單胞菌驗(yàn)證異丁香酚單加氧酶酶活，只有其中4條優(yōu)化后的基因(本發(fā)明SEQIDNO:2-5所示核苷酸序列的異丁香酚單加氧酶操縱子基因)構(gòu)建的菌株產(chǎn)酶酶活得到顯著提高，其他存在酶活下降或消失的現(xiàn)象，表明并非所有優(yōu)化后的基因構(gòu)建重組菌株后均可以實(shí)現(xiàn)提高酶活的目的。因此，作為優(yōu)選，優(yōu)化后的基因選自SEQIDNO:2-5任意一個所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述操縱子基因通過構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化至菌株后能夠具備較高酶活，并且對高濃度底物有較高耐受性，故本發(fā)明提出了所述操縱子基因在制備重組載體和/或重組假單胞菌中的應(yīng)用。其中，所述的載體可為本領(lǐng)域常用的各種載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選為質(zhì)粒，質(zhì)粒更優(yōu)選為pBBR1MCS系列質(zhì)粒，如pBBR1MCS-5-start質(zhì)粒，所述的pBBR1MCS-5-start質(zhì)?？捎缮唐坊a(chǎn)品質(zhì)粒pBBR1MCS根據(jù)文獻(xiàn)SonjaFedoraGordanaImprovementofpBBR1MCSplasmids,averyusefulseriesofbroad-host-rangecloningvectors所報道的方法步驟由本領(lǐng)域技術(shù)人員自行構(gòu)建獲得。所述假單胞菌可選自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)或硝基還原假單胞菌(Pseudomonasnitroreducens)，在本發(fā)明具體實(shí)施過程中可選擇惡臭假單胞菌KT2440或惡臭假單胞菌MTCC5279(均購置于廣東省微生物菌種保藏中心，GIMCC)。針對上述操縱子基因的應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，包括基礎(chǔ)質(zhì)粒和位于基礎(chǔ)質(zhì)粒上的所述操縱子基因。所述基礎(chǔ)質(zhì)粒如前述可選自pBBR1MCS質(zhì)粒，如pBBR1MCS-5-start質(zhì)粒(質(zhì)粒圖譜見圖1)。同時，由于本發(fā)明所述操縱子基因存在的原因，還提供了該重組質(zhì)粒在制備重組假單胞菌中的應(yīng)用，假單胞菌可具體選自前述所列各種假單胞菌。本發(fā)明所述重組質(zhì)粒構(gòu)建方式可參照本發(fā)明常規(guī)的載體構(gòu)建方法：a.根據(jù)本發(fā)明所述異丁香酚單加氧酶操縱子基因設(shè)計PCR上下游引物，并分別在其上下游引物中各自引入不同種類的核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；b.以本發(fā)明所述異丁香酚單加氧酶操縱子基因?yàn)槟０?，利用所設(shè)計的PCR上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得兩端連接有不同核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的異丁香酚單加氧酶操縱子基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與包含相同兩種限制性內(nèi)切酶的質(zhì)粒載體進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒。在具體實(shí)施方式過程中，本發(fā)明以基礎(chǔ)質(zhì)粒為pBBR1MCS-5-start為例進(jìn)行進(jìn)一步說明：a.根據(jù)本發(fā)明所述異丁香酚單加氧酶操縱子基因設(shè)計PCR上下游引物，分別為Iem-1和Iem-2，如下：Iem-1：5’-AGATCTCAGAGCCGGATAGATATACGACTTAATTAG-3'含BglII酶切位點(diǎn)；Iem-2：5’-CATATGTCTTGGCATGCACGCTTTACGAAGGG-3'含NdeI酶切位點(diǎn)；b.然后利用上述引物對本發(fā)明所述操縱子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start分別用限制性內(nèi)切酶BglII和NdeI在37℃處理2-12小時，純化回收；將酶切純化后的質(zhì)粒和目的基因序列按物質(zhì)的量之比1:3混合，利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，22℃溫育4-5小時；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中，獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem。根據(jù)本發(fā)明前述提供的應(yīng)用，進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種重組假單胞菌，其轉(zhuǎn)化有本發(fā)明所述重組質(zhì)粒。所述假單胞菌同樣可以選自前述任意一種所列舉的假單胞菌。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化手段是指使用現(xiàn)有技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)手段將目的DNA(包含質(zhì)粒載體)導(dǎo)入易感宿主細(xì)胞，包括使用化學(xué)法、氯化鈣熱激法、電擊轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法及其它微生物轉(zhuǎn)化方法，優(yōu)選的為電擊轉(zhuǎn)化法。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具體的電擊轉(zhuǎn)化方法：①挑取假單胞菌單菌落接種于培養(yǎng)基(優(yōu)選的為LB培養(yǎng)基)中，30℃,220轉(zhuǎn)/分鐘過夜培養(yǎng)，至菌液濁度OD600接近0.6時；取1mL過夜培養(yǎng)的種子液接入裝有50-100mLLB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，220轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3小時，至OD600＝0.5-0.6；②將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻20-30分鐘，4℃下5000rpm離心6分鐘，棄上清；③加50mL預(yù)冷至0℃的3M蔗糖無菌溶液重懸菌體，菌體充分?jǐn)U散后于4℃下5000rpm離心8分鐘，棄上清；④重復(fù)步驟③兩次后，加3mL預(yù)冷的3M蔗糖無菌溶液，置于冰浴中，分裝至1.5mL離心管中，每管100μL，加入構(gòu)建好的含有本發(fā)明所述異丁香酚單加氧酶操縱子基因的重組載體(如重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem)3μL，混均后加入到預(yù)冷的2mm電轉(zhuǎn)杯內(nèi)冰浴30分鐘；⑤打開電轉(zhuǎn)儀，2.5kv電壓電激后，迅速加入1mL預(yù)冷的無菌LB培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)入試管中，30℃緩慢振蕩培養(yǎng)2小時后，涂布到加有適當(dāng)慶大霉素的固體LB平板上，30℃倒置培養(yǎng)24小時，獲得含有重組載體的基因工程惡臭假單胞菌。同時，本發(fā)明提供了所述重組假單胞菌在制備催化異丁香酚轉(zhuǎn)化為香蘭素的催化劑和/或生產(chǎn)香蘭素中的應(yīng)用。所述催化劑為重組假單胞菌的菌體細(xì)胞、菌體細(xì)胞提取物、發(fā)酵液、發(fā)酵液提取物或重組假單胞菌產(chǎn)生的異丁香酚單加氧酶。本發(fā)明針對催化劑為異丁香酚單加氧酶時的情形，提供了其制備方法，將本發(fā)明所述重組假單胞菌接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，至培養(yǎng)基的濁度OD600值不再變化時，將培養(yǎng)基離心，收集菌體細(xì)胞，重懸并破碎菌體細(xì)胞，離心收集上清獲得異丁香酚單加氧酶。其中，所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均優(yōu)選為LB培養(yǎng)基，如蛋白胨10-12g/L、酵母粉5-7g/L、氯化鈉5-7g/L；進(jìn)一步優(yōu)選地，在發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括誘導(dǎo)劑和/或伴侶因子，所述誘導(dǎo)劑為異丁香酚、茴香腦、丁香酚、阿魏酸、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、松柏醛、松伯醇、甲苯、原兒茶醛中的一種或兩種以上，濃度為10-1000μmol，優(yōu)選10-20μmol；所述伴侶因子為Fe2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Mo2+、Ni2+、Zn2+、NADH、FAD、維生素C中的一種或兩種以上，濃度為10-20μmol；在誘導(dǎo)劑和伴侶因子為多種時，各誘導(dǎo)劑或伴侶因子的濃度相同，優(yōu)選地，誘導(dǎo)劑為異丁香酚和阿魏酸組合，伴侶因子為Fe3+和維生素C組合。上述方法中的活化培養(yǎng)優(yōu)選為在30℃，220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)12小時，發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選為在30℃，220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)。在將生產(chǎn)香蘭素的實(shí)施例中，采用本發(fā)明所述重組假單胞菌的菌體細(xì)胞為催化劑時，香草蘭的收率達(dá)到38.5％以上；采用所述重組假單胞菌產(chǎn)生的異丁香酚單加氧酶為催化劑時，香草蘭的收率達(dá)到38.5％以上。此外，在和表達(dá)異丁香酚單加氧酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的對比試驗(yàn)中，在異丁香酚濃度為0.1g/L時，大腸桿菌的香草蘭收率僅為3.41％，而本發(fā)明重組假單胞菌的香草蘭收率為70％，并且隨著異丁香酚濃度的逐漸升高，本發(fā)明重組假單胞菌的香草蘭收率并未出現(xiàn)明顯下降，均在70％以上，在異丁香酚濃度為1.2g/L時，達(dá)到最高的85％收率?；谏鲜黾夹g(shù)效果，本發(fā)明提供了一種香蘭素的制備方法，向本發(fā)明所述的催化劑中加入異丁香酚進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)后收集香蘭素；或?qū)⒈景l(fā)明所述重組假單胞菌活化后，加入異丁香酚并流加異丁香酚控制其濃度恒定，然后收集生成的香蘭素。作為優(yōu)選，所述制備方法為在pH9-10的甘氨酸或氫氧化鈉溶液中加入本發(fā)明所述的催化劑，然后加入異丁香酚和異丙醇，在17-30℃下恒溫振蕩器中反應(yīng)30-70h，然后收集生成的香蘭素。其中，所述甘氨酸或氫氧化鈉溶液濃度為0.05-0.1mol/L。催化劑為菌體細(xì)胞時，濃度為5g/L；催化劑為異丁香酚單加氧酶時，濃度為20-40g/L。作為優(yōu)選，所述制備方法可將所述重組假單胞菌接種于LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度為0.1-5g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度恒定，然后收集生成的香蘭素。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一段異丁香酚單加氧酶操縱子基因以及依照假單胞菌密碼偏好性優(yōu)化后的操縱子基因，該操縱子基因通過基因工程技術(shù)應(yīng)用于重組載體和重組工程菌構(gòu)建中，所獲得的重組假單胞菌對異丁香酚、香草醛、阿魏酸等底物或產(chǎn)物的耐受性較高，且應(yīng)用于香蘭素生產(chǎn)中無需添加有毒的誘導(dǎo)劑，香草蘭收率達(dá)到70％以上，同時異丁香酚單加氧酶具備較高酶活。附圖說明圖1所示為pBBR1MCS-5-start質(zhì)粒圖譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種異丁香酚單加氧酶操縱子基因及其重組載體和重組假單胞菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述基因、載體、重組菌株和相關(guān)應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的各種產(chǎn)品和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1：含異丁香酚單加氧酶操縱子基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建含異丁香酚單加氧酶操縱子基因的重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem的構(gòu)建。以SEQIDNO:1所示的異丁香酚單加氧酶操縱子基因?yàn)槟０?，利用引物Iem-1和Iem-2進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增后獲得在異丁香酚單加氧酶操縱子基因兩端連有不同限制性酶切位點(diǎn)的核酸序列，其中涉及的PCR反應(yīng)體系如下:其中涉及的引物為：Iem-1：5’-AGATCTCAGAGCCGGATAGATATACGACTTAATTAG-3'含BglII酶切位點(diǎn)；Iem-2：5’-CATATGTCTTGGCATGCACGCTTTACGAAGGG-3'含NdeI酶切位點(diǎn)；PCR程序?yàn)?首先94-95℃預(yù)變性5分鐘，之后采用94-95℃30秒，50-60℃30秒，68℃2分鐘三段溫度循環(huán)程序，待完成25-30次循環(huán)后，保持68℃10分鐘，最后程序降溫至10℃保溫。PCR擴(kuò)增回收的片段即為在異丁香酚單加氧酶操縱子基因(SEQIDNO:1)兩端分別連有BglII和NdeI限制性酶切位點(diǎn)的基因片段，其基因序列通過送至上海某生物科技公司進(jìn)行測序得到驗(yàn)證。將通過PCR擴(kuò)增獲得的兩端分別獲得的連有BglII和NdeI限制性酶切位點(diǎn)的異丁香酚單加氧酶操縱子基因(SEQIDNO:1)和質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start分別用限制性內(nèi)切酶BglII和NdeI處理(37℃,4小時)，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)分別回收目的片段，將酶切后的質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物序列按1:3的比例進(jìn)行連接反應(yīng)(22℃，4小時)；連接產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)篩選獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem。實(shí)施例2：表達(dá)異丁香酚單加氧酶惡臭假單胞菌KT2440重組基因工程菌的制備①惡臭假單胞菌KT2440感受態(tài)細(xì)胞的制備:挑取惡臭假單胞菌KT2440接種于LB培養(yǎng)基中，30℃,220rpm培養(yǎng)12小時，取1mL培養(yǎng)的菌液接入裝有50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃,220rpm培養(yǎng)3h，至OD600約0.6；將裝有菌液的三角瓶置于冰浴上冷卻30分鐘，4℃下5000rpm離心5分鐘，棄上清；加50mL預(yù)冷至0℃的3M蔗糖無菌溶液重懸菌體，使菌體充分?jǐn)U散后于4℃下5000rpm離心8分鐘，棄上清；加3M蔗糖無菌溶液搖勻，置于冰浴中，獲得惡臭假單胞菌KT2440感受態(tài)細(xì)胞。②質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem的電轉(zhuǎn)化按照實(shí)施例1所述方法，構(gòu)建異丁香酚單加氧酶操縱子基因重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem。取100uL惡臭假單胞菌KT2440感受態(tài)細(xì)胞于1.5mL離心管中，加入10μL構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem，混合均勻后加入到預(yù)冷的電脈沖杯內(nèi)冰浴30分鐘；打開電轉(zhuǎn)儀，按設(shè)定的轉(zhuǎn)化程序進(jìn)行電激(2.5kV)；電激后向電脈沖杯內(nèi)迅速加入1mL預(yù)冷的無菌LB培養(yǎng)基，混勻后，轉(zhuǎn)入試管中，30℃緩慢振蕩培養(yǎng)2小時后，涂布到加有適當(dāng)濃度慶大霉素的選擇平板上，30℃倒置培養(yǎng)36小時，獲得含有重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌。實(shí)施例3：表達(dá)異丁香酚單加氧酶惡臭假單胞菌MTCC5279重組基因工程菌的制備依照實(shí)施例2所述步驟進(jìn)行重組基因工程菌的制備，不同的是所使用的重組質(zhì)粒的宿主為惡臭假單胞菌MTCC5279。實(shí)施例4：異丁香酚單加氧酶操縱子基因的密碼子偏好序列的在線優(yōu)化利用在線基因序列優(yōu)化軟件優(yōu)化異丁香酚單加氧酶基因提高表達(dá)量和酶活，主要包括以下步驟：1、打開在線密碼子優(yōu)化軟件(http://www.jcat.de/)；2、在序列框中輸入異丁香酚加氧酶的編碼基因序列；3、選取宿主菌類型；4、提交序列，進(jìn)行部分隨機(jī)序列優(yōu)化，一共隨機(jī)生成13條優(yōu)化后的異丁香酚加氧酶的編碼基因序列，將優(yōu)化后的異丁香酚單加氧酶的編碼基因序列替換原異丁香酚加氧酶操縱子基因序列中的異丁香酚加氧酶的編碼基因序列，從而獲得13條密碼子偏好性優(yōu)化后的的異丁香酚單加氧酶操縱子基因序列；5、按照13條優(yōu)化后的異丁香酚單加氧酶操縱子基因序列分別合成13條異丁香酚單加氧酶操縱子基因片段(委托上海某生物技術(shù)公司合成)；6、將所獲得的13條操縱子基因片段按照實(shí)施例1所示步驟分別制備重組質(zhì)粒，之后按照實(shí)施例惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌，制備過程中與實(shí)施例2唯一不同的是所用的異丁香酚加氧酶操縱子基因分別采用13條密碼子偏好性優(yōu)化后的操縱子基因片段中任一條，從而獲得13株含有不同的重組質(zhì)粒的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌；7、將所獲得的13株含有不同的重組質(zhì)粒的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃，220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時，之后分別測定發(fā)酵液的異丁香酚單加氧酶活力，13株含有有不同的重組質(zhì)粒的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌中，其中異丁香酚單加氧酶活力低于由序列3制備的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌的為8株，2株未能檢測到異丁香酚單加氧酶活力，另有3株的異丁香酚單加氧酶活力較由序列3制備的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌有30-50％的提高。8、3株的異丁香酚單加氧酶活力明顯提高的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌，其重組載體中含有的異丁香酚單加氧酶操縱子序列分別為SEQIDNO:2-4所示的基因序列。實(shí)施例5：異丁香酚單加氧酶操縱子基因的密碼子偏好序列的優(yōu)化1.利用在線優(yōu)化軟件OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)將異丁香酚單加氧酶操縱子基因中的異丁香酚單加氧酶編碼基因?qū)?yīng)的正義鏈序列輸入OPTIMIZER；2.利用表1所列的惡臭假單胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)密碼子偏好統(tǒng)計數(shù)據(jù)和表2通用惡臭假單胞菌密碼子偏好統(tǒng)計數(shù)據(jù)，輸入OPTIMIZER計算數(shù)據(jù)庫；3.選擇Guidedrandom模式進(jìn)行優(yōu)化；4.重復(fù)步驟3以獲得不同的優(yōu)化后異丁香酚單加氧酶編碼基因的序列，共獲得8條優(yōu)化后的異丁香酚單加氧酶操縱子序列5.將所獲得的異丁香酚單加氧酶編碼基因序列替換回原來的異丁香酚單加氧酶操縱子基因中；6.按照優(yōu)化后的異丁香酚單加氧酶操縱子序列分別合成異丁香酚單加氧酶操縱子基因片段(委托上海某生物技術(shù)公司合成)，將優(yōu)化后的異丁香酚單加氧酶操縱子基因片段按照實(shí)施例2所示方式，制備表達(dá)異丁香酚單加氧酶惡臭假單胞菌KT2440重組基因工程菌，與實(shí)施例2不同的是所采用的異丁香酚單加氧酶操縱子基因分別為優(yōu)化后的8條優(yōu)化后的異丁香酚單加氧酶操縱子基因；7.將所獲得的8株含有不同的重組質(zhì)粒的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃，220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時，之后分別測定發(fā)酵液的異丁香酚單加氧酶活力，酶活相較于含有序列3所示的惡臭假單胞菌KT2440重組基因工程菌，酶活力下降或者消失的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌為7株，獲得1株異丁香酚單加氧酶活力提高48％的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌；所獲得的酶活力顯著提高的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌其所采用的異丁香酚單加氧酶操縱子基因的基因序列為SEQIDNO:5所示。表1惡臭假單胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)密碼子偏好統(tǒng)計數(shù)據(jù)(每1000個密碼子中出現(xiàn)的次數(shù))表2通用惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)密碼子使用偏好情況(每1000個密碼子中出現(xiàn)的次數(shù))實(shí)施例6：利用表達(dá)異丁香酚單加氧酶的基因工程假單胞菌菌發(fā)酵生產(chǎn)異丁香酚單加氧酶1、利用表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異丁香酚單加氧酶(1)依照實(shí)施例2所述方法獲得表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌；(2)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，在30℃，220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)12小時；就本次實(shí)驗(yàn)而言，種子培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化鈉6g/L，其余為水。(3)異丁香酚單加氧酶發(fā)酵制備按10％(V/V)的接種量，將種子液接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，待OD600值不在變化時，離心富集菌體細(xì)胞。將所得細(xì)胞重懸于100mLpH7.5的磷酸鹽甘油緩沖液中，高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞，離心收集上清，即為重組異丁香酚單加氧酶粗酶液。就本次實(shí)驗(yàn)而言，發(fā)酵培養(yǎng)基組成:蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化鈉6g/L，F(xiàn)e3+10μmol、異丁香酚1mM，其余為水。2、利用表達(dá)異丁香酚單加氧酶假單胞菌MTCC5279重組基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異丁香酚單加氧酶(1)依照實(shí)施例3所述方法獲得表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌MTCC5279基因工程重組菌；(2)按照上述步驟(2)、(3)發(fā)酵制備異丁香酚單加氧酶，與之不同的是所采用的基因工程重組菌為惡臭假單胞菌MTCC5279基因工程重組菌。3、酶活的測定步驟發(fā)酵結(jié)束后，取30ml發(fā)酵液離心(6000rpm離心10min)獲得的濕菌體加入反應(yīng)液(10ml)：DMSO1ml，濕菌體0.3g，異丁香酚0.2g，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH＝10.59mL，30℃，220rpm，搖床振蕩，反應(yīng)1小時。4、酶活單位U的定義：單位酶活定義為每分鐘生產(chǎn)1μmol香蘭素的濕菌體。5、結(jié)果見表3。表3酶活測定結(jié)果重組菌株異丁香酚單加氧酶酶活U/mL惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌0.14惡臭假單胞菌MTCC5279基因工程菌0.11實(shí)施例7：利用誘導(dǎo)劑提高異丁香酚單加氧酶酶活濃度按照實(shí)施6中1所述方式制備異丁香酚單加氧酶，在實(shí)施過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中還單獨(dú)添加了下表內(nèi)所述的誘導(dǎo)劑或誘導(dǎo)劑組合來替換原有1mM異丁香酚，其測定的酶活如下：表4誘導(dǎo)物種類濃度發(fā)酵液酶活U/mL不添加-0.01異丁香酚20μmol0.14茴香腦20μmol0.1丁香酚20μmol0.07阿魏酸20μmol0.033愈創(chuàng)木酚20μmol0.044-乙基愈創(chuàng)木酚20μmol0.037松柏醛20μmol0.053松伯醇20μmol0.056甲苯20μmol0.066原兒茶醛20μmol0.037異丁香酚+阿魏酸10μmol+10μmol0.16實(shí)施例8：利用伴侶因子提高異丁香酚單加氧酶酶活濃度按照實(shí)施6所述方式制備異丁香酚單加氧酶，在實(shí)施過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的Fe3+替換為下表內(nèi)所述的伴侶因子或伴侶因子組合：表5伴侶因子種類濃度發(fā)酵液酶活U/mL不添加-0.08Fe3+10μmol0.14Mn2+10μmol0.09Mo2+10μmol0.1Mg2+10μmol0.109Fe3++維生素C10μmol+10μmol0.19Mn2++Mo2+10μmol+10μmol0.101Mg2+維生素C10μmol+10μmol0.09實(shí)施例9：催化異丁香酚生成香蘭素的方法方案a：在50mL甘氨酸/氫氧化鈉溶液中(0.1mol/L，pH9)中加入實(shí)施例6獲得的濕菌體至最終菌體濃度為5g/L，加入異丁香酚300mmol，加入異丙醇4mL，17℃下恒溫振蕩器中反應(yīng)30h，HPLC檢測異丁香酚轉(zhuǎn)化率48.4％，香蘭素收率38.5％。方案b：在50mL甘氨酸/氫氧化鈉溶液(0.1mol/L、pH9.5)中加入粗酶液至最終蛋白濃度為20g/L，加入異丁香酚200mmol，加入2mL異丙醇，30℃下恒溫振蕩器中反應(yīng)70h，HPLC檢測，異丁香酚轉(zhuǎn)化率80.5％，香蘭素收率70.2％。方案c：在50mL甘氨酸/氫氧化鈉溶液中(0.05mol/L，pH10)中加入粗酶液至最終蛋白濃度為40g/L,加入異丁香酚150mmol，加入5mL異丙醇，25℃下恒溫振蕩器中反應(yīng)40h，HPLC檢測異丁香酚轉(zhuǎn)化率85.3％，香蘭素收率77.4％。實(shí)施例10：本發(fā)明惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌與表達(dá)異丁香酚單加氧酶的大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵同步轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的對比試驗(yàn)1、對照方法將表達(dá)異丁香酚單加氧酶的大腸桿菌基因工程菌(參照公開專利CN2014102045280構(gòu)建)接種于種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入IPTG至終濃度1mM，異丁香酚至終濃度0.1g/L，25℃繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果，24小時后發(fā)酵液逐漸變清，OD值下降，異丁香酚轉(zhuǎn)化率5.4％，香蘭素收率3.41％；2、本發(fā)明方法依照實(shí)施例2所述方法獲得表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌，然后在不同異丁香酚濃度下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)；(1)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度0.1g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度在0.1g/L左右。24小時后，異丁香酚轉(zhuǎn)化率82％，香蘭素收率70％。(2)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度0.4g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度在0.4g/L左右。24小時后，異丁香酚轉(zhuǎn)化率85％，香蘭素收率74％。(3)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度0.8g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度在0.8g/L左右。24小時后，異丁香酚轉(zhuǎn)化率86.5％，香蘭素收率77％。(4)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度1.2g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度在1.2g/L左右。24小時后，異丁香酚轉(zhuǎn)化率91％，香蘭素收率85％。(5)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度2g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度在2g/L左右。24小時后，異丁香酚轉(zhuǎn)化率89％，香蘭素收率81％。(6)將所述的表達(dá)異丁香酚單加氧酶的惡臭假單胞菌KT2440基因工程菌接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD＝0.8時，加入異丁香酚至終濃度5g/L，繼續(xù)培養(yǎng)并流加異丁香酚控制其濃度在5g/L左右。24小時后，異丁香酚轉(zhuǎn)化率87％，香蘭素收率79％。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>波頓（上海）生物技術(shù)有限公司<120>一種異丁香酚單加氧酶操縱子基因及其重組載體和重組假單胞菌<130>MP1622948<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>3112<212>DNA<213>人工序列<400>1agatctcagagccggatagatatacgacttaattagtcaggcatgaaggctgagcggagg60agagaggtggcgtcatgcgaaggcatcactggcgggatccgcgccatgagcctcatcttg120gtcaccctgcgatctacgacaccgggcaactttatcgccatcgtgatcgccacgatcagg180attctgtcacccgcagcgctcatcagcaccgaatccaactggccctggcaagtaggccca240ctcaattgccgaggtactagggacagagcgcggtcaggcgaatagagggacgctcgagtc300gacacctaatgtggcagtcctagccttgatgatcacgcaggtccgcatttgcaacgacga360ctgcaataacgctatgggaaatcaagcctgcctcaccaaggagacaggcgaaacaccgta420tctttccttaaatttcttgctgaaatggcttgaatccgaaaaacctgaggacatggccac480tttcagcacagcacccgagccactcgtcgcacagagcattcgataagctttgcccaggcg540tatttccaacagctcgcgaccaaaggtcgtaccgcacgcagcaaagacataatgcaaata600gcgcttcgaaattcctaattgacttgaaacactttccggctcgagattagcgtctgcgaa660actctgctcgagtactctcttcacttccctcattttccgtagagccacacccccatcttc720agaactaaccgcagaacttgctagtgaaattaacatagcaacatgctctgcaatgctatt780tacattgctacccaaatcgtcgatgcgcaatggatctagattagaaaccgatgcgcttag840cgccctaccccaccctatctcagcatcaactcgtcgggcgataagatcctccggattgga900cacccacgctcccagccaactcaccggaaagcgtattacaacaccttgggtcgaagaatt960cgaggaaagtgtgaagtcttggcgactatcaactatggagcaatcaccatttgccaagat1020cacctttcttccgccggatgcaacgcccaaagccccacttcgtatctgaatcaaatagct1080gtgctcagcctcattagcatttcgctggtcgttgaagtggcgaagtacctggcttggtgc1140aatggcactgtacagctcacccgcgccaaatctagatcgggcaaggtaggcacctctacc1200ccgctcaagacgctggacttcgaaatgagtacgcattgatccattaagggtatgcgccca1260atgcagcggcgaatccgcgagagtgatccgctcagagtgaatggacatacgccgccaccg1320aatagttgtcattcttgaaatcctcaacaataggccagcctcggcccattttcaataccg1380ccaccattgcactcacagacatcctcacttcaccggcacacatgaaatccggtcagtcct1440aaacataaactccaacccggcaagccgcgcatttaggccattcagaacaacaaaggagac1500cgtgccatggcgagactcaaccgcaacgacccgcaattagtaggaacacttctccccacc1560cgtatcgaggcagacttgttcgatctagaggttgacggcgaaatcccaaaatcaataaat1620ggaacgttctaccgtaatacgccagaacctcaagttaccccgcaaaaattccacaccttc1680atagatggagatggaatggcctctgccttccacttcgaagatggtcatgtcgacttcatc1740agtcgctgggttaaaaccgctcgattcacggccgaacgactagcgcgaaaatcgctattt1800ggcatgtacagaaacccctataccgacgacaccagtgtaaaaggactagaccgcaccgtt1860gccaatacaagcatcattagccatcacggcaaggtgctggcggtgaaggaagacggccta1920ccgtacgaactggatcctcgtacacttgaaactcgcggacgcttcgactacgacggccaa1980gttaccagccaaacccacaccgcccatccaaaatatgacccggaaacgggtgacttgttg2040ttcttcggttcggcagctaagggcgaagcaactccagacatggcctattacattgtcgac2100aagcacggcaaggtgacacatgaaacttggtttgagcagccctatggcgcattcatgcac2160gactttgccattacccgaaattggtccattttcccaattatgccggccaccaacagcctg2220tcccgcctcaaggcgaaacagccaatttatatgtgggagccggaactgggcagctacatt2280ggcgtactgccgcgccgcggccagggcagtcagattcgctggctcaaggcaccggcgctc2340tgggtatttcatgttgtgaatgcttgggaagtcggaaccaagatttatatcgaccttatg2400gaaagtgaaatcctgccgttccccttccccaactcacaaaaccaacccttcgcccctgag2460aaagccgtaccacgcctgactcgttgggaaattgacctcgatagcagcagcgacgagatc2520aagcgaacccggctacacgatttctttgcggaaatgccaatcatggattttcgcttcgcc2580ctgcaatgcaaccgctatggctttatgggggtggacgatccacgcaaaccacttgcgcat2640cagcaggccgagaagatatttgcgtacaactcactcggcatctgggacaaccaccgaggt2700gactacgacctctggtactccggagaagcctcggcggcccaggagccggccttcgtccct2760agaagtccgaccgccgccgaaggtgatgggtacttgctgaccgtggttggtcgtctcgat2820gaaaatcgcagtgatctggtaattctcgacactcaagacatccagtctggtcccgtggca2880accatcaagctgccattccggttaagggccgctctccatggctgctgggtacccagacct2940taacgaaactccaaccttccagcccttcagggccgccggtacggcggcccctgtcctcgc3000acgaatttccaatccctatcacgacggtgagagcctgcacgcaagcccattgattacgcc3060ccggggcgtctgtccctggccccttcgtaaagcgtgcatgccaagacatatg3112<210>2<211>3112<212>DNA<213>人工序列<400>2agatctcagagccggatagatatacgacttaattagtcaggcatgaaggctgagcggagg60agagaggtggcgtcatgcgaaggcatcactggcgggatccgcgccatgagcctcatcttg120gtcaccctgcgatctacgacaccgggcaactttatcgccatcgtgatcgccacgatcagg180attctgtcacccgcagcgctcatcagcaccgaatccaactggccctggcaagtaggccca240ctcaattgccgaggtactagggacagagcgcggtcaggcgaatagagggacgctcgagtc300gacacctaatgtggcagtcctagccttgatgatcacgcaggtccgcatttgcaacgacga360ctgcaataacgctatgggaaattaggcctggcgcaccagcgacaccggcgacacgccgta420gcgttccttgaacttcttcgagaagtgcgacgagtccgagaagcccgacgacatggccac480cttcagcacggcgcccgagcccgaggtggcgcacagcatgcggtaggccttgcccaggcg540gatttccagcagttcgcggccgaaggtggtgccgcaggcggcgaacacgtagtgcaggta600gcgcttcgagatgcccagctgcgacgacaccgattccggttccaggttggcgtcggcgaa660cgactgttccagcacgcgcttcacttcgcgcatcttgcgcagggccacgccgccgtcttc720cgacgacacggccgacgaggccagcgagatcagcatggccacgtgttcggcgatcgagtt780cacgttcgagcccaggtcgtcgatgcgcagcgggtccaggttcgacaccgaggccgacag840ggcgcggccccagccgatttcggcgtccacgcggcgggcgatcaggtcttccgggttcga900cacccaggcgcccagccacgacaccgggaagcggatcaccacgccctgggtcgacgagtt960cgacgacagggtgaagtcctggcgcgagtccacgatcgagcagtcgccgttggccaggat1020caccttgcggccgcccgaggccacgcccagggcgcccgagcggatctggatcaggtacga1080gtgttcggcttcgttggcgttgcgctggtcgttgaagtggcgcagcacctgcgacggggc1140gatggccgagtacagttcgccggcgccgaagcgcgagcgggccaggtaggcgccgcggcc1200gcgttccaggcgctgcacttcgaagtgggtgcgcatcgagccgttcagggtgtgggccca1260gtgcagcggcgagtcggccagggtgatgcgttccgagtggatcgacatgcggcgccagcg1320gatggtggtcattcttgaaatcctc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