本發(fā)明涉及一種高蝦青素及其酯含量的南極磷蝦油脂的提取方法，屬于食品和化工
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：南極磷蝦(Euphausiasuperba)又名大磷蝦或南極大磷蝦，隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、磷蝦目，是南大洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中的關(guān)鍵物種，是地球上數(shù)量最大、繁衍最成功的單種生物資源之一。南極磷蝦生物蘊藏量最新估計為3.42～5.36億噸，年可持續(xù)捕撈量將近1億噸，相當于目前全世界魚類和其他水產(chǎn)捕獲量的總和，世界各國都將南極磷蝦作為重要的戰(zhàn)略生物資源。南極磷蝦油脂是大自然饋贈給人類的天然健康食品，含有其他食品不能替代的功效。臨床證實，南極磷蝦油脂具有降血脂、降血糖、降血壓、穿越血腦屏障營養(yǎng)及活化腦部細胞和神經(jīng)的作用，能夠預(yù)防和治療腦血管疾病，還可以起到抗菌消炎，預(yù)防癌癥的發(fā)生發(fā)展，延緩衰老，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多重功效，因此，南極磷蝦油脂在保健品和化妝品制造業(yè)都具有廣闊的開發(fā)與利用前景。目前對于南極磷蝦油脂提取的研究報道主要有：中國專利“從南極磷蝦中提取高磷脂含量的南極磷蝦油的方法”(CN102041166B)，其公開的提取方法為：先將南極磷蝦在55～75℃條件下干燥制成含水8～10％的干蝦，然后在25～55℃條件下用非極性有機溶劑反復(fù)萃取干蝦中的油脂。但該提取方法需要在提取油脂前對南極磷蝦進行干燥除水，不僅消耗大量的能量，而且加熱過程中容易引起磷蝦自溶，降低了油脂質(zhì)量。中國專利“提取南極磷蝦油脂及分離生物活性物質(zhì)的方法”(CN102676291A)對于南極磷蝦油脂的提取采用的是低溫混合溶劑提取，將疏水性有機溶劑和親水性有機溶劑按比例混合后直接加入到南極磷蝦中進行攪拌提取。該方法的油脂得率和提取率比較高，但是，大量的(超過40％)蝦青素仍存留在提取南極磷蝦油脂的殘渣中，需要再通過多相鹽析萃取對留存的蝦青素進行進一步的提取分離。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種高蝦青素及其酯含量的南極磷蝦油脂的提取方法。本發(fā)明采用不同極性的混合有機溶劑從南極磷蝦中提取得到油脂，油脂的提取率高，油脂中蝦青素及其酯的含量也得到極大的提高。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：本發(fā)明第一方面，提供一種高蝦青素及其酯含量的南極磷蝦油脂的提取方法，步驟如下：取南極磷蝦，將組織搗碎，加入二氯甲烷、甲醇和丙酮的混合溶劑，攪拌提取，得提取液；過濾，收集濾液，濃縮，即得高蝦青素及其酯含量的南極磷蝦油脂。上述提取方法中，所用到的南極磷蝦為新捕撈的南極磷蝦或經(jīng)冷凍處理的南極磷蝦。所述冷凍處理的溫度為-45℃～-80℃；將南極磷蝦在-45℃～-80℃條件下冷凍處理可以極大的減少南極磷蝦蝦青素被氧化的速度，進而提高提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的含量。上述提取方法中，南極磷蝦的組織搗碎處理，一方面可以增加樣品的比表面積；另一方面有助于組織在攪拌下運動，增加溶劑與物料的接觸機會，使樣品與溶液充分混勻、充分提取。上述提取方法中，所述混合溶劑中二氯甲烷、甲醇和丙酮的體積比為(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(1.8-2.2)。優(yōu)選的，混合溶液中，二氯甲烷、甲醇和丙酮的體積比為1：1：2。上述提取方法中，混合溶劑與南極磷蝦加入量的比為(8-12)ml：1g；優(yōu)選為：10ml：1g?；旌先軇┑募尤肓繒苯佑绊懩蠘O磷蝦油脂的提取效果，若混合溶劑的加入量過少，則會導(dǎo)致油脂溶解不完全，降低了南極磷蝦油脂的提取率；若混合溶劑的加入量過多，則會造成提取溶劑的浪費，以及增加后續(xù)濃縮處理的時間，進而增加了南極磷蝦油脂提取的成本。上述提取方法中，攪拌提取的溫度為20-30℃，每次攪拌提取的時間為1-2h，重復(fù)提取2-4次；優(yōu)選的，每次攪拌提取的時間為1h，重復(fù)提取2-3次。本發(fā)明對攪拌提取的次數(shù)和攪拌提取時混合溶劑的加入量進行了優(yōu)化考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的攪拌提取條件可以將南極磷蝦中的油脂最大限度的提取出來，同時提取溶劑的使用量得到控制，降低了處理成本。上述提取方法中，濃縮處理的條件為：40-50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。本發(fā)明第二方面，提供從上述南極磷蝦油脂中分離制備蝦青素一酯和蝦青素二酯標準品的方法，其中，蝦青素一酯標準品的制備步驟如下：(1)按上述方法提取南極磷蝦油脂；(2)向南極磷蝦油脂中加入丙酮，攪拌提取至濾渣無色，收集濾液合并，將溶液進行濃縮，得到深紅色蝦油；(3)將步驟(2)得到的蝦油采用硅膠柱層析進行分離純化，先用石油醚淋洗，然后改用乙酸乙酯-石油醚進行洗脫，逐漸從乙酸乙酯:石油醚＝10:1，9:1，8:1，7:1……，順梯度淋洗直到1:1；將1:1梯度時接下來的粉紅色條帶進行濃縮，即得到蝦青素一酯的標準品。蝦青素二酯標準品的制備步驟如下：(a)按上述方法提取南極磷蝦油脂；(b)向南極磷蝦油脂中加入無水乙醇，攪拌提取至濾渣無色，收集濾液合并，將溶液進行濃縮，得到深紅色蝦油；(c)將步驟(b)得到的蝦油采用硅膠柱層析進行分離純化，先用石油醚淋洗，然后改用乙酸乙酯-石油醚進行洗脫，逐漸從乙酸乙酯:石油醚＝1:10，9:1，順梯度淋洗直到1:1；將7:1梯度時接下來的粉紅色條帶進行濃縮，即得到蝦青素二酯的標準品。步驟(2)中，南極磷蝦油脂與丙酮加入量的比為1g：4-6ml；優(yōu)選為1g：5ml。步驟(3)中，淋洗用石油醚的量與蝦油的體積比為120-180：1；步驟(3)中，每個梯度的乙酸乙酯-石油醚淋洗液的用量與蝦油的體積比為480-520：1；優(yōu)選為500：1。洗脫流速為1.2-1.4ml/min，優(yōu)選為1.3ml/min。步驟(b)中，南極磷蝦油脂與無水乙醇加入量的比為1g：7-9ml；優(yōu)選為1g：8ml。步驟(c)中，淋洗用石油醚的量與蝦油的體積比為120-180：1；每個梯度的乙酸乙酯-石油醚淋洗液的用量與蝦油的體積比為480-520：1；優(yōu)選為500：1。洗脫流速為1.2-1.4ml/min，優(yōu)選為1.3ml/min。本發(fā)明第三方面，提供上述南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的檢測方法，步驟如下：(1)按上述方法提取南極磷蝦油脂；(2)將南極磷蝦油脂用三氯甲烷溶解，制成樣品溶液，將蝦青素標準品和蝦青素酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)標準品用三氯甲烷溶解，制成標準品溶液，以體積比為7：3的正己烷-丙酮混合溶液作為展開劑，進行高效薄層層析，并薄層掃描計算南極磷蝦油脂中蝦青素及其至酯的含量。步驟(2)中，薄層掃描的條件為：D2&W下掃描波長476nm，掃描狹縫6.00*0.90nm2,掃描速度40mm·s-1，分辨率100μm·step-1。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明的提取對象為南極磷蝦鮮蝦(即新捕撈的南極磷蝦)或經(jīng)冷凍處理的南極磷蝦，未經(jīng)干燥處理，樣品中含水量較多，若單采用疏水性溶劑或整體極性偏小的混合溶劑進行油脂提取時，容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；若為避免出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，而簡單的增加混合溶劑中親水性溶劑的比例，則可能會引入大量的水溶性雜質(zhì)。因此，由于提取對象的特殊性，直接從南極磷蝦鮮蝦或經(jīng)冷凍處理的南極磷蝦中提取高蝦青素及其酯含量的油脂，其對提取溶劑的要求更為嚴苛。本發(fā)明綜合考慮蝦青素及其酯的理化性能和結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計了多組不同溶劑組成的混合提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組成的提取溶劑其提取效果差別較大，采用本發(fā)明的二氯甲烷、甲醇和丙酮混合溶劑進行提取，混合溶劑中二氯甲烷、甲醇和丙酮的體積比為(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(1.8-2.2)，該體積比的混合溶劑從含水量較高的南極磷蝦樣品中將蝦青素及其酯很好的溶解出來，不會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，而且溶解的雜質(zhì)較少；與其他組成的提取溶劑相比，顯著提高了南極磷蝦油脂的得率，而且提取得到的南極磷蝦油脂的蝦青素及其酯的含量得到了極大的提升。(2)本發(fā)明的南極磷蝦油脂的提取工藝步驟簡單，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，可以在工業(yè)化生產(chǎn)中可以將蝦青素及其酯的提取效率發(fā)揮到更大程度。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述實施例僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。下述實施例和對比例中所用到的南極磷蝦均為在同一季節(jié)、同一海域捕獲的南極磷蝦，南極磷蝦中的蝦青素及其酯的含量無顯著的差異，具有可比性。實施例1：南極磷蝦油脂的提取具體步驟如下：(1)取少量-45℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分數(shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取50g南極磷蝦(干重為10g)，將組織搗碎；(2)按溶液與南極磷蝦加入量的比為10：1(w：v，g:ml)向燒杯中加入二氯甲烷、甲醇和丙酮1:1：2(v：v：v)的混合溶液，攪拌提取1小時，并過濾，以同樣的方法再將濾渣提取過濾1次，收集濾液，將2份濾液合并；(3)將收集的溶液，在40℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到南極磷蝦油脂2.2253g，將其4℃遮光保存。實施例2：南極磷蝦油脂的提取具體步驟如下：(1)取少量-80℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分數(shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取50g南極磷蝦(干重10g)，將組織搗碎；(2)按溶液與南極磷蝦加入量的比為8：1(w：v，g:ml)向燒杯中加入二氯甲烷、甲醇和丙酮0.8:0.8：1.8(v：v：v)的混合溶液，攪拌提取1小時，并過濾，以同樣的方法再將濾渣提取過濾2次，收集濾液，將3份濾液合并；(3)將收集的濾液，在40℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到南極磷蝦油脂2.2259g，將其4℃遮光保存。實施例3：南極磷蝦油脂的提取具體步驟如下：(1)取少量-80℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分數(shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取50g南極磷蝦(干重10g)，將組織搗碎；(2)按溶液與南極磷蝦加入量的比為12：1(w：v)向燒杯中加入二氯甲烷、甲醇和丙酮1.2:1.2:2.2(v：v)的混合溶液，攪拌提取2小時，并過濾，以同樣的方法再將濾渣提取過濾4次，收集濾液，將5份濾液合并；(3)收集下層清夜，在40℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到南極磷蝦油脂2.2262g，將其4℃遮光保存。實施例4：蝦青素一酯標準品和蝦青素二酯標準品的制備1.蝦青素一酯標準品的制備：(1)以料液比為1g：5ml向?qū)嵤├?制備的南極磷蝦油脂中加入丙酮，35℃下攪拌提取至濾渣無色，收集濾液合并，將溶液在35℃下進行旋蒸蒸發(fā)至干，得到深紅色蝦油；(2)將石油醚和活化后的柱層析硅膠(200-300目的GF254柱層析硅膠，活化條件為：110℃活化12h)混合，緩慢倒入清洗干凈的3cm×30cm的玻璃硅膠柱，用石油醚淋洗，大約5h后，柱子中硅膠高度基本保持不變后待上樣；(3)向硅膠柱中加入1ml步驟(1)制備的深紅色蝦油，上樣過程要連續(xù)，切不可停頓，且上樣時需將硅膠柱下口關(guān)閉，防止因淋洗液持續(xù)流出而導(dǎo)致樣品在柱子頂端出現(xiàn)分層現(xiàn)象；樣品加完后，開啟硅膠柱下口的旋鈕，繼續(xù)用150ml的石油醚淋洗，而后逐漸從乙酸乙酯:石油醚＝10:1，9:1，8:1，7:1順梯度淋洗直到1:1；每個梯度分別使用400ml淋洗液，流速約為1.3ml/min。將1:1梯度時接下來的粉紅色條帶在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，即得到蝦青素一酯的標準品。經(jīng)高效薄層層析檢測，本實施例制備的蝦青素一酯標準品的純度達98.5％。2.蝦青素二酯標準品的制備：(1)以料液比為1g：8ml向?qū)嵤├?制備的南極磷蝦油脂中加入無水乙醇，35℃下攪拌提取至濾渣無色，收集濾液合并，將溶液在35℃下進行旋蒸蒸發(fā)至干，得到深紅色蝦油；(2)將石油醚和活化后的柱層析硅膠(200-300目的GF254柱層析硅膠，活化條件為：110℃活化12h)混合，緩慢倒入清洗干凈的3cm×30cm的玻璃硅膠柱，用石油醚淋洗，大約5h后，柱子中硅膠高度基本保持不變后待上樣；(3)向硅膠柱中加入1ml步驟(1)制備的深紅色蝦油，上樣過程要連續(xù)，切不可停頓，且上樣時需將硅膠柱下口關(guān)閉，防止因淋洗液持續(xù)流出而導(dǎo)致樣品在柱子頂端出現(xiàn)分層現(xiàn)象；樣品加完后，開啟硅膠柱下口的旋鈕，繼續(xù)用150ml的石油醚淋洗，而后逐漸從乙酸乙酯:石油醚＝10:1，9:1，8:1，7:1順梯度淋洗直到1:1；每個梯度分別使用400ml淋洗液，流速約為1.3ml/min。將7:1梯度時接下來的粉紅色條帶在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，即得到蝦青素二酯的標準品。經(jīng)高效薄層層析檢測，本實施例制備的蝦青素二酯標準品的純度達98.9％。實施例5：南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的檢測：具體步驟如下：(1)準確稱量實施例1-實施例3制備的南極磷蝦油脂78.63mg溶于三氯甲烷中配成7.863mg/ml的溶液，混合均勻為待測樣品溶液；準確稱量蝦青素標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥95％)1.29mg溶于三氯甲烷中配成0.03225mg/ml的標準溶液；準確稱量蝦青素一酯標準品溶于三氯甲烷配成0.03196mg/ml的標準溶液；準確稱量蝦青素二酯標準品溶于三氯甲烷配成0.03182mg/ml的標準溶液。蝦青素一酯和蝦青素二酯標準品為本發(fā)明實施例4制備。(2)精密吸取0.5μL、1μL、2μL、2.5μL、3μL、4μL、5μL標準溶液及10μL的待測樣品溶液，點于同一塊高效薄層硅膠板GF254(10cm*10cm)上，將展開劑正己烷和丙酮7:3(v：v)的混合溶液倒入雙相玻璃展開缸預(yù)飽和30分鐘，將高效薄層硅膠板上行8cm，取出板自然晾干，使用CAMAGTLCSCANNER3搭載軟件為WINCATS1.4.1版本在波長476nm、掃描狹縫規(guī)格6.00*0.90nm2、掃描速度為40mm·s-1，數(shù)據(jù)分辨率100μm·step-1條件下進行薄層掃描峰面積積分值，分別以蝦青素、蝦青素一酯、蝦青素二酯標準品的質(zhì)量(ng)為橫坐標(X)，峰面積積分值(AU)為縱坐標(Y)，得到回歸方程；(3)根據(jù)回歸方程計算實施例1-3制備的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的含量，結(jié)果見表1。表1：不同實施例提取的南極磷蝦油脂中游離蝦青素、蝦青素一酯和蝦青素二酯的含量樣品游離蝦青素蝦青素一酯蝦青素二酯蝦青素及其酯的總量實施例1276.5μg/g638.7μg/g1592.6μg/g5.581mg實施例2281.6μg628.8μg1596.2μg5.579mg實施例3280.9μg627.9μg1595.8μg5.576mg對比例1：在南極磷蝦油脂提取的步驟(2)中，將二氯甲烷、甲醇和丙酮混合溶液替換為三氯甲烷和甲醇混合溶液(混合溶液中，三氯甲烷和甲醇的體積比為1:1)，其余操作同實施例1，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦油脂為1.1286g。采用實施例5的方法對南極磷蝦油脂中的蝦青素及其酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)進行檢測，結(jié)果為：提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的總量為1.954mg。對比例2：在南極磷蝦油脂提取的步驟(2)中，將二氯甲烷、甲醇和丙酮混合溶液替換為正己烷，其余操作同實施例1，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦油脂為1.1984g。采用實施例5的方法對南極磷蝦油脂中的蝦青素及其酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)進行檢測，結(jié)果為：提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的總量為0.412mg。對比例3：在南極磷蝦油脂提取的步驟(2)中，將二氯甲烷、甲醇和丙酮混合溶液替換為二氯甲烷和甲醇混合溶液(混合溶液中，二氯甲烷和甲醇的體積比為2:1)，其余操作同實施例1，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦油脂為1.1389g。采用實施例5的方法對南極磷蝦油脂中的蝦青素及其酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)進行檢測，結(jié)果為：提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的總量為2.518mg。對比例4：在南極磷蝦油脂提取的步驟(2)中，將二氯甲烷、甲醇和丙酮混合溶液中，二氯甲烷和甲醇和丙酮的體積比調(diào)整為2:1:1，其余操作同實施例1，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦油脂為1.8453g。采用實施例5的方法對南極磷蝦油脂中的蝦青素及其酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)進行檢測，結(jié)果為：提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的總量為2.863mg。對比例5：采用正己烷和乙醇混合溶劑對南極磷蝦中的油脂進行提取，步驟如下：取少量-45℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分數(shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取50g南極磷蝦(干重為10g)；加入150g質(zhì)量比為10：1的正己烷/乙醇混合溶劑；在150轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下攪拌提取2小時，分離富含油脂的上相。提取過程中溫度由開始的-20℃逐漸上升至20℃。在溫度25～40℃，相對真空度為-0.07～-0.095Mpa條件下，減壓蒸餾，蒸去溶劑，即可得到富含磷脂和多不飽和脂肪酸的南極磷蝦粗油脂，同時回收溶劑，對所得到的南極磷粗蝦油脂進行干燥和過濾，去除雜質(zhì)，得到的南極磷蝦油脂為1.3146g。采用實施例5的方法對南極磷蝦油脂中的蝦青素及其酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)進行檢測，結(jié)果為：提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的總量為1.835mg。對比例6：將對比例5中正己烷/乙醇混合溶劑的用量調(diào)整為500g，其余操作同對比例5，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦油脂為1.5308g。采用實施例5的方法對南極磷蝦油脂中的蝦青素及其酯(蝦青素一酯和蝦青素二酯)進行檢測，結(jié)果為：提取得到的南極磷蝦油脂中蝦青素及其酯的總量為2.0423mg。由上述對比例可以看出，在南極磷蝦油脂提取過程中，替換不同的提取溶劑，則會直接影響南極磷蝦油脂的提取率及油脂中蝦青素及其酯的總含量，使提取的南極磷蝦油脂和蝦青素及其酯的總量明顯下降。與對比例相比，采用本發(fā)明的提取方法，能夠顯著提高南極磷蝦油脂的提取率和油脂中蝦青素及其酯的總量。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3