本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，生物治療己經(jīng)成為繼手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療之后的第五大治療模式，并逐漸受到重視。過繼性細(xì)胞免疫治療法(ACI)是細(xì)胞生物治療方法之一，它是指向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。目前在臨床上應(yīng)用過繼性免疫細(xì)胞包括DC-CIK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、LAK細(xì)胞及NK細(xì)胞，其中，CIK細(xì)胞、LAK細(xì)胞和A-NK細(xì)胞都是以自然殺傷細(xì)胞為主體的抗癌體系。自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercells)也叫做NK細(xì)胞，主要來源于骨髓CD34+的淋巴細(xì)胞，分布在骨髓、外周血和脾臟，占外周血淋巴細(xì)胞的10％-20％。NK細(xì)胞在腫瘤免疫、清除非己細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用：它是天然免疫防御的主要組成，位于機(jī)體防御體系的第一道防線，NK細(xì)胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，可無需抗原預(yù)先致敏即可識別并殺死腫瘤及病毒感染的細(xì)胞，通過穿孔素-顆粒酶途徑和Fas-FasL通路直接對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞；同時它又能在發(fā)病早期分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1等，這些細(xì)胞因子參與抗癌和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，故NK細(xì)胞也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。雖然NK細(xì)胞的抗癌效果的安全性和療效得到肯定，但由于它僅占外周血淋巴細(xì)胞的10％-20％，因而如何獲得高純度、高質(zhì)量地NK細(xì)胞產(chǎn)品是NK治療的關(guān)鍵。近幾年發(fā)現(xiàn)通過體外的刺激培養(yǎng)可進(jìn)行相對大規(guī)模的NK細(xì)胞制備，己知IL-2、IL-15、IL-18和IL-7等細(xì)胞因子在對NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增上發(fā)揮重要作用，它們體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的倍數(shù)在幾倍至數(shù)十倍不等。IL-2是重要的誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，它可以激活NK細(xì)胞、促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IL-15和IL-7的作用與IL-2相似，同時它們還可通過與NK細(xì)胞表面表達(dá)的復(fù)合受體γ鏈結(jié)合，促進(jìn)造血干細(xì)胞定向分化為NK細(xì)胞，且對NK細(xì)胞的發(fā)育、分化和維持長期體外存活等方面發(fā)揮重要作用。IL-15與IL-2的協(xié)同作用也使兩者聯(lián)合作用于NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增，是目前NK細(xì)胞體外擴(kuò)增最傳統(tǒng)的細(xì)胞因子組合。據(jù)報道IL-18不但能誘導(dǎo)活化的THi細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量的IFN-γ，更能通過促進(jìn)Fas-FasL通路的開放，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，且呈劑量依賴性。但目前市場上已有NK細(xì)胞治療產(chǎn)品存在，但凍存后復(fù)蘇效果差、使用的培養(yǎng)體系繁雜、擴(kuò)增倍數(shù)及殺瘤效果不佳，部分培養(yǎng)體系存在安全風(fēng)險等問題。由此，自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇方法有待改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇的方法，該方法誘導(dǎo)擴(kuò)增免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)效率高、擴(kuò)增速度快、安全性高和成本低，并且誘導(dǎo)擴(kuò)增獲得的大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞長期保存后復(fù)蘇依然保持良好的細(xì)胞特性。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：利用CD16抗體包被培養(yǎng)容器，以便得到包被后的培養(yǎng)容器；利用免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基將單個核細(xì)胞置于所述包被后的培養(yǎng)容器中進(jìn)行第一誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，以便得到初步誘導(dǎo)擴(kuò)增的免疫細(xì)胞；利用免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基將所述初步誘導(dǎo)擴(kuò)增的免疫細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，以便得到分化的免疫細(xì)胞；利用免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基將所述分化的免疫細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，以便獲得大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞；利用免疫細(xì)胞凍存液凍存所述大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞，以便得到凍存的免疫細(xì)胞；將所述凍存的免疫細(xì)胞置于37-42℃水浴中融化，并與免疫細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇液混合，以便得到復(fù)蘇細(xì)胞混合液；以及將所述復(fù)蘇細(xì)胞混合液進(jìn)行離心處理，以便得到復(fù)蘇的免疫細(xì)胞，其中，所述免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基為添加了第一血漿、白介素-2和沙培林的無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；所述免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為添加了白介素-2和沙培林的無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；所述免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基為添加了白介素-2的無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；所述免疫細(xì)胞凍存液包含2-10體積％的DMSO、2-15體積％的HSA、20-88體積％的第二血漿和余量凍存培養(yǎng)基；白酒草系菊科白酒草屬植物Conyzajaponica(Thunb.)Less的全草，顏世倫等曾經(jīng)報道從白酒草中分離得到化合物白酒草皂苷R，結(jié)構(gòu)鑒定為3-O-β-D-glucopyranosylmedicagenicacid28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosylester，其結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明人還驚訝地發(fā)現(xiàn)，微量白酒草皂苷R，血漿和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)與DMSO結(jié)合制備免疫細(xì)胞的凍存液，可以降低DMSO的使用量，這種凍存液對凍存細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，凍存細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞凍存液，其包含0.2-0.8體積％的DMSO；2-15體積％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88體積％的血漿；以及余量培養(yǎng)基。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于凍存免疫細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，并且細(xì)胞回收率高。所述冷凍復(fù)蘇液包含白蛋白和右旋糖酐。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法對單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)得到大規(guī)模的免疫細(xì)胞，具有誘導(dǎo)效率高、擴(kuò)增速度快、安全性高和成本低等優(yōu)點(diǎn)。并且，該方法凍存的大規(guī)模的免疫細(xì)胞，有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高，從而滿足臨床治療大量免疫細(xì)胞的需要。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征：根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基和所述免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中，所述沙培林的濃度均為0.007-0.013KE/ml，優(yōu)選地，為0.01KE/ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基、所述免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和所述免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基中，所述白介素-2的濃度均為700-1300IU/ml，優(yōu)選地，為1000IU/ml。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基、所述免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和所述免疫細(xì)胞規(guī)模化擴(kuò)增培養(yǎng)基中，所述無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基均為OpTmizerTMCTSTM無血清培養(yǎng)基或SuperCultureTML500人淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基中，所述第一血漿的濃度為7-13體積％，優(yōu)選地，為10體積％。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一血漿和所述第二血漿均為自體血漿。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞凍存液中，所述DMSO的濃度為10體積％；所述HSA的濃度為5體積％；所述第二血漿的濃度為40體積％；所述凍存培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基或Stemspan培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述冷凍復(fù)蘇液中，所述白蛋白為人白蛋白，任選地，所述人白蛋白來源于市售人血清白蛋白或自體血漿。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述白蛋白的含量為1-5％，優(yōu)選地，為2.5％。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述右旋糖酐為右旋糖酐40。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述右旋糖酐的含量為2-8重量％，優(yōu)選地，為5重量％。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述初步誘導(dǎo)擴(kuò)增的免疫細(xì)胞的CD56的表達(dá)超過70％時，進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述分化的免疫細(xì)胞的CD56的表達(dá)超過90％時，進(jìn)行所述第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，每1天傳代一次。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，每2天傳代一次。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，每2天傳代一次。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每106-109個所述大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述凍存的免疫細(xì)胞融化后與所述冷凍復(fù)蘇液混合的體積比為1：0.5-5，優(yōu)選地，為1：1。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提出一種免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇的方法，該方法誘導(dǎo)擴(kuò)增免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)效率高、擴(kuò)增速度快、安全性高和成本低，并且誘導(dǎo)擴(kuò)增獲得的大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞長期保存后復(fù)蘇依然保持良好的細(xì)胞特性。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的培養(yǎng)不同時間的外周血單個核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性的結(jié)果示意圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的培養(yǎng)14天前后的外周血單個核細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞的比例結(jié)果示意圖；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明又一個實(shí)施例的培養(yǎng)不同時間的外周血單個核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性的結(jié)果示意圖；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的培養(yǎng)12天前后的外周血單個核細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞比例的結(jié)果示意圖；圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施例的裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：利用CD16抗體包被培養(yǎng)容器，得到包被后的培養(yǎng)容器；利用免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基將單個核細(xì)胞置于包被后的培養(yǎng)容器中進(jìn)行第一誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到初步誘導(dǎo)擴(kuò)增的免疫細(xì)胞；利用免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基將初步誘導(dǎo)擴(kuò)增的免疫細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到分化的免疫細(xì)胞；利用免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基將分化的免疫細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞；利用免疫細(xì)胞凍存液凍存大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞，得到凍存的免疫細(xì)胞；將凍存的免疫細(xì)胞置于37-42℃水浴中融化，并與免疫細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇液混合，得到復(fù)蘇細(xì)胞混合液；以及將復(fù)蘇細(xì)胞混合液進(jìn)行離心處理，得到復(fù)蘇的免疫細(xì)胞。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法對單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)得到大規(guī)模的免疫細(xì)胞，具有誘導(dǎo)效率高、擴(kuò)增速度快、安全性高和成本低等優(yōu)點(diǎn)。并且，該方法凍存的大規(guī)模的免疫細(xì)胞，有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高，從而滿足臨床治療大量免疫細(xì)胞的需要。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基為添加了第一血漿、白介素-2和沙培林的無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為添加了白介素-2和沙培林的無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基為添加了白介素-2的無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。利用該培養(yǎng)基組對單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)得到大規(guī)模的免疫細(xì)胞，具有誘導(dǎo)效率高、擴(kuò)增速度快、安全性高和成本低等優(yōu)點(diǎn)，從而滿足臨床治療大量免疫細(xì)胞的需要。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞凍存液包含：2-10體積％的DMSO、2-15體積％的HSA、20-88體積％的第二血漿和余量凍存培養(yǎng)基。由此，該免疫細(xì)胞凍存液中添加了第二血漿，并且各組分的比例適宜，免疫細(xì)胞的有效保存時間長，復(fù)蘇后細(xì)胞依然保持良好的細(xì)胞活力，細(xì)胞回收率高。其中，需要說明的是，當(dāng)所述DMSO、HSA和血漿的體積百分?jǐn)?shù)之和小于1時，免疫細(xì)胞凍存液進(jìn)一步包含剩余體積的培養(yǎng)基。例如，在免疫細(xì)胞凍存液中，當(dāng)DMSO的濃度為10體積％、HSA的濃度為2％體積，血漿的濃度為88％體積時，該免疫細(xì)胞凍存液不包含培養(yǎng)基；當(dāng)DMSO的濃度為5體積％、HSA的濃度為2％體積，血漿的濃度為88％體積時，該免疫細(xì)胞凍存液包含5％體積的培養(yǎng)基；當(dāng)DMSO的濃度為10體積％、HSA的濃度為5％體積，血漿的濃度為40％體積時，該免疫細(xì)胞凍存液包含45％體積的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，冷凍復(fù)蘇液包含白蛋白和右旋糖酐。由此，利用包括白蛋白和右旋糖酐的冷凍復(fù)蘇液稀釋融化的免疫細(xì)胞，在常溫下，不僅減少在細(xì)胞凍存液中的DMSO對免疫細(xì)胞的傷害，而且冷凍復(fù)蘇液中的白蛋白和右旋糖酐對融化的免疫細(xì)胞滲透壓和營養(yǎng)起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基和所述免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中，沙培林的濃度均為0.007-0.013KE/ml。由此，免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖速度快，擴(kuò)增效率高，獲得的免疫細(xì)胞純度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗腫瘤和提高免疫力等臨床治療。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基和所述免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中，沙培林的濃度均為0.01KE/ml。由此，免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖速度更快，擴(kuò)增效率高，獲得的免疫細(xì)胞純度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗腫瘤和提高免疫力等臨床治療。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基、免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基中，白介素-2的濃度均為700-1300IU/ml。由此，免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖速度快，擴(kuò)增效率高，獲得的免疫細(xì)胞純度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗腫瘤和提高免疫力等臨床治療。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基、免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基中，白介素-2的濃度均為1000IU/ml。由此，免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖速度更快，擴(kuò)增效率高，獲得的免疫細(xì)胞純度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗腫瘤和提高免疫力等臨床治療。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基、免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基和免疫細(xì)胞規(guī)?；瘮U(kuò)增培養(yǎng)基中，無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基均為：OpTmizerTMCTSTM無血清培養(yǎng)基或SuperCultureTML500人淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。由此，有利于免疫細(xì)胞的體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)，并且保持較高的功能活性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基中，第一血漿的濃度為7-13體積％。由此，有利于免疫細(xì)胞的體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)，并且保持較高的功能活性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基中，第一血漿的濃度為10體積％。由此，免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖速度和效率顯著提高，獲得的免疫細(xì)胞純度高，具有更好的免疫功能。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一血漿和第二血漿均為自體血漿。由此，免疫細(xì)胞對血漿的排異作用小，免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖速度和效率顯著提高，獲得的免疫細(xì)胞純度高，具有更好的免疫功能。其中，需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語“自體血漿”是指與待誘導(dǎo)擴(kuò)增和凍存的細(xì)胞具有同一來源的血漿。換言之，即該血漿與待誘導(dǎo)擴(kuò)增的單個核細(xì)胞取自同一個體。由此，對自體的免疫細(xì)胞排異作用小，有利于凍存細(xì)胞的保護(hù)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞凍存液中，DMSO的濃度為10體積％；HSA的濃度為5體積％；第二血漿的濃度為40體積％；凍存培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基或Stemspan培養(yǎng)基。由此，冷凍復(fù)蘇過程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，，對細(xì)胞的保護(hù)作用突出，細(xì)胞復(fù)蘇后依然保持良好的細(xì)胞活力，從而能夠有效保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞存活率，并且合理控制凍存液的成本。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，冷凍復(fù)蘇液中，白蛋白為人白蛋白。血液中的白蛋白具有運(yùn)輸、維持滲透壓以及營養(yǎng)作用。體外白蛋白具有保護(hù)細(xì)胞的作用。而人白蛋白與單個核細(xì)胞均為血液成分，更有利于保護(hù)細(xì)胞，使細(xì)胞的活力更好，促進(jìn)單個核細(xì)胞誘導(dǎo)為CIK細(xì)胞，并且得到CIK細(xì)胞用于臨床，患者的排異作用小。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，人白蛋白的來源不受特別的限制，只要能提供人白蛋白即可，即可以來源于市售人血清白蛋白，也可以來源于人體血漿。人單個核細(xì)胞對人源性的人血清白蛋白或血漿的排異作用小，有利于凍存細(xì)胞的恢復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，白蛋白的含量不受特別的限制，只要能提高單個核細(xì)胞誘導(dǎo)為CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)效率、擴(kuò)增倍數(shù)或活性即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，白蛋白的含量為1-5％或1-5。由此，復(fù)蘇得到的細(xì)胞的增殖速率快，誘導(dǎo)分化效率高，細(xì)胞活性好。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，白蛋白的含量為2.5。由此，復(fù)蘇得到的細(xì)胞的增殖速率更快，誘導(dǎo)分化效率高，細(xì)胞活性更佳。其中需要說明的是，白蛋白的含量即可以是體積百分比也可以是重量百分比，根據(jù)白蛋白的狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，如果是白蛋白是固態(tài)，則白蛋白的含量為1-5重量％，如果白蛋白為液態(tài)，則白蛋白的含量為1-5體積％。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，右旋糖酐為右旋糖酐40。由此，有利于提高細(xì)胞的復(fù)蘇效果。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，右旋糖酐的含量為2-8重量％。由此，復(fù)蘇得到的細(xì)胞的增殖速率快，誘導(dǎo)分化效率高，細(xì)胞活性好。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述右旋糖酐的含量為5重量％。由此，復(fù)蘇得到的細(xì)胞的增殖速率更快，誘導(dǎo)分化效率高，細(xì)胞活性更佳。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種用于多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包括前述的用于多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇液。由此，利用該冷凍復(fù)蘇試劑盒復(fù)蘇得到的單個核細(xì)胞，在后續(xù)的誘導(dǎo)過程中，誘導(dǎo)形成多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的增殖速率快，誘導(dǎo)分化效率高，細(xì)胞活性好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。由此，誘導(dǎo)擴(kuò)增效率高。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述激活的免疫細(xì)胞的CD56的表達(dá)超過70％時，進(jìn)行第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)。由此，當(dāng)大部分單個核細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成免疫細(xì)胞時即可進(jìn)行第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，使得免疫細(xì)胞純度進(jìn)一步提升，細(xì)胞數(shù)量得到明顯提高，同時擴(kuò)增過程中免疫細(xì)胞功能進(jìn)一步增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述分化的免疫細(xì)胞的CD56的表達(dá)超過90％時，進(jìn)行所述第三規(guī)?；T導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)。由此，當(dāng)絕大部分單個核細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成免疫細(xì)胞時即可進(jìn)行第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，使得免疫細(xì)胞得到進(jìn)一步規(guī)模化擴(kuò)增，同時保持免疫功能，為可能的臨床免疫治療提供充足的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基過程中，每1天傳代一次。由此，免疫細(xì)胞激活培養(yǎng)基過程中，免疫細(xì)胞得到明顯激活，同時得到有效擴(kuò)增，其他細(xì)胞比例明顯降低。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，每2天傳代一次。由此，第二誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，免疫細(xì)胞純度得到進(jìn)一步提高，同時其他細(xì)胞比例進(jìn)一步降低，免疫細(xì)胞功能得到增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，每2天傳代一次。由此，第三誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)過程中，免疫細(xì)胞在高純度下實(shí)現(xiàn)規(guī)模化擴(kuò)增，獲得充足的功能激活的免疫細(xì)胞用于可能的臨床免疫治療。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每106-109個大規(guī)模的功能激活的免疫細(xì)胞采用1ml免疫細(xì)胞凍存液。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞的凍存，并且凍存的細(xì)胞濃度高，適于大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存，凍存成本低，效果好。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，每107-108個免疫細(xì)胞采用1ml所述免疫細(xì)胞凍存液。由此，凍存的細(xì)胞濃度高，適于大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存，凍存成本低，并且細(xì)胞凍存效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，凍存的免疫細(xì)胞融化后與所述冷凍復(fù)蘇液按體積比為1：0.5-5進(jìn)行混合。由此，保證冷凍復(fù)蘇液稀釋后的DMSO濃度較低，對免疫細(xì)胞的損傷小。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，凍存的免疫細(xì)胞融化后與所述冷凍復(fù)蘇液按體積比為1：1進(jìn)行混合。由此，在保證稀釋后DMSO的濃度低，對免疫細(xì)胞的損傷小的前提下，冷凍復(fù)蘇液的用量小，冷凍復(fù)蘇的成本低。下面參考具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Sigma公司。實(shí)施例1：利用本發(fā)明實(shí)施例的免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增方法，將分離的單個核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增為免疫細(xì)胞，并檢測免疫細(xì)胞的活性。一、實(shí)驗(yàn)方法1.準(zhǔn)備抗人CD16包被的T75瓶1.1在無菌培養(yǎng)瓶中加入經(jīng)醫(yī)用生理鹽水溶解的2.5μg/mL抗人CD16單克隆抗體5mL，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使抗體鋪滿培養(yǎng)面，4℃避光過夜。1.2使用前回收抗體包被液，用5mL生理鹽水洗滌培養(yǎng)瓶一次，再用5mL的T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(OpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM)洗滌一次。2.采集外周血，分離外周血血漿和單個核細(xì)胞2.1用加入抗凝劑的無菌采血袋采集人外周血約100ml，預(yù)留1ml外周血做快檢和血型鑒定，采血袋立即無菌封裝，無菌4℃保存運(yùn)輸，準(zhǔn)確記錄采集信息。快檢篩選合格后將外周血送入GMP實(shí)驗(yàn)室，若快檢不合格，血樣廢棄處理。2.2在GMP實(shí)驗(yàn)室中取出血袋，酒精消毒采血袋，觀察無凝血和溶血后在超凈臺中打開血袋，將血液轉(zhuǎn)移到至50ml無菌離心管中(≤40ml/管)，2500rpm離心15min。2.3轉(zhuǎn)移上層血漿到另一離無菌離心管中，3500rpm離心15min，收集上清血漿到新的無菌離心管中，用口膜密封離心管口，血細(xì)胞用于分離單個核細(xì)胞。2.4將血漿放到56℃水浴鍋中水浴30-50min滅活補(bǔ)體，3500rpm離心15min去除補(bǔ)體，10ml每支分裝到15ml無菌離心管中，-20℃凍存?zhèn)溆茫徊⒘羧?.5ml血漿進(jìn)行慢檢：病毒五項(xiàng)、支原體、內(nèi)毒素和微生物，其中病毒由第三方檢測為準(zhǔn)。2.5將步驟2中的血細(xì)胞沉淀用血漿等體積的生理鹽水重懸后轉(zhuǎn)移到250ml無菌玻璃瓶中，加入血液總體積1/3量的羥乙基淀粉，輕輕晃動鹽水瓶使混合均勻，靜置使紅細(xì)胞沉降。2.6待紅細(xì)胞層沉降分層后，將上層乳白色懸液輕輕吸取到無菌離心管，1800rpm離心5min，棄去上清，沉淀用10ml生理鹽水重懸。2.7取無菌15ml離心管2支，各加入5ml常溫人外周血淋巴細(xì)胞分離液，分別在上層輕輕加入各5ml細(xì)胞懸液。室溫2000rpm慢升慢降離心25min。2.8輕輕取出離心管，小心吸取界面中間云霧層白細(xì)胞至新的15ml離心管中，補(bǔ)加生理鹽水洗滌2次。2.91ml生理鹽水重懸細(xì)胞，取5μl細(xì)胞加入到245μl生理鹽水中稀釋50倍，計數(shù)，并用臺盼藍(lán)染色計細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束的帶血污物均經(jīng)過配比過得新潔爾滅浸泡過夜才能丟棄。2.10預(yù)留4.5x106個細(xì)胞進(jìn)行流式抗體標(biāo)記檢測NK細(xì)胞的比例；剩余的單個核細(xì)胞細(xì)胞接種到加有20ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基配比為：18mlOpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培養(yǎng)基+2ml自體血漿(Autologousplasma)+終濃度1000IU/mlPeproTechIL-2+終濃度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2無菌培養(yǎng)，記為第0天。2.11每日觀察細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)傳代擴(kuò)增，培養(yǎng)基配比為培養(yǎng)基配比為：OpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培養(yǎng)基+10％自體血漿(Autologousplasma)+終濃度1000IU/mlPeproTechIL-2。當(dāng)自體血漿已經(jīng)用完時，不再補(bǔ)加血漿，即OpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培養(yǎng)基+終濃度1000IU/mlPeproTechIL-2。2.12當(dāng)培養(yǎng)體系已經(jīng)達(dá)到2L時，更換培養(yǎng)體系，即SuperCultureTML500人淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基+終濃度1000IU/ml國產(chǎn)IL-2，每日觀察細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)傳代。待14天時，進(jìn)行細(xì)胞回收，留取10ml培養(yǎng)基上清進(jìn)行Elisa分泌因子檢測。2.13將回收的細(xì)胞用200ml生理鹽水重懸，并加入10ml人血清白蛋白，混勻；并從中取10ml細(xì)胞懸液待檢，剩余的細(xì)胞注入回輸袋中準(zhǔn)備回輸。從回輸袋中抽取10ml細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測：支原體、內(nèi)毒素、微生物和病毒五項(xiàng)。3.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中淋巴細(xì)胞譜系將取出的10ml細(xì)胞懸液，1800rpm離心回收細(xì)胞，進(jìn)行流式抗體標(biāo)記。設(shè)置同型對照、單標(biāo)樣品和染色管，每管樣品細(xì)胞數(shù)約5×105個，然后加入對應(yīng)抗體染色。4℃，30min放置，用生理鹽水洗滌，然后上機(jī)檢測分析淋巴細(xì)胞群中的NK細(xì)胞比例。4.將剩余10ml細(xì)胞懸液上清，進(jìn)行分裝，用以檢測病毒五項(xiàng)、內(nèi)毒素、支原體、微生物。5.裸鼠致瘤試驗(yàn)SPF級雌性BALB/c裸鼠，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，4-6周齡，體重16-20g，于空氣層流架中帶蓋鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)，飲用水、標(biāo)準(zhǔn)飼料及其它與動物接觸品均經(jīng)滅菌處理。取陽性對照Ragi細(xì)胞和K562細(xì)胞及待檢測的體外誘導(dǎo)分化的第21天的NK細(xì)胞按3×107個/0.2ml接種裸鼠肋部皮下，用苦味酸標(biāo)記，為期2個月觀察成瘤情況。6.將收細(xì)胞的培養(yǎng)基上清進(jìn)行Elisa分泌因子檢測，即IFN-γ、TNF-α和Perforin檢測。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1培養(yǎng)14天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1培養(yǎng)14天后細(xì)胞可擴(kuò)增150倍所述取外周血淋巴細(xì)胞分離液分離后的6×107個外周血單個核細(xì)胞接種到20ml培養(yǎng)體系中，細(xì)胞很快進(jìn)入對數(shù)生長階段。培養(yǎng)14d后，培養(yǎng)體系擴(kuò)大到4L，細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增到9×109，擴(kuò)增倍數(shù)在最高達(dá)150倍，活細(xì)胞數(shù)在90％以上，培養(yǎng)不同時間的外周血單個核細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性的結(jié)果詳見圖1。1.2擴(kuò)增后的外周血單個核細(xì)胞中的NK細(xì)胞比例明顯升高外周血單個核細(xì)胞經(jīng)14天擴(kuò)增后，淋巴細(xì)胞中的NK細(xì)胞比例(CD3-CD56+)由18.15％上升到95.27％，與此同時T淋巴細(xì)胞(CD3+)比例由72.15％下降到4.61％，輔助性T細(xì)胞(Th,CD3+CD4+)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc,CD3+CD8a+)都有降低，B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)基本消失，細(xì)胞均一性顯著提高；結(jié)合圖1中的細(xì)胞計數(shù)計算可知，培養(yǎng)14天后NK細(xì)胞擴(kuò)增780倍，培養(yǎng)14天前后的外周血單個核細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞比例的結(jié)果見圖2，其中，NK細(xì)胞：CD3-CD56+；T細(xì)胞：CD3+；輔助性T細(xì)胞(Th)：CD3+CD4+；細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc細(xì)胞)：CD3+CD8a+；B細(xì)胞：CD3-CD9+。1.3培養(yǎng)擴(kuò)增得到的細(xì)胞產(chǎn)品檢測未發(fā)現(xiàn)病原體感染我們將培養(yǎng)后的細(xì)胞和細(xì)胞懸液委托檢測平臺檢測了乙肝表面抗原、餅干抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、巨噬細(xì)胞病毒以及支原體、細(xì)菌和內(nèi)毒素，檢測結(jié)果均呈陰性，說明該批次產(chǎn)品是安全的，培養(yǎng)過程中沒有造成污染，結(jié)果詳見表1。表1培養(yǎng)14天后的NK細(xì)胞臨床安全性檢測2、培養(yǎng)12天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1培養(yǎng)12天后細(xì)胞可擴(kuò)增75倍取外周血淋巴細(xì)胞分離液分離后的9×107個外周血單個核細(xì)胞接種到20ml培養(yǎng)體系中，細(xì)胞很快進(jìn)入對數(shù)生長階段。培養(yǎng)12d后，培養(yǎng)體系擴(kuò)大到4L，細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增到6.76×109，擴(kuò)增倍數(shù)在達(dá)75倍，活細(xì)胞數(shù)在90％以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見圖3。2.2擴(kuò)增后的外周血單個核細(xì)胞中的NK細(xì)胞比例明顯升高外周血單個核細(xì)胞經(jīng)12天擴(kuò)增后，淋巴細(xì)胞中的NK細(xì)胞比例(CD3-CD56+)從第7天的32.87％上升到第12天的92.19％，與此同時T淋巴細(xì)胞(CD3+)比例下降到3.24％，輔助性T細(xì)胞(Th,CD3+CD4+)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc,CD3+CD8a+)都有降低，B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)基本消失，細(xì)胞均一性顯著提高，培養(yǎng)12天前后的外周血單個核細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞比例詳見圖4，其中，NK細(xì)胞：CD3-CD56+；T細(xì)胞：CD3+；輔助性T細(xì)胞(Th)：CD3+CD4+；細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc細(xì)胞)：CD3+CD8a+；B細(xì)胞：CD3-CD9+。2.3培養(yǎng)擴(kuò)增得到的細(xì)胞產(chǎn)品檢測未發(fā)現(xiàn)病原體感染我們將培養(yǎng)后的細(xì)胞和細(xì)胞懸液委托檢測平臺檢測了乙肝表面抗原、餅干抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、梅毒螺旋體特異性抗體、巨噬細(xì)胞病毒以及支原體、細(xì)菌和內(nèi)毒素，檢測結(jié)果均呈陰性，說明該批次產(chǎn)品是安全的，培養(yǎng)過程中沒有造成污染，結(jié)果詳見表2。表2培養(yǎng)12天后的NK細(xì)胞臨床安全性檢測表3.培養(yǎng)基上清進(jìn)行Elisa檢測實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2IFN-γ1.48x105pg/ml1.435x105pg/mlTNF-α61.1pg/ml48.75pg/mlPerforin19ng/ml17.48ng/ml所培養(yǎng)的細(xì)胞均有IFN-γ、TNF-α、Perforin的分泌。3.培養(yǎng)擴(kuò)增后的NK細(xì)胞不會在體內(nèi)形成腫瘤裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，其中，A生理鹽水對照組(成瘤小鼠數(shù)/組內(nèi)小鼠數(shù)，0/5)，BRaji細(xì)胞對照組(3/5)，CK562細(xì)胞對照組(4/5)，DNK細(xì)胞組(0/5)，即在2個月觀察期內(nèi)皮下注射0.2ml生理鹽水組和3×107個/0.2ml培養(yǎng)21天的NK細(xì)胞組小鼠均未見腫瘤形成，注射形同體積的Raji細(xì)胞和K562細(xì)胞的小鼠分別有3/5和4/5只小鼠形成了可見的腫瘤。該結(jié)果說明即使培養(yǎng)到21天，NK細(xì)胞依然是安全有效的，不會導(dǎo)致腫瘤的形成。實(shí)施例2本實(shí)施例中，分別采用不含血漿的6種凍存液和含有血漿的6種凍存液，對實(shí)施例1體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的NK細(xì)胞進(jìn)行凍存，比較凍存效果，以便觀察血漿對NK細(xì)胞凍存保存的影響，以及降低DMSO濃度以減少細(xì)胞毒性的可能性。具體如下：1、采用不含血漿的凍存液凍存NK細(xì)胞1.1、NK細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇方法：將實(shí)施例1體外誘導(dǎo)擴(kuò)增第10天獲得的NK細(xì)胞分別采用含HSA的四種凍存液進(jìn)行凍存，其中四種凍存液的成份如下：凍存液1：5體積％DMSO+10體積％HSA；凍存液2：5體積％DMSO+15體積％HSA；凍存液3：10體積％DMSO+10％體積HSA；凍存液4：10體積％DMSO+15體積％HS凍存液5：0.2體積％的DMSO+15體積％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；凍存液6：0.4體積％的DMSO+10體積％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；A，其中，凍存液1-6中剩余體積的均為1640或Stemspan培養(yǎng)基。按照以下步驟凍存NK細(xì)胞：將冷凍保存液與細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放入凍存盒中，-70℃程序降溫過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)。其中，每107個NK細(xì)胞采用1ml凍存液。冷凍保存NK細(xì)胞30d，然后進(jìn)行復(fù)蘇。檢測凍存前后細(xì)胞的存活率，以及復(fù)蘇后細(xì)胞回收率。具體地，凍存前以及凍存并復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率計算方法為：【活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))】×100％。復(fù)蘇后細(xì)胞回收率的計算方法為：(復(fù)蘇后活細(xì)胞數(shù)/凍存時活細(xì)胞數(shù))×100％。1.2、復(fù)蘇NK細(xì)胞檢查結(jié)果：結(jié)果表明，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率均低于凍存前。具體地，凍存液3和4保存的細(xì)胞存活率明顯優(yōu)于凍存液1和2，且凍存液3和4之間未見差別，表明10體積％的DMSO對NK細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，且不同濃度的HSA對于NK細(xì)胞的保護(hù)作用無顯著差別；凍存液3和4的細(xì)胞回收率也優(yōu)于凍存液1和2。凍存液5和6的細(xì)胞回收率也優(yōu)于凍存液1和2，尤其是凍存液5，細(xì)胞回收率高達(dá)99.3％。各組凍存液的細(xì)胞回收率為：凍存液1：62.3％；凍存液2：61.2％；凍存液3：73.5％；凍存液4：75.3％，凍存液5：99.3％；凍存液6：77.2％；2、采用含血漿的凍存液凍存NK細(xì)胞2.1、分離獲得臍帶血單個核細(xì)胞，將單個核細(xì)胞接種到加有20ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基配比為：18mlOpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培養(yǎng)基+2ml自體血漿(Autologousplasma)+終濃度1000IU/mlPeproTechIL-2+終濃度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2無菌培養(yǎng)，記為第0天。每日觀察細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)傳代擴(kuò)增，培養(yǎng)基配比為培養(yǎng)基配比為：OpTmizerTMCTSTMT-cellexpansionSFM培養(yǎng)基+10％自體血漿(Autologousplasma)+終濃度1000IU/mlPeproTechIL-2，誘導(dǎo)擴(kuò)增得到NK細(xì)胞。2.2、NK細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇方法：分別采用含血漿的四種冷凍保存液，將上述體外誘導(dǎo)擴(kuò)增10天獲得的NK細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，其中含血漿的四種凍存液的成份如下：凍存液9：5體積％DMSO+40體積％血漿；凍存液10：10體積％DMSO+40體積％血漿；凍存液11：5體積％DMSO+5體積％HSA+40體積％血漿；凍存液12：10體積％DMSO+5體積％HSA+40體積％血漿，凍存液13：0.2體積％的DMSO+15體積％的HSA+40體積％血漿，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；凍存液14：0.4體積％的DMSO+10體積％的HSA+40體積％血漿，配制完成后加入白酒草皂苷R至其終濃度為0.001g/ml；其中，在凍存液9-14中，血漿為自體血漿，剩余體積的均為1640或Stemspan培養(yǎng)基。其中，按照以下步驟凍存NK細(xì)胞：將冷凍保存液與細(xì)胞混勻后，速移入凍存管，并放入凍存盒中，-70℃程序降溫過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)。其中，每107個NK細(xì)胞采用1ml凍存液。冷凍保存NK細(xì)胞30d，然后進(jìn)行復(fù)蘇，其中，復(fù)蘇液含2.5％血漿和5％Dextran40。檢測凍存前后細(xì)胞的存活率、細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)情況，以及復(fù)蘇后細(xì)胞回收率。具體地，凍存前以及凍存并復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率計算方法為：【活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))】×100％。復(fù)蘇后細(xì)胞回收率的計算方法為：(復(fù)蘇后活細(xì)胞數(shù)/凍存時活細(xì)胞數(shù))×100％。利用流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志CD3-CD56+的表達(dá)情況。2.3、復(fù)蘇NK細(xì)胞檢查結(jié)果：結(jié)果表明，六種保存液保存的免疫細(xì)胞存活率和細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)情況與凍存前相比無顯著差別，細(xì)胞回收率高于“步驟1”中不含血漿的凍存液。并且，冷凍保存液5和6，9和10凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后均具有一定的增殖能力，13和14凍存液凍存的細(xì)胞具有旺盛的繁殖能力。由此，表明血漿以及白酒草皂苷R對細(xì)胞有很好的保護(hù)作用。各組凍存液的細(xì)胞回收率為：凍存液7：71.5％；凍存液8：72.3％；凍存液9：83.3％；凍存液10：83.2％，凍存液11：99.7％；凍存液12：92.3％；綜上，發(fā)明人采用DMSO、HAS、白酒草皂苷R和血漿不同濃度配比，保存臍血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞，觀察凍存液效果，結(jié)果表明，10體積％DMSO具有較好的細(xì)胞保護(hù)作用；而不同濃度的HSA對免疫細(xì)胞的保護(hù)作用無顯著差別。而采用本發(fā)明實(shí)施例的自體血漿與HSA和DMSO聯(lián)用或者進(jìn)一步聯(lián)用白酒草皂苷R的凍存液保存體外誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞回收率高，細(xì)胞活性好，具有一定的增殖能力，而其余各組冷凍液保存的細(xì)胞回收率偏低。實(shí)施例3將實(shí)施例2凍存液9凍存的NK細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，具體方法如下1、復(fù)蘇過程(1)液氮中取出實(shí)施例2凍存液7冷凍保存的NK細(xì)胞，采用37～42℃水浴速融。(2)分別使用等體積的X-VIVO15培養(yǎng)基(記為P組)，以及等體積的含2.5％HSA，5％Dextran40的復(fù)蘇液(記為F1組)兩種方式處理細(xì)胞。(3)離心，分別取細(xì)胞，采用細(xì)胞活力分析儀計數(shù)，測細(xì)胞存活率。2、復(fù)蘇后培養(yǎng)分別將P組和F1組的細(xì)胞采用免疫細(xì)胞規(guī)模化擴(kuò)增培養(yǎng)基，即SuperCultureTML500人淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基+終濃度1000IU/ml國產(chǎn)IL-2，進(jìn)行體外培養(yǎng)，次日進(jìn)行細(xì)胞技術(shù)和活力分析。3、計算由于復(fù)蘇細(xì)胞時，起始細(xì)胞數(shù)不一致，需引用校正因子，計算CD3/CD56陽性細(xì)胞數(shù)。計算方法如下：(1)計算兩組起始細(xì)胞數(shù)的平均值；(2)使用平均值數(shù)除以各組起始細(xì)胞數(shù)，得到各組的校正因子K；(3)將各組最終細(xì)胞數(shù)分別乘以對應(yīng)的校正因子K以及CD3/CD56陽性百分率，即為CD3/CD56陽性細(xì)胞數(shù)。4.結(jié)果(1)復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)結(jié)果“步驟1”復(fù)蘇得到的NK細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力結(jié)果如表4所示。表4復(fù)蘇液對細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的影響分組細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力P(0.90±0.08)×107(80.30±0.01)％F1(0.95±0.04)×107(90.25±0.02)％由表4可見，采用培養(yǎng)基P或復(fù)蘇液F1處理復(fù)蘇的細(xì)胞，兩者細(xì)胞數(shù)無顯著差別(p>0.05)，但是細(xì)胞活力有顯著性差異(p<0.05)。結(jié)果表明，與對照組P復(fù)蘇液相比，F(xiàn)1復(fù)蘇液能夠很好的提升復(fù)蘇得到的NK細(xì)胞的活力。(2)復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)果“步驟2”中，P組和F1組在次日NK細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果如表5所示。表5復(fù)蘇液對培養(yǎng)24h的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的影響分組細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力P(0.89±0.08)×107(90.20±0.01)％F1(0.96±0.04)×107(93.10±0.02)％由表5可見，采用培養(yǎng)基P或復(fù)蘇液F1處理復(fù)蘇的細(xì)胞，進(jìn)行24h體外培養(yǎng)后，兩者細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力均無顯著差別(p>0.05)。5.結(jié)論上述結(jié)果表明，NK細(xì)胞經(jīng)過大規(guī)模體外培養(yǎng)擴(kuò)增以及凍存后，采用P組和F1組復(fù)蘇液處理冷凍保存的細(xì)胞，盡管兩者數(shù)量無明顯差別，但F1組處理的細(xì)胞活力高于P組，進(jìn)而證明與P組普通培養(yǎng)基的冷凍復(fù)蘇液相比，F(xiàn)1組(含2.5％HSA、5％Dextran40)的冷凍復(fù)蘇液能夠在細(xì)胞復(fù)蘇過程中，能更好的促使細(xì)胞恢復(fù)活力。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個或多個實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁1 2 3