本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種尿嘧啶DNA糖苷酶的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

PCR技術(shù)的出現(xiàn)使得體外快速制備特定DNA分子成為可能，目前廣泛應(yīng)用于各種核酸擴(kuò)增與檢測(cè)領(lǐng)域，極大地促進(jìn)了基于核酸的分子診斷技術(shù)的發(fā)展。在基于PCR等核酸擴(kuò)增技術(shù)的分子診斷中，DNA樣本的交叉污染，特別是以前的檢測(cè)樣本對(duì)后續(xù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣本的污染，直接影響著檢測(cè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性。為了消除不同批次檢測(cè)DNA樣本的交叉污染，目前采用在PCR反應(yīng)體系中通過添加dUTP，從而使合成的DNA中含有dU堿基，在進(jìn)行下一次PCR檢測(cè)反應(yīng)之前，在樣本中添加尿嘧啶DNA糖苷酶，使得DNA片段化來消除以前檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的DNA。然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)行新樣本的檢測(cè)。從

以前的尿嘧啶DNA糖苷酶在高溫具有較高穩(wěn)定性，不容易失活，從而導(dǎo)致合成的DNA中的dU被水解，從而使DNA被碎片化，使擴(kuò)增反應(yīng)不能夠有效進(jìn)行，導(dǎo)致DNA擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)量大大降低，降低了檢測(cè)靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種熱敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶DNA污染清除劑、制備方法及其應(yīng)用；本發(fā)明中的尿嘧啶DNA糖苷酶具有熱敏感特性好、低溫活性高等特點(diǎn)。該尿嘧啶DNA糖苷酶能夠有效去除檢測(cè)樣本中的污染DNA分子，提高核酸檢測(cè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明尿嘧啶DNA糖苷酶的作用原理主要在于：中低溫下尿嘧啶DNA糖苷酶能夠水解尿嘧啶堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，從而使DNA樣本因熱斷裂而不能夠作為PCR的模板分子，使得污染DNA分子不產(chǎn)生任何檢測(cè)信號(hào)。同時(shí)尿嘧啶DNA糖苷酶的熱敏感性使得其在PCR階段會(huì)發(fā)生熱失活，消除其對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的抑制作用。經(jīng)此尿嘧啶DNA糖苷酶處理，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸分子的準(zhǔn)確檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下。

本發(fā)明提供一種熱敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶PCR污染清除劑的制備方法及其應(yīng)用，具體步驟如下：

（1）構(gòu)建尿嘧啶DNA糖苷酶的重組表達(dá)質(zhì)粒

基于嗜冷微生物基因組信息，設(shè)計(jì)其編碼的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，在此基礎(chǔ)上，修改優(yōu)化尿嘧啶DNA糖苷酶編碼基因的稀有密碼子，采用全基因合成或PCR技術(shù)獲得嗜冷菌株的尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET28等，構(gòu)建尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達(dá)質(zhì)粒；

（2）重組表達(dá)尿嘧啶DNA糖苷酶

將構(gòu)建的尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21（DE3）等，得到尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達(dá)菌株；再將其用誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行尿嘧啶DNA糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)；

（3）親和純化表達(dá)的尿嘧啶DNA糖苷酶

離心收集誘導(dǎo)表達(dá)尿嘧啶DNA糖苷酶后的大腸桿菌，將菌體重懸于非變性蛋白裂解液，超聲波破碎菌體，離心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大腸桿菌裂解上清液；再利用固定化鎳離子親和純化樹脂從上清液中純化尿嘧啶DNA糖苷酶；

（4）檢測(cè)純化的尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和熱敏感性，篩選出熱敏感型PCR污染清除劑蛋白。

將純化后尿嘧啶DNA糖苷酶進(jìn)行酶活性和熱穩(wěn)定性檢測(cè)，從中篩選出特異性水解DNA中dU堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，并具有良好熱敏感性的尿嘧啶DNA糖苷酶；熱敏感型的技術(shù)參數(shù)為：在60度以上保溫5分鐘，尿嘧啶DNA糖苷酶的殘余活性低于1%。

（5）熱敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶用于清除基于PCR的核酸檢測(cè)中的DNA污染物。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供基于尿嘧啶DNA糖苷酶的蛋白型PCR污染清除劑的應(yīng)用。該P(yáng)CR污染清除劑應(yīng)用于DNA聚合酶的PCR核酸檢測(cè)體系。具體方法如下：在PCR反應(yīng)體系中加入樣本DNA和尿嘧啶DNA糖苷酶，處理15分鐘，清除DNA污染物中的dU堿基，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA分子，利用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

本發(fā)明中，步驟（1）中，所述嗜冷微生物包括Colwellia psychrerythraea等。

本發(fā)明中，步驟（2）中用誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體條件為：先將尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達(dá)菌株培養(yǎng)至OD600=0.4-1.0，再加入0.5mM 誘導(dǎo)劑IPTG在30-37℃溫度下培養(yǎng)3小時(shí)或10-30℃溫度下培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

本發(fā)明中，步驟（3）中，所述非變性蛋白裂解液的組成如下：20 mM pH值為 8.0的Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油。

本發(fā)明中，所述熱敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶PCR污染清除劑為Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶，其中：Colwellia psychrerythraea的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有顯著進(jìn)步，其可用于清除PCR等核酸擴(kuò)增體系中污染的DNA樣本，可以大大提高核酸檢測(cè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性與靈敏度，具體如下：

（1）檢測(cè)靈敏度高。由于熱敏感型尿嘧啶DNA糖苷酶在高溫下快速失活，從而在PCR階段不會(huì)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)造成抑制作用，因而能夠能夠增加PCR擴(kuò)增產(chǎn)量，提高檢測(cè)靈敏度。

（2）檢測(cè)準(zhǔn)確性高。由于尿嘧啶DNA糖苷酶能夠清楚以前的檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的DNA（該DNA含有dU堿基）；因此能夠顯著減弱以前檢測(cè)反應(yīng)生成的DNA分子對(duì)目標(biāo)分子檢測(cè)的檢陽性現(xiàn)象。

（3）操作條件簡(jiǎn)單，無需優(yōu)化，直接使用。由于尿嘧啶DNA糖苷酶在PCR等眾多核酸擴(kuò)增體系中具有很高的活性，無需優(yōu)化反應(yīng)體系，只需直接加入尿嘧啶DNA糖苷酶，在PCR前加上一步常溫溫育步驟。

附圖說明

圖1 是嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶對(duì)DNA中dU堿基的水解活性。

圖2 是嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的熱穩(wěn)定性。

圖3 是嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶對(duì)DNA聚合酶催化PCR的樣本中DNA污染物的清除效果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1 嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的制備

第一步，設(shè)計(jì)合成嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表達(dá)載體，構(gòu)建尿嘧啶DNA糖苷酶的重組表達(dá)質(zhì)粒。重組嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶N端帶有來源于pET28載體的6個(gè)連續(xù)組氨酸親和純化標(biāo)簽，用于固定化鎳離子親和層析純化。

第二步，重組表達(dá)嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶。將嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21（DE3），得到嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重組表達(dá)菌株。將表達(dá)菌株培養(yǎng)至OD600=0.6，加入0.5mM 誘導(dǎo)劑IPTG，在20℃溫度下培養(yǎng)12小時(shí)，誘導(dǎo)嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶表達(dá)。

嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重組蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQ IDNO:1所示。

第三步，嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶親和純化。將步驟二誘導(dǎo)后的大腸桿菌離心收集后，菌體重新懸浮于蛋白裂解液（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油）。超聲波破碎菌體，離心收集含有嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的菌體裂解上清液。利用固定化鎳離子親和純化樹脂純化嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶。

第四步，檢測(cè)嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和熱穩(wěn)定性。利用含dU堿基的雙鏈DNA作為底物，加入嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶，測(cè)定其對(duì)dU堿基的移除活性。具體酶活性結(jié)果見圖1。結(jié)果表明嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶特異性水解dU堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，而對(duì)4種正常堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵不具有水解活性。

在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶的熱穩(wěn)定性。將嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶在不同溫度保溫5分鐘，然后測(cè)定其剩余的尿嘧啶DNA糖苷酶活性大小。嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重組蛋白的熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖2，結(jié)果表明其在60℃保溫5分鐘后的剩余活性小于1%，其能夠在PCR熱循環(huán)條件下完全熱失活。

實(shí)施例2 嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶作為PCR污染清除劑的應(yīng)用

利用純化的嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶作為Pfu DNA聚合酶催化的PCR的污染清除劑。擴(kuò)增目的基因?yàn)榇竽c桿菌DNA聚合酶IV基因，PCR反應(yīng)緩沖液：20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0.1 mg/mL BSA, 0.1% (v/v) Triton X-100, 2 mM MgSO4；其它組分為0.2 mM dNTP，0.3 μM引物，20ng大腸桿菌DNA聚合酶IV基因片段（含dU堿基），2.5單位 Pfu DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖片見圖3，結(jié)果表明嗜冷細(xì)菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶能夠有效消除含dU堿基的DNA污染物。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列

SEQ ID NO:1

1 MIKPQWQQLI AGEAKQSYFK NLVKEVATQR ASEISIYPAE GDVFNAFNHV DLAEIKVVIL

61 GQDPYHGKDQ AHGLAFSVQE GIKVPPSLVN IYKELATDVE GFEIPKHGCL THWAEQGVLL

121 LNTVLTVQQA NAHSHAKLGW ETFTEQAINA LNEHNDGCVF ILWGAHAHKK GKNINQEKHL

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SEQUENCE LISTING

<110> 蘇州曠世駿弛生物科技有限公司

<120> 一種尿嘧啶DNA糖苷酶的制備方法及其應(yīng)用

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