本發(fā)明涉及細胞提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高移植性脂肪細胞或者填充式脂肪細胞成活率的復(fù)活因子的提純和萃取工藝。

背景技術(shù)：

自體脂肪從人體自身某些部位吸取多余的皮下脂肪細胞，然后經(jīng)過吸出的混合物經(jīng)凈化處理、注入藥物得到復(fù)合脂肪顆粒，選擇完整的顆粒脂肪細胞通過注射的方式再移植到自己需要進行脂肪填充的部位，例如乳房、面部等，用以治療胸部扁平、兩側(cè)乳房不對稱、淺表微細皺紋、薄嘴唇隆成厚嘴唇等等。但是目前很多脂肪填充后有一定程度的被吸收，為了保證最好的效果需要進行再次手術(shù)，脂肪的用量過多或注射過于集中，大量脂肪堆積會因供血不足導致脂肪壞死、溶解、吸收，極易引發(fā)感染，出現(xiàn)纖維化或鈣化、脂肪壞死等后遺癥，很多的自體脂肪在注射之后，成活率都較低，會造成手術(shù)的負面效果，影響手術(shù)成果，需要使用PRP來提高自體脂肪注射的成活率，因此設(shè)計了一種提高移植性脂肪細胞或者填充式脂肪細胞成活率的復(fù)活因子的提純和萃取工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上問題，本發(fā)明提供了一種提高移植性脂肪細胞或者填充式脂肪細胞成活率的復(fù)活因子的提純和萃取工藝，能夠很好的提取出自體脂肪注射所需的PRP，大大提高了從細胞中提取PRP的效率，能夠保證自體脂肪注射后的活力，使得自體脂肪注射手術(shù)更加安全可靠，值得推廣。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種提高移植性脂肪細胞或者填充式脂肪細胞成活率的復(fù)活因子的提純和萃取工藝，該方法包括以下步驟：

（a）對于全血樣本的采集：采集成人血液，放入試管內(nèi)，在離心機內(nèi)離心12-14min；離心之后血液加入抗凝劑靜置30min。

（b）全血樣本的分離：靜置后的全血樣本分為三個明顯的層次，吸取上清血漿用于提取富血小板血漿；加入羥乙基淀粉溶液放置在搖床上充分混勻。

（c）全血樣本的發(fā)酵：將全血樣本加入發(fā)酵液內(nèi)，得到全血樣本發(fā)酵液，攪拌10min后靜置，提取出發(fā)酵液上清。

（d）發(fā)酵液上清冷凍處理：將發(fā)酵液上清加入凍存液，重懸全血發(fā)酵液，加入凍存容器，使用半導體制冷設(shè)備冷凍，溫度逐步降低，并放入液氮罐內(nèi)保存。

（e）全血樣本細胞復(fù)蘇：將冷凍的發(fā)酵液從液氮罐內(nèi)取出，經(jīng)過生理鹽水水浴，在發(fā)酵液重新液化之后，靜置處理。

（f）復(fù)活因子的提純與萃?。红o置后的液體加入離心管內(nèi)，放在離心機內(nèi)進行二次離心處理，離心完成后在恒溫環(huán)境下靜置處理，棄掉離心管上層的血漿，加入新的血漿樣本，使得沉淀的血小板重新懸浮，得到復(fù)活因子。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（a）中，離心機轉(zhuǎn)速保持1000-1100rpm，使得全血樣本初步分離，便于將血小板與血清分離開來。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（a）中，抗凝劑采用乙二胺四乙酸、草酸鈉、肝素與枸櫞酸鈉混合制成，所述抗凝劑與全血樣本比例為1:9~11。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（b）中，溶液在室溫下靜置，最上層為含血小板的血漿層，中間層呈現(xiàn)黃色，為血塊黃層，最低層厚度最大，為紅細胞層。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（b）中，羥乙基淀粉溶液每100ml組分為含羥乙基淀粉130/0.4 6g和氯化鈉0.9g。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（c）中，發(fā)酵液與全血樣本的比例為1:20~22，發(fā)酵液采用核酸型發(fā)酵液。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（d）中，凍存液為小牛血清與DMSO混合物，且小牛血清與DMSO比例為1:9，其中DMSO濃度為10%。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（d）中，半導體制冷設(shè)備溫度降低速率為8-12℃/min。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（e）中，生理鹽水濃度為5%。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（f）中，離心機轉(zhuǎn)速保持800-1000rpm，恒溫溫度為23-25℃，確保血小板的重新懸浮。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明能夠很好的提取出自體脂肪注射所需的PRP，大大提高了從細胞中提取PRP的效率，能夠保證自體脂肪注射后的活力，使得自體脂肪注射手術(shù)更加安全可靠，值得推廣。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例：

一種提高移植性脂肪細胞或者填充式脂肪細胞成活率的復(fù)活因子的提純和萃取工藝，該方法包括以下步驟：

（a）對于全血樣本的采集：采集成人血液，放入試管內(nèi)，在離心機內(nèi)離心12-14min；離心之后血液加入抗凝劑靜置30min。

（b）全血樣本的分離：靜置后的全血樣本分為三個明顯的層次，吸取上清血漿用于提取富血小板血漿；加入羥乙基淀粉溶液放置在搖床上充分混勻。

（c）全血樣本的發(fā)酵：將全血樣本加入發(fā)酵液內(nèi)，得到全血樣本發(fā)酵液，攪拌10min后靜置，提取出發(fā)酵液上清。

（d）發(fā)酵液上清冷凍處理：將發(fā)酵液上清加入凍存液，重懸全血發(fā)酵液，加入凍存容器，使用半導體制冷設(shè)備冷凍，溫度逐步降低，并放入液氮罐內(nèi)保存。

（e）全血樣本細胞復(fù)蘇：將冷凍的發(fā)酵液從液氮罐內(nèi)取出，經(jīng)過生理鹽水水浴，在發(fā)酵液重新液化之后，靜置處理。

（f）復(fù)活因子的提純與萃?。红o置后的液體加入離心管內(nèi)，放在離心機內(nèi)進行二次離心處理，離心完成后在恒溫環(huán)境下靜置處理，棄掉離心管上層的血漿，加入新的血漿樣本，使得沉淀的血小板重新懸浮，得到復(fù)活因子。

步驟（a）中，離心機轉(zhuǎn)速保持1000-1100rpm，使得全血樣本初步分離，便于將血小板與血清分離開來；步驟（a）中，抗凝劑采用乙二胺四乙酸、草酸鈉、肝素與枸櫞酸鈉混合制成，所述抗凝劑與全血樣本比例為1:9~11；所述步驟（b）中，溶液在室溫下靜置，最上層為含血小板的血漿層，中間層呈現(xiàn)黃色，為血塊黃層，最低層厚度最大，為紅細胞層；步驟（b）中，羥乙基淀粉溶液每100ml組分為含羥乙基淀粉130/0.4 6g和氯化鈉0.9g。

作為本發(fā)明一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟（c）中，發(fā)酵液與全血樣本的比例為1:20~22，發(fā)酵液采用核酸型發(fā)酵液；步驟（d）中，凍存液為小牛血清與DMSO混合物，且小牛血清與DMSO比例為1:9，其中DMSO濃度為10%；步驟（d）中，半導體制冷設(shè)備溫度降低速率為8-12℃/min；步驟（e）中，生理鹽水濃度為5%；步驟（f）中，離心機轉(zhuǎn)速保持800-1000rpm，恒溫溫度為23-25℃，確保血小板的重新懸浮。

目前對于自體脂肪注射如何提高成活率，主要有這幾個方法，一、注意選擇抽吸的方法，盡量采用空針吸脂，負壓不要超過0.05MPa手術(shù)中抽吸脂肪組織的方法直接影響手術(shù)的結(jié)果。因為，手術(shù)抽吸過程中，不可避免地會造成部分細胞的損壞及破壞。損傷的程度大，活細胞就越少，存活率也就越低。多數(shù)學者主張用空針吸脂，其負壓不超過0.05MPa，這樣可減少細胞的破壞。如用其它無創(chuàng)技術(shù)抽吸脂肪，則吸管都應(yīng)選用4mm以下的細管為佳。由于整個手術(shù)是在皮下無大的血管和神經(jīng)分布的脂肪層內(nèi)進行，所以抽吸出來的都是脂肪，患者基本不出血、無痛苦。二、盡量選擇脂肪活性比較高的大腿部位脂肪研究發(fā)現(xiàn)，人體不同部位的脂肪組織的脂蛋白酶的活性存在差異。發(fā)現(xiàn)大腿部位的脂肪組織的脂蛋白酶的活性高于其他部位。LPL的活性高，有利于移植脂肪細胞的再生成活。大腿及臀部的LPL活性最高，依次為下腹部、上腹部遞減。根據(jù)這項研究以及這些部位的深層脂肪分布，故宜在軀干的下半部首選作自體脂肪豐胸脂肪移植的供區(qū)。三、豐太陽穴時盡量將脂肪分多個點分散注射自體脂肪豐太陽穴的原則是將脂肪多個點分散注射，均勻分散在受區(qū)組織中。每個點注入量不超過1ml，應(yīng)避免將大量的脂肪集中在某一部位，注射后按摩撫平。此法由于脂肪體積小、部位分散、植入物血運易建立，有利于脂肪顆粒的成活。四、脂肪顆粒的純化處理萃取優(yōu)質(zhì)脂肪收集脂肪顆粒應(yīng)用4度生理鹽水清洗過濾，洗盡已破壞的脂肪細胞，脂滴及血液。純化過程應(yīng)特別注意無菌操作;還應(yīng)盡量減少脂肪顆粒在體外的存放時間，以提高脂肪細胞生存率。

其中，實驗通過測定自動收集器收集的每一管中的核糖以及蛋白含量，可以得出發(fā)酵液經(jīng)sepharose-4FF柱洗脫后的分布曲線，結(jié)果表明，最先洗脫得到的是莢膜多糖，最后洗脫得到的為蛋白質(zhì)和核酸，由于蛋白質(zhì)和核酸往往小于莢膜多糖，sepharose-4FF凝膠分離收集管中PRP核糖的合并依據(jù)兩個原則：其一，合并管的主要成分是核糖，其二：分子量符合中國藥典規(guī)定的Kd小于0.5的比例占50％以上，采用本領(lǐng)域常見的實驗方法計算PRP核糖的洗脫曲線，計算KD＝O.5時對應(yīng)的洗脫體積就可以確定收集范圍。因此sepharose-4FF可以很方便的分離蛋白質(zhì)、核酸以及核糖，最先收集的莢膜多糖中，接近外水體積的莢膜多糖的分子量比較大，中間位置出來的莢膜多糖的分子量比較小，依前所述，分子量大小只是糖單元重復(fù)數(shù)不同，由于莢膜多糖分子量普遍過大，因此分子量大和小的莢膜多糖的免疫原性差別不大。

經(jīng)過實驗表明，本發(fā)明生產(chǎn)出的復(fù)活因子，在注射自體脂肪之后，能夠很好的提高自體脂肪的活性，自體脂肪注射后的成活率提高了60%，而且對于身體無副作用。

基于上述，本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明能夠很好的提取出自體脂肪注射所需的PRP，大大提高了從細胞中提取PRP的效率，能夠保證自體脂肪注射后的活力，使得自體脂肪注射手術(shù)更加安全可靠，值得推廣。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。