本發(fā)明涉及家禽飼養(yǎng)及疾病防治領(lǐng)域，尤其是一種鴨瘟和大腸桿菌雙重PCR診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

鴨瘟(Duck Plague)，又名鴨病毒性腸炎(Duck Viral Enteritis,DVE)，是由鴨瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)引起鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性敗血性傳染病，因其發(fā)病率和死亡率較高，常給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。大腸桿菌(Escherichia coli,E coil)是家禽最常見的細菌病之一，所引其的局部或全身感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫、氣囊病、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及卵黃囊感染。

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；潭炔粩嗵岣?，鴨群中多種疾病混合感染的情況普遍存在，為疾病的診斷帶來了不小的難度。大腸桿菌病在禽類宿主防御能力下降時，常引起繼發(fā)性局部或全身感染，且鴨瘟、大腸桿菌病與鴨霍亂在臨床癥狀、病理變化及流行病學(xué)等方面都存在諸多相似^[3]。因此，常規(guī)的診斷方法很難快速、準(zhǔn)確地做出診斷，故建立鴨瘟和大腸桿菌病鑒別診斷的分子生物學(xué)方法十分必要。

多重PCR的優(yōu)勢之處在于：可實現(xiàn)一份樣品中同時檢測出多種病原體，且特異性強、敏感性高、檢測時間短、檢測成本低，適合大量臨床樣本(特別是混合感染樣本)中病原體的快速診斷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種鴨瘟和大腸桿菌雙重PCR診斷試劑盒，它能夠同時對臨床樣本進行DPV和E.coli的雙重檢測，并且操作簡便、快速、且靈敏性及準(zhǔn)確性好，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：鴨瘟和大腸桿菌雙重PCR診斷試劑盒，包括Taq polymerase、緩沖液2×Buffer、超純水、混合引物及陽性對照；Taq polymerase濃度為1U/mL、緩沖液2×Buffer濃度為0.5mol/L、混合引物濃度為10mmol/L，陽性對照濃度為鴨瘟基因組DNA，大腸桿菌基因組DNA各10ng/L，陰性對照為超純水；其中，混合引物包括引物DPV-F 5’-GCGTGATTCAGTGCCTAT-3’，引物DPV-R 5’-GTCATCTCGGTATTGTATTGG-3’，引物E.coli-F 5’-AGAGATGAGAATGTGCCTTC-3’，引物E.coli-R 5’-GTTAC CTTGTTACGACTTCAC-3’。

所述的陽性對照為鴨瘟基因組DNA，大腸桿菌基因組DNA。

為了驗證本發(fā)明的技術(shù)效果，進行了以下試驗：

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗的DPV活疫苗(雞胚化弱毒株)購自南京天邦生物技術(shù)有限公司，鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)微生物保藏管理中心(CVCC)，DPV GZ株由貴州大學(xué)動物科技學(xué)院惠贈；DPV病毒CHv強毒株、E.coli(血清O78、O11、O88型)、鴨疫里默氏巴氏桿菌(血清1型)、鴨多殺性巴氏桿菌由本實驗室分離鑒定后保存。

Gold view、Taq Polymerase、無核酸酶ddH₂O、Tris、HCl、KCl、MgCl₂、dNTPs、RNase free dH₂O、DL2000、DL500、DNAiso Reagant等購自寶生物(大連)工程有限公司；50×TAE等購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)Genbank收錄中的DPV TK基因(DQ640611.1)、大腸桿菌16 sRNA基因(NC_018658.1)序列，設(shè)計了2對引物，用于擴增目的基因片段，引物序列見表一。

表1 引物序列

1.2.2 病毒核酸提取 解剖病鴨后分別取腦、肺、心、肝臟、腸、血、糞便等病樣各50mg，按照DNAiso Reagant說明書進行病毒(菌)DNA的提取，將提取的DNA樣品于-20℃保存。

1.2.3 單一病毒PCR擴增 單一病毒的RT-PCR反應(yīng)在25μL體系中進行，上下游引物各1μL(10μM)、Taq Polymerase 1.3U、2×Buffer 12.5μL、模板1μL，無核酸酶ddH₂O補充至25μL，反應(yīng)程序：94℃ 5min、94℃30s、58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，72℃延伸5min。取5μL PCR擴增產(chǎn)物于20g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 對多重PCR反應(yīng)條件，包括退火溫度(54、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃)、下上游引物濃度(2μM、5μM、10μM、15μM、20μM)、Taq Polymerase(15U、25U、30U、35U、40U)、dNTPs濃度(5μM、10μM、20μM、25μM、30μM)進行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件，同時以無核酸酶ddH₂O作為空白對照。多重PCR在50μL反應(yīng)體系中進行。反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30s、退火溫度(54、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃)30s、72℃30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。取5μL擴增產(chǎn)物于20g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

1.2.5 敏感性試驗 將提取的病毒(菌)DNA用蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度后，取2μg DPV和E.coli DNA混合，分別經(jīng)10倍系列稀釋的病毒核酸用于多重PCR；2μg DPV、2μg E.coli濃度用于分別經(jīng)10倍系列稀釋的病毒核酸用于單一PCR反應(yīng)，以確定多重PCR的敏感性；

1.2.6 特異性試驗 分別以DPV(疫苗株、Gz株、CHv強毒株)、E.coli(血清O78、O11、O88型)、鴨疫里默氏菌和鴨沙門氏菌的DNA為模板，進行多重PCR反應(yīng)，以確定多重PCR的特異性。

1.2.7 重復(fù)性試驗 應(yīng)用建立多重PCR方法，重復(fù)檢測DPV、E.coli單一病毒(菌)DNA或混合DNA樣品3次，已檢驗結(jié)果的可靠性。

1.2.8 多重PCR試劑盒的組成及對臨床樣品的檢測 應(yīng)用建立的多重PCR方法組成試劑盒，包括：(1)Taq polymerase；(2)緩沖液(2×Buffer)；(3)無核酸酶ddH₂O；(4)混合引物；(5)陽性對照。應(yīng)用試劑盒對貴州省貴陽市、凱里市、都勻市、興義市、天柱縣、三穗縣地區(qū)幾個規(guī)?；B(yǎng)鴨場和養(yǎng)鴨專業(yè)戶采集的187分病料進行檢測，同時將結(jié)果與單一PCR檢測結(jié)果進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR反應(yīng)及產(chǎn)物的鑒定

多重PCR反應(yīng)在50μL反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為退火溫度58℃，DNA Polymerase 2U，2×Buffer 25.0μL，引物濃度15μmol/L均有效擴增出目的片段，DPV擴增產(chǎn)物312bp，E.coli擴增產(chǎn)物499bp，無特異性片段產(chǎn)生(圖1)。DPV、E.coli的多重PCR擴增片段經(jīng)切膠回收后，送寶生物(大連)工程有限公司測序，結(jié)果表明，擴增片段分別為兩個病毒(菌)的特異性條帶。

2.2 敏感性試驗

研究發(fā)現(xiàn)，在單一病毒的PCR反應(yīng)中，DPV最低核酸檢測量為0.02ng/mL(圖2)、E.coli為0.01ng/mL(圖3)；兩種病毒(菌)混合后，在多重PCR反應(yīng)中，DPV最低核酸檢測量為0.2ng/L、E.coli為0.1ng/L(圖4)。

2.3 特異性試驗

分別以DPV、E.coli、鴨疫里默氏菌、鴨多殺性巴氏桿菌、鴨沙門氏菌、健康鴨組織DNA和水為模板，進行多重PCR反應(yīng)，DPV(疫苗株、Gz株、CHv強毒株)、E.coli(O11、O78、O88血清型)的單一和混合DNA均能擴增出相應(yīng)的特異性條帶，而以鴨疫里默氏菌、鴨多殺性巴氏桿菌、鴨沙門氏菌、健康鴨組織DNA和水為模板，均未能擴增出條帶(圖5-6)。

2.4 重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立的多重PCR方法，重復(fù)檢測DPV、E.coli單一病毒(菌)DNA或混合DNA樣品3次，結(jié)果均一致。

2.5 多重PCR試劑盒對臨床樣品的檢測

應(yīng)用研制的DPV和E.coli多重PCR試劑盒對200份病料進行檢測，結(jié)果中有33份病料DPV陽性，陽性率為16.5％；57份E.coli陽性，陽性率為28.5％。其中DPV和E.coli均陽性16份，陽性率為8％。其結(jié)果與單一病毒(菌)PCR檢測結(jié)果的符合率為100％。

3 討論

1980年，王永坤等人于首次在我國發(fā)現(xiàn)鵝生殖器官E.coli病，隨著科養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，該病已呈現(xiàn)普遍感染趨勢，統(tǒng)計顯示，禽E.coli的發(fā)病率為11％—69％，死亡率為3.8—72.9％，致死率為40.2％—90.3％?，F(xiàn)有研究表明，E.coli抗原主要有O(菌體抗原)、K(莢膜抗原)、H(鞭毛抗原)、F(菌毛抗原)四種，已經(jīng)確定的O抗原有173種，K抗原80種，H抗原56種，F(xiàn)抗原不少于17種。E.coli血清型復(fù)雜多樣，常規(guī)實驗條件難以同時檢測所有血清型，也提示我們需要轉(zhuǎn)而尋求分子生物學(xué)診斷方法。鴨瘟是一種急性敗血性傳染病，傳播速度快，發(fā)病率、死亡率高，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。DPV僅有一種血清型，目前DPV的常規(guī)檢測方法包括：病毒分離、瓊脂擴散試驗、Elisa等，這些方法不僅耗時，且敏感性較低，不利于疾病的快速、準(zhǔn)確診斷。鴨瘟與大腸桿菌病在臨床癥狀、病理變化及流行病學(xué)等方面都存在諸多相似。因此，常規(guī)的診斷方法很難快速、準(zhǔn)確地做出診斷。

PCR技術(shù)以其快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點在動物疫病檢測中得到廣泛應(yīng)用，已成為動物病原檢測的重要方法之一。常規(guī)的PCR檢測方法通常只檢測1種病原，本研究首次同時檢測DPV和E.coli，簡化了檢測程序，節(jié)本增效，為臨床檢測提供了新的方法。16S rRNA基因普遍存在于細菌并參與細菌的蛋白質(zhì)合成過程，含有高度保守的序列區(qū)域，16S rRNA基因已成為多種細菌診斷方法的基礎(chǔ)。研究顯示，胸腺激酶(Thymidine kinase，TK)基因?qū)儆诎捳畈《镜闹饕亩玖蛑唬彩菢?gòu)建皰疹病毒基因缺失疫苗的首選靶基因。隨著Plummer等和Hansen等國外學(xué)者先后應(yīng)用PCR檢測DPV獲得成功，我國的劉菲等和程安春等、孟日增等、魏雪濤等很多學(xué)者先后建立了檢測DPV的PCR方法，均獲得了良好的效果。湯承等建立了檢測DPV的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，石建平等和徐洋先后建立了檢測DPV的TaqMan實時熒光定量PCR方法，實現(xiàn)了對DPV DNA從定性到定量的檢測。然而值得注意的是，實時熒光定量操作復(fù)雜，且我國大部分基層動物預(yù)控中心及養(yǎng)殖場尚未配備熒光定量PCR儀。

由于采用了以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以再同一個反應(yīng)體系中同時檢測DPV和E.coli這兩種病毒，檢測量分別為DPV 0.2ng/mL、E.coli 0.1ng/mL，雖然敏感性較建立的單一病毒(均)PCR低，但是已高于傳統(tǒng)的血清學(xué)及Elisa檢測方法，可滿足臨床檢測的需要；同時，針對本診斷試劑盒的特異性驗證結(jié)果顯示：在鴨多殺性巴氏桿菌、鴨沙門氏菌和鴨疫里默氏桿菌及健康鴨組織DNA的擴增結(jié)果均為陰性，表明本診斷試劑盒的特異性良好，能夠?qū)εR床樣品中DPV和E.coli的單獨或混合感染進行快速、準(zhǔn)確的診斷，可滿足大批量樣品的快速檢測需要，能夠在我國基層動物預(yù)控中心或養(yǎng)殖企業(yè)中推廣使用。

附圖說明

圖1為DPV及E.coli多重PCR結(jié)果；

M:DL2000Marker；1:DPV及E.coli多重PCR產(chǎn)物；2:E.coli單一PCR產(chǎn)物；3:DPV單一PCR產(chǎn)物；4:空白對照(水)；

圖2為DPV單一PCR靈敏度檢測；

M:DL2000Marker；1:200ng；2:20ng；3:2ng；4:0.2ng；5:0.02ng；6:2pg；

圖3為E.coli單一PCR靈敏度檢測；

M:DL2000Marker；1:100ng；2:10ng；3:1ng；4:0.1ng；5:0.01ng；6:1pg；

圖4為DPV、E.coli多重PCR靈敏度檢測；

M:DL2000Marker；1:DPV/E.coli:0.02/0.01ng；2:DPV/E.coli:0.2/0.1ng；3:DPV/E.coli:2/1ng；4:DPV/E.coli:20/10ng；5:DPV/E.coli:2/1μg；6:DPV/E.coli:20/10μg

圖5為DPV、E.coli多重PCR特異性檢測；

M:DL2000 Marker；1:鴨疫里默氏桿菌；2:鴨多殺性巴氏桿菌；3:鴨沙門氏菌；4:E.coli；5:DPV；6:水；7:健康鴨；8:DPV和E.coli；

圖6為鴨瘟及禽致病性大腸桿菌多重PCR特異性檢測結(jié)果；

M:DL500 Marker；1:E.coli血清O78型；2:E.coli血清O11型；3:E.coli血清O88型；4:DPV疫苗株；5:DPV CHv株；6:DPV GZ株；7:鴨多殺性巴氏桿菌；8:鴨疫里默氏巴氏桿菌:9:禽源多殺性巴氏桿菌；10:健康鴨組織。

具體實施方式

本發(fā)明的實施例：鴨瘟和大腸桿菌雙重PCR診斷試劑盒，包括T aq polymerase、緩沖液2×Buffer、超純水、混合引物及陽性對照；Taq polymerase濃度為1U/mL、緩沖液2×Buffer濃度為0.5mol/L、混合引物濃度為10mmol/L，陽性對照濃度為鴨瘟基因組DNA，大腸桿菌基因組DNA各10ng/L，陰性對照為超純水；其中，混合引物包括引物DPV-F 5’-GCGTGATTCAGTGCCTAT-3’，引物DP V-R 5’-GTCATCTCGGTATTGTATTGG-3’，引物E.coli-F 5’-A GAGATGAGAATGTGCCTTC-3’，引物E.coli-R 5’-GTTACCTT GTTACGACTTCAC-3’。

所述的陽性對照為鴨瘟基因組DNA，大腸桿菌基因組DNA。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 貴州省畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 鴨瘟和大腸桿菌雙重PCR診斷試劑盒

<130> nm:

<160> 4

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)Genbank中的DPV TK基因（DQ640611.1）序列，應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計，以用PCR擴增。

<400> 1

GCGTG ATTCA GTGCC TAT 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)Genbank中的DPV TK基因（DQ640611.1）序列，應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計，以用PCR擴增。

<400> 2

GTCAT CTCGG TATTG TATTG G 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根據(jù)Genbank中的大腸桿菌16 sRNA基因（NC_018658.1）序列，應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計，以用PCR擴增。

<400> 3

AGAGA TGAGA ATGTG CCTTC 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根據(jù)Genbank中的大腸桿菌16 sRNA基因（NC_018658.1）序列，應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計，以用PCR擴增。

<400> 4

GTTAC CTTGT TACGA CTTCA C 21