本發(fā)明屬于環(huán)境微生物及廢水處理領域，具體涉及一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌及其應用。

背景技術：

據報道苯酚、苯胺等的生產量和使用量占芳烴總量的90％以上，其中作為化工行業(yè)中最重要中間體之一的苯胺，應用十分廣泛：染料工業(yè)中可用于制造酸性嫩黃、直接橙S、直接桃紅、靛藍、分散黃棕、陽離子桃紅FG和活性艷紅X-SB等染料，還可用于制造金光紅、大紅粉、酚菁紅、油溶黑等有機顏料；橡膠制造工業(yè)中是橡膠助劑的重要原料，可用于制造防老劑、促進劑、抗氧劑、穩(wěn)定劑等；醫(yī)藥行業(yè)可作為磺胺藥的原料；也是農藥行業(yè)的重要中間體，可制造殺菌劑、殺蟲劑和除草劑；苯胺在其他行業(yè)也具有重要作用，如可作為生產香料、塑料、清漆、膠片等的中間體；還可作為炸藥中的穩(wěn)定劑、汽油中的防爆劑。隨著我國經濟的發(fā)展，對苯胺的需求量也快速增長，苯胺產量由2005年的49萬噸增長到2015年的178萬噸。近年隨著以苯胺為主要原料的MDI的需求量快速增長，也極大的拉動了苯胺的需求量。

苯胺因其毒性大、難降解、具有致癌、致畸、致突變的“三致”特性，已被美國EPA列為優(yōu)先控制的129種污染物之一，同時也屬于我國水中優(yōu)先控制污染物黑名單中的一種有機污染物。工業(yè)上應用十分廣泛的苯胺會隨著工業(yè)廢水進入自然環(huán)境及地下水中，因苯胺亦屬于高毒高殘留物質，極易危害生物健康。苯胺可與動物體內血紅蛋白結合成高鐵血紅蛋白而引起高鐵血紅蛋白血癥，還會引起肝臟、腎臟、心血管等臟器損害；每年大約有30 000t苯胺被排放到環(huán)境中，該物質可通過生物富集、皮膚接觸等途徑進入人體，嚴重威脅環(huán)境安全及人類健康。生物降解相比于傳統(tǒng)的物理吸附法和化學處理法，具有高效、成本低、不會產生二次污染等優(yōu)勢，已成為降解苯胺的最佳方法。特別是微生物具有來源廣、易培養(yǎng)、繁殖速度快等優(yōu)勢，已引起人們的廣泛關注。目前還沒有一種利用鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)菌株降解苯胺廢水的方法。

技術實現要素：

本發(fā)明針對現有技術的不足，提供一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌及其應用。

本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現的：

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請人將其編號為BA-4；已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經BLAST比對后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號為KJ848476.1)的同源性達到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為28-38℃、pH為6-9條件下搖床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

優(yōu)選的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為30℃、pH為7條件下搖床培養(yǎng)72h。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度不大于350mg/L。

優(yōu)選的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為350mg/L。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4用于污水體系中苯胺的降解，不僅具有很高的降解速率和耐受濃度，且無二次污染，使用安全，具有廣闊的應用前景。

菌種保藏信息

保藏時間：2016年12月07日，

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，

保藏編號：CGMCC No.13428，

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101

分類命名：鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.

附圖說明

圖1為本發(fā)明的鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4的照片；

其中：a為菌落照片，b為革蘭氏染色顯微鏡照片；

圖2為本發(fā)明鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；

圖3為不同苯胺濃度下本發(fā)明的鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4對苯胺的降解曲線。

具體實施方式

下面列舉具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，但不因此而限制本發(fā)明的內容。

實施例1

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請人將其編號為BA-4；已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經BLAST比對后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號為KJ848476.1)的同源性達到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為38℃、pH為6條件下搖床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為300mg/L。

實施例2

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請人將其編號為BA-4；已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經BLAST比對后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號為KJ848476.1)的同源性達到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為30℃、pH為7條件下搖床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為350mg/L。

實施例3

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請人將其編號為BA-4；已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經BLAST比對后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號為KJ848476.1)的同源性達到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為28℃、pH為9條件下搖床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為200mg/L。

Sphingobacterium sp.BA-4的分離、純化和鑒定

Sphingobacterium sp.BA-4是從山東省曲阜市某污水溝污泥取樣，經初篩和復篩得到的一株革蘭氏陰性菌。具體步驟如下：

一、初篩

(1)富集培養(yǎng)：從山東省曲阜市某污水溝采集的污泥5g接種于45ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(內含數粒小玻璃珠)，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)24h。

(2)分離純化：在無菌環(huán)境下，用移液槍取步驟(1)獲得的菌液0.5ml加至4.5ml無菌水中，充分混勻，制備成10^-1的菌液；再吸取該稀釋菌液0.5ml加入到4.5ml無菌水中，充分混勻，制備成10^-2的菌液；同樣的方法依次制備成梯度為10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液；分別取稀釋梯度為10^-4、10^-5、10^-6的菌液200μl，涂布于苯胺濃度為50mg/L的固體篩選培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；培養(yǎng)完成，挑取平板上形態(tài)、大小不同的單菌落劃線于純化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；多次重復上一步驟，直至獲得純菌落，接種于斜面培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)，于4℃冰箱中保存。

二、復篩

(1)菌株活化：在無菌環(huán)境下，挑取初篩步驟(2)獲得的純菌落一環(huán)，接種于活化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(2)種子培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，將菌株活化步驟獲得的活化菌株以2％(V/V)接種量接種于種子培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)24h。

(3)發(fā)酵降解：將步驟(2)種子培養(yǎng)獲得的種子液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為50mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h。

(4)離心：將步驟(3)發(fā)酵降解獲得的發(fā)酵液用12000r/min離心10min，獲得上清液。

(5)苯胺濃度檢測：取步驟(4)離心獲得的上清液1ml，參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版中N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定發(fā)酵液中苯胺濃度含量。分別計算各菌株發(fā)酵液中的苯胺濃度，根據苯胺降解率復篩得出具有降解苯胺能力的Sphingobacterium sp.BA-4。Sphingobacterium sp.BA-4的照片如圖1所示。

Sphingobacterium sp.BA-4的16SrDNA鑒定

通過16SrDNA序列分析，確定BA-4菌屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，具體步驟如下：

一、提取基因組DNA

(1)菌株活化：在無菌環(huán)境下，挑取復篩步驟獲得的具有降解苯胺能力的純菌落一環(huán)，接種于5ml活化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH7.2±0.2)，置于30℃、150r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24h。

(2)提取基因組DNA：使用北京索萊寶科技有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，提取活化后的苯胺降解菌BA-4的基因組DNA。

(3)檢驗基因組DNA片段：將步驟(2)獲得的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗是否提取出目的基因組DNA。瓊脂糖凝膠配方為：瓊脂糖0.25mg、1×TAE 25ml、Gelred2.5μl。電泳條件為：120V、20min。

二、PCR產物純化

(1)PCR擴增：使用細菌通用引物27F、1492R，50μl PCR體系對目的基因片段進行擴增。50μl PCR體系和PCR反應條件分別如表1和表2所示。

細菌通用引物27F、1492R序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

表1 50μl PCR體系

表2 PCR反應條件

(2)檢驗PCR產物：將步驟(1)獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗獲得的PCR產物的純度。瓊脂糖凝膠配方為：瓊脂糖0.25mg、1×TAE 25ml、Gelred 2.5μl。電泳條件為：120V、20min。

(3)純化PCR產物：使用康寧生命科學(吳江)有限公司的AxyPrep PCR產物純化試劑盒，純化步驟(1)獲得的PCR產物。

三、測序比對

(1)測序：將PCR產物純化步驟(3)獲得的PCR純化產物寄送至山東省濟南市力戈科技有限公司進行測序。

(2)序列比對：將步驟(1)獲得的菌株序列在NCBI上進行核苷酸序列BLAST比對后，發(fā)現與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號為KJ848476.1)的同源性達到99％，圖2為該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹圖，故該苯胺降解菌屬于鞘氨醇桿菌屬，將該菌命名為Sphingobacterium sp.BA-4。

Sphingobacterium sp.BA-4菌株馴化

(1)菌株活化：在無菌環(huán)境下，分別挑取復篩步驟獲得的苯胺降解菌BA-4純菌落一環(huán)，接種于5ml活化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH7.2±0.2)，置于30℃、150r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24h，得活化種子液；

(2)將活化種子液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為50mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(3)將步驟(2)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為100mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(4)將步驟(3)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為150mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(5)將步驟(4)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為200mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(6)將步驟(5)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為250mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(7)將步驟(6)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為300mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(8)將步驟(7)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(9)將步驟(8)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為400mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量；

(10)將步驟(9)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為450mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量。

由馴化和圖3發(fā)現：Sphingobacterium sp.BA-4能高效降解濃度小于350mg/L的苯胺，可在72h完全降解濃度為350mg/L的苯胺。之后隨著苯胺濃度的增大，其降解效果逐漸降低。

溫度對Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響

選用Sphingobacterium sp.BA-4能完全降解苯胺的最大濃度350mg/L為初始苯胺濃度，在培養(yǎng)基pH 7.0的條件下，研究溫度對Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響。

(1)種子液制備：將Sphingobacterium sp.BA-4菌株馴化步驟(8)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.0，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h，作為種子液備用；

(2)將步驟(1)獲得的種子液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方同步驟(1))中，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃的150r/min搖床中培養(yǎng)72h；分別取不同溫度條件下培養(yǎng)的菌液10ml用12000r/min離心10min后，分別取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量。

當苯胺初始濃度為350mg/L、培養(yǎng)基pH 7.0的條件下，苯胺降解菌BA-4能在28-38℃范圍內對苯胺進行有效降解，在30℃時可將苯胺完全降解。溫度大于或小于30℃時，該菌株對苯胺的降解率均有不同程度的下降。

酸堿度對Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響

選用Sphingobacterium sp.BA-4能完全降解苯胺的最大濃度350mg/L為初始苯胺濃度，在培養(yǎng)溫度為30℃的條件下，研究酸堿度對Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響。

(1)種子液制備：將Sphingobacterium sp.BA-4菌株馴化步驟(8)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.0，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h，作為種子液備用；

(2)按步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基后，分別以2mol/L的NaOH溶液、1mol/L的HCl溶液調節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度，分別配置成pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9、pH＝10的發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20min待用；

(3)分別將步驟(1)獲得的種子液以2％(V/V)接種量接種于酸堿度不同(步驟(2)所示)的40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；分別取不同酸堿度條件下培養(yǎng)的菌液10ml用12000r/min離心10min后，分別取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測定上清液中苯胺濃度含量。

當苯胺初始濃度為350mg/L、培養(yǎng)溫度為30℃的條件下，苯胺降解菌BA-4能在pH＝6-9范圍內對苯胺進行有效降解，在pH＝7時可將苯胺完全降解。當酸堿度大于或小于pH＝7時，該菌株對苯胺的降解率均有不同程度的下降。