本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體而言，涉及一種攜帶人miR486基因的重組腺病毒、制備該病毒的載體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

缺血性心臟病已經(jīng)成為全球范圍的最主要死亡原因之一，是影響人類健康的重大疾病。隨著醫(yī)學科學技術(shù)不斷發(fā)展，目前心臟外科手術(shù)及血管支架等治療措施已經(jīng)大大降低了缺血性心臟病病人的死亡率。另外，一些新型的治療藥物及治療手段也在嘗試應(yīng)用于臨床。如血管生長因子基因治療、干細胞治療等能夠誘導治療性血管新生從而達到改善心肌缺血目的。在研究缺血性心臟病病理生理學過程中發(fā)現(xiàn)，一些重要調(diào)控分子有可能成為防治的新靶點。

miRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮功能的非編碼小RNA。miRNA由高等真核生物基因組編碼，通過與其靶基因mRNA 3’非編碼區(qū)堿基互補序列(UTRs)結(jié)合引導沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯的方式調(diào)節(jié)特異基因的表達[FEBS J.2011；278(10):1610-8]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)近千個特異miRNA，每一種miRNA可以調(diào)控數(shù)百種不同的蛋白編碼基因，從而通過調(diào)控不同靶基因功能參與眾多細胞生命活動的調(diào)節(jié)，包括調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、自噬以及凋亡等[Cell.2005；123:631–640]。在缺血心臟疾病中，愈來愈多的功能miRNA受到關(guān)注。研究顯示在熱休克小鼠的心臟中，miRNA-1，miRNA-2以及miRNA-24有顯著的增加。許多miRNAs，包括miR-21、miR-29、miR-210、miR-373和miR-322/424在心肌細胞缺氧及纖維化時上調(diào)并涉及到血管化的調(diào)控[Cardiovasc Res.2009；82(1):21-29.Cancer Res.2009；69:1221–1229.]，并且一些miRNA還可以調(diào)控重要的心臟保護蛋白包括HSP-70、eNOS、iNOS、HSP-20、Sirt-1和HIF-1α的合成[J Clin Invest.2010；120(11):4141–4154.Circulation.2010；122(13):1308-18]。這些功能microRNA在缺血性心臟病的發(fā)病及治療中發(fā)揮重要作用，并有可能成為缺血性心臟疾病防治的重要靶點。

MicroRNA-486(miR-486)于2005年由軍事醫(yī)學科學院鄭曉飛課題組從人胎肝組織中鑒定并注冊[FEBS Lett.2005；579(17):3849-54.]。進一步分析表明miR-486基因(GeneID:619554)位于8號染色體Ankyrin-1(Ank-1)基因的最后一個個內(nèi)含子(8p11.21位點)。Ank1在紅細胞、肌肉細胞及腦組織中廣泛存在。miR-486是心臟高豐度表達的重要miRNA之一，在miR-486的啟動調(diào)控序列中，有兩個重要心肌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(MRTF-A)和血清反應(yīng)因子(SRF)的結(jié)合序列。研究顯示在利用重組腺病毒技術(shù)轉(zhuǎn)染了MRTF-A的乳鼠心肌細胞表達的一系列microRNAs中，miRNA-486升高的最明顯[Proc Natl Acad Sci.2010；107(9),4218-4223]。而心肌缺血過程中，MRTF-A和SRF是參與心肌細胞適應(yīng)及心臟纖維化基因的表達調(diào)控重要轉(zhuǎn)錄因子。在MRTF-A基因敲除的小鼠中，心肌缺血后膠原的基因表達及產(chǎn)生明顯減低[Circ Res.2010；107(2):294-304.]。然而，miR-486在治療心肌缺血性疾病方面未見報道。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶人miR486基因的腺病毒載體，并提供了所述載體表達的腺病毒的制備和純化方法，該腺病毒可用于預(yù)防或治療心肌缺血性相關(guān)疾病。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種攜帶人miR486基因的腺病毒載體，所述腺病毒載體由miR-486基因插入pHBAd-U6-GFP得到，由U6啟動子調(diào)控miR-486基因表達。

本發(fā)明所構(gòu)建的攜帶人miR486基因的腺病毒載體可以作為一種工具藥，用于阻斷/減少與調(diào)控重要的心臟保護蛋白相關(guān)的蛋白，從而具有治療心肌缺血性疾病的作用。

優(yōu)選的，如上所述的攜帶人miR486基因的腺病毒載體，miR-486基因插入pHBAd-U6-GFP的位點為EcoR I和BamH I位點。

攜帶人miR486基因的重組腺病毒的制備方法，包括：將如上所述的腺病毒載體及腺病毒輔助骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細胞，培養(yǎng)所述宿主細胞并收集整合包裝得到的重組腺病毒。

腺病毒載體是目前運用最廣的病毒載體之一，它被廣泛用于基因治療、基因功能性研究、反義治療、疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。

優(yōu)選的，如上所述的制備方法，所述腺病毒輔助骨架質(zhì)粒為pHBAd-BHG。

優(yōu)選的，如上所述的制備方法，所述宿主細胞為HEK293細胞。

優(yōu)選的，如上所述的制備方法，還包括：

將收集得到的重組腺病毒作為毒種進行擴大培養(yǎng)；

更優(yōu)選的，所述擴大培養(yǎng)直至獲得第三代重組腺病毒為止。

優(yōu)選的，如上所述的制備方法，在收集得到所述重組腺病毒之后，還包括純化步驟。

優(yōu)選的，如上所述的制備方法，所述純化步驟采用CsCl密度梯度超離心法。

更優(yōu)選的，所述CsCl密度梯度超離心法經(jīng)過兩次超速離心，離心條件為90000×g～110000×g離心80～100分鐘。

更優(yōu)選的，在離心后CsCl密度梯度超離心之后還包括透析操作。

具體為每次用200x體積的透析buffer，透析三次，間隔一小時換一次液。

如上所述的腺病毒載體及如上所述的制備方法制備得到的重組腺病毒在制備用于治療心肌缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。

如上所述的腺病毒載體及如上所述的制備方法制備得到的重組腺病毒在制備用于預(yù)防心肌缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述心肌缺血性疾病即冠心病，包括心絞痛、心肌梗塞。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為腺病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為腺病毒擴增時HEK293細胞形態(tài)圖；

圖3為4W后不同組大鼠梗死周圍區(qū)域MVD(微血管密度)比較結(jié)果；上圖：微血管密度檢測結(jié)果代表圖；A：Sham組；B：MI組；C：Ad組；D：miR-486組；下圖為實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖；

圖4為TTC染色結(jié)果代表圖(上圖)及統(tǒng)計圖(下圖)；A：Sham組；B：MI組；C：Ad組；D：miR-486組；

圖5 HE染色結(jié)果代表圖；A：Sham組；B：MI組；C：Ad組；D：miR-486組；

圖6為Masson染色結(jié)果代表圖(上圖)及統(tǒng)計圖(下圖)；A：Sham組；B：MI組；C：Ad組；D：miR-486組；

圖7為Tunel染色結(jié)果代表圖(上圖)及統(tǒng)計圖(下圖)；A：Sham組；B：MI組；C：Ad組；D：miR-486組。

具體實施方式

在描述本發(fā)明的化合物、組合物、蛋白質(zhì)、肽等以及方法之前，應(yīng)當理解，這些實施方式不限于所描述的特定方法、方案以及試劑，這是因為它們可以變化。還應(yīng)當理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式目的，并且不旨在限制本實施方式或權(quán)利要求的范圍。

除非另有限定，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與所公開的實施方案所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本發(fā)明所述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于本實施方式的實踐或測試中，但下文仍然描述了合適的方法和材料。本發(fā)明提及的所有出版物、專利申請、專利以及其他參考文獻通過引用全部內(nèi)容結(jié)合于本文中。在沖突的情況下，本說明書(包括定義)將起支配作用。此外，材料、方法以及實施例僅僅是說明性的，而不旨在限制。實施方式的其他特征和優(yōu)點將從以下詳細的說明書和權(quán)利要求中變得明顯。

為了促進理解本文描述的實施方式這一目的，將參考某些實施方式，并且將使用特定語言來描述這些實施方式。本文所使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方式目的，而不旨在限制本公開的范圍。

本發(fā)明的內(nèi)容主要為一種治療心肌缺血的方法，即利用攜帶人miR-486基因的腺病毒治療心肌梗塞疾病。具體內(nèi)容如下：

第一方面：腺病毒載體Ad-miR486的構(gòu)建，足夠量的病毒制備及純化。

第二方面：建立大鼠心肌梗塞模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，觀察Ad-miR486在心肌的表達，證明miR486可以改善、治療心肌缺血。

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1腺病毒載體Ad-miR486的構(gòu)建及病毒制備和純化

(1)腺病毒載體構(gòu)建

使用pHBAd-U6-GFP過表達載體，EcoR I和BamH I為插入位點。目的片斷miR-486基因插入EcoR I和BamH I位點，由U6啟動子調(diào)控表達，該載體中含有CMV啟動子調(diào)控的GFP基因表達(圖1)。

(2)病毒制備和純化

轉(zhuǎn)染前一天，將293細胞接種于60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為DMEM+10％Hyclon胎牛血清,置37℃含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞生長至底面積的長滿到70～80％時，取重組腺病毒載體質(zhì)粒miR-486過表達及骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG，用LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6小時后，更換新鮮的細胞培養(yǎng)液。每天觀察細胞出毒跡象。出毒現(xiàn)象為細胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。待細胞大部分病變并從底部脫落進行收毒。將60mm培養(yǎng)皿中所有細胞及培養(yǎng)液收于15ml離心管中。打開恒溫水浴鍋至37℃，將15ml離心管在液氮及37℃水浴反復(fù)凍融三次。3000rpm離心5分鐘，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為Ad-mir486過表達第一代毒種(P1)，將作為隨后大量病毒擴增的毒種。從P1代病毒上清擴增，直至獲得第三代病毒(P3)(圖2)。

第一次超速離心。將離心機預(yù)冷到4℃。慢慢將8ml CsCl1.4加入離心管中，繼續(xù)緩慢加入10ml CsCl1.2，在其上部緩慢加入約20ml的病毒溶液(不夠20ml用10mMTris補齊)(體積共約37ml)。配平之，100000×g(24000rpm in SW31)90分鐘，4℃，減速度為0。離心結(jié)束后，吸棄離心管上部的廢液并用75％酒精擦拭管壁，用膠布貼住將要穿刺的部位(防止穿刺時管裂)。用5ml針管配1.22(18G)的針頭在藍白色條帶下方穿刺吸出病毒溶液(針頭開口向上)。用至少一倍體積的TE稀釋所收集的病毒溶液。第二次超速離心：慢慢將12ml CsCl1.4加入離心管中，繼續(xù)緩慢加入14ml CsCl1.2，在其上部非常緩慢的加入8～10ml稀釋好的病毒溶液。之后同上述，用5ml針管配0.8(20G)的針頭吸出藍白條帶(方法同上)或在離心管下部扎孔使液體自然流下來，收集藍白色條帶即可(可以減少cscl混入)。透析：每次用200x體積的透析buffer，透析三次，間隔一小時換一次液。透析結(jié)束后測滴度并分裝-80℃保存病毒。感染性滴度檢測，測定結(jié)果為2×10¹¹PFU/ml。

實施例2 Ad-miR486治療大鼠心肌梗塞的實驗研究

(1)動物模型及基因轉(zhuǎn)移

成年雄性SD大鼠120只，體重230～250g，所有大鼠均予以普通飼料，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境均一。按照隨機數(shù)表法將大鼠分為四組：Sham組(30只)，MI組(30只)，Ad組(30只)，miR-486組(30只)。大鼠稱重后，采用10％的水合氯醛溶液(3mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠。備皮后氣管插管連接小動物呼吸機，胸骨左緣第3～4肋間開胸，與左心耳下緣與肺動脈圓錐連線終點下2～3mm處用6-0無創(chuàng)縫合針結(jié)扎左冠狀動脈前降支。結(jié)扎后結(jié)扎點靠心尖部左室前壁呈灰白色，Ⅱ和AVL導聯(lián)心電圖S-T段抬高則證明造模成功。Sham組不予任何干預(yù)。MI組、Ad組和miR-486組用微量注射器分別吸取75μl生理鹽水、腺病毒載體溶液、攜帶miR-486腺病毒溶液，于心肌梗死周圍區(qū)域選取三點，斜行進針，直接注射入心肌內(nèi)。閉合肋間傷口，通過軟管抽取胸腔負壓，然后依次縫合手術(shù)切口，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔出氣管插管。

(2)qRT-PCR檢測miR-486在心肌的表達含量

分別于治療后1W、2W和4W時間點處死老鼠，獲取大鼠心臟。以SD大鼠心肌梗死的邊帶為標志，剪取梗死周邊區(qū)域，應(yīng)用Trizol法提取各個組心肌組織的RNA，Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒，通過特異性引物反轉(zhuǎn)錄miR-486和U6，SYBR Green熒光染料法檢測miR-486表達情況。將U6作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT方法計算miR-486相對表達水平。結(jié)果顯示：Sham組、MI組、Ad組和miR-486組心梗大鼠在1W、2W和4W時心肌組織miR-486的表達量隨時間逐漸下降。1W時Sham組、MI組、Ad組和miR-486組四組相比較，miR-486的表達量具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；進一步分析，MI組和Ad組miR-486的表達量低于miR-486組(P＜0.05)，但高于Sham組(P＜0.05)，且MI組和Ad組之間miR-486的表達量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。2W時Sham組、MI組、Ad組和miR-486組四組相比較，Sham組、MI組和Ad組的表達量低于miR-486組(P＜0.05)，Sham組、MI組和Ad組三組之間miR-486的表達量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。4W時Sham組、MI組、Ad組和miR-486組四組相比較，miR-486的表達量具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，MI組和Ad組miR-486的表達量低于Sham組(P＜0.05)和miR-486組(P＜0.05)，且MI組和Ad組miR-486的表達量不具有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表1)。

表1

注：#P＜0.05vs miR-486組；*P＜0.05vs MI組和Ad組

(3)基因治療效果

小動物心臟超聲心動圖檢測

心梗4W后，各組大鼠異氟烷吸入持續(xù)麻醉，取仰臥位。使用Vevo2100小動物超聲成像系統(tǒng)，超聲探頭于乳頭肌水平垂直于室間隔及左心室后壁而獲得M型超聲心動圖，記錄左室收縮期末徑和左室舒張期末徑，由成像系統(tǒng)自帶軟件計算出左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF，％)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS，％)，取連續(xù)3個以上心動周期的平均值。結(jié)果顯示：4W后大鼠心梗模型超聲結(jié)果示(表2)：與Sham組相比，心梗大鼠的LVEF和LVFS明顯減低(P＜0.01)；miR-486組與MI組和Ad組比較，LVEF和LVFS明顯升高(P＜0.05)；而MI組和Ad組間，LVEF和LVFS無明顯差異(P＞0.05)。

表2

注：#P＜0.05vs Sham組；*P＜0.05vs MI組+Ad組

免疫組化法測定微血管密度(MVD)

切片完成后用小鼠抗大鼠CD31多克隆抗體免疫組織化學染色，內(nèi)皮細胞被染成棕褐色。參照Weidner法計數(shù)MVD，在400倍光學顯微鏡下，在MI周圍區(qū)域隨機選取5個高倍視野計數(shù)微血管數(shù)目，求得計數(shù)的平均值作為該份標本的MVD。結(jié)果顯示如圖3：MI大鼠心肌MVD明顯高于Sham組[(58.8±6.60)個/視野](P＜0.05)。且miR-486組心肌MVD[(117.88±10.81)個/視野]高于MI組[(95.76±9.18)個/視野]和Ad組[(98.32±9.70)個/視野(P＜0.05)]，MI組與Ad組之間心肌MVD沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。(#P＜0.05vs Sham組；＊＊P＜0.05vs MI組&Ad組)

組織染色

TTC染色：4W后脫頸處死大鼠后迅速取出心臟，用PBS溶液沖洗血污，紗布吸干后放入-20℃冰箱中凍15分鐘，垂直于心臟長軸以2mm厚度連續(xù)切片，置入1％的TTC溶液中，于水浴箱中37℃避光孵育15分鐘，染色完成后用數(shù)碼照相機拍照。磚紅色為正常區(qū)域,灰白色為梗死區(qū)域，用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)計算梗死面積，梗死面積＝梗死面積/心臟切面總面積的百分數(shù)來表示。結(jié)果顯示如圖4：Sham組未見心肌梗死，其余三組可見明顯的乳白色梗死區(qū)域，miR-486組梗死面積較小。miR-486組心肌梗死面積(30.75±1.96)％明顯小于MI組和Ad組(P＜0.05)，且MI組(35.81±1.51)與Ad組(35.05±1.75)之間心肌梗死面積無明顯差異(P＞0.05)(#P＜0.05vs Sham組；＊＊P＜0.05vs MI組&Ad組。)

HE染色、Masson染色及Tunel染色：4W后處死大鼠，將心臟置于多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片后脫蠟、脫水，應(yīng)用相應(yīng)的試劑染色制片，在光學顯微鏡觀察。大鼠心肌HE染色顯示如圖5：Sham組左室前壁心肌細胞排列整齊、邊界清晰、形態(tài)正常，細胞間無纖維細胞增生現(xiàn)象；MI組和Ad組左室前壁心肌細胞排列紊亂，心肌細胞腫脹，細胞核固縮或碎裂，周圍有大量炎癥細胞浸潤，存活心肌細胞呈島樣分布，周圍纖維肉芽組織增生，壞死心肌為纖維組織取代：miR-486組左室前壁梗死病變程度輕于MI組和Ad組，心肌纖維排列輕度紊亂，細胞形態(tài)較為均一，有少量炎癥細胞和纖維組織浸潤。Masson染色后，通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)采圖、分析，每張病例切片隨機選取5個心梗周圍區(qū)域視野，膠原組織面積占所測視野面積的百分比的平均值即為膠原容積分數(shù)(CVF)。結(jié)果顯示如圖6所示：膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。Sham組大鼠心肌組織形態(tài)正常，膠原纖維含量較少；心梗后大鼠心肌組織排列紊亂，膠原纖維含量明顯增多，纖維化程度明顯。通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)量化分析，與Sham組(7.45±1.37)％相比MI組、Ad組和miR-486組CVF含量明顯增加(P＜0.05)，且miR-486組CVF含量(53.72±2.89)較MI組(62.87±3.30)％和Ad組(64.38±5.25)％降低(P＜0.05)，MI組和Ad組之間CVF無差異(P＜0.05)(#P＜0.05vs Sham組；＊＊P＜0.05vs MI組&Ad組)。Tunel染色后，細胞系呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細胞形態(tài)學特征判定為凋亡細胞，在400倍光鏡下，每張切片拍攝5個陽性視野，以平均陽性細胞數(shù)所占觀察心肌細胞的比例作為凋亡指數(shù)(apoptotoc index，AI)，即心肌細胞凋亡指數(shù)(％)＝(凋亡心肌細胞系數(shù)/正常心肌細胞系數(shù))x 100％。結(jié)果顯示如圖7：與Sham組相比，MI大鼠心肌凋亡細胞數(shù)顯著增多、AI值顯著增高(P＜0.05)。經(jīng)過miR-486治療，4W后miR-486組AI值(36.78±2.64)％明顯低于MI組(45.96±3.49)％和Ad組(44.41±4.80)％(P＜0.05)，且MI組與Ad組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(#P＜0.05vs Sham組；＊＊P＜0.05vs MI組&Ad組)

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。