本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，更具體地講，涉及一種利用七肽和十二肽作為互補(bǔ)決定區(qū)的非保守序列的納米抗體的設(shè)計(jì)構(gòu)建和制備方法。

背景技術(shù)：

肝癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，每年全球范圍內(nèi)的肝癌新發(fā)患者數(shù)量多達(dá)約75萬(wàn)，中國(guó)占其中的55％。目前治療主要有手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)藥物治療。這些療法對(duì)早期肝癌可獲得較滿意的效果，但對(duì)晚期肝癌且伴有局部擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，療效往往較差。而身體對(duì)放療和化療不良反應(yīng)較大，放療和化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也有影響。

生物靶向治療是以腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的某些標(biāo)志性分子為靶點(diǎn)，選擇針對(duì)性地阻斷、干預(yù)受該標(biāo)志性分子調(diào)控和密切相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的效果。生物靶向治療具有較好的分子選擇性，能選擇性、高效地殺傷腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常組織的損傷。同時(shí)，為避免腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，現(xiàn)在有越來(lái)越多的治療策略是關(guān)于靶向凋亡抑制因子的，survivin就是其中之一。

Survivin是已知的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中最小的成員(142個(gè)氨基酸殘基)，它的大小約為16.5kDa。與其他IAP家族成員的結(jié)構(gòu)相比，survivin的結(jié)構(gòu)較特殊：其他IAP家族成員的N末端是2-3個(gè)包含70個(gè)氨基酸殘基的桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)，C末端是一個(gè)鋅指環(huán)的結(jié)構(gòu)；而survivin的N末端是一個(gè)鋅結(jié)合BIR域，C末端是一個(gè)長(zhǎng)的α螺旋。單拷貝的survivin基因有六種剪接體，除了野生型的含3個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)外顯子的survivin，還有五個(gè)survivin剪接體，分別為在外顯子2和3之間插入69個(gè)堿基的survivin-2B，缺失一個(gè)外顯子的survivin-△Ex3，隱藏于內(nèi)含子3內(nèi)的外顯子3B取代外顯子4的survivin-3B，由外顯子1,2和來(lái)源于內(nèi)含子2組成的survivin-2α，以及由外顯子1,2和來(lái)源于內(nèi)含子3組成的survivin-3α，這些survivin剪接體的轉(zhuǎn)錄和翻譯已經(jīng)被很多研究者證實(shí)了，這些剪接體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于正常組織。

在駱駝體內(nèi)不僅存在著傳統(tǒng)的四鏈抗體，還存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體(HCAb)。所有的駱駝科動(dòng)物體內(nèi)都存在重鏈抗體，但在其他偶蹄類動(dòng)物中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)重鏈抗體，重鏈抗體是由一個(gè)可變區(qū)域(variable domain，VHH)和兩個(gè)恒定區(qū)域(constant domain，CH2和CH3)組成的，雖然它是天然缺失輕鏈以及重鏈的恒定區(qū)CH1的，但是重鏈抗體仍然具有可以與單克隆抗體可比擬的抗原結(jié)合力。更重要的是，單獨(dú)克隆與表達(dá)重鏈抗體可變區(qū)，得到可以穩(wěn)定存在并可以獨(dú)立結(jié)合抗原的VHH抗體，由于VHH抗體的大小是在納米級(jí)(直徑2.5nm，高4nm)，因此VHH抗體也稱為納米抗體(Nb)。到目前為止，納米抗體是已知最小的抗原結(jié)合片段、。

目前，獲取特異性納米抗體主要有兩種方法，最為常用的方法是用特異性蛋白或者表達(dá)該種蛋白的細(xì)胞免疫駱駝科動(dòng)物，使其大量產(chǎn)生重鏈抗體。隨后，收集外周血淋巴細(xì)胞，用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建特異性納米抗體文庫(kù)，再進(jìn)行篩選鑒定，通過(guò)免疫駱駝科動(dòng)物構(gòu)建納米抗體噬菌體文庫(kù)能夠保持納米抗體功能多樣性的完整，同時(shí)這也是一種簡(jiǎn)單而直觀的過(guò)程，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲取高親和力的特異性納米抗體。然而，在有些條件下，這種方法是很難進(jìn)行的，如：當(dāng)抗原是具有高毒性和致病性的，是錯(cuò)誤折疊的包涵體，是自我免疫抗原，或者是一些無(wú)免疫性的小分子化合物時(shí)，構(gòu)建經(jīng)免疫的納米抗體噬菌體文庫(kù)是非常困難的。在這種情況下，天然納米抗體噬菌體文庫(kù)是另外一種可選的方法，理論上它是可以跳過(guò)免疫而直接淘選出靶向任何抗原的特異性納米抗體，然而，在已經(jīng)報(bào)道的納米抗體噬菌體文庫(kù)庫(kù)容量是1.6×10⁵-5×10⁹colony-forming units(CFU)/mL，較小的庫(kù)容量加之非經(jīng)免疫特異性不強(qiáng)，以及受到自身免疫耐受和所接觸抗原的限制，因此很難篩選到高親和力的納米抗體?；诖耍覀兂浞掷眉{米抗體的結(jié)構(gòu)：保守的框架區(qū)與非保守的決定其特異性的互補(bǔ)決定區(qū)，嘗試一種新型的獲取對(duì)survivin具有特異性親和力的納米抗體的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供與survivin具有高親和力的多肽組合。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供與survivin具有高親和力的多肽組合在制備靶向survivin納米抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供靶向survivin納米抗體的制備方法。

本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供靶向survivin納米抗體的制備方法制備獲得的靶向survivin納米抗體。

本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供靶向survivin納米抗體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供靶向survivin納米抗體與細(xì)胞穿膜肽TAT融合表達(dá)的產(chǎn)物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：與survivin具有高親和力的多肽組合，其特征在于，所述多肽組合包括七肽和十二肽，所述七肽序列如SEQ ID NO：1——SEQ ID NO：5任一所示，所述十二肽序列如SEQ ID NO：6——SEQ ID NO：7任一所示。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述多肽組合為SEQ ID NO：1+SEQ ID NO：6組合，SEQ ID NO：2+SEQ ID NO：6組合，SEQ ID NO：4+SEQ ID NO：6組合，SEQ ID NO：1+SEQ ID NO：7組合，SEQ ID NO：4+SEQ ID NO：7組合。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：與survivin具有高親和力的多肽組合在制備靶向survivin納米抗體中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第三個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：靶向survivin納米抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將與survivin具有高親和力的多肽組合作為納米抗體互補(bǔ)決定區(qū)的非保守序列；

(2)通過(guò)基因操作將這些非保守序列分別整合到納米抗體一致性框架中，獲得嵌合納米抗體。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第四個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：利用靶向survivin納米抗體的制備方法制備獲得的靶向survivin納米抗體。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第五個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：靶向survivin納米抗體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第六個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：靶向survivin納米抗體與細(xì)胞穿膜肽TAT融合表達(dá)的產(chǎn)物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

所述七肽序列Seq1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述七肽序列Seq2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述七肽序列Seq3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述七肽序列Seq4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述七肽序列Seq5的序列如SEQ ID NO：5所示。所述十二肽序列SeqA的序列如SEQ ID NO：6所示，所述十二肽序列SeqB的序列如SEQ ID NO：7所示。

七肽和十二肽的組合方式為seq1-seqA，seq2-seqA，seq3-seqA，seq4-seqA，seq5-seqA，seq1-seqB，seq2-seqB，seq3-seqB，seq4-seqB，seq5-seqB。

七肽序列Seq1的序列：ARTKQTA(SEQ ID NO：1)(丙氨酸—精氨酸—蘇氨酸—賴氨酸—谷氨酰胺—蘇氨酸—丙氨酸)

七肽序列Seq2的序列：ATKSNLI(SEQ ID NO：2)(丙氨酸—蘇氨酸—賴氨酸—絲氨酸—天冬酰胺—亮氨酸—異亮氨酸)

七肽序列Seq3的序列：DNSHTHT(SEQ ID NO：3)(天冬氨酸—天冬酰胺—絲氨酸—組氨酸—蘇氨酸—組氨酸—蘇氨酸)

七肽序列Seq4的序列：SQLPFHH(SEQ ID NO：4)(絲氨酸—谷氨酰胺—亮氨酸—脯氨酸—苯丙氨酸—組氨酸—組氨酸)

七肽序列Seq5的序列：SLLGQTP(SEQ ID NO：5)(絲氨酸—亮氨酸—亮氨酸—甘氨酸—谷氨酰胺—蘇氨酸—脯氨酸)

十二肽序列SeqA的序列：SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO：6)(絲氨酸—甘氨酸—纈氨酸—酪氨酸—賴氨酸—纈氨酸—丙氨酸—酪氨酸—天冬氨酸—色氨酸—谷氨酰胺—組氨酸)

十二肽序列SeqB的序列：SPTVSDWMPIYI(SEQ ID NO：7)(絲氨酸—脯氨酸—蘇氨酸—纈氨酸—絲氨酸—天冬氨酸—色氨酸—甲硫氨酸—脯氨酸—異亮氨酸—酪氨酸—異亮氨酸)

為實(shí)現(xiàn)獲取靶向survivin納米抗體的目的，在獲取其保守框架的基礎(chǔ)上，最主要的是獲取與survivin具有高親和力的多肽作為CDR1，CDR2與CDR3的survivin結(jié)合環(huán)。將原始納米抗體序列與一些癌癥相關(guān)因子(如EGFR，bax，VEGF)的特異性納米抗體序列比對(duì)，我們最終確定CDR1非保守區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)目為4個(gè)，CDR2非保守區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)目為7個(gè)，CDR3非保守區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)目為12個(gè)。據(jù)報(bào)道，survivin可以識(shí)別Smac N末端的A1-V2-P3-I4，因此靶向survivin納米抗體的CDR1的非保守區(qū)域選用該序列。對(duì)于更長(zhǎng)的CDR2及CDR3序列的非保守區(qū)域，我們從庫(kù)容量為1.5×10¹³PFU/ml的隨機(jī)七肽與十二肽噬菌體展示文庫(kù)中以survivin為靶分子篩選得到。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：從隨機(jī)七肽與十二肽噬菌體展示文庫(kù)中篩選與survivin結(jié)合能力強(qiáng)的七肽及十二肽作為納米抗體互補(bǔ)決定區(qū)的非保守序列，通過(guò)基因操作將這些非保守序列分別整合到納米抗體一致性框架中，共獲得10種嵌合納米抗體。進(jìn)一步從ELISA，MTT，流式檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TAT-Nb4A(納米抗體Nb4A與細(xì)胞穿膜肽TAT融合表達(dá))展現(xiàn)了最好的效果。單克隆抗體由于鼠源內(nèi)源性免疫原性所引起的不良免疫反應(yīng)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)產(chǎn)生排異反應(yīng)，人源化困難，另外，較大的體積也使單克隆抗體具有較弱的組織滲透能力，這使得其在與腫瘤相互作用過(guò)程中超過(guò)80％的單克隆抗體是不起作用的。本發(fā)明制備的納米抗體體積小，免疫原性小，穩(wěn)定性好，可溶性高，吸收好，人源化簡(jiǎn)單，表達(dá)容易，偶聯(lián)其他分子容易，并可用于診斷\成像\示蹤。因此，作為抗體藥物有著廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為PCR擴(kuò)增survivin電泳圖，泳道M:DL2000Marker；泳道1：survivin基因。

圖2為survivin雙酶切PCR產(chǎn)物，泳道M:DL2000Marker；泳道1，2：雙酶切PCR產(chǎn)物。

圖3為雙酶切pET-24a質(zhì)粒，泳道M:DL2000Marker；泳道1：雙酶切的pET-24a質(zhì)粒；泳道2：pET-24a質(zhì)粒。

圖4為菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆子，泳道M:DL2000Marker；泳道1-4：Survivin基因。

圖5為蛋白電泳分析純化survivin蛋白。泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1-6：400mM咪唑洗脫收集液。

圖6為蛋白電泳分析透析的survivin，泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1，2：復(fù)性的survivin蛋白。

圖7為ELISA鑒定survivin結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆子。

圖8為PCR擴(kuò)增替換的CDR2序列的納米抗體上游片段，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb2A基因的上游片段；泳道2：Nb3A基因的上游片段；泳道3：Nb4A基因的上游片段；泳道4：Nb5A基因的上游片段。

圖9為PCR擴(kuò)增替換的CDR2序列的納米抗體下游片段，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb2A基因的下游片段；泳道2：Nb3A基因的下游片段；泳道3：Nb4A基因的下游片段；泳道4：Nb5A基因的下游片段。

圖10為PCR擴(kuò)增替換CDR2序列的納米抗體的全長(zhǎng)，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb2A基因；泳道2：Nb3A基因；泳道3：Nb4A基因；泳道4：Nb5A基因。

圖11為PCR擴(kuò)增替換的CDR3序列的納米抗體，泳道M:DL1000Marker；泳道1,2：Nb1B基因的上游片段；泳道3,4：Nb2B基因的上游片段；泳道5,6：Nb3B基因的上游片段；泳道7,8：Nb4B基因的上游片段；泳道9,10：Nb5B基因的上游片段。

圖12為PCR擴(kuò)增替換的CDR3序列的納米抗體下游片段，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb1B基因的下游片段；泳道2：Nb2B基因的下游片段；泳道3：Nb3B基因的下游片段；泳道4：Nb4B基因的下游片段；泳道4：Nb5B基因的下游片段。

圖13為PCR擴(kuò)增替換CD3序列的納米抗體的全長(zhǎng)，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb1B基因；泳道2：Nb2B基因；泳道3：Nb3B基因；泳道4：Nb4B基因；泳道5：Nb5B基因。

圖14為蛋白電泳分析純化的10種納米抗體，泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1：Nb1A；泳道2：Nb2A；泳道3：Nb3A；泳道4：Nb4A；泳道5：Nb5A；泳道6：Nb1B；泳道7：Nb2B；泳道8：Nb3B；泳道9：Nb4B泳道10：Nb5B。

圖15為納米抗體與survivin之間親和力大小。

圖16為PCR擴(kuò)增TAT-Nbs，泳道M:DL1000Marker；泳道1：TAT-Nb1A基因；泳道2：TAT-Nb2A基因；泳道3：TAT-Nb4A基因的上游片段；泳道4：TAT-Nb1B基因；泳道5：TAT-Nb4B基因。

圖17為純化的TAT-Nbs的蛋白電泳圖，泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1：TAT-Nb1A蛋白；泳道2：TAT-Nb2A蛋白；泳道3：TAT-Nb4A蛋白；泳道4：TAT-Nb1B蛋白；泳道5：TAT-Nb4B蛋白。

圖18為MTT實(shí)驗(yàn)分析抗survivin TAT-Nbs對(duì)HepG2與QSG-7701的細(xì)胞存活，A.將濃度分別為20，40，60，80，100μg/mL的TAT-Nb1A，TAT-Nb2A，TAT-Nb4A，TAT-Nb1B及TAT-Nb4B分別作用HepG2與QSG-7701細(xì)胞48小時(shí)的MTT檢測(cè)。B.將濃度為80μg/mL的TAT-Nb1A，TAT-Nb2A，TAT-Nb4A，TAT-Nb1B及TAT-Nb4B分別作用HepG2與QSG-7701細(xì)胞4，12，24，36及48小時(shí)的MTT檢測(cè)。

圖19為TAT-Nb1A and TAT-Nb4A對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。

圖20為流式檢測(cè)TAT-Nb1A與TAT-Nb4A對(duì)HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡能力。

圖21為Western blotting分析TAT-Nb4A作用后HepG2中survivin與β-actin的表達(dá)。

圖22為獲得的抗原特異性的納米抗體(Nbs)策略圖示。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1.運(yùn)用七肽與十二肽噬菌體文庫(kù)篩選survivin結(jié)合多肽

主要材料及試劑

主要設(shè)備

主要溶液配制

擴(kuò)增survivin的基因序列，以表達(dá)survivin蛋白的酵母菌質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增survivin基因序列(圖1)，PCR擴(kuò)增survivin序列的純化采用DNA片段回收試劑盒進(jìn)行。

從過(guò)夜培養(yǎng)的含有pET-24a質(zhì)粒的大腸桿菌中抽提質(zhì)粒，雙酶切PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒(圖2，3)，將雙酶切的survivin基因序列與pET-24a質(zhì)粒過(guò)夜連接。

轉(zhuǎn)化：

①將連接產(chǎn)物吸取到感受態(tài)的EP管中，混合均勻。

②將上述EP管冰浴30min。

③在42℃恒溫水浴中熱激90sec，熱激后迅速再冰浴15min。

④在上述EP管中加入不含抗生素的800μl LB培養(yǎng)基，200rpm 37℃條件下培養(yǎng)1小時(shí)。

⑤將菌液在10000rpm條件下離心1min，吸取200μl離心上清液混勻沉淀，在平板上用玻璃珠輔助涂勻菌液，倒置并于37℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。

⑥用接種環(huán)挑取獲得的單克隆，在5mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-10h，進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖4)。將陽(yáng)性克隆送至測(cè)序(公司：上海睿迪生物科技)。

將測(cè)序結(jié)果與survivin基因序列進(jìn)行比對(duì)，將測(cè)序正確的含survivin基因序列的質(zhì)粒取1μl轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)中，步驟。挑取過(guò)夜培養(yǎng)獲得的單克隆加入到5mL含5μl 50mg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，再吸取1mL加入至含100mL，100μl 50mg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基的500mL的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，OD約為0.6(約2.5h左右)時(shí)，加入70-80μl濃度為1mol/l IPTG誘導(dǎo)，在培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速為200rpm左右的條件下誘導(dǎo)10h或者過(guò)夜。

Survivin蛋白的純化

①將survivin過(guò)夜誘導(dǎo)物于轉(zhuǎn)速為8000rpm條件下離心10min，棄去上清液。

②在沉淀的菌體中加入20-30mL破菌緩沖液并吹打均勻，用超聲破碎儀破碎：功率為120w左右，超聲時(shí)間為3s，間歇時(shí)間為5s，循環(huán)為99個(gè)，重復(fù)3次。

③將破碎后的菌體于4℃，12000rpm條件下離心15min，將上清液放置于冰浴盒中保存；離心獲得的沉淀加入10mL溶解緩沖液，在離心管內(nèi)加入轉(zhuǎn)子，在磁力攪拌器上溶解包涵體。

④待上述包涵體全部溶解后，取出轉(zhuǎn)子，在4℃，10000rpm條件下離心10min，用0.45μm濾膜過(guò)濾離心所獲上清液后置于冰浴盒中保存。

⑤在蛋白純化柱中加入1mL預(yù)先混勻的鎳填料，再加入超純水與破菌緩沖液平衡蛋白純化鑷柱。

⑥分別向鑷柱中加入冰浴盒中保存的上清液與包涵體溶解液，為增加survivin與鑷柱結(jié)合率，每種分別加兩遍(survivin在上清液中少量表達(dá)，在包涵體中大量表達(dá))。然后，加入包涵體結(jié)合緩沖液與包涵體洗滌緩沖液去除膜蛋白等雜蛋白，當(dāng)鑷柱中僅剩有少量的洗滌緩沖液后，加入包涵體洗脫緩沖液，待洗滌緩沖液全部流出后，用1.5mL EP管收集流出的survivin蛋白。收集之后，向鑷柱中加入超純水清洗，并加入20％的乙醇，于4℃保存。

⑦將獲得的survivin蛋白用蛋白電泳檢測(cè)其純化情況(圖5)。

Survivin蛋白的透析及濃縮

處理透析袋：

①用剪刀將透析袋剪成約為15cm左右的長(zhǎng)度。

②將透析袋放入含有500mL 2％(w/v)NaHCO₃以及pH為8.0的1mmol/L EDTA₂Na的燒杯中，并用高壓滅菌鍋在100℃煮沸10min。

③用去離子水洗凈透析袋，并放置于500mL pH為8.0的1mmol/LEDTA₂Na的溶液中在100℃的條件下煮沸10min。

④冷卻后，將處理好的透析袋放于50％乙醇中后置于4℃冰箱中保存。

將純化好的survivin蛋白收集液與適量溶解緩沖液一并加入透析袋中，用夾子夾好后，置于透析液(1.5L透析液：30mL Tris母液，43.8g NaCl，360g脲素)中，置于4℃冰箱中，在磁力攪拌器中透析。期間，更換透析液兩次，脲素濃度逐漸降低(4mol/L→2mol/L→0)。

將透析好的survivin蛋白取樣用蛋白電泳檢測(cè)(圖6)，并在4℃，10000rpm條件下離心10min，將上清液加入到預(yù)先用超純水清洗的超濾管中并在4℃，4000g條件下濃縮。

采用Bradford工作液測(cè)定survivin的濃度

①配置Bradford工作液：稱取重量為50mg的G-250(考馬斯亮蘭)，溶解于25ml 95％的乙醇中，再加入85％的磷酸60ml后，用超純水定容至500ml。

②將濃度為1mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品配成8個(gè)不同的濃度梯度，分別加入190μL Bradford工作液，每個(gè)濃度的樣品各取10μL至96孔板中，反應(yīng)5min后，在OD595nm的波長(zhǎng)下測(cè)定酶標(biāo)儀讀數(shù)，并繪制出蛋白濃度測(cè)定所需要的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

③取190μL Bradford工作液于96孔板中，再加入濃縮并經(jīng)稀釋的survivin

10μL，同樣反應(yīng)5min后讀數(shù)，根據(jù)讀數(shù)計(jì)算survivin濃度。

以survivin為靶分子，淘選與其結(jié)合的七肽與十二肽

分別以survivin為靶分子從噬菌體七肽庫(kù)及十二肽庫(kù)中進(jìn)項(xiàng)四輪篩選，以下步驟以第一輪淘選為例，在隨后的淘選中淘選條件越來(lái)越嚴(yán)苛以便淘汰與survivin結(jié)合能力不強(qiáng)的噬菌體：第一輪：survivin濃度為100μg/mL，TBST濃度為0.1％，survivin與噬菌體結(jié)合時(shí)間為60min；第二輪：survivin濃度為70μg/mL，TBST濃度為0.3％，survivin與噬菌體結(jié)合時(shí)間為50min；第三輪：survivin濃度為40μg/mL，TBST濃度為0.5％，survivin與噬菌體結(jié)合時(shí)間為40min；第四輪：survivin濃度為10μg/mL，TBST濃度為0.5％，survivin與噬菌體結(jié)合時(shí)間為30min。

①用包被液稀釋濃縮后的survivin使其濃度為100μg/mL，將其包被到96孔板中，每孔中150μL，用超純水潤(rùn)濕紙巾，包裹96孔板外，并在最外層用保鮮膜密封，以保持其濕潤(rùn)，并在400rpm的條件下在4℃冰箱中輕微震蕩包被過(guò)夜。

②將包被液與蛋白混合液倒出，在干凈紙巾上拍甩，使96孔板上只留有包被在孔板上的survivin蛋白，每孔中加滿封閉液用以封閉沒(méi)有包被survivin的位點(diǎn)，4℃放置1h。

③如步驟②中方法倒出封閉液，用排槍加入0.1％TBST洗板6次，每次洗過(guò)之后在干凈紙巾上拍甩，以確保TBST緩沖液全部倒出。

④10μL原始噬菌體七肽庫(kù)/十二肽庫(kù)(每次保證所加噬菌體的滴度10¹¹)，各加入990μL 0.1％TBST進(jìn)行稀釋混勻，在每個(gè)孔中加入100μL，在室溫下溫和震蕩孔板60min。

⑤如步驟②中方法倒出噬菌體培養(yǎng)液，如步驟③中方法洗板10次。

⑥加入噬菌體洗脫緩沖液，在室溫條件下溫和震蕩孔板15min，將洗脫下來(lái)的能與survivin結(jié)合的噬菌體吸取至15mL EP管中，在EP管中加入1.44mL噬菌體中和緩沖液，放置于4℃。得到的噬菌體通過(guò)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)進(jìn)行下一輪的篩選。

噬菌體滴度的測(cè)定

①挑取M13噬菌體宿主ER2738的單克隆，接種于5mL低鹽LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，約培養(yǎng)4.5h使其OD600nm在0.5左右。

②用微波爐將頂層瓊脂融化，在滅菌的試管中分裝3mL，噬菌體有幾個(gè)稀釋倍數(shù)，就分裝幾個(gè)試管，保存于45℃烘箱中。同時(shí)，將與試管相同數(shù)目的LB/IPTG/Xgal平板置于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。

③用低鹽LB培養(yǎng)基稀釋并混勻待測(cè)噬菌體，以10倍的稀釋倍數(shù)遞增，一般情況下，未經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的噬菌體的稀釋倍數(shù)通常在10¹-10⁴，已經(jīng)擴(kuò)增的噬菌體稀釋倍數(shù)通常在10⁸-10¹¹。

④將處于對(duì)數(shù)中期的ER2738菌液分裝于與稀釋梯度數(shù)目相同的1.5mL EP管中，每個(gè)EP管200μL。

⑤將上述EP管中加入10μL第一個(gè)稀釋倍數(shù)的待測(cè)噬菌體，混勻后加入預(yù)先預(yù)熱的頂層瓊脂，快速加入至LB/IPTG/Xgal平板內(nèi)并旋轉(zhuǎn)混勻，待其凝固冷卻后在37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜倒置培養(yǎng)。然后再以相同的方法處理其余稀釋倍數(shù)的噬菌體。

⑥對(duì)出現(xiàn)1-100個(gè)藍(lán)斑的平板計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體的滴度。若所有平板的藍(lán)斑數(shù)都超過(guò)100，則增加稀釋倍數(shù)；反之，若所有平板都沒(méi)出現(xiàn)藍(lán)斑，則降低稀釋倍數(shù)。

噬菌體的擴(kuò)增及提純

①將淘選過(guò)程中洗脫下來(lái)的噬菌體連同ER2738過(guò)夜培養(yǎng)物置于低鹽LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)約4.5h，使噬菌體侵染ER2738，并在其宿主擴(kuò)增的過(guò)程中完成其本身的擴(kuò)增。

②將混合培養(yǎng)液在4℃，12000g的條件下離心10min，將上清液裝入另一新的離心管再在相同條件下離心，再一次將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，并用上清液1/6體積的PEG/NaCl作用，在4℃冰箱中過(guò)夜放置。

③將上述培養(yǎng)液在4℃，12000g的條件下離心15min，收集沉淀，重懸于1mL TBS并轉(zhuǎn)入1.5mL EP管中離心5min收集上清液。

④加入上述上清液1/6體積的PEG/NaCl作用，冰上孵育60min。

⑤4℃，12000g的條件下離心10min，將沉淀溶于200μL TBS中，置于4℃冰箱保存。

ELISA鑒定陽(yáng)性克隆

①在96孔板中分別包被100μg/mL的survivin與BSA，包被方法同淘選步驟。

②棄包被液，加入ELISA鑒定用的封閉液，在4℃條件下封阻2h。

③棄封閉液，用0.1％TBST洗板6次，每孔中加入待鑒定的已經(jīng)擴(kuò)增的噬菌體，保證survivin包被板與BSA包被板加入相同濃度與相同體積展示同種序列的噬菌體作用2h。

④棄噬菌體培養(yǎng)液，用0.1％TBST洗板6次，每孔加入200μL稀釋的HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體抗體室溫震蕩1h。

⑤取21mL提前配置好的ABTS儲(chǔ)液加入36μL 30％的H₂O₂混合均勻，棄去抗體稀釋液，用0.1％TBST洗板6次，在每孔加入200μL ABTS與H₂O₂混合液，室溫震蕩10-15min，用酶標(biāo)儀在OD410nm條件下讀數(shù)(圖7)。抽提所選的克隆的DNA

①對(duì)擴(kuò)增的ELISA陽(yáng)性噬菌體克隆在4℃，12000g條件下離心處理30sec。

②加入200μl PEG/NaCl并室溫靜置10min沉淀噬菌體。

③4℃，12000g離心10min，加入100μl碘化物緩沖液重懸沉淀的噬菌體。

④在上述EP管中加入250μl純乙醇，室溫靜置10min后離心處理，并用70％的乙醇洗沉淀，置60℃烘箱中10min，使乙醇完全蒸發(fā)，避免其影響后面測(cè)序。

⑥用30μl ddH₂O重懸沉淀，得到陽(yáng)性噬菌體的單鏈DNA進(jìn)行測(cè)序。

實(shí)施例2.嵌合納米抗體的構(gòu)建表達(dá)純化及其與survivin之間親和力的測(cè)定質(zhì)粒及菌株

主要儀器及設(shè)備

分子克隆實(shí)驗(yàn)所需試劑與試劑盒

所用其他試劑

構(gòu)建質(zhì)粒所需試劑配制

蛋白表達(dá)純化所需試劑配制

蛋白電泳所需試劑配制

全基因合成Nb1A(由seq1與seqA組合，含HA標(biāo)簽，F(xiàn)R1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3)的序列，在此基礎(chǔ)上對(duì)其CDR2與CDR3的非保守區(qū)的序列進(jìn)行替換。

運(yùn)用重疊的引物特異性替換CDR2與CDR3

Fusion PCR替換納米抗體CDR2的基因序列分為三步PCR：①以合成的含有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的Nb1A的基因序列為模板，分別以F1，R1-2a為引物進(jìn)行PCR替換獲得Nb2A基因序列上游片段(圖8)，以F2-2a，R1為引物擴(kuò)增Nb2A基因序列的下游片段(替換的序列分別在由引物R1-2a與F2-2a中引入，上游片段與下游片段含有一段含有替換序列的重疊鏈)(圖9)；②以膠回收純化的Nb2A基因序列的上游片段與下游片段互為模板，F(xiàn)1，R1為引物進(jìn)行PCR，可以獲得Nb2A的基因序列全長(zhǎng)(圖10)。

Fusion PCR替換納米抗體CDR3的基因序列分為三步PCR：①以合成的含有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的Nb1A的基因序列為模板，分別以F1，R1-1為引物PCR替換獲得Nb1B基因序列的上游片段(圖11)，以F1-1，R1為引物擴(kuò)增Nb1B基因序列的下游片段(圖12)，(替換的序列分別在由引物R1-1與F1-1中引入，上游片段與下游片段含有一段含有替換序列的重疊鏈)；②以膠回收純化的Nb1B基因序列的上游片段與下游片段互為模板，F(xiàn)1，R1為引物進(jìn)行PCR，可以獲得Nb1B的基因序列全長(zhǎng)(圖13)。

納米抗體的純化

①8000rpm，離心10min收集菌體，并用25-30mL裂解液裂解菌體。

②用勻漿機(jī)破碎菌體，壓力為1000bar左右，破碎后在4℃，12000rpm條件下離心，用含脲素的緩沖液溶解沉淀，將上清液與溶解的沉淀跑蛋白電泳鑒定納米抗體是是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)。

③包涵體沉淀以裂解液相同體積的Buffer I(含2％曲拉通X100)重懸，37℃，200rpm條件下振蕩30min。

④4℃，8000g條件下離心10min，收集沉淀并以相同體積的Buffer I重懸，超聲破碎懸浮液。

⑤4℃，8000g條件下離心10min，收集沉淀并以相同體積的BufferI(含2％曲拉通X100)重懸，37℃，200rpm條件下振蕩30min。

⑥4℃，8000g條件下離心10min，收集沉淀并以相同體積的Buffer I重懸，37℃，200rpm條件下振蕩30min。

⑦4℃，8000g條件下離心10min，收集沉淀并以相同體積的2mol/L脲素溶解，低溫?cái)嚢?0min。

⑧4℃，8000g條件下離心10min，收集上清液，蛋白電泳檢測(cè)2mol/L脲素的包涵體溶解液所含納米抗體情況。沉淀繼續(xù)以相同體積的4mol/L脲素溶解，低溫?cái)嚢?0min。

⑨4℃，8000g條件下離心10min，收集上清液，蛋白電泳檢測(cè)4mol/L脲素的包涵體溶解液所含納米抗體情況。沉淀繼續(xù)以相同體積的8mol/L脲素溶解，低溫?cái)嚢?0min。

⑩4℃，12000g條件下離心10min，收集上清液，幾乎所有沉淀都溶解在8mol/L脲素中，棄去未溶解的沉淀，蛋白電泳檢測(cè)8mol/L脲素的包涵體溶解液所含納米抗體情況。

鑒定納米抗體抗體純化效果

蛋白電泳(SDS-PAGE)分析純化結(jié)果

①將配蛋白膠所用的玻璃板沖洗干凈，用吹風(fēng)機(jī)吹干待用。

②將玻璃板放置在配膠架上夾緊，在膠板縫隙加滿超純水并放置10min驗(yàn)證是否漏水。如不漏水，用剪好的濾紙擦干膠板縫隙。

③在燒杯中加入各組分配置分離膠(15％)，并混勻沿膠板縫隙緩慢加入，避免產(chǎn)生氣泡，剩下部分用無(wú)水乙醇補(bǔ)齊以壓平分離膠放置30min。

④倒出乙醇，用剪好的濾紙擦干，在燒杯中加入各組分配置濃縮膠(5％)，并混勻沿膠板縫隙緩慢加入，避免產(chǎn)生氣泡，加好后放入梳子，放置30min。

⑤取30μl蛋白樣品，向樣品中加入10μl 4×loading buffer，沸水煮10min使蛋白變性，期間，將玻璃板放置于電泳槽中，并加入1×蛋白電泳緩沖液，將梳子緩慢并垂直拔出。

⑥加入10μl蛋白marker，再依次加入蛋白樣品，每孔中加入20μl，加好后連同電極，調(diào)節(jié)電壓為80V，電泳槽中會(huì)出現(xiàn)不斷上升的氣泡。

⑦待樣品跑過(guò)分離膠時(shí)加大電壓至120V，當(dāng)樣品跑至玻璃板底部時(shí)關(guān)閉電源，撬開(kāi)玻璃板將蛋白膠拿出放置染色盤中，加入染色液，將染色盤放置在振蕩器中至少振蕩6h。

⑧將染色液回收，用自來(lái)水沖洗蛋白膠2次，加入脫色液，在振蕩器中振蕩脫色，若脫色液變藍(lán)，更換脫色液，直到出現(xiàn)清晰條帶，將蛋白膠置于UVItec凝膠成像儀拍照并保存(圖14)。

純化后的納米抗體與survivin之間的親和力是鑒于納米抗體的HA標(biāo)簽，進(jìn)而通過(guò)ELISA方法測(cè)定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將兩種濃度的survivin(5和10μg/mL)包被在96孔板中，相同濃度的BSA作為陰性對(duì)照也與survivin以同樣的條件包被在孔板中，在用5％脫脂乳粉37℃封閉1h(再用TBST清洗)，在不同濃度的survivin與BSA孔中分別加入4種不同濃度(1.25，2.5，5和10μg/mL)的10種納米抗體(Nb1A，Nb2A，Nb3A，Nb4A，Nb5A，Nb1B，Nb2B，Nb3B，Nb4B，Nb5B)室溫孵育30min(再用TBST清洗)，再在孔板中加入HRP標(biāo)記的抗HA的抗體(稀釋比例1:1000)，室溫孵育30min(再用TBST清洗)，最后加入HRP底物ABTS，作用10-15min，設(shè)置酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為OD410nm并讀數(shù)。每種納米抗體與survivin之間親和力的計(jì)算公式如下：

Ag/Ag’＝n

Kaff＝n-1/2([Nb’]-[Nb])

最終，獲得5種與survivin有較高親和力的納米抗體(圖15)，分別為Nb1A，Nb2A，Nb4A，Nb1B，Nb4B，選擇這5種納米抗體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例3.靶向survivin納米抗體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞活性的研究細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2與正常肝細(xì)胞QSG-7701為實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。細(xì)胞株的培養(yǎng)基成分為含10％胎牛血清，100mg/mL鏈霉素，100unit/mL青霉素的DMEM，在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)。

主要儀器

主要試劑

主要試劑配制

TAT基因序列是通過(guò)TAT-F1及R1兩個(gè)引物加入在納米抗體(Nb1A,Nb2A,Nb4A,Nb1B,Nb4B)的N末端(，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-24a都具有相同的酶切位點(diǎn)(NdeI與XhoI)(圖16)，通過(guò)雙酶切產(chǎn)生相同的粘性末端，再連接轉(zhuǎn)化，挑單克隆測(cè)序，將測(cè)序比對(duì)正確的序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，再誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體洗滌方法純化5種TAT-Nbs(圖17)，再用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。

在塑料杯中裝入溫水調(diào)節(jié)其溫度為37℃，從液氮罐中迅速取出細(xì)胞，放置塑料杯中使其溶解，將其移入到培養(yǎng)瓶中，加入9mL培養(yǎng)基，混勻，置于37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，第二天更換新鮮培養(yǎng)基，棄漂浮死細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)。

將置于4℃保存的培養(yǎng)基與-20℃保存的胰酶放在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞的增殖狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞增殖數(shù)目未達(dá)到80％出現(xiàn)漂浮細(xì)胞時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍細(xì)胞，加入4mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶的80％以上體積時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，加入500μL預(yù)熱的胰酶，消化30sec左右，吸去胰酶，拍打培養(yǎng)瓶，當(dāng)看到細(xì)胞下滑時(shí)，加入4mL新鮮培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)瓶瓶壁用無(wú)菌吸管吹打細(xì)胞使其形成單細(xì)胞懸液后，吸取一半的細(xì)胞并移至另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，在原細(xì)胞培養(yǎng)瓶與新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)基，使其最終體積均為4mL，再將兩個(gè)培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

當(dāng)培養(yǎng)瓶底層鋪滿細(xì)胞時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，棄去PBS，加入胰酶消化，加入新培養(yǎng)基終止消化并吹打細(xì)胞使其形成單細(xì)胞懸液，移入至離心管中，在4℃，900rpm的條件下離心8min，棄去上清液，在沉淀中加入1mL細(xì)胞凍存液懸浮沉淀，再移入細(xì)胞凍存管中蓋緊蓋子。將凍存管置于4℃冰箱30min后，轉(zhuǎn)入-20℃冰箱2h,再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。

TAT-Nbs對(duì)HepG2及QSG-7701細(xì)胞生長(zhǎng)活性的抑制是通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定的，其原理為：活細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C和琥珀酸脫氫酶可以使MTT生成藍(lán)紫色的結(jié)晶甲瓚，形成的甲瓚結(jié)晶可以進(jìn)一步在DMSO中溶解，因此，甲瓚的生成量與活細(xì)胞的數(shù)目是成正比的，而死細(xì)胞中由于缺乏琥珀酸脫氫酶而缺少甲瓚結(jié)晶，因此該方法可以區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，及確定細(xì)胞存活率。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

①純化好TAT-Nb1A，TAT-Nb2A，TAT-Nb4A，TAT-Nb1B，TAT-Nb4B五種蛋白置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②當(dāng)肝癌細(xì)胞HepG2與正常肝細(xì)胞QSG-7701兩種細(xì)胞鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部時(shí)，用胰酶消化處理細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取合適體積的細(xì)胞加入15mL離心管中，加培養(yǎng)基至15mL，且稀釋后的細(xì)胞濃度為2×10⁴個(gè)/ml。

③將稀釋的細(xì)胞加入96孔板中，在超凈臺(tái)“劃十字”以使細(xì)胞均勻分布在孔板中，再放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)基稀釋的蛋白或只加入培養(yǎng)基(將測(cè)定的濃度較高的蛋白加入培養(yǎng)基稀釋，使五種蛋白濃度分別為100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL，0μg/mL，并將每個(gè)濃度的TAT-Nbs裝于2mLEP管中待用)，做6個(gè)實(shí)驗(yàn)組平行孔，每孔加入200μL蛋白；12個(gè)對(duì)照組平行孔，每孔加入200μL培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，12h，24h，36h以及48h，期間，用倒置顯微鏡觀察HepG2及QSG-7701兩種細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化(圖19)。

④在每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔與對(duì)照孔中加入20μL預(yù)先配置好的，在-20℃避光保存的濃度為5mg/ml MTT溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)4h。

⑤吸去孔板中的液體，每孔加入150μL DMSO，在振蕩器上振動(dòng)10min，在酶標(biāo)儀OD 490nm讀數(shù)，同時(shí)參考OD 570nm的讀數(shù)。

⑥計(jì)算細(xì)胞存活率(圖18)。

選擇對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)活性有較強(qiáng)抑制能力的anti-survivin TAT-Nbs進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)其細(xì)胞凋亡率，其原理為：在活細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸只會(huì)分布在細(xì)胞膜磷脂雙分子層里側(cè)，而在早期凋亡的細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸會(huì)側(cè)翻并暴露在磷脂雙分子層外側(cè)，而Annexin V可以與磷脂酰絲氨酸發(fā)生特異性地結(jié)合，因此可檢測(cè)到暴露在細(xì)胞膜外的磷脂酰絲氨酸的早凋亡的細(xì)胞；對(duì)于活細(xì)胞，PI不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞染色，而對(duì)于死細(xì)胞或者是凋亡中晚期的細(xì)胞，PI可以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)而對(duì)細(xì)胞染色，因此，Annexin V-FITC/PI可以檢測(cè)處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞及死細(xì)胞，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。其具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：

①將鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的HepG2細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基稀釋HepG2細(xì)胞為合適的密度并鋪在6孔板中，在超凈臺(tái)“劃十字”使細(xì)胞分布均勻，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

②過(guò)夜培養(yǎng)后，吸去6孔板中的原培養(yǎng)基，加入2mL新鮮培養(yǎng)基稀釋的不同蛋白濃度加入到6孔板中(將測(cè)定的濃度較高的蛋白加入培養(yǎng)基稀釋，使蛋白濃度分別為120μg/mL，80μg/mL，40μg/mL，0μg/mL)在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

③從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出6孔板，將每個(gè)孔的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到不同的2mLEP管中，并用PBS洗6孔板2次，再向每個(gè)孔中加入200μl 37℃預(yù)熱的胰酶，當(dāng)細(xì)胞變圓并脫落的時(shí)候，吸去胰酶，并加入EP管中的培養(yǎng)基，用移液槍吹打并分散細(xì)胞，移入至原培養(yǎng)基所在EP管中，4℃，2000rpm條件下離心15min。

④棄去上清液，用PBS重懸沉淀的細(xì)胞，4℃，2000rpm條件下離心10min。

⑤重復(fù)④的步驟。

⑥棄去上清液，吸取500μl凋亡試劑盒附帶的Binding Buffer，重懸細(xì)胞，避光條件下在細(xì)胞中加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育15min。

⑦在細(xì)胞中加入5μl PI溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育10min后，將EP管避光放在冰盒中，在波長(zhǎng)為488nm處用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各樣品的熒光強(qiáng)度，并分析各個(gè)凋亡時(shí)期的細(xì)胞的比例。

選擇對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有較強(qiáng)促凋亡能力TAT-Nb，分析經(jīng)TAT-Nb作用后，細(xì)胞內(nèi)survivin表達(dá)水平與未經(jīng)TAT-Nb作用的細(xì)胞內(nèi)survivin表達(dá)水平是否出現(xiàn)差異，同時(shí)選擇在MTT實(shí)驗(yàn)中對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果不好的

TAT-Nb2A作為陰性對(duì)照。其具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：

①將鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的HepG2細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基稀釋HepG2細(xì)胞為合適的密度并鋪在6孔板中，在超凈臺(tái)“劃十字”使細(xì)胞分布均勻，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

②過(guò)夜培養(yǎng)后，吸去6孔板中的原培養(yǎng)基，加入2mL新鮮培養(yǎng)基稀釋的不同蛋白濃度加入到6孔板中(將測(cè)定的濃度較高的的蛋白加入培養(yǎng)基稀釋，使蛋白濃度分別為120μg/mL，80μg/mL，40μg/mL，0μg/mL，TAT-Nb2A的濃度為120μg/mL)在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

③吸去培養(yǎng)基，加入PBS，用刮刀刮取孔板中的細(xì)胞并收集到2mL EP管中，4℃，1000rpm的條件下離心10min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并與上一步相同的條件離心，棄去上清液，加入細(xì)胞裂解液，用移液槍吹打混勻，并在冰盒上裂解30min，期間，每隔5min用移液槍吹打幾次。

④4℃，1500rpm的條件下離心10min，收集上清液，并用PBS稀釋20倍(取出2μL，加入38μL PBS)用Bradford方法測(cè)總蛋白的濃度，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，量取一定體積使每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的總蛋白為50μg。

⑤配置蛋白電泳膠，將預(yù)染marker及加入loading buffer煮沸處理過(guò)的蛋白樣品，加到進(jìn)樣孔中，打開(kāi)電源并調(diào)節(jié)電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑過(guò)濃縮膠后調(diào)節(jié)電壓至100V，當(dāng)溴酚藍(lán)跑至膠板底部時(shí)停止電泳。

⑥將電泳膠小心從玻璃板中分離出來(lái)并浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，切去濃縮膠，并按照預(yù)染marker顯示出來(lái)的各條帶的位置，將survivin及β-actin分子量大小的部分分別剪下，裁剪與蛋白電泳膠大小一致的PVDF膜，裁剪后，將PVDF膜在甲醇中浸泡活化5min，同時(shí)將3張用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的濾紙鋪在濕轉(zhuǎn)儀的陽(yáng)極碳板上，將蛋白膠整齊放置于濾紙上，再將PVDF膜用鑷子小心蓋在蛋白膠上，此過(guò)程避免出現(xiàn)氣泡，最后在PVDF膜上再蓋上3張浸濕的濾紙，以及在濾紙上蓋上負(fù)極板，打開(kāi)電源調(diào)節(jié)電壓為60V，恒壓轉(zhuǎn)膜時(shí)間約為2h。

⑦電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF膜放于封閉液中，在振蕩器上室溫封閉2h。棄去封閉液，將PVDF膜放入封閉袋中，在含有survivin目標(biāo)條帶大小的封閉袋中加入封閉液稀釋的survivin抗體(稀釋比例為1:1000)；在含有β-actin目標(biāo)條帶大小的封閉袋中加入封閉液稀釋的β-actin抗體(稀釋比例為1:2000)，將封閉袋固定在旋轉(zhuǎn)儀上，將旋轉(zhuǎn)儀放入4℃冰箱中，過(guò)夜孵育一抗。

⑧取出PVDF膜，同時(shí)回收survivin與β-actin抗體。并用TBST緩沖液洗滌15min，期間，每隔5min換一次TBST。

⑨將PVDF膜分別轉(zhuǎn)入封閉液稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗及羊抗鼠IgG-HRP二抗中(稀釋比例均為1:2000)，室溫?fù)u晃孵育1h。

⑩取出PVDF膜并用TBST緩沖液洗滌30min，期間，每隔5min換一次TBST。再將PVDF放入凝膠成像儀中，每次加200μL配置好的ECL試劑，將PVDF中含蛋白的那一面朝上放置，選擇合適的曝光時(shí)間拍照(圖21)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 華東理工大學(xué)

<120> 靶向survivin納米抗體及其制備方法和應(yīng)用

<130> /

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ala Thr Lys Ser Asn Leu Ile

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Asp Asn Ser His Thr His Thr

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Ser Gln Leu Pro Phe His His

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Ser Leu Leu Gly Gln Thr Pro

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Ser Pro Thr Val Ser Asp Trp Met Pro Ile Tyr Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cataataaat cagattgctt ttggttgcaa tggcggccac aaattcgcgt tc 52

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccattgcaac caaaagcaat ctgatttatt atgccgatag cgtgaaag 48

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cataataggt atgggtatgg ctattatcaa tggcggccac aaattcgcgt tc 52

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccattgataa tagccatacc catacctatt atgccgatag cgtgaaag 48

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cataataatg atgaaacggc agctggctaa tggcggccac aaattcgcgt tc 52

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ccattagcca gctgccgttt catcattatt atgccgatag cgtgaaag 48

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cataatacgg ggtctgaccc agcaggctgg cggccacaaa ttcgcgttc 49

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ccattagcct gctgggtcag accccgtatt atgccgatag cgtgaaag 48

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

ggcggcgcaa taataaacgg cggta 25

<210> 17

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggccccaata cggttcgctt ttctgtgcaa tcggaacggc ggcgcaataa taaacggc 58

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ggaattccat atgtatccgt atgatgtgcc ggattatg 38

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ccgctcgagg ctgctcacgg tcacctggg 29