本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及誘導(dǎo)植物雄性不育相關(guān)調(diào)控的microRNA167a及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雜種優(yōu)勢(shì)利用被認(rèn)為是今后小麥生產(chǎn)水平大幅度提高的主要途徑。目前，育種工作者已利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一些育性調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)入到植物中，并獲得了部分甚至完全雄性不育的植株。

MicroRNAs(miRNAs)是一類21-25nt的非編碼蛋白質(zhì)的小RNA分子，能通過堿基配對(duì)與mRNA分子的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合來降解mRNA或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。關(guān)于miR167在植物研究中的報(bào)道，擬南芥中發(fā)現(xiàn)只有miR167a過表達(dá)引起了花卷曲，短花絮，抑制了花的發(fā)育；在水稻中，將人工合成的miR167導(dǎo)入體外培養(yǎng)的水稻細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，ARF8mRNA及其調(diào)控的OsGH3-2(水稻的一個(gè)吲哚乙酸結(jié)合酶)表達(dá)水平下降。敲除和過表達(dá)ARF8，都會(huì)影響下胚軸的伸長(zhǎng)和根的發(fā)育習(xí)性。目前，還未有小麥miR167功能的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控植物雄性不育相關(guān)的miRNA tae-miR167a。

本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述調(diào)控植物雄性不育相關(guān)tae-miR167a的前體序列tae-pre-miR167a。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述microRNA前體的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述microRNA前體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明的另一目的是提供上述調(diào)控植物雄性不育相關(guān)tae-pre-miR167a的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的調(diào)控植物雄性不育的相關(guān)tae-miR167a，來源于雜交小麥品種京麥7號(hào)(京審麥2009003)的母本BS366，其成熟體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：tae-miR167a

5ˊ-UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUA-3ˊ

其前體的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，tae-pre-miR167a所示。

SEQ ID NO.2：

5ˊ-CUGCCCAAGGGAACGAGUGAAGCUGCCAGCAUGAUCUAGCUCCGAGUGAUCAAACAAGAAACGCUGCGGCAGCCUCACUUCUUCCCGCCGUUGGGCACAACUACUUCU-3ˊ

根據(jù)本發(fā)明的tae-miR167a及其前體序列tae-pre-miR167a可人工合成，也可以根據(jù)公開的序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增得到。

根據(jù)本發(fā)明的調(diào)控植物雄性不育相關(guān)tae-miR167a的前體序列tae-pre-miR167a的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)植株出現(xiàn)花藥不開裂，花粉不育及果莢退化不結(jié)實(shí)。

含有tae-pre-miR167a的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有tae-pre-miR167a的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元表達(dá)載體系統(tǒng)和可用于植物微彈轟擊法的載體等。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育雄性不育植株的方法。本發(fā)明所提供的培育雄性不育植物的方法，是將上述任一種含有tae-pre-miR167a的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到雄性不育植物，優(yōu)選所述植物為小麥。

利用任何一種可以引導(dǎo)外源microRNA在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的tae-pre-miR167a基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得花器官發(fā)育缺陷以及雄性不育的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有tae-pre-miR167a的載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：煙草、小麥、長(zhǎng)穗偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。

本發(fā)明以雜交小麥品種京麥7號(hào)(京審麥2009003)的母本BS366為實(shí)驗(yàn)材料，利用設(shè)計(jì)的特異引物，從小麥克隆獲得小麥來源的tae-pre-miR167a，并將tae-pre-miR167a導(dǎo)入擬南芥，使得擬南芥花藥不開裂，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因植株的育性降低，從而通過基因工程的方法驗(yàn)證其功能。對(duì)于小麥來源的tae-pre-miR167a，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)它也可以誘導(dǎo)擬南芥雄蕊的花粉不育，果莢出現(xiàn)不結(jié)實(shí)現(xiàn)象，研究小麥中該microRNA與育性的關(guān)系是本發(fā)明的一個(gè)重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。

本發(fā)明的誘導(dǎo)雄性不育相關(guān)microRNA對(duì)培育光溫敏雄性不育小麥有很大的推進(jìn)作用，使二系法育種更加實(shí)際，對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的利用和推廣有十分重要的理論和實(shí)際意義。總之，運(yùn)用基因工程方法構(gòu)建雄性不育轉(zhuǎn)基因植株，可以簡(jiǎn)化育種程序，改進(jìn)育種模式，尤其是對(duì)光溫敏雄性不育相關(guān)基因的研究和利用，可以推進(jìn)二系法育種，從而加速雜種優(yōu)勢(shì)在小麥遺傳育種中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1顯示誘導(dǎo)雄性不育相關(guān)調(diào)控tae-pre-miR167a的克隆。以BS366cDNA為模板，PCR擴(kuò)增tae-pre-miR167a的cDNA片段，1,2為tae-pre-miR167a擴(kuò)增產(chǎn)物；M，DL2000marker(100，250，500，750，1000，2000bp)。

圖2顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株檢測(cè)，其中，1為陰性對(duì)照，2為野生型，3～8為轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測(cè)株，9為載體對(duì)照。

圖3顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥整株表型，其中，轉(zhuǎn)基因擬南芥，花器官發(fā)育不正常，不能完成受精作用，果莢不發(fā)育。

圖4顯示tae-pre-miR167a表達(dá)導(dǎo)致擬南芥果莢發(fā)育異常，其中，A為野生型擬南芥的果莢，果莢大并且飽滿；B為轉(zhuǎn)基因擬南芥的果莢，果莢小并且干癟。

圖5顯示tae-pre-miR167a表達(dá)導(dǎo)致擬南芥花器官發(fā)育異常，其中A為野生型擬南芥花器官，花絲長(zhǎng)度正常，花藥正常開裂，花粉自然散出；B為轉(zhuǎn)基因擬南芥花器官，花絲短小，花藥不開裂，無花粉散出。

圖6顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥花藥碘染結(jié)果，其中，A為野生型擬南芥花粉能被碘染，具有活力；B為轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉不能被碘染，沒有活力。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：小麥光溫敏雄性不育相關(guān)tae-pre-miR167a的cDNA克隆

取小麥BS366的花藥，用Trizol法提取花藥的總RNA，用superscript II(購(gòu)自invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得到cDNA。利用tae-pre-miR167a的特異引物P1和P2，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1所示。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-CTGCCCAAGGGAACGAGTGAA-3’

P2：5’-AGAAGTAGTTGTGCCCAACGGC-3’

PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到長(zhǎng)度約為120bp左右的條帶，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-T Easy(購(gòu)自Promega公司)連接，參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的氨卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。

實(shí)施例2：用Tae-pre-miR167a基因培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物

1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

tae-pre-miR167a雙子葉植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以小麥BS366的總microRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有XbaI和SmaI接頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后酶切PCR產(chǎn)物，回收，將酶切產(chǎn)物插入載體pBI121，得到重組載體pBI121-tae-pre-miR167a。

引物序列如下：

tae-pre-miR167a[XbaI]：5’–GCTCTAGACTGCCCAAGGGAACGAGTGAA-3’

tae-pre-miR167a[SmaI]：5’–TCCCCCGGGAGAAGTAGTTGTGCCCAACGGC-3’

2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和鑒定

1)轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBI121-tae-pre-miR167a用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C₃₈C₁，再用浸花法將整合有pBI121-tae-pre-miR167a的根癌農(nóng)桿菌C₃₈C₁轉(zhuǎn)化擬南芥。在含有100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到候選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

對(duì)tae-pre-miR167a轉(zhuǎn)基因擬南芥候選陽(yáng)性植株經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得長(zhǎng)度為120bp大小的條帶，如圖2所示，結(jié)果獲得5株陽(yáng)性植株。

2)轉(zhuǎn)tae-pre-miR167a擬南芥雄性不育表型鑒定

將T2代轉(zhuǎn)tae-pre-miR167a擬南芥陽(yáng)性株與野生型植株在培養(yǎng)室培養(yǎng)，22℃，濕度40％，光周期：12h/12h，觀察表型并拍照。在開花期結(jié)合花器官生長(zhǎng)情況，做花粉碘染實(shí)驗(yàn)，觀察花粉的育性。

結(jié)果表明：pBI121-tae-pre-miR167a轉(zhuǎn)基因植株在正常溫室條件下能正常生長(zhǎng)，生長(zhǎng)初期花器官發(fā)育正常，與對(duì)照植株相比無明顯差別。到開花期時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株和野生植株花器官呈現(xiàn)出明顯差異，轉(zhuǎn)基因株的育性明顯下降。tae-pre-miR167a調(diào)控?cái)M南芥花器官發(fā)育鑒定結(jié)果證明，tae-pre-miR167a在植物開花期或繁殖期調(diào)控植株雄性不育。圖3顯示了pBI121-tae-pre-miR167a轉(zhuǎn)基因植株在正常生長(zhǎng)條件下的情況，其中，轉(zhuǎn)基因擬南芥花器官發(fā)育不正常，不能完成受精作用，果莢不發(fā)育。

擬南芥tae-pre-miR167a轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株在開花期和果莢成熟期表現(xiàn)出明顯的不同。如圖5所示，A為野生型擬南芥花器官，花絲長(zhǎng)度正常，花藥正常開裂，花粉自然散出；B為轉(zhuǎn)基因擬南芥花器官，花絲短小，花藥不開裂，無花粉散出，開花期主要表現(xiàn)在雄蕊的生長(zhǎng)發(fā)育上，轉(zhuǎn)基因植株花藥形態(tài)異常，花絲不能伸長(zhǎng)，花藥不開裂，花粉不能散出。而對(duì)照植株雄蕊發(fā)育正常，花絲正常伸長(zhǎng)，花藥正常開裂，花粉正常散出，且能完成受精作用。如圖4所示，tae-pre-miR167a表達(dá)導(dǎo)致擬南芥果莢發(fā)育異常，其中，A為野生型擬南芥的果莢，果莢大并且飽滿；B為轉(zhuǎn)基因擬南芥的果莢，果莢小并且干癟果莢成熟期的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為果莢異常，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因植株的果莢小，干癟，無正常種子形成。圖6所示，顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥花藥碘染結(jié)果，其中，A為野生型擬南芥花粉能被碘染，具有活力；B為轉(zhuǎn)基因擬南芥花粉不能被碘染，沒有活力。用1％KI-I₂對(duì)花粉進(jìn)行碘染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組花粉粒較多并且飽滿，能被碘染，而轉(zhuǎn)基因組花粉粒較少且不能被碘染，為碘敗，證明轉(zhuǎn)基因植株的花粉無活力。

<110> 北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120> 誘導(dǎo)植物雄性不育相關(guān)調(diào)控的microRNA167a及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 小麥

<400> 1

ugaagcugcc agcaugaucu a 21

<210> 2

<211> 108

<212> RNA

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