本發(fā)明涉及一種基因工程新藥-重組人卵泡抑素蛋白的高效純化方法。

背景技術(shù)：

卵泡抑素（Follistatin）是1987年由Robertson和Ueno分別從牛和豬的卵泡液中分離出的一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽，對卵泡刺激素有較強的抑制作用。卵泡抑素分布較為廣泛，在不同組織中均能檢測到卵泡抑素。卵泡抑素（Follistatin）作為Activin的結(jié)合蛋白，它可以通過Activin/ Follistatin系統(tǒng)來調(diào)節(jié)動物的生殖活動。近年來的實驗表明，卵泡抑素可以通過其作用系統(tǒng)，參與機體多種生理機能的調(diào)節(jié)，對卵巢顆粒細胞分化、胚胎發(fā)育、紅細胞生成和成骨細胞功能的調(diào)節(jié)均起重要的作用，具有重要的生物學(xué)意義。

卵泡抑素（Follistatin）可用于治療肌肉疾病和病癥，尤其是肌肉組織的增加將有利于治療的疾病，也可用于治療與代謝、脂肪組織及骨變性相關(guān)的疾病和病癥。

利用基因工程發(fā)酵方法，表達重組人卵泡抑素蛋白，表達量較高，但是由于蛋白疏水性較高，含豐富的二硫鍵，蛋白多為包涵體形式存在。本發(fā)明提供了一種高效的純化工藝，可以得到高純度的重組人卵泡抑素蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種重組人卵泡抑素蛋白的純化方法，該方法純化得率高，蛋白純度高，純化工藝簡單。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種重組人卵泡抑素蛋白的純化方法，該方法包括以下的步驟：

1）菌體破碎：從低溫冰箱中取出凍存的菌體，敲碎成小塊，加入菌體重量10~50倍體積的10~30mM PB溶液，并加入終濃度20~30mg/L的溶菌酶，用機械攪拌器攪拌0.5~2小時；在冰浴條件下，分批次用超聲波破碎儀進行破碎菌體，確保破碎后的液體不再粘稠；用大容量冷凍高速離心機，6000~8000rpm/min，1~5℃離心10~30分鐘，去掉上清液體，沉淀為包涵體蛋白即粗制重組人卵泡抑素蛋白；

2）包涵體洗滌、溶解：上述包涵體蛋白用洗滌溶液去除雜質(zhì)；包涵體蛋白經(jīng)過洗滌后用助溶溶液助溶包涵體蛋白，按原始菌體重量:溶液體積=1:3~10的比例溶解，磁力攪拌器室溫攪拌3~6小時或者1~5℃攪拌過夜；用大容量冷凍高速離心機，6000~8000rpm/min，1~5℃離心5~20分鐘，收集上清即為重組人卵泡抑素蛋白裂解液；

3）重組蛋白粗純化：將重組人卵泡抑素蛋白裂解液通過鎳親和層析柱，用包含咪唑的緩沖液進行清洗，最終洗脫的為重組蛋白粗制品；

4）重組蛋白精細純化：將重組蛋白粗制品通過DEAE Sepharose陰離子交換柱和Q-Sepharose陰離子交換柱，用包含Nacl的緩沖液進行清洗，最終洗脫的為重組蛋白精制品。

作為優(yōu)選，所述的步驟2）中洗滌溶液含有2M 尿素、0.5mM Nacl、1% Triton-100的20mM PB（pH8.0）；洗滌溶液分三次洗滌包涵體蛋白。

作為優(yōu)選，所述的步驟2）中助溶溶液含有6M鹽酸胍，2mM DTT的20mM PB（pH8.0）。

作為優(yōu)選，所述的步驟3）中鎳親和層析柱用含8M尿素、0.5mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡緩沖液平衡層析柱，以80cm/h線速度平衡2個柱體積后，保持pH值、UV、電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

作為優(yōu)選，所述的步驟3）中重組人卵泡抑素蛋白裂解液以30~50cm/h線速度上樣，洗脫先用含25mM咪唑的緩沖液，以80cm/h的線速度洗脫雜蛋白，直到UV，電導(dǎo)率等基線平穩(wěn)；再用含300mM咪唑的緩沖液，以40cm/h線速度洗脫蛋白。

作為優(yōu)選，所述的步驟4）中用含8M尿素、1.0mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡緩沖液平衡DEAE Sepharose FF陰離子交換柱，以80cm/h線速度平衡2個柱體積后，保持pH值、UV、電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

作為優(yōu)選，所述的步驟4）中重組蛋白粗制品以40cm/h線速度上樣DEAE Sepharose陰離子交換柱，先用含100mM Nacl的緩沖液，以80cm/h的線速度洗脫雜蛋白，直到UV，電導(dǎo)率等基線平穩(wěn)，再用含150mM Nacl的緩沖液，以40cm/h線速度洗脫蛋白。

作為優(yōu)選，所述的步驟4）中通過DEAE Sepharose陰離子交換柱后的重組人卵泡抑素蛋白，使用PALL超濾系統(tǒng)處理，再用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化，用包含150mM NaCl的20mM PB緩沖液洗脫，收集重組人卵泡抑素蛋白。

本發(fā)明的重組人卵泡抑素蛋白的純化工藝，包括：菌體破碎→包涵體洗滌、溶解→目的蛋白粗純化→目的蛋白精細純化。本發(fā)明的特點和優(yōu)點有：

1.通過上述步驟得到的重組人卵泡抑素蛋白，經(jīng)過高效液相色譜法檢測，目的蛋白純度＞98%；

2.生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)物收率高，生產(chǎn)成本低。

具體實施方式

本發(fā)明重組人卵泡抑素的高效純化工藝：菌體破碎→包涵體洗滌、溶解→目的蛋白粗純化→目的蛋白精細純化。

具體過程如下：

1.菌體破碎：

1.1 從低溫冰箱中取出凍存的菌體，敲碎成2立方厘米左右的小塊，放入大燒杯中，加入菌體重量20倍體積的20mM PB溶液，并加入終濃度25mg/L的溶菌酶，用機械攪拌器攪拌1小時。

1.2 在冰浴條件下，分批次用超聲波破碎儀進行破碎菌體，確保破碎后的液體不再粘稠。

1.3 用大容量冷凍高速離心機，7000rpm/min，4℃離心20分鐘，去掉上清液體，沉淀為包涵體蛋白即粗制重組人卵泡抑素蛋白。

2.包涵體洗滌、溶解：

2.1 包涵體洗滌：上述包涵體蛋白包含較多雜質(zhì)，須用包涵體洗滌液清洗。用含有2M 尿素、0.5mM Nacl、1% Triton-100的20mM PB（pH8.0）溶液懸浮包涵體蛋白，磁力攪拌至無大顆粒。用冷凍高速離心機，7000rpm/min，4℃離心20分鐘后，棄上清液體。重復(fù)洗滌步驟3次。

2.2 包涵體溶解：包涵體蛋白經(jīng)過洗滌，去除了大部分細胞壁碎片，脂蛋白，部分雜蛋白。大部分包涵體難溶于水，需用8M尿素或者6M鹽酸胍助溶。按原始菌體重量:溶液體積=1:5的比例，用含有6M鹽酸胍，2mM DTT的20mM PB（pH8.0）溶液助溶包涵體蛋白，磁力攪拌器室溫攪拌4小時或者4℃攪拌過夜。

2.3 裂解液除雜：用大容量冷凍高速離心機，7000rpm/min，4℃離心20分鐘，然后用0.45um濾膜過濾除去小顆粒雜質(zhì)，收集上清即為重組人卵泡抑素蛋白裂解液。

3. 重組人卵泡抑素蛋白粗純化

3.1 層析柱平衡：用含8M尿素、0.5mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡緩沖液平衡層析柱，以80cm/h線速度平衡2個柱體積后，保持pH值、UV、電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

3.2 蛋白上樣：過濾后的蛋白裂解液以40cm/h線速度上樣，重組蛋白上帶有6His，能特異性的與固定在凝膠上的鎳結(jié)合，上樣完畢用平衡緩沖液沖洗層析柱1個柱體積。

3.3 蛋白洗脫：先用含25mM咪唑的緩沖液，以80cm/h的線速度洗脫雜蛋白，直到UV，電導(dǎo)率等基線平穩(wěn)。再用含300mM咪唑的緩沖液，以40cm/h線速度洗脫蛋白，分部收集，取樣檢測。

4. 重組人卵泡抑素蛋白的精純化

從此步驟開始，所有配制緩沖溶液所需的水、無機鹽試劑和相關(guān)容器需為無熱源或醫(yī)用級。

4.1 層析柱平衡：用含8M尿素、1.0mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡緩沖液平衡DEAE Sepharose FF陰離子交換柱，以80cm/h線速度平衡2個柱體積后，保持pH值、UV、電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

4.2 蛋白上樣：上述步驟3.3洗脫的蛋白溶液以40cm/h線速度上樣，重組蛋白等電點為5.2，在pH8.0時帶有負電荷，能特異性的與帶正電荷的凝膠基團結(jié)合，上樣完畢用平衡緩沖液沖洗層析柱1個柱體積。

4.3 蛋白洗脫：先用含100mM Nacl的緩沖液，以80cm/h的線速度洗脫雜蛋白，直到UV，電導(dǎo)率等基線平穩(wěn)。再用含150mM Nacl的緩沖液，以40cm/h線速度洗脫蛋白，分部收集，取樣檢測。

4.4 將上一步驟收集得到的重組人卵泡抑素蛋白，使用PALL超濾系統(tǒng)處理，除去溶液中的鹽分并適當(dāng)縮小體積，再用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化，用包含150mM NaCl的20mM PB緩沖液洗脫，收集重組人卵泡抑素蛋白，此步驟是為了進一步純化目的蛋白并去除蛋白溶液中的內(nèi)毒素。

收集的重組人卵泡抑素蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳顯示目的條帶為36KD，與預(yù)測分子量一致，條帶單一無可見雜帶；使用高效液相色譜分析，蛋白純度達到98.45%。

本發(fā)明提供了一種高效純化重組人卵泡抑素蛋白的工藝，蛋白純度高，工藝步驟簡單，蛋白得率高，可進行規(guī)?；a(chǎn)。