本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用基因?qū)α鞲胁《具M(jìn)行分型的方法。

背景技術(shù)：

流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，傳染性較強(qiáng)，臨床上以高熱、乏力、頭痛、全身酸痛等癥狀為主，常周期性的引發(fā)世界范圍內(nèi)的流行或大流行。流感病毒有三種類型：甲型(A型)流感病毒感染哺乳動(dòng)物以及鳥類；乙型(B型)流感病毒只感染人類，疾病的產(chǎn)生通常較甲型病毒溫和；丙型(C型)流感病毒只感染人類，并不會(huì)引起嚴(yán)重的疾病。從傳染規(guī)模來看，甲型流感常引起爆發(fā)流行，甚至是世界大流行，約2～3年發(fā)生小流行1次，根據(jù)世界上已發(fā)生的4次大流行情況分析，一般10～15年發(fā)生一次大流行。乙型流感呈爆發(fā)或小流行，丙型以散發(fā)為主。

流感的臨床癥狀與普通感冒相似，但流感發(fā)病迅速，傳染性強(qiáng)，而病毒自身對(duì)現(xiàn)有藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，疫苗保護(hù)作用有限，因此病原體的快速確診對(duì)疾病的預(yù)防和早期治療具有重大意義衛(wèi)生部頒布的流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)指出，鑒別診斷主要依靠病原學(xué)、特異核酸檢查和血清抗體測(cè)定。但是依靠病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷以及抗原檢測(cè)等經(jīng)典方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以適應(yīng)疫情爆發(fā)時(shí)快速診斷的需要。而PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)，是目前公認(rèn)的病原體鑒別診斷的有效方法之一。準(zhǔn)確鑒別流感病毒類型，對(duì)于監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)及流行動(dòng)態(tài)，并對(duì)流感病毒的變異作出預(yù)警，對(duì)于流感的防控具有重大意義，同時(shí)對(duì)臨床一線醫(yī)生在診治過程具有一定的指導(dǎo)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)現(xiàn)有流感病毒檢測(cè)所存在的上述不足而提供一種利用基因?qū)α鞲胁《具M(jìn)行分型的方法，該方法能通過PCR和一代測(cè)序?qū)仔秃鸵倚土鞲胁《具M(jìn)行基因分型。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來解決:

一種利用基因?qū)α鞲胁《具M(jìn)行分型的方法,包括如下步驟：

步驟S1、病毒RNA提??；

步驟S2、將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；

步驟S3、利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟S4、回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟S5、對(duì)所述回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；

步驟S6、將測(cè)序結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比較，將未知病毒劃分至對(duì)應(yīng)的類別。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示。

本發(fā)明的方法跟傳統(tǒng)的基于血清學(xué)檢測(cè)的方法相比，基于PCR原理的核酸檢測(cè)方法檢測(cè)效率更高、更為快速便捷，在突發(fā)傳染病應(yīng)急工作中將會(huì)發(fā)揮巨大作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明模板-PCB產(chǎn)物加量示意圖。

圖2為本發(fā)明模板-拷貝數(shù)示意圖。

圖3和圖4為本發(fā)明樣品類型示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

1、病毒RNA提取

1.1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol 1ml，充分混勻，室溫放置10min，保證病毒外殼充分裂解；

1.2、加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管(溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象)，室溫放置10min(由于氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)離心管可能爆開，小心)；

1.3、12000g室溫離心15min，取上層液相移入另一管(切忌吸動(dòng)白色中間相)；

1.4、加入500ul異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min；

1.5、4℃，10000g離心10min，離心完畢可見管底白色沉淀，即為RNA，用槍小心吸去所有上清；

1.6、加入1ml 75％乙醇，讓RNA沉淀懸起來，4℃，7500g離心5min，用槍小心吸去所有上清，在超凈臺(tái)中干燥5min；

1.7、加入適量DEPC處理水。

1.8、建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后凍存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在－20℃保存1個(gè)月左右。

2、將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

2.1在冰浴的試管中加入如下反應(yīng)混合物：

模板RNA：總RNA 1-3μg

引物：Oligo(dT)(50uM) 1μl

dNTP Mix(10mmol/L) 1μl

2.2加RNase free dH2O至10μl，混勻后65℃孵育5min，結(jié)束后迅速冰浴。

2.3在冰浴的試管中加入如下反應(yīng)混合物：

加RNase free dH2O至20μl輕輕混勻后。

2.4反應(yīng)混合物42℃30-60min。

2.5在95℃加熱5min結(jié)束反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存。

3、引物設(shè)計(jì)

本專利為了提高檢測(cè)效率，根據(jù)流感病毒的基質(zhì)蛋白(M)基因和血凝素(HA)基因以及神經(jīng)氨酸酶(NA)分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，這些引物由上海派森諾生物科技有限公司合成，引物序列如下：

4.PCR擴(kuò)增：對(duì)病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到待測(cè)的基因片段

擴(kuò)增體系和程序如下：

在0.2ml離心管中加入以下成分：

輕彈混勻，瞬時(shí)離心收集管壁上的液滴至管底,在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)如下：

反應(yīng)完成后，取3ulPCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。

5、PCR產(chǎn)物的回收

PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，步驟如下：

5.1在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠放入干凈的離心管中，稱取重量。

5.2加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75℃加熱直至凝膠塊完全熔化。

5.3加0.5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻；當(dāng)分離的DNA片段小于400bp時(shí)，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇。

5.4將混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管12,000×g離心1min。棄濾液。

5.5將制備管置回2ml離心管，加500μl Buffer W1，12,000×g離心30s，棄濾液。

5.6將制備管置回2ml離心管，加700μl Buffer W2，12,000×g離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700μl Buffer W2，12,000×g離心1min。

5.7將制備管置回2ml離心管中，12,000×g離心1min。

5.8將制備管置于潔凈的1.5ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，在制備膜中央加25-30μl去離子水，室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫DNA。

6、一代測(cè)序

利用基于Sanger雙脫氧鏈終止法的技術(shù)進(jìn)行一代測(cè)序，所用測(cè)序儀為ABI3730xl。

7、序列比對(duì)，劃分流感病毒類型

將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將未知病毒劃分至對(duì)應(yīng)的類別。

序列表 ( SEQUENCE LISTING )

<110＞周有 良

胡春凌 王海濤 陳峰

汪朝暉

<120＞丙型肝炎病毒基因分型芯片及分型方法

<160> 8

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTTGCTCYTTYTCTATCTT

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TCATCATATCCCANGCCAT

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTTTTTTTTT-ACTAGGGACGGCAAAC

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TTTTTTTTTT-AGAACAACGCCTCCC

<210> 5

<2 11> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

TTTTTTTTTT-AGAACACCAGTAAGAG

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

TTTTTTTTTT-AGCTAGTCTAGGGTG

<210>7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

TTTTTTTTTT-GTCTGGTCTAGAGCACA

<210> 8

<2 11> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

TTTTTTTTTT-GGCTCTTACCTACG