本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種NDRG4基因甲基化檢測試劑體系和試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌是人類主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位于第三位和第四位。每年有120萬新確診的病例，并且有超過60萬名患者死于結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌發(fā)病率在50歲以下年齡段較低，但會(huì)隨著年齡的增大而增加。發(fā)達(dá)國家的結(jié)直腸癌發(fā)病中位年齡為70歲。結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯，隨著腫瘤的增大而表現(xiàn)排便習(xí)慣改變、便血、腹瀉、腹瀉與便秘交替、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體重減輕等全身癥狀。結(jié)直腸癌可以發(fā)生在結(jié)腸或直腸的任何部位，但以直腸、乙狀結(jié)腸最為多見，其余依次見于盲腸、升結(jié)腸、降結(jié)腸及橫結(jié)腸。癌瘤大多數(shù)為腺癌，少數(shù)為鱗狀上皮癌及粘液癌。本病可以通過淋巴、血液循環(huán)及直接蔓延等途徑，播散到其他組織和臟器。目前結(jié)直腸癌的診斷方法主要有便潛血檢測、X射線鋇劑灌腸或纖維結(jié)腸鏡檢查，但上述方法準(zhǔn)確度和靈敏度均較低，尤其是纖維結(jié)腸鏡檢查給病人帶來很大的痛苦，病人的依從性較差。因此一種新的檢測方法是迫在眉睫的。在腫瘤研究中，許多腫瘤的產(chǎn)生都伴隨有基因的甲基化，癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化狀態(tài)，可導(dǎo)致癌基因的激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改變是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征。NDRG4基因?yàn)橐职┗騈DRG基因家族成員，該基因家族在人體多種其他正常組織中高表達(dá)，在某些腫瘤組織中不表達(dá)或低表達(dá)，低表達(dá)則可能與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)。近年來，研究表明NDRG4基因存在于結(jié)直腸癌腫瘤組織和體液中，且穩(wěn)定性高，NDRG4基因的高甲基化會(huì)導(dǎo)致NDRG4基因的低表達(dá)，即抑癌基因失活，指示結(jié)直腸癌的發(fā)生。研究表明，糞便中的NDRG4甲基化異?？勺鳛榻Y(jié)直腸癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。經(jīng)過大量臨床試驗(yàn)確定了NDRG4基因的甲基化會(huì)導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生，一般通過檢測病人腸道內(nèi)大量脫落癌細(xì)胞中的NDRG4基因甲基化狀態(tài)，從而診斷結(jié)直腸癌的發(fā)生。現(xiàn)有技術(shù)中，有大量文獻(xiàn)闡述了NDRG4基因及NDRG4基因甲基化與結(jié)直腸癌的關(guān)系，但是缺乏對(duì)NDRG4基因甲基化進(jìn)行快速、簡便、靈敏、特異性檢測的方法，不能及時(shí)有效的診斷結(jié)直腸癌。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：結(jié)直腸癌早期診斷困難，現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法靈敏度低、準(zhǔn)確度低并且不方便，尚未有能夠快速、簡便地檢測NDRG4基因甲基化狀態(tài)的試劑體系和試劑盒。本發(fā)明的目的是提供一種NDRG4基因甲基化檢測試劑體系和試劑盒，利用該試劑盒結(jié)合熒光定量PCR方法快速、方便地定性檢測結(jié)直腸癌的發(fā)生；利用所述試劑盒檢測NDRG4基因甲基化狀態(tài)的靈敏度高、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)，操作簡便，周期短。具體來說，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供了一種NDRG4基因甲基化檢測用試劑體系，其特征在于，所述試劑體系包括特異性引物和特異性探針，所述特異性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特異性探針如SEQIDNO.3所示。優(yōu)選的，在所述試劑體系中，所述特異性探針上連接有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，其中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-甲基熒光素(HEX)、四氯-6-羧基熒光素(TET)、異硫氰酸熒光素(FITC)或VIC中的一種，優(yōu)選6-羧基熒光素；所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ或四甲基羅丹明(TAMRA)。優(yōu)選的，所述試劑體系還包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品中含有插入了NDRG4基因甲基化特異性序列SEQIDNO.4的重組質(zhì)粒。優(yōu)選的，所述試劑體系還包括陰性標(biāo)準(zhǔn)品，所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品中含有沒有插入NDRG4基因甲基化特異性序列的質(zhì)粒。優(yōu)選的，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品中的重組質(zhì)粒濃度為1.0×103copies/μL，所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品中的質(zhì)粒濃度為1.0×103copies/μL。優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒與質(zhì)粒相同，選自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322或pMD-T中的一種，優(yōu)選pGM-T或pBR322。優(yōu)選的，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品中的重組質(zhì)粒和所述陰性標(biāo)準(zhǔn)品中的質(zhì)粒的制備方法如下：(1)以序列SEQIDNO.4為模板，利用引物序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；(2)將目的基因連接到質(zhì)粒載體上，得到連接產(chǎn)物；(3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)；(4)篩選含有目的基因的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品；不含目的基因的質(zhì)粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)選的，所述試劑體系還包括緩沖液和dNTPs，所述緩沖液的組成包括三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀和氯化鎂。優(yōu)選的，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為50～200mM，優(yōu)選為100～150mM；氯化鉀的濃度為300～800mM，優(yōu)選為400～600mM；氯化鎂的濃度為10～30mM，優(yōu)選為10～20mM。優(yōu)選的，所述試劑體系還包括DNA聚合酶，優(yōu)選為TaqDNA聚合酶。另一方面，本發(fā)明提供了一種NDRG4基因甲基化檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含前述的試劑體系。再一方面，本發(fā)明提供了特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3在制備NDRG4基因甲基化檢測用試劑或試劑盒中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備NDRG4基因甲基化結(jié)直腸癌檢測用試劑或試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述NDRG4基因甲基化檢測用試劑或試劑盒的使用方法包括以下步驟：(1)甲基化處理樣本DNA；(2)利用特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3對(duì)步驟(1)甲基化處理后的樣本DNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。優(yōu)選的，前述使用方法還包括：將含有插入了NDRG4基因甲基化特異性序列SEQIDNO.4的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；將含有沒有插入NDRG4基因甲基化特異性序列SEQIDNO.4的質(zhì)粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。優(yōu)選的，所述甲基化處理樣本DNA的步驟包括：(1)從糞便樣本中提取基因組DNA；(2)利用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，得到甲基化處理的樣本DNA。優(yōu)選的，在所述應(yīng)用中，所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為：94～95℃預(yù)變性2～5min，1個(gè)循環(huán)；94～95℃15～20s，53～55℃30～50s，58～60℃30～50s，共40～50個(gè)循環(huán)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的效果和益處在于：1)本發(fā)明試劑盒定量準(zhǔn)確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。2)本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度和特異性高，由于采取特異性引物和探針的雙保險(xiǎn)設(shè)計(jì)，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測結(jié)直腸癌。3)本發(fā)明試劑盒檢測速度快，總共僅需2個(gè)小時(shí)，步驟簡單，可同時(shí)進(jìn)行高通量樣本檢測。附圖說明圖1為陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品在熒光PCR擴(kuò)增過程的熒光曲線；圖2為樣品在熒光PCR擴(kuò)增過程的熒光曲線。其中，圖1中的曲線1為陰性標(biāo)準(zhǔn)品在PCR擴(kuò)增過程的熒光曲線，曲線2為陽性標(biāo)準(zhǔn)品在PCR擴(kuò)增過程的熒光曲線；圖2中的曲線1為樣品1的熒光曲線，曲線2為樣品2的熒光曲線，曲線3為樣品3的熒光曲線，曲線4為樣品4的熒光曲線，曲線5為樣品5的熒光曲線；其中，樣品1的提供者不是結(jié)直腸癌患者，樣品2-5的提供者患有結(jié)直腸癌。具體實(shí)施方式熒光PCR技術(shù)在1995年由美國PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。本發(fā)明將熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于檢測NDRG4基因的甲基化狀態(tài)，從而定性檢測結(jié)直腸癌的發(fā)生。具體而言，本發(fā)明提供了一種NDRG4基因甲基化檢測用的試劑體系和試劑盒，所述試劑體系中含有特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3；特異性探針的5’和3’端分別含有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、HEX、TET、、FITC或VIC中的一種，所述熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ或TAMRA。當(dāng)探針上同時(shí)含有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)時(shí)，不發(fā)出熒光；當(dāng)特異性探針被DNA聚合酶降解時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分開，發(fā)出熒光。試劑體系還包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品，也含有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要的基本組分，比如緩沖液和dNTPs。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，試劑體系中的緩沖液組成為50～200mM三羥甲基氨基甲烷，300～800mM氯化鉀和10～30mM氯化鎂。試劑體系中的DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。本發(fā)明提供了一種含有NDRG4基因甲基化序列的重組質(zhì)粒，所述NDRG4基因甲基化序列如SEQIDNO.4所示，所述質(zhì)粒選自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322和pMD-T中的一種。在重組質(zhì)粒篩選過程中，轉(zhuǎn)化成功的含有NDRG4基因甲基化序列的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，即作為陽性對(duì)照；沒有轉(zhuǎn)化成功的空白質(zhì)粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品，即作為陰性對(duì)照。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種NDRG4基因甲基化檢測用試劑盒，所述試劑盒包括陽性標(biāo)準(zhǔn)品，陰性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)液以及DNA聚合酶。所述反應(yīng)液含有特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3，反應(yīng)液的組成為：每18μL反應(yīng)液中含有的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和dNTP的量依次為200-300nM，200-300nM，200-300nM和100-200mM。陽性標(biāo)準(zhǔn)品(重組質(zhì)粒)和陰性標(biāo)準(zhǔn)品(空白質(zhì)粒)的篩選方法包括以下步驟：(1)以序列SEQIDNO.4為模板，利用引物序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的基因；(2)將目的基因連接到質(zhì)粒載體上，得到連接產(chǎn)物；(3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)；(4)篩選含有目的基因的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品；不含目的基因的質(zhì)粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品。采用本發(fā)明所述試劑盒檢測NDRG4基因甲基化的情況，檢測方法包括以下步驟：樣品預(yù)處理，將處理后的樣品加入樣品管內(nèi)。制備待測溶液的步驟包括，取新反應(yīng)管編號(hào)，然后分別加入陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，再往其中分別加入反應(yīng)液和DNA聚合酶，混勻；各組待測溶液中的樣品量或陽性標(biāo)準(zhǔn)品含量或者陰性標(biāo)準(zhǔn)品含量相同，且反應(yīng)液和DNA聚合酶的含量也相同；通常，待測溶液中陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品與反應(yīng)液、DNA聚合酶的比為：(1-2)μL：(18-20)μL：(5-20)U。將待測溶液放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行測定，PCR測定的條件為：94～95℃預(yù)變性2～5min，1個(gè)循環(huán)；94～95℃15～20s，53～55℃30～50s，58～60℃30～50s，共40～50個(gè)循環(huán)；最后分析熒光定量PCR測定結(jié)果，判斷樣品提供者是否患有結(jié)直腸癌。檢測前的樣品處理方法包括，先利用基因組DNA提取試劑盒從糞便樣本中提取DNA，再利用基因組DNA甲基化處理試劑盒處理提取得到的DNA。甲基化處理試劑盒的原理為亞硫酸氫鹽法甲基化處理，經(jīng)甲基化處理試劑盒處理后的DNA作為樣品。樣本基因組DNA經(jīng)甲基化處理試劑盒處理后，若樣本基因組中的NDRG4基因序列中的胞嘧啶(C)已經(jīng)被甲基化，則經(jīng)甲基化處理試劑盒處理之后的NDRG4基因序列不變，如SEQIDNO.4所示，特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3能與SEQIDNO.4結(jié)合，熒光定量PCR反應(yīng)過程中，在DNA聚合酶的作用下探針SEQIDNO.3上的5’熒光報(bào)告基團(tuán)與3’淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光；若樣本基因組中的NDRG4基因序列中的胞嘧啶(C)沒有被甲基化，則經(jīng)甲基化處理試劑盒處理后，NDRG4基因序列中的C變成尿嘧啶(U)，即甲基化處理后的NDRG4基因序列與SEQIDNO.4不同，特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3無法與處理后的樣本DNA結(jié)合，熒光定量PCR反應(yīng)過程中，探針SEQIDNO.3保持完整，由于同時(shí)連接有5’熒光報(bào)告基團(tuán)與3’淬滅基團(tuán)，熒光PCR反應(yīng)過程中不發(fā)出熒光；即經(jīng)甲基化處理試劑盒后，甲基化的NDRG4基因在熒光定量PCR檢測過程中會(huì)發(fā)出熒光，而沒有甲基化的NDRG4基因不發(fā)熒光。因此，本發(fā)明所述的試劑體系和試劑盒與熒光定量PCR檢測相結(jié)合后，可以用于檢測NDRG4基因的甲基化狀態(tài)。NDRG4基因高度甲基化是結(jié)直腸癌的重要分子標(biāo)志，故本發(fā)明所述的試劑體系和試劑盒及其使用在結(jié)直腸癌診斷中具有重要意義。采用本發(fā)明所述試劑盒檢測NDRG4基因甲基化狀態(tài)的方法簡單，靈敏度高，特異性強(qiáng)；通過檢測NDRG4基因甲基化能有效判斷樣本供體是否為結(jié)直腸癌患者。下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，實(shí)施例中所用試劑和儀器的廠家如下：三羥甲基氨基甲烷，廠家：百靈威科技有限公司；氯化鉀，廠家：百靈威科技有限公司；氯化鎂，廠家：百靈威科技有限公司；dNTPs，廠家：TAKARA，日本；TaqDNA聚合酶，廠家：TAKARA，日本；SAP酶EF0511，廠家：賽默飛世爾科技有限公司；ExoI酶，廠家：TAKARA，日本；熒光定量PCR儀，廠家：美國ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500，美國；基因組DNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司；基因組DNA甲基化處理試劑盒，購自QIAGEN公司；pGM-T質(zhì)粒載體，均購自天根生化科技(北京)有限公司；本發(fā)明中用到的特異性引物，以及特異性探針序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其中，特異性探針上連接的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例1試劑盒的制備本實(shí)施例制備的試劑盒包括含有NDRG4基因甲基化序列的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，含空白質(zhì)粒的陰性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)液和DNA聚合酶。其中，裝DNA聚合酶的試管容積為500μL，管內(nèi)含有濃度為5U/μL的TaqDNA聚合酶22μL。(一)陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品的制備通過對(duì)大量臨床結(jié)直腸癌患者以及正常人群的DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)得到一條和結(jié)直腸癌疾病有關(guān)的序列，NDRG4基因甲基化序列SEQIDNO.4，SEQIDNO.4序列如下：以SEQIDNO.4的序列為目的基因，設(shè)計(jì)引物序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系見表1。引物序列SEQIDNO.5：5’-TAGTATAGTTCGCGCGGC-3’引物序列SEQIDNO.6：5’-CGAACGAACCGCGATC-3’PCR反應(yīng)參數(shù)為：表1PCR反應(yīng)體系組成體積(μL)目的基因1(30μg/mL)10×Buffer2.5dNTP0.2(20mM，each)TaqDNA聚合酶0.25(5U/μL)引物序列SEQIDNO.50.25(25μM)引物序列SEQIDNO.60.25(25μM)ddH2O15.55總體積20表1中的緩沖液為pH8.0的Tris-HcL緩沖液。擴(kuò)增結(jié)束后，將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物連接到pGM-T質(zhì)粒載體上，得到連接有目的基因的質(zhì)粒；所述PCR產(chǎn)物的純化體系如表2所示：表2PCR產(chǎn)物純化體系組分體積(μL)PCR產(chǎn)物20SAP酶0.85(1U/μL)ExoI酶0.375(10U/μL)ddH2O3.775總體積25將PCR產(chǎn)物純化體系放置于PCR擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37℃、20min，73℃、20min。接著將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向DNA測序鑒定，目的基因與質(zhì)粒連接成功的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外分光光度計(jì)定量，并將陽性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到103拷貝每微升的濃度后裝入陽性標(biāo)準(zhǔn)品管內(nèi)，保存于-20℃。雙向DNA測序表明沒有重組的pGM-T質(zhì)粒作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品，將其稀釋到103拷貝每微升的濃度后裝入陰性標(biāo)準(zhǔn)品管內(nèi)。陽性標(biāo)準(zhǔn)品管和陰性標(biāo)準(zhǔn)品管的容量均為200μL，其中，陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品的體積均為50μL。(二)反應(yīng)液的制備根據(jù)NDRG4基因的高甲基化序列SEQIDNO.4設(shè)計(jì)特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3。反應(yīng)液中含有所述的特異性引物和探針；其中，正向引物SEQIDNO.1為5’-CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG-3’；反向引物SEQIDNO.2為5’-GTAACTTCCGCCTTCTACGC-3’；探針SEQIDNO.3為5’-TCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCG-3’；特異性探針上含有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)BHQ，F(xiàn)AM和BHQ分別連接在特異性探針序列的5’和3’端。表3列出了反應(yīng)液的配方，按照該配方制備反應(yīng)液。表3本實(shí)施例中反應(yīng)液的配方組成體積(μL)10xBuffer2SEQIDNO.10.4(200nM)SEQIDNO.20.4(200nM)SEQIDNO.30.2(200nM)dNTP0.8(100mM)H2O14.2總體積18其中，所述緩沖液(buffer)溶液的組成為：Tris-HCl100mM、KCl400mM、MgCl210mM，其中Tris-HCl的pH值為8.5。按照表3的配比配制反應(yīng)液，本實(shí)施例所述試劑盒中的反應(yīng)液總體積為380μL。由此，裝有步驟(一)制備的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品，步驟(二)制備的反應(yīng)液，以及TaqDNA聚合酶組成了本實(shí)施例所述的試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的制備本實(shí)施例制備的試劑盒與實(shí)施例1制備的試劑盒中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品相同，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：本實(shí)施例反應(yīng)液的配方如表4所示，其中，引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3與實(shí)施例1相同。本實(shí)施例中DNA聚合酶管內(nèi)的酶為TaqDNA聚合酶，其濃度為4U/μL，體積為30μL。表4本實(shí)施例中反應(yīng)液的配方組成體積(μL)10xBuffer2SEQIDNO.10.5(300nM)SEQIDNO.20.5(300nM)SEQIDNO.30.3(300nM)dNTP1.0(200mM)H2O13.7總體積18其中，所述緩沖液(buffer)溶液的組成為：Tris-HCl150mM、KCl600mM、MgCl220mM，其中Tris-HCl的pH值為8.3。按照表4的配比配制反應(yīng)液，本實(shí)施例所述試劑盒中的反應(yīng)液總體積為350μL。實(shí)施例3試劑盒的制備本實(shí)施例制備的試劑盒與實(shí)施例1制備的試劑盒中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品相同，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：本實(shí)施例反應(yīng)液的配方如表5所示，其中，引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3與實(shí)施例1相同，但探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ；本實(shí)施例中DNA聚合酶管內(nèi)的酶為TaqDNA聚合酶，其濃度為5U/μL，體積為30μL。表5本實(shí)施例中反應(yīng)液的配方組成體積(μL)10xBuffer3SEQIDNO.10.4(250nM)SEQIDNO.20.4(250nM)SEQIDNO.30.3(250nM)dNTP1.0(200mM)H2O12.9總體積18其中，所述緩沖液(buffer)溶液的組成為：Tris-HCl50mM、KCl300mM、MgCl210mM，其中Tris-HCl的pH值為8.2。按照表5的配比配制反應(yīng)液，本實(shí)施例所述試劑盒中的反應(yīng)液總體積為400μL。實(shí)施例4試劑盒的制備本實(shí)施例制備的試劑盒與實(shí)施例1制備的試劑盒中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品相同，本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于：本實(shí)施例反應(yīng)液的配方如表6所示，其中，引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3與實(shí)施例1相同；本實(shí)施例中DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶，其濃度為5U/μL，體積為30μL。表6本實(shí)施例中反應(yīng)液的配方組成體積(μL)10xBuffer2SEQIDNO.10.4(250nM)SEQIDNO.20.4(250nM)SEQIDNO.30.2(250nM)dNTP0.9(150mM)H2O14.1總體積18其中，所述緩沖液(buffer)溶液的組成為：Tris-HCl200mM、KCl800mM、MgCl230mM，其中Tris-HCl的pH值為8.5。按照表6的配比配制反應(yīng)液，本實(shí)施例所述試劑盒中的反應(yīng)液總體積為380μL。實(shí)施例5本實(shí)施例利用實(shí)施例1制備的試劑盒檢測樣本的NDRG4基因甲基化狀態(tài)。試劑盒中已經(jīng)含有陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)液和TaqDNA聚合酶，應(yīng)用試劑盒檢測NDRG4甲基化的步驟如下：(1)樣本預(yù)處理從天津總醫(yī)院獲得臨床結(jié)直腸癌患者或者潛在患者的糞便樣本，按照基因組DNA提取試劑盒上的操作說明提取基因組DNA，然后利用DNA甲基化處理試劑盒處理上述提取到的基因組DNA，處理后的DNA作為樣品。(2)制備待測溶液取新反應(yīng)管，分別標(biāo)記為陽性標(biāo)準(zhǔn)品管、陰性標(biāo)準(zhǔn)品管和樣品管，然后往各個(gè)管中分別加入陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，再往各個(gè)管中分別加入反應(yīng)液和DNA聚合酶，各個(gè)管中的待測溶液組成見表7。需說明的是，可以同時(shí)檢測多個(gè)樣品，即同時(shí)準(zhǔn)備多個(gè)樣品管，每個(gè)樣品管中裝有按照相同的方法處理過的來自不同供體的糞便樣本，本實(shí)施例同時(shí)檢測了5個(gè)樣品，并依次標(biāo)記為樣品1-5。表7待測溶液的組成(3)熒光定量PCR探針SEQIDNO.3上的熒光報(bào)告基團(tuán)FAM發(fā)出綠色熒光，當(dāng)探針中的序列無法與待測溶液中的DNA模板配對(duì)時(shí)，探針保持完整，即同時(shí)含有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)BHQ，PCR擴(kuò)增后無法檢測到熒光；而當(dāng)探針能夠與待測溶液中的DNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，探針被TaqDNA聚合酶降解，探針5’的報(bào)告基團(tuán)與3’的淬滅基團(tuán)分離，PCR擴(kuò)增過程中能夠檢測到熒光。探針序列SEQIDNO.3是以NDRG4基因高甲基化后的DNA序列為模板設(shè)計(jì)的，若PCR擴(kuò)增過程能檢測到熒光則說明體系中存在NDRG4基因高甲基化后的序列，結(jié)直腸癌檢測結(jié)果很可能為陽性；若PCR擴(kuò)增過程中無法檢測到熒光，則結(jié)直腸檢測結(jié)果可能為陰性；具體的結(jié)直腸癌檢測結(jié)果判斷還需要結(jié)合PCR擴(kuò)增后的定量分析。熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃15秒，53℃40秒，58℃40秒，共40個(gè)循環(huán)。(4)結(jié)果分析本實(shí)施例檢測了5個(gè)樣品以及1個(gè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品和1個(gè)陰性標(biāo)準(zhǔn)品。利用ABI7500Software軟件記錄PCR擴(kuò)增過程，其結(jié)果如圖1和圖2所示。如果熒光強(qiáng)度增長曲線不呈S型曲線或Ct值>＝35，則判斷樣品為陰性或樣品的總含量小于檢測極限。如果增長曲線呈S型曲線且Ct值<35，則樣品的診斷結(jié)果為陽性。圖1給出的是陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品在PCR擴(kuò)增過程中的熒光曲線圖，其中，熒光強(qiáng)度增長曲線呈S型增長，且Ct值小于35的曲線為陽性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果，陰性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與陽性標(biāo)準(zhǔn)品相同，均在檢測范圍內(nèi)，故隨著循環(huán)數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度變化非常小的曲線為陰性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果。圖2給出的是5個(gè)樣品在PCR擴(kuò)增過程中的熒光曲線圖，所有樣品的濃度均在檢測范圍內(nèi)。曲線1的熒光強(qiáng)度幾乎不變，可以推斷該樣品的檢測結(jié)果為陰性，該樣本(樣品1)的提供者不是結(jié)直腸癌患者；曲線2、曲線3、曲線4和曲線5的熒光強(qiáng)度增長呈S型，且Ct值均小于35，故樣品2-5的檢測結(jié)果為陽性，樣品2-5的提供者為大腸癌患者。該檢測結(jié)果與樣本的實(shí)際來源相同，證明了本發(fā)明所述試劑盒和檢測方法的可靠性。以上所述僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例，并不用于局限本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均需要包含在發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>劉鵬飛<120>NDRG4基因甲基化檢測用試劑體系和試劑盒及其應(yīng)用<130>OICN160092<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1cggttttcgttcgttttttcg21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2gtaacttccgccttctacgc20<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3tcgtttatcgggtattttagtcgcg25<210>4<211>168<212>DNA<213>人工序列<400>4tagtatagttcgcgcggcggagcgggtgagaagtcggcgggggcgcggatcgatcggggt60gttttttaggtttcgcgtcgcggttttcgttcgttttttcgttcgtttatcgggtatttt120agtcgcgtagaaggcggaagttacgcgcgagggatcgcggttcgttcg168<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5tagtatagttcgcgcggc18<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>6cgaacgaaccgcgatc16當(dāng)前第1頁1 2 3