本發(fā)明屬于多肽合成技術領域，具體涉及一種通過片段法合成艾塞那肽的方法。

背景技術：

艾塞那肽是一種含有39個氨基酸的活性多肽，氨基酸序列為：H₂N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂，是GLP-1的類似物，能夠刺激胰島β細胞再生，促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，具有控制血糖功效，艾塞那肽注射液通過減少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖濃度，從而改善血糖控制。

艾塞那肽的制備方法目前主要采用傳統(tǒng)經典的固相多肽合成法，此法合成效率低、純化成本高。

因此，開發(fā)一種高效率低成本合成艾塞那肽的方法成為本領域急需解決的技術問題。

張騰在《精細化工》，2014年10月公開艾塞那肽的合成，該合成方法將艾塞那肽分成六個片段進行固相合成法，該方法中使用了傳統(tǒng)的多肽合成碳端酰胺化，所用氨基酸都為全保護氨基酸，價格較貴，并在片段合成時使用了價格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基樹脂的方案，成本較高。本方案盡可能降低成本較高的全保護氨基酸的使用，提高價格低廉的游離氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術問題是提供一種合成艾塞那肽的方法，其提高了合成效率，減少了雜質累積，降低了純化難度，為有效解決艾塞那肽合成規(guī)模化，降低純化難度，提高產品純度。

具體來說，本發(fā)明公開了一種固液聯(lián)合法合成艾塞那肽的方法，以N-C延伸策略，將艾塞那肽的39個氨基酸分成13個小片段，先用液相法分別合成12個N端Fmoc保護小片段肽，用固相法合成第13個肽樹脂片段，然后用固相法將12個小片段依次連接到第13個肽樹脂片段上，得到艾塞那肽樹脂，然后進行切割，得到艾塞那肽粗品，粗品經純化后得到艾塞那肽產品。

更具體來說，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)的。

一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過如下的13個片段的保護片段進行合成：His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

所述方法通過如下的13個片段進行合成：片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2：Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3：Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4：Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5：Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6：Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7：Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8：Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9：Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10：Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11：Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

所述方法包括如下步驟：

(1)通過液相合成片段1-12，通過固相合成片段13；以及

(2)組裝連接得到產品。

其中，所述片段1-12的液相合成方法是將片段的羧基端通過N-羥基丁二酰亞胺活化后連接氨基酸而延長氨基酸鏈。

其中，所述片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將Fmoc-His(Trt)-OH、有機溶劑和N-羥基丁二酰亞胺混合至溶解，之后加入溶解在有機溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺進行反應，固液分離得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機溶液；

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉混合水溶液加到步驟(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機溶液中進行反應，之后對反應液進行濃縮，調節(jié)pH值至2～3，萃取分離得到有機相，經濃縮得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

所述片段2-12的合成方法如下：選擇相應的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

中所述步驟(1)所述有機溶劑為1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃；優(yōu)選所述Fmoc-His(Trt)-OH與有機溶劑是按質量-體積比為1g：(5～10)mL混合。

其中步驟(1)所述在有機溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺是二環(huán)己基碳二亞胺與有機溶劑按質量-體積比為1g：(2～3)mL的混合溶液.

其中步驟(1)Fmoc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)；步驟(1)和步驟(2)所述反應條件為室溫反應2～3小時。

其中步驟(2)所述萃取步驟的萃取劑是乙酸乙酯；優(yōu)選萃取的步驟是用乙酸有機乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、過濾得到有機相；甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1；

片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步驟:

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶脹后脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將步驟(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；以及

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步驟(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步驟(2)的方法依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

步驟(1)所述溶脹是用N,N-二甲基甲酰胺溶脹；優(yōu)選所述各個步驟脫Fmoc是用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc；更優(yōu)選所述反應的條件是在氮氣保護下，常溫攪拌1～2小時

其中所述組裝連接得到產品包括如下步驟：

(1)將片段13脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12，1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(2)按照步驟(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段片段11、片段10、片段9和片段8，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(3)將步驟(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin脫Fmoc兩次，之后加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1的混合液、片段7、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-A sn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(4)按照步驟(3)的方法在步驟(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-A sn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段6、片段5、片段4、片段3，片段2和片段1，之后脫Fmoc兩次得到艾塞那肽樹脂，加入切割液中切割，經分離得到艾塞那肽粗品，經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽產品。

其中步驟(4)所述切割液是質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液；所述連接的12個片段肽與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):1。

所述1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺各個物質與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～4):1。

一種所述制備方法制備得到艾塞那肽，其純度大于98％。

再具體來說，本發(fā)明提供一種固液聯(lián)合法合成艾塞那肽的方法，其由下述步驟組成：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

①合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將Fmoc-His(Trt)-OH與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為1g：5～10mL混合，室溫攪拌，加入N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為1g：2～3mL的混合溶液，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)，室溫反應2～3小時，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液；

②合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟①得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液中，甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1，室溫攪拌反應18～20小時，減壓濃縮，用質量分數(shù)為10％的檸檬酸水溶液調節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

(2)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

①合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu

將Fmoc-Glu(otBu)-OH與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為1g：5～10mL混合，室溫攪拌，加入N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為1g：2～3mL的混合溶液，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)，室溫反應2～3小時，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液；

②合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟①得到的Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液中，甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-Glu(otBu)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1，室溫攪拌反應18～20小時，減壓濃縮，用質量分數(shù)為10％的檸檬酸水溶液調節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH；

③合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOSu

將Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為1g：5～10mL混合，室溫攪拌，加入N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為1g：2～3mL的混合溶液，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)，室溫反應2～3小時，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液；

④合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

將蘇氨酸和碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟③得到的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃溶液中，蘇氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1，室溫攪拌反應18～20小時，減壓濃縮，用質量分數(shù)為10％的檸檬酸水溶液調節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH；

(3)合成Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Phe-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Phe--Thr-S er-COOH；

(4)合成Fmoc-Asp-Leu-Ser-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Asp-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-S er-COOH；

(5)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH

按照步驟(1)中①的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟(1)中②的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH；

(6)合成Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Met-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成F moc-Met-Glu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-Gl u-COOH；

(7)合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成F moc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH；

(8)合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmo c-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Arg(pb f)-Leu-Phe-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH；

(9)合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成F moc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH；

(10)合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmo c-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH；

(11)合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Gly-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH；

(12)合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH

按照步驟(2)中①的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-COOSu，按照步驟(2)中②的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOH，按照步驟(2)中③的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOSu，按照步驟(2)中④的合成方法合成Fmo c-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH；

(13)合成Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

①合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～2小時，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；

②合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～2小時，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；

③合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟②的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBH A Resin；

(14)合成艾塞那肽

①組裝連接Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin

將步驟(13)得到的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Re sin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-，加入N,N-二甲基甲酰胺、步驟(12)得到的Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～2小時，得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pr o-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

②組裝連接Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟①的組裝連接方法，向Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、F moc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Arg(p bf)-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-L ys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Am ide MBHA Resin；

③組裝連接Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin

將Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為0.5～1:1～2:1的混合液、Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin；

④組裝連接艾塞那肽

按照步驟③的方法，向Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Gl u(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Met-Glu-Glu-COO H、Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、Fmoc-Phe--Thr-Ser-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液，室溫攪拌1～3小時，過濾，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽；

上述12個片段肽與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):1，1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～4):1。

本發(fā)明有益效果如下：

1.本發(fā)明提高了合成效率，減少了雜質累積，降低了純化難度，為有效解決艾塞那肽合成規(guī)?；?，降低純化難度，提高產品純度，提供了一種新方法。

2.本發(fā)明盡可能降低成本較高的全保護氨基酸原料的使用，提高價格低廉的游離氨基酸的使用，使合成成本大幅降低。

3.本發(fā)明最大限度的減少了價格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink A mide-MBHA Resin等氨基樹脂的使用，降低了合成成本。

4.本發(fā)明片段合成時，采用液相法合成，縮合時采用固相法進行片段對接，兼顧了液相規(guī)?；?、成本低等優(yōu)點及固相法步驟簡單、效率高的優(yōu)點，大幅的降低了生產成本，提高了生產效率。

附圖說明

圖1是實施例1合成的艾塞那肽的質譜圖。

圖2是實施例1合成的艾塞那肽的液相色譜圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。

下面對說明書中的簡寫進行說明：

Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其名稱是4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺樹脂

Fmoc：芴甲氧羰基

pbf、tbu、Otbu、Trt、Boc都是保護基，名稱分別是2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基、叔丁基、叔丁氧基、三苯甲基、叔丁氧羰基。

本發(fā)明所述“全保護片段”是指對氨基酸中影響合成的基團進行保護后得到具有保護基的片段。

一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過如下的13個片段的保護片段進行合成：His-Gly-COOH、Glu-Gly-Thr-COOH、Phe-Thr-Ser-COOH、Asp-Leu-Ser-COOH、Lys-Gln-COOH、Met-Glu-Glu-COOH、Glu-Ala-Val-COOH、Arg-Leu-Phe-Ile-COOH、Glu-Trp-Leu-COOH、Lys-Asn-Gly-COOH、Gly-Pro-Ser-COOH、Ser-Gly-Ala-COOH和Pro-Pro-Pro-Ser-Rink Amide MBHA Resin。

在一種具體實施方式中，所述方法通過如下的13個片段進行合成：片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH、片段2：Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、片段3：Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH、片段4：Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、片段5：Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、片段6：Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、片段7：Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、片段8：Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH、片段9：Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、片段10：Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、片段11：Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、片段12：Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

這是發(fā)明人對該序列分析并結合各個氨基酸的性質，同時考慮到合成的成本，在各個因素之間進行選擇和實驗獲得的結果，及對39個氨基酸的位置進行拆分為如上所述的13個片段。上述選擇是發(fā)明人創(chuàng)造性勞動的結果，其控制了不利因素，有效降低成本。

上述序列中各個氨基酸選擇的保護基可以是任意保護基，只要能夠達到所希望的可以保護的技術效果即可，但發(fā)明人經過優(yōu)選上述取代基效果最好。選擇所述氮端和碳端是兼顧氨基酸作為碳端和氮端的反應活性以利于片段的組裝反應，同時兼顧斷點的選擇以平衡全保護片段的長度、溶解性、數(shù)量，這樣可以有效減少合成步驟、提高效率、降低成本，減少組裝完成后的處理步驟。

在一種具體實施方式中，所述方法包括如下步驟：

(1)通過液相合成片段1-12，通過固相合成片段13；以及

(2)組裝連接得到產品。

其中，所述片段1-12的液相合成方法是將片段的羧基端通過N-羥基丁二酰亞胺活化后連接氨基酸而延長氨基酸鏈。

所述片段1：Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH的合成方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將Fmoc-His(Trt)-OH、有機溶劑和N-羥基丁二酰亞胺混合至溶解，之后加入溶解在有機溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺進行反應，固液分離得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機溶液；

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將甘氨酸和碳酸氫鈉混合水溶液加到步驟(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的有機溶液中進行反應，之后對反應液進行濃縮，調節(jié)pH值至2～3，萃取分離得到有機相，經濃縮得到Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH；

該方法在合成片段結構時，使用了N-羥基丁二酰亞胺進行羧基的活化，可有效防止氨基酸縮合過程中旋光性改變，而使用二環(huán)己基碳二亞胺進行縮合，反應生成二環(huán)己基脲，該物質在一般有機溶劑中的溶解度都比較小，僅需經過簡單的過濾就可除去，另，F(xiàn)moc-His(Trt)-COOSu合成反應后，過量的二環(huán)己基碳二亞胺在水中即反應生成二環(huán)己基脲，不會影響與甘氨酸的縮合反應。

所述片段2-12的合成方法如下：選擇相應的氨基酸按照片段1的合成方法合成得到片段2-12。

其中，所述步驟(1)所述有機溶劑為1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃；優(yōu)選所述Fmoc-His(Trt)-OH與有機溶劑是按質量-體積比為1g：(5～10)mL混合。

其中，步驟(1)所述在有機溶劑中的二環(huán)己基碳二亞胺是二環(huán)己基碳二亞胺與有機溶劑按質量-體積比為1g：(2～3)mL的混合溶液。

其中，步驟(1)Fmoc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(1～1.5):(1～2)；步驟(1)和步驟(2)所述反應條件為室溫反應2～3小時。

其中，步驟(2)所述萃取步驟的萃取劑是乙酸乙酯；優(yōu)選萃取的步驟是用乙酸有機乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、過濾得到有機相；甘氨酸、碳酸氫鈉與Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾比為(1～1.5):(1～2.5):1。

片段13：Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin的合成方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將Fmoc-Rink Amide MBHA Resin溶脹后脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA R esin；該步驟中使用的原料是Fmoc-Rink Amide MBHA Resin，其是由MB HA Resin連接Fmoc保護修飾的Rink Amide Linker構成。本發(fā)明使用的是取代度為0.34mmol/g，但其他取代度的也可以達到相同或類似的技術效果，也在本發(fā)明的保護范圍內。本發(fā)明使用的取代度0.34mmol/g是從合成片段的產率、純度、樹脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將步驟(1)得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MB HA Resin；

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

步驟(2)得到的Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin按照步驟(2)的方法依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

步驟(1)所述溶脹是用N,N-二甲基甲酰胺溶脹；優(yōu)選所述各個步驟脫Fmoc是用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc；更優(yōu)選所述反應的條件是在氮氣保護下，常溫攪拌1～2小時

其中所述組裝連接得到產品包括如下步驟：

(1)將片段13脫Fmoc，之后加入N,N-二甲基甲酰胺、片段12，1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide M BHA Resin；

(2)按照步驟(1)的方法在Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(t Bu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段片段11、片段10、片段9和片段8，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(3)將步驟(2)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink A mide MBHA Resin脫Fmoc兩次，之后加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為(0.5～1):(1～2):1的混合液、片段7、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Ri nk Amide MBHA Resin；

(4)按照步驟(3)的方法在步驟(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(t Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin依次組裝連接片段6、片段5、片段4、片段3，片段2和片段1，之后脫Fmoc兩次得到艾塞那肽樹脂，加入切割液中切割，經分離得到艾塞那肽粗品，經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽產品。

其中步驟(4)所述切割液是質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液；所述連接的12個片段肽與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(1～3):1。

所述1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺各個物質與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為(2～4):1。

該步驟中各個物質的投料量均是以Fmoc-Rink Amide MBHA Resin作為參比，通過這種控制有助于對投料量的有效控制，保證原料的完全反應，從而達成保持產品品質，同時控制成本的目的。該比例保證了合成的成本最低化，同時純度和工藝達到要求。在制備過程中各個物質之間的比例可以進行適當調節(jié)，獲得的產品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個物質之間的比例進行適當調整也在本發(fā)明的保護范圍內。

本發(fā)明還提供了所述制備方法制備得到艾塞那肽，其純度大于98％

實施例

下面對實施例中使用的各個物質的來源進行說明，如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領域常規(guī)使用儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

本發(fā)明的Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的取代度為0.34mmol/g，2-c hlorotrityl chloride resin的取代度為1.74mmol/g，均由天津南開和成科技有限公司生產。

固相多肽合成反應器為通用的多肽合成反應器，可以購自成都斯諾進出口貿易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

分析型高效液相色譜儀為日立全自動L2000。

制備型高效液相色譜儀為創(chuàng)新恒通LC3000，C18分析色譜柱為大連物理化學研究所4.6mm×250mm，C18制備色譜柱為成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺購自上海吉爾生化有限公司。

LTQ-XL電噴霧電離質譜儀為美國Thermo Finnigan公司。

哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、三異丙基硅烷等其它試劑均為國產AR或CP。

實施例1

1、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

(1)合成Fmoc-His(Trt)-COOSu

將30.99gFmoc-His(Trt)-OH與300ml 1,4-二氧六環(huán)混合，室溫攪拌，加入6.33gN-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)按質量-體積比為11.35g：23mL的混合溶液，室溫反應,3小時，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

(2)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-COOH

將4.13g甘氨酸和4.62g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液滴加到步驟(1)得到的Fmoc-His(Trt)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，室溫攪拌反應20小時，減壓濃縮，用質量分數(shù)為10％的檸檬酸水溶液調節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到27.07gFmoc-His(Trt)-Gly-COOH。

反應中Fmoc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.1:1.1:1.1:1.1。

2、合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

(1)合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu

將21.28gFmoc-Glu(otBu)-OH與200ml 1,4-二氧六環(huán)混合，室溫攪拌，加入6.33gN-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃按質量-體積比為11.35g：23mL的混合溶液，室溫反應3小時，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

(2)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH

將4.13g甘氨酸和4.62g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液滴加到步驟(1)得到的Fmoc-Glu(otBu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，室溫攪拌反應18小時，減壓濃縮，用質量分數(shù)為10％的檸檬酸水溶液調節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到22.20gFmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH。

反應中Fmoc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.1:1.1:1.1:1.1。

(3)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOSu

將19.30gFmoc-Glu(otBu)-Gly-COOH與190ml 1,4-二氧六環(huán)混合，室溫攪拌，加入5.06gN-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1,4-二氧六環(huán)按質量-體積比為9.08g：20mL的混合溶液，室溫反應3小時，減壓過濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

(4)合成Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH

將5.24g蘇氨酸和3.70g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液加到步驟(3)得到的Fmoc-Glu(otBu)-Gly-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，室溫攪拌反應20小時，減壓濃縮，用質量分數(shù)為10％的檸檬酸水溶液調節(jié)pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機相依次經水洗、飽和食鹽水洗、無水硫酸鈉干燥、減壓過濾、減壓濃縮，得到21.01gFmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH；

反應中Fmoc-Glu(otBu)-Gly-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.1:1.1:1.1:1.1

3、合成Fmoc-Phe-Thr-Ser-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Phe-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Phe-Thr-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成21.87gFmoc-Phe-Thr-Ser-COOH。

4、合成Fmoc-Asp-Leu-Ser-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Asp-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Asp-Leu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成22.51gFmoc-As p-Leu-Ser-COOH。

5、合成Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH

按照步驟1中(1)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟1中(2)的合成方法合成21.48gFmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH。

6、合成Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Met-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Met-Glu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成F moc-Met-Glu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成23.68gFmoc-Met-Glu-Glu-COOH。

7、合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Ala-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成21.92gFmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH。

8、合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-A rg(pbf)-Leu-Phe-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成34.75gFmoc-Ar g(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH。

9、合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Glu(otBu)-Trp-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成26.38gFmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH。

10、合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成23.81gFmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH。

11、合成Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Gly-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Gly-Pro-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成F moc-Gly-Pro-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成18.29gFmoc-Gly-Pro-Ser-COOH。

12、合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH

按照步驟2中(1)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-COOSu，按照步驟2中(2)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOH，按照步驟2中(3)的合成方法合成Fmoc-Ser(tBu)-Gly-COOSu，按照步驟2中(4)的合成方法合成19.23gFmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH。

13、合成Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

(1)合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin

將30gFmoc-Rink Amide MBHA Resin(取代度0.34mmol/g)用300ml N,N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液300ml反應20min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗滌兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺300ml、7.82gFmoc-Ser(tBu)-OH、2.76g1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(2)合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin

將步驟(1)Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液300ml反應20min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗滌兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺300ml、6.88gFmoc-Pro-OH、2.76g 1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，得到F moc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。

(3)合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

按照步驟(2)的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次連接F moc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。Fmoc-Rink Amide MBHA Resin與所加保護氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1:2:2:2:2。

14、合成艾塞那肽

(1)組裝連接Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

將步驟13得到的Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液300ml反應20min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N,N-二甲基甲酰胺各300ml洗滌兩次，加入300ml N,N-二甲基甲酰胺、10.43gFmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-COOH、2.76g 1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，得到Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin。

(2)組裝連接Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MB HA Resin

按照步驟(1)的組裝連接方法，向Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COO H、Fmoc-Lys(Boc)-Asn-Gly-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rin k Amide MBHA Resin。

(3)組裝連接Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin

將Fmoc-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液400ml脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液400ml、12.15gFmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-COOH、2.76g 1-羥基苯丙三唑、7.74g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5ml N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌3小時，得到Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Le u-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin；

(4)組裝連接艾塞那肽

按照步驟(3)的方法，向Fmoc-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Rink Amide MBHA Resin上依次組裝連接Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、Fmoc-Lys(Boc)-Gln-COOH、Fmoc-Asp(otBu)-Leu-Ser-COOH、Fmoc-Phe--Thr-Ser-COOH、Fmoc-Glu(otBu)-Gly-Thr-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-C OOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液，室溫攪拌2小時，過濾，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽14.13g，收率33.1％；

所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為：2:2:2:2:1。

采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，結果見圖1，由圖可見，所合成的產物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致，說明合成產物為艾塞那肽。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，液相色譜圖見圖2，由圖2可見，艾塞那肽的純度大于98％。

實施例2

本實施例步驟1中，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

本實施例步驟2中Fmoc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-Gly-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟3中，F(xiàn)moc-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Phe-Thr-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟4中，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟5中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟6中，F(xiàn)moc-Met-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Met-Glu-C OOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟7中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Ala-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、纈氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟8中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Arg(pb f)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、苯丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、異亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟9中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、色氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Trp-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟10中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、天冬酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-L ys(Boc)-Asn-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它與實施例1相同。

該實施例步驟11中，F(xiàn)moc-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、脯氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Gly-Pro-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟12中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，F(xiàn)moc-Ser(tB u)-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.3:1.3:1.3:1.3，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟13中，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與所加保護氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1:2:3:3:3，該步驟的其它與實施例1相同。

該實施例步驟14中，所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為：3:3:3:3:1，該步驟的其它步驟與實施例1相同。得到14.01g艾塞那肽，收率32.8％。采用實施例1相同的條件對產品采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，所合成的產物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，純度大于98％。

實施例3

本實施例步驟1中，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

本實施例步驟2中Fmoc-Glu(otBu)-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-Gly-OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟3中，F(xiàn)moc-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、蘇氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Phe-Thr-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟4中，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Asp(otBu)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟5中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟6中，F(xiàn)moc-Met-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Met-Glu-C OOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、谷氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟7中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Ala-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、纈氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟8中，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Arg(pb f)-Leu-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、苯丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-Leu-Phe-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、異亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟9中，F(xiàn)moc-Glu(otBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、色氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Glu(ot Bu)-Trp-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、亮氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟10中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、天冬酰胺、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-L ys(Boc)-Asn-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它與實施例1相同。

該實施例步驟11中，F(xiàn)moc-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、脯氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Gly-Pro-CO OH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、絲氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟12中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，F(xiàn)moc-Ser(tB u)-Gly-COOH與N-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、丙氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1:1.5:1.5:1.5:1.5，該步驟的其它步驟與實施例1相同。

該實施例步驟13中，F(xiàn)moc-Rink Amide MBHA Resin與所加保護氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1:3:4:4:4，該步驟的其它與實施例1相同。

該實施例步驟14中，所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩爾比為：4:4:4:4:1，該步驟的其它步驟與實施例1相同。得到13.20g艾塞那肽，收率30.9％。采用實施例1相同的條件對產品采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，所合成的產物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，純度大于98％。