本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中魚(yú)類(lèi)性別鑒定技術(shù)，更具體涉及烏鱧雄性分子標(biāo)記引物及應(yīng)用，利用本發(fā)明提供的引物可對(duì)烏鱧進(jìn)行性別鑒定，在全雄烏鱧、全雄斑烏雜交鱧育種和苗種持續(xù)規(guī)模化生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)在其它生物全雄育種及苗種生產(chǎn)中也具有應(yīng)用前景。

背景技術(shù)：

烏鱧(Channa argus Cantor，1842)，屬鱸形目(Perciformes)，鱧科(Channidae)，鱧屬(Channa)，俗名為生魚(yú)、黑魚(yú)等。因其肉嫩刺少，蛋白質(zhì)含量豐富，且具有生肌補(bǔ)血等藥用價(jià)值，耐低氧能力強(qiáng)，2014年烏鱧年產(chǎn)量達(dá)到510340噸，位列中國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)的第十位，是中國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。烏鱧雌核發(fā)育研究結(jié)果，推測(cè)烏鱧性別遺傳機(jī)制為雄魚(yú)異配。烏鱧雄性比雌性生長(zhǎng)快，同齡商品規(guī)格的成魚(yú)，雄性的體重平均比雌性大30％，烏鱧全雄單性育種及規(guī)模化定向養(yǎng)殖具有更高的經(jīng)濟(jì)效益。

雄性異配魚(yú)類(lèi)的全雄單性育種首先得制備出超雄魚(yú)，獲得超雄魚(yú)可通過(guò)幾種途徑，如生理雌魚(yú)誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)、雄核發(fā)育等，但關(guān)鍵是如何經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確地鑒定。傳統(tǒng)的方法是通過(guò)測(cè)交實(shí)驗(yàn)，依據(jù)子代性別比例來(lái)判斷父本的性染色體組成，即是XY還是YY。由于測(cè)交實(shí)驗(yàn)一是時(shí)間耗費(fèi)長(zhǎng)，通過(guò)解剖能識(shí)別烏鱧性腺至少需要四個(gè)月；二是規(guī)模化成本高，每組測(cè)交子代的單獨(dú)養(yǎng)殖占用巨大的養(yǎng)殖資源。對(duì)于烏鱧全雄單性育種及規(guī)模化定向養(yǎng)殖，經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確地鑒定烏鱧超雄魚(yú)至關(guān)重要。

目前關(guān)于烏鱧性染色體的研究很少，未見(jiàn)關(guān)于其異形性染色體的報(bào)道，已有的性別分子標(biāo)記未能?chē)?yán)格區(qū)分雌、雄性烏鱧。在其它魚(yú)類(lèi)，遺傳育種學(xué)家們運(yùn)用不同的分子標(biāo)記技術(shù)在魚(yú)類(lèi)中已經(jīng)找到了一些性別特異的或性別連鎖的DNA片段，例如大西洋鮭(Salmo salar L.)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、青鳉(Oryzias latipes)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)，但基本上都是運(yùn)用SSR和AFLP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)技術(shù)獲得。這些分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法花費(fèi)高、工作量大，耗時(shí)長(zhǎng)。

限制位點(diǎn)相關(guān)DNA(restriction site associated DNA，RAD)測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)性別標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，在斑馬魚(yú)(Danio rerio)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、太平洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus L.)、肉色平鲉(Sebastes carnatus)和黃黑平鲉(Sebastes chrysomelas)等魚(yú)類(lèi)中篩選出了性別相關(guān)的分子標(biāo)記。該技術(shù)是基于對(duì)全基因組中伴隨每個(gè)位點(diǎn)特異的限制性?xún)?nèi)切酶的小DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，受限制性酶切位點(diǎn)的限制，常需要幾種限制性?xún)?nèi)切酶酶切。

本發(fā)明基于雌雄烏鱧基因組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，利用基因組組裝和基因組比對(duì)等生物信息學(xué)分析方法，在基因組范圍內(nèi)快捷、準(zhǔn)確篩選烏鱧雄性分子標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供烏鱧雄性分子標(biāo)記引物，本發(fā)明提供了基于分子標(biāo)記Contig-359642和Contig-418354設(shè)計(jì)的引物，其中：

Contig-359642上游引物：TATGTAGCCACCACTGTCTGC

Contig-359642下游引物：GGGTGGAGTCTGTCCTGCT

Contig-418354上游引物：TTTCAAAACAAATACTCCCTC

Contig-418354下游引物：TGAACCAGGCACAAACTTA。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了烏鱧雄性分子標(biāo)記引物的應(yīng)用，包括利用所述引物進(jìn)行烏鱧的性別鑒定以及烏鱧及斑烏鱧全雄單性育種及規(guī)?；ㄏ蝠B(yǎng)殖。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

烏鱧雄性分子標(biāo)記引物的獲得：

申請(qǐng)人通過(guò)：一)雌雄烏鱧基因組高通量測(cè)序；二)Y染色體特異DNA片段的富集；三)Y染色體連鎖(雄性)分子標(biāo)記的篩選；四)雄性分子標(biāo)記的進(jìn)一步驗(yàn)證四個(gè)步驟，獲得了烏鱧雄性分子標(biāo)記Contig-359642和Contig-418354，針對(duì)兩個(gè)分子標(biāo)記設(shè)計(jì)的引物為：

Contig-359642上游引物TATGTAGCCACCACTGTCTGC

Contig-359642下游引物GGGTGGAGTCTGTCCTGCT

Contig-418354上游引物TTTCAAAACAAATACTCCCTC

Contig-418354下游引物TGAACCAGGCACAAACTTA。

烏鱧雄性分子標(biāo)記引物的應(yīng)用，包括利用Contig-359642分子標(biāo)記引物或Contig-418354分子標(biāo)記引物對(duì)烏鱧的性別進(jìn)行鑒定或?qū)貅k(或斑烏鱧)進(jìn)行全雄單性育種及規(guī)?；ㄏ蝠B(yǎng)殖，或是聯(lián)合Contig-359642分子標(biāo)記引物和Contig-418354分子標(biāo)記引物對(duì)烏鱧的性別進(jìn)行鑒定或?qū)貅k(或斑烏鱧)進(jìn)行全雄單性育種及規(guī)?；ㄏ蝠B(yǎng)殖。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確。其特點(diǎn)是：

1.運(yùn)用1尾雌魚(yú)、1尾雄魚(yú)和48尾雌魚(yú)DNA混合池進(jìn)行高通量測(cè)序；

2.采用一尾雌魚(yú)基因組測(cè)序reads經(jīng)過(guò)組裝作為reference，雄魚(yú)Kmer-60作為query進(jìn)行比對(duì)，再將不能與reference比對(duì)的雄魚(yú)Kmer-60進(jìn)行組裝，獲得雄魚(yú)基因組特異性Contig；

3.然后以雄魚(yú)基因組特異性Contig為reference，雌魚(yú)DNA混合池測(cè)序reads為query進(jìn)行比對(duì)，富集得到196條包含來(lái)自Y染色體的特異DNA片段的Contig；

4.最后通過(guò)雌雄魚(yú)DNA混合池的引物篩選、雌雄魚(yú)個(gè)體DNA的引物篩選，獲得烏鱧雄性分子標(biāo)記。

附圖說(shuō)明

圖1為雄魚(yú)特有Kmer-60的獲得示意圖。

圖2為雄魚(yú)特有候選片段長(zhǎng)度分布情況示意圖。

圖3為Y染色體特有片段獲取示意圖。

圖4為Y染色體特有片段長(zhǎng)度分布情況示意圖。

圖5為雌、雄混合池中均獲得目的條帶引物的PCR產(chǎn)物示意圖。

圖6為引物Contig-359642F/R的雌、雄個(gè)體檢測(cè)PCR產(chǎn)物電泳圖

圖中展示了其中的48尾的檢測(cè)結(jié)果。

圖7為引物Contig-418354F/R的雌、雄個(gè)體檢測(cè)PCR產(chǎn)物電泳圖

圖中展示了其中的48尾的檢測(cè)結(jié)果。

圖8為引物Contig-359642F/R和Contig-418354F/R在其他來(lái)源36尾烏鱧個(gè)體PCR檢測(cè)電泳圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)；所用試劑或材料，如未特別說(shuō)明，均來(lái)源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

烏鱧雄性分子標(biāo)記的獲得：其步驟包括：

一)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及重測(cè)序

1.烏鱧DNA樣品制備：

繁殖期間剪取烏鱧雌、雄各96個(gè)個(gè)體尾尾鰭，依次按雌魚(yú)F1-F96、雄魚(yú)M1-M96編號(hào)，采用常規(guī)柱式離心法(通用型柱式基因組提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，參照說(shuō)明書(shū)操作步驟制備DNA樣品，并用1％瓊脂塘凝膠電泳和微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000)進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)，達(dá)到高通量測(cè)序的要求。

2.測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序：

取雌魚(yú)F1、雄魚(yú)M1DNA樣品，構(gòu)建400-500bp片段測(cè)序文庫(kù)，利用Illumina Hiseq X Ten平臺(tái)進(jìn)行雙末端(Paired-End)PE150測(cè)序，分別獲得F1、M1基因組測(cè)序clean data 53.99G(359,946,114reads)和54.17G(361,160,556reads)。

從F2-F49共48份DNA樣品中，取等量混勻成雌魚(yú)DNA混合池，構(gòu)建400-500bp片段測(cè)序文庫(kù)，利用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行雙末端PE150測(cè)序，獲得雌魚(yú)DNA混合池測(cè)序clean data5.91G(38,487,986reads)。

文庫(kù)構(gòu)建具體步驟參考NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina說(shuō)明書(shū)，測(cè)序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

二)Y染色體特異DNA片段的富集

1.包括雌魚(yú)基因組Contig組裝：

運(yùn)用SOAPdenovo2軟件(https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo2)中all方法對(duì)雌魚(yú)F1測(cè)序reads進(jìn)行基因組組裝，共獲得784,393條雌魚(yú)Contig，總大小為651Mb，其中N50＝3.9Kb，N80＝1.1Kb；獲得507,119條雌魚(yú)Scaffold，總大小為678Mb，其中N50＝37.0Kb，N80＝9.0Kb(圖1)。

2.雄魚(yú)特異性DNA片段獲得：

在雄魚(yú)M1每條read的特定位置(起始坐標(biāo)：11，終止坐標(biāo)：70)截取一段60nt的序列，生成雄魚(yú)Kmer-60。以雌魚(yú)F1基因組Contig作為reference，雄魚(yú)Kmer-60作為query，采用Bowtie2軟件(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)進(jìn)行序列比對(duì)(圖2)，棄掉能夠比對(duì)的Kmer-60(圖2中整齊排列的淺藍(lán)色的Kmer-60)，收集不能比對(duì)的Kmer-60(圖2中隨機(jī)排列的深藍(lán)色的Kmer-60)，獲得271,700,328條不能比對(duì)上雌魚(yú)reference的雄魚(yú)Kmer-60,這就是雄魚(yú)特有的Kmer-60。

采用IDBA(Iterative De Bruijn Graph Assembler)軟件(http://i.cs.Hku.hk/～alse/hkubrg/projects/idba/index.html)對(duì)271,700,328條雄魚(yú)特有的Kmer-60進(jìn)行組裝，獲得515,091條雄魚(yú)Contig。雄魚(yú)Contig主要分布于250-500bp，占總數(shù)的77.10％；長(zhǎng)度≧1500bp的Contig占總數(shù)的0.26％。由此獲得雄魚(yú)基因組特異性Contig(圖3)。

3.Y染色體特異DNA片段的富集：

以雄魚(yú)基因組特異性Contig為reference，雌魚(yú)DNA混合池測(cè)序reads(150bp)為query，采用Bowtie2軟件進(jìn)行序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，雌魚(yú)DNA混合池中的reads能與雄魚(yú)reference中的大部分Contig成功比對(duì)，僅有196條雄魚(yú)Contig沒(méi)有任何一條雌魚(yú)DNA混合池的read能比對(duì)得上。這些雄魚(yú)Contig(196條)的長(zhǎng)度主要分布于220-340bp，占總數(shù)的77.04％；長(zhǎng)度≧580bp的Contig占總數(shù)的6.63％。這196條Contig中包含來(lái)自Y染色體的特異DNA片段(圖4)。

三)Y染色體連鎖分子標(biāo)記的篩選

1.引物設(shè)計(jì)與合成：

基于上述196條雄魚(yú)Contig序列，采用Primer5軟件(軟件使用參照Primer PREMIER Version5.0for Windows and Power Macintosh)設(shè)計(jì)PCR引物，引物按Contig-xxF/R編號(hào)(xx代表Contig號(hào)碼)，如Contig-107794的引物編號(hào)為Contig-107794F/R(F代表上游引物，R代表下游引物，下同)。引物由生工(上海)生物工程公司合成。

2.Y染色體連鎖片段富集：

從F1-F96和M1-M96DNA樣品中取等量混勻成雌魚(yú)DNA混合池和雄魚(yú)DNA混合池，以混合池DNA為模板，196對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μl，包括康為世紀(jì)2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，39個(gè)循環(huán)，72℃終延伸2min。PCR反應(yīng)完成，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果：14對(duì)引物僅在雄魚(yú)DNA混合池中獲得擴(kuò)增條帶；142對(duì)引物在雄魚(yú)DNA混合池和雌魚(yú)DNA混合池中均能獲得相同大小的擴(kuò)增條帶(圖5)；其余40對(duì)引物在雌、雄魚(yú)DNA混合池中均未獲得擴(kuò)增條帶。經(jīng)過(guò)96對(duì)引物在雌雄魚(yú)DNA混合池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集了14條contig可能是Y染色體連鎖片段。

3.Y染色體連鎖分子標(biāo)記的篩選及確認(rèn)：

選擇上述中的14對(duì)引物分別對(duì)雌雄各96尾個(gè)體進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μl，包括康為世紀(jì)2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，39個(gè)循環(huán)，72℃終延伸2min。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，2對(duì)引物在雄性個(gè)體中均擴(kuò)增出同樣大小的片段，在雌性個(gè)體中均未檢測(cè)到擴(kuò)增片段，兩對(duì)引物分別為Contig-359642F/R(圖6)和Contig-418354F/R(圖7)，代表它們分別對(duì)應(yīng)的Contig是Contig-359642和Contig-418354，其余12對(duì)引物在雌雄群體中的檢測(cè)結(jié)果并未呈現(xiàn)明顯規(guī)律，難以嚴(yán)格區(qū)分雌雄性別。

切下來(lái)自Contig-359642F/R和Contig-418354F/R擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳條帶，用Gel Extraction Kit(Omega公司)回收，回收產(chǎn)物鏈接到商業(yè)載體pMD18-T(Takara公司)，采用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，常規(guī)PCR法篩選含有目標(biāo)片段的陽(yáng)性克隆，擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增序列與Contig-359642和Contig-418354引物涵蓋的序列一致。說(shuō)明Contig-359642、Contig-418354為烏鱧Y染色體連鎖片段，是烏鱧的雄性分子標(biāo)記。針對(duì)Contig-359642和Contig-418354分別設(shè)計(jì)引物，具體為：

Contig-359642上游引物TATGTAGCCACCACTGTCTGC，

Contig-359642下游引物GGGTGGAGTCTGTCCTGCT。

Contig-418354上游引物TTTCAAAACAAATACTCCCTC，

Contig-418354下游引物TGAACCAGGCACAAACTTA。

實(shí)施例2：

烏鱧雄性分子標(biāo)記引物的應(yīng)用，包括下述步驟：

1.DNA樣品制備：

從武漢市水果湖生鮮市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)經(jīng)目測(cè)已性成熟的烏鱧，經(jīng)解剖得到雌、雄性別烏鱧各36尾。分別剪取尾鰭，同樣采用常規(guī)柱式離心法(通用型柱式基因組提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，參照說(shuō)明書(shū)操作步驟制備DNA樣品。

2.PCR擴(kuò)增驗(yàn)證：

采用引物Contig-359642F/R和Contig-418354F/R分別對(duì)上述雌、雄各36個(gè)烏鱧DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μl，包括康為世紀(jì)2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，39個(gè)循環(huán)，72℃終延伸2min。

PCR反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果：引物Contig-359642F/R和Contig-418354F/R在36尾雄魚(yú)DNA樣品中均能擴(kuò)增出條帶，在36尾雌魚(yú)DNA樣品中均不能擴(kuò)增出條帶(圖8)。表明分子標(biāo)記Contig-359642和/或Contig-418354可用于鑒定烏鱧的性別鑒定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢達(dá)邦生物科技有限公司

<120> 烏鱧雄性分子標(biāo)記引物及應(yīng)用

<130> 烏鱧雄性分子標(biāo)記引物及應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatgtagcca ccactgtctg c 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggtggagtc tgtcctgct 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttcaaaaca aatactccct c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaaccaggc acaaactta 19