本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用脂肪酸的pH變化對溴甲酚紫酸堿指示劑進(jìn)行變色反應(yīng)，能夠快速、方便、高通量的篩選出能夠生產(chǎn)高產(chǎn)脂肪酶菌的方法。該方法具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確和高通量等特點。

背景技術(shù)：

脂肪酶在生物體內(nèi)具有相當(dāng)重要的位置，對脂肪酶的研究報道已有近二百年歷史。因其反應(yīng)所需條件溫和，催化率高，立體選擇性好，廣泛的底物特異性以及便于提取與潛在的無限供給，所以得到廣大工業(yè)領(lǐng)域的普遍應(yīng)用例如食品、能源、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、精細(xì)化工和生物修復(fù)等行業(yè)領(lǐng)域。

微生物誘變育種是指利用各種誘變劑的物理因素或化學(xué)因素，提高基因突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法，誘變育種的速度快、成本低、耗時短、方法簡便，是當(dāng)前菌種選育的一種常用的方法。常用的誘變育種方法主要有三種，即物理誘變法、化學(xué)誘變法、復(fù)合誘變法。目前為止，產(chǎn)脂肪霉菌株的初篩方法有透明圈法、油脂同化法、耐爾藍(lán)顯色法，其中第一種方法比較常用。一般的方法有將溴甲酚紫、羅丹明B、維多利亞藍(lán)等指示劑加入分離培養(yǎng)基中，菌落周圍出現(xiàn)變色圈，觀察變色圈的大小，但這其中存在較大的誤差。傳統(tǒng)方法-平板法中出現(xiàn)的一些問題，采取平板法，需耗時6天(真菌)，需要太多一次性平板和原料(單個平板至少需5mL培養(yǎng)基)，總需750mL培養(yǎng)基(以50種菌計算)，且需手動測量進(jìn)行計算，耗費大量人力、物力，并且浪費大量時間，且計算結(jié)果存在一定誤差。綜上所述，建立一種快速、方便、高通量的篩選方法是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種高通量篩選脂肪酶菌的方法，過程簡單、快速、易操作，而且對環(huán)境無污染。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用脂肪酸的pH變化對溴甲酚紫酸堿指示劑進(jìn)行變色反應(yīng)，并在96孔板中建立了產(chǎn)脂肪酶菌株的高通量篩選方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案操作步驟如下：

(1)將菌株P(guān)enicillium sp.Y進(jìn)行紫外誘變，無菌條件下取培養(yǎng)2-3天的斜面，加入生理鹽水或緩沖溶液制成孢子懸浮液，再用血細(xì)胞計數(shù)法，得出一定體積內(nèi)的孢子個數(shù)，將富集培養(yǎng)液稀釋到10-4、10-5、10-6，將稀釋液體覆蓋一次性平板底部，于256nm 12w紫外燈下誘變，距離為20cm，不同時間A下照射。

(2)物理輻射結(jié)束后，將誘變后平板于30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2天，選取100uL誘變后液體涂布于固體培養(yǎng)基上。在致死率的時間段的平板上，選取50個菌進(jìn)行初篩。

(3)96孔板中加入200ul含有溴甲酚紫的發(fā)酵培養(yǎng)基，每個孔中接入誘變菌株(3個平行樣，10個空白樣)，每隔一定的時間在酶標(biāo)儀特定波長C下測數(shù)據(jù)。為了驗證高通量篩選法所得到的結(jié)果，挑選幾株菌株進(jìn)行平板實驗，將接種到初篩培養(yǎng)基的平板上，在30℃下培養(yǎng)2天，觀察菌落四周黃色變色圈的大小，計算半徑比值。

其中步驟(1)、(2)、(3)所述方法，照射時間為1min，2min，3min，4min，5min，6min，致死率選取菌種最優(yōu)的一個，檢測波長根據(jù)最終發(fā)酵液的最大吸收波長。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、采用本發(fā)明進(jìn)行篩選，耗時36h，且96孔板可回收再次利用，一個平板共需25mL培養(yǎng)基，節(jié)省物料，結(jié)果無需手動測量，通過酶標(biāo)儀顯示，結(jié)果準(zhǔn)確，相對于傳統(tǒng)方法而言，該方法快速、準(zhǔn)確、易操作且成本低；

2、本發(fā)明中所產(chǎn)生的廢液可進(jìn)行高溫滅菌，處理過液體對環(huán)境無污染。

本發(fā)明的一種產(chǎn)脂肪酶菌株的高通量篩選方法，具有操作方便、快捷、準(zhǔn)確和高通量等特點。

附圖說明：

圖1、高通量篩選法

具體實施方式

為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

本發(fā)明涉及的菌株P(guān)enicillium sp.Y具有如下微生物學(xué)特征：

1、形態(tài)特征

分生孢子梗壁光滑，帚狀枝具有單束的小梗，密集，菌絲有橫隔，孢子成束狀或鏈狀，鏈長而糾結(jié)，單個孢子為球形，腎形，直徑為3-3.5μm。

2、平板固體培養(yǎng)基上的菌落特征(30℃，36h)

圓形，1-4mm；培養(yǎng)基初期表面帶絲狀，呈綠色。

3、生長環(huán)境

最適生長溫度32℃，最適生長pH 6.5，生長溫度范圍為20-48℃。

實施例1：96孔板法

采用高通量篩選法對誘變菌株進(jìn)行初篩，在96孔板中加入200ul發(fā)酵液并加入一定體積的溴酚藍(lán)，將其混勻，采用紫外分光光度計測其最大吸收波長，測得該溶液最大吸收波長為570nm。根據(jù)物理輻射最終結(jié)果，挑選經(jīng)紫外誘變的特定致死率下的單菌落孢子一一對應(yīng)的接入裝有發(fā)酵液和溴酚藍(lán)的96孔板中(3個平行樣，其中兩邊作為空白)，于30℃，160r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別在不同時間段用酶標(biāo)儀測量數(shù)值。采用酶標(biāo)儀檢測時，需將波長調(diào)至570nm，提前預(yù)熱30min。菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生脂肪酸，溶液pH發(fā)生變化，溴甲酚紫作為指示劑，溶液顏色由紫色逐漸變淺最終為正黃色，這期間于570nm下酶標(biāo)儀顯示的數(shù)值越來越小。通過不同時間段的檢測數(shù)值，在最短時間內(nèi)達(dá)到數(shù)值差異最大的為最終選擇菌，誤差＜12％，用時36h。

實施例2：平板法

將配置好的培養(yǎng)基倒入一次性平板中，平均平板中含有5mL溶液，根據(jù)物理輻射最終結(jié)果，挑選經(jīng)紫外誘變的特定致死率下的單菌落孢子一一對應(yīng)的接入所在平板(3個平行樣)，于30℃，160r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，定期進(jìn)行觀察，直到所在平板全為黃色(溴甲酚紫顯色)，采用直尺分別測量菌落及變色全直徑。其中采用平板法篩選需用時6天，檢測得到的最終結(jié)果與96孔板法一致。