本發(fā)明涉及一株多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多效唑作為一種抑制類的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有延緩植物生長、抑制莖桿伸長、縮短節(jié)間、促進(jìn)花芽分化、增加植物抗逆性能、提高作物產(chǎn)量等功能，廣泛應(yīng)用于水稻、麥類、花生、果樹、煙草、油菜、大豆等農(nóng)作物生產(chǎn)。多效唑在土壤中易被吸收，殘留時(shí)間長，可能對非目標(biāo)物產(chǎn)生危害，許多歐盟國家已經(jīng)禁用，很多國家對多效唑也作出了嚴(yán)格限量，我國在農(nóng)產(chǎn)品上對多效唑的最嚴(yán)限量≤0.2mg/kg。
為了有效監(jiān)督監(jiān)測食品中使用多效唑的情況，需要尋找一種特異性好，靈敏度高的測定方法，而目前檢測方法如薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法等，分離純化過程冗長，靈敏度低，加上食品中干擾物多，難以獲得準(zhǔn)確結(jié)果。因此建立快速簡便的多效唑檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時(shí)對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。建立高效的免疫學(xué)檢測方法，篩選高特異性的單克隆抗體是重要前提。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備的抗體對多效唑具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立多效唑的免疫學(xué)檢測方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案，一株多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號為cgmccno.13082。
多效唑單克隆抗體，它由所述保藏編號為cgmccno.13082的多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1分泌產(chǎn)生。
所述多效唑單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測中多效唑殘留的分析檢測。
本發(fā)明提供的多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1的制備基本步驟為：
1）半抗原的合成：
合成路線如下：
稱取化合物ⅰ多效唑5g（17.06mmol）和4-溴丁酸芐酯13.16g（51.19mmol）溶解于二甲亞砜50ml中，加入氫氧化鉀1.05g（18.77mmol），在90℃下攪拌過夜，然后加水30ml，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。粗品通過制備型-hplc純化，得到化合物ⅱ800mg；稱取化合物ⅱ600mg（1.25mmol）溶解在四氫呋喃3ml和水2ml混合溶液中，加入氫氧化鋰131.5mg（3.13mmol），并在室溫下攪拌2h。反應(yīng)溶液用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。通過制備型hplc純化粗產(chǎn)物，得到半抗原pbba200mg；
2）完全抗原pbba-klh的制備：稱取pbba4.3mg，二環(huán)己基碳二亞胺3mg，n-羥基琥珀酰亞胺2mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺溶解(稱為a液)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4-5h。取匙孔血藍(lán)蛋白klh1.47ml(6.8mg/ml)，加入等體積硼酸緩沖溶液（稱為b液），在室溫條件，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物pbba-klh混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；
3）小鼠的免疫：pbba-klh完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐劑，多次加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑。首次免疫與第二次加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，多次加強(qiáng)免疫之間間隔21天。最后一次用pbba-klh完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）檢測血清效價(jià)和抑制；
4）細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過聚乙二醇（peg4000）法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過hat培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）檢測陽性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用ic-elisa測定陽性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1；
5）雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過ic-elisa測定靈敏度和特異性。
取高效價(jià)低ic50小鼠的脾細(xì)胞，通過peg方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過間接競爭酶聯(lián)免疫法篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的細(xì)胞株cs12-1分泌的單克隆抗體，對多效唑具有較好的特異性和檢測靈敏度（ic50值為5ng/ml），可實(shí)現(xiàn)對水、果蔬、谷物中多效唑殘留量的檢測，為食品中多效唑殘留的免疫檢測提供了原料，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
生物材料樣品保藏：一株多效唑單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株cs12-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，分類命名為單克隆細(xì)胞株，保藏編號為cgmccno.13082。
附圖說明
圖1cs12-1單克隆抗體對多效唑的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明通過將多效唑完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過ic-elisa篩選細(xì)胞上清，最終得到了對多效唑有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株cs12-1的制備
（1）半抗原的合成：稱取多效唑5g（17.06mmol）和4-溴丁酸芐酯13.16g（51.19mmol），溶解于二甲亞砜50ml中，加入氫氧化鉀1.05g（18.77mmol），在90℃下攪拌過夜，然后加水30ml，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。粗品通過制備型-hplc純化，得到化合物a800mg；稱取化合物a600mg（1.25mmol）溶解在四氫呋喃3ml和水2ml混合溶液中，加入氫氧化鋰131.5mg（3.13mmol），并在室溫下攪拌2h。反應(yīng)溶液用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。通過制備型hplc純化粗產(chǎn)物，得到半抗原pbba200mg。
（2）完全抗原的合成：稱取pbba4.3mg，二環(huán)己基碳二亞胺3mg，n-羥基琥珀酰亞胺2mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺溶解(稱為a液)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4-5h。取匙孔血藍(lán)蛋白klh1.47ml(6.8mg/ml)，加入等體積硼酸緩沖溶液（稱為b液），在室溫條件，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物pbba-klh混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定。
（3）動(dòng)物免疫：選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進(jìn)行免疫。取多效唑完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與第二次加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，多次加強(qiáng)免疫之間間隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-elisa測定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天沖擊免疫，腹腔注射，要求沖免劑量減半且不含任何佐劑。
（4）細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為4000）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
a、摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，無菌操作取出小鼠的脾臟，用注射器的膠頭適度研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，收集，離心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞三次，最后一次離心后，將脾細(xì)胞稀釋到一定體積，計(jì)數(shù)，備用；
b、收集sp2/0細(xì)胞：融合前7-10天，將sp2/0瘤細(xì)胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培養(yǎng)基在5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合前要求sp2/0瘤細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（1~4）×107，保證融合前sp2/0瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期。融合時(shí)，收集瘤細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
c、融合過程7min。第1min，將1ml的peg1500由慢到快滴加到細(xì)胞中；第2min，靜置。第3min和第4min，在1min內(nèi)滴加1mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第5min和第6min，在1min內(nèi)滴加2mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培養(yǎng)基。然后37℃溫浴5min。離心（800rpm，8min），棄上清，重懸入含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，按照200μl/孔加到96孔細(xì)胞板，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（5）細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第3天對融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步：第一步先用ic-elisa篩選出陽性細(xì)胞孔，第二步選用多效唑?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品，用ic-elisa對陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測定。選擇對多效唑標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測。重復(fù)三次，獲得細(xì)胞株cs12-1。
（6）單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化。在偏酸條件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他雜蛋白，然后離心，棄沉淀；再用等量飽和度的硫酸銨溶液沉淀igg型的單克隆抗體，離心，棄上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脫鹽，最終得到純化后的單克隆抗體置于-20℃保存。
6.1包被：將包被原pbba-ova用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從1μg/ml開始倍比稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h；
pbba-bsa制備如下：
a、稱取步驟（1）制備的pbba2.5mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽3.3mg，n-羥基琥珀酰亞胺2mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺和100μl超純水混合液溶解，稱為a液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4-6h；稱取10mg雞卵清白蛋白o(hù)va，pbba與ova摩爾比為30︰1，溶解于4ml硼酸緩沖溶液中，稱為b液；在室溫條件下逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物pbba-ova混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物pbba-ova混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次換液，即得包被原pbba-ova；
6.2洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
6.3封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
6.4加樣：將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；
6.5顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；
6.6終止和測定：每孔加入50μl終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定各孔的od450值。
用ic-elisa測定單克隆抗體多效唑的ic50為5ng/ml，說明對多效唑有很好的靈敏度，可用于多效唑免疫分析檢測。
溶液的配置：碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐溫20的pbs；
tmb顯色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。