本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種HIV重組抗原、表達基因、表達載體以及HIV檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：自1982年命名獲得性免疫缺陷病綜合癥(AIDS)以來，HIV(Humanimmunodeficiencyvirus)的感染在全球廣泛流行，嚴重威脅著人們的生命健康，因此，必須對HIV感染進行監(jiān)控。為了盡早、盡快發(fā)現(xiàn)感染者《國務(wù)院關(guān)于進一步加強艾滋病防治工作的通知》國發(fā)【2010】48號明確提出要進一步加強監(jiān)測檢測網(wǎng)絡(luò)建設(shè)依托現(xiàn)有醫(yī)療衛(wèi)生資源配備必要的設(shè)備和人員擴大檢測服務(wù)范圍，推廣使用快速簡便的檢測方法提高檢測可及性。有鑒于此，研發(fā)簡便、準確、快速的檢測產(chǎn)品，及早檢測艾滋病病毒感染，杜絕艾滋病的傳播成為預防控制艾滋病的首要手段。目前國內(nèi)外用于檢測艾滋病的方法有酶聯(lián)免疫吸附實驗、膠體金檢測技術(shù)、免疫印跡檢測技術(shù)、核酸檢測技術(shù)和生物芯片檢測技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)：是免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入標本，洗滌，加入酶標記抗原，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用于測定HIV特異抗體。膠體金檢測技術(shù)(Colloidal-GoldTest)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)，能夠用于快篩查，但有一定的缺陷如靈敏度不夠等等。免疫印跡檢測技術(shù)(Immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該方法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，但比較耗時。核酸檢測技術(shù)(NucleicAcidTest，NAT)是利用分子生物學的理論和技術(shù)，它的目標分子是DNA或RNA，通過直接探查病毒核酸的存在與否，從而對人體狀態(tài)與疾病做出診斷的方法，但其對標本及核酸擴增酶的靈敏度及特異性要求較高，目前國內(nèi)外還沒有大量普及。生物芯片檢測技術(shù)(Bio-chipTest)是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測，但價格昂貴不適合普查。每種檢測技術(shù)各有優(yōu)缺，ELISA檢測因為其操作簡單、靈敏度和特異性好、成本低廉、檢測時間短等特點，已經(jīng)被各大血站、血液制品廠、醫(yī)院等醫(yī)療結(jié)構(gòu)所普遍采用，是應(yīng)用最廣的一項檢測技術(shù)。按照檢測原理，ELISA可以分為間接法、夾心法、捕獲法、競爭抑制法等。根據(jù)試劑所用抗原的來源以及檢測試劑的類型，可將HIV酶聯(lián)免疫檢測試劑的發(fā)展分為4個階段。第一代試劑問世于1985年，采用間接法原理，使用來自T淋巴細胞系中培養(yǎng)的HIV病毒的裂解產(chǎn)物，這類抗原通常會同時含有宿主細胞成分的污染，從而造成假陽性。其污染成分最常見的是病毒寄生的淋巴細胞的主要組織相容性區(qū)域來源的蛋白質(zhì)片段，因此，因在懷孕期間暴露于胚胎白細胞或由于輸血而與外源HLA接觸的個體由于具有抗HLA抗體而有時會出現(xiàn)假陽性。為減少非特異性，通常不得不降低包被的抗原濃度，另外，雜蛋白的存在會與抗原競爭包被位點，因此第一代試劑的靈敏度也受到了一定的限制。第二代試劑為提高靈敏度和特異度，開始使用基因工程重組和(或)人工合成肽作為抗原，重組抗原和合成肽的使用使包被抗原中免疫優(yōu)勢區(qū)的比例明顯增強，通過基因重組的方法，通常易于在培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量同源性抗原，表達產(chǎn)物為單一目的基因而非多樣性抗原混合，從而提高了試劑的靈敏度，而且在標準化條件下生產(chǎn)的抗原純度更高，使試劑的特異性和重復性均相應(yīng)提高。但和第一代試劑一樣，第二代試劑仍然使用間接法原理，即先以抗原包被聚苯乙烯板，再加入待檢血清，最后加入酶標記的抗人IgG抗體，因而只能檢測樣品中的IgG抗體，限制了試劑對HIV感染窗口期的檢測。第三代試劑使用合成多肽或重組HIV抗原，應(yīng)用雙抗原夾心法原理檢測HIV抗體，即先以抗原包被聚苯乙烯板，再加入待檢血清、酶標記的抗原，從而可同時檢測所有類型抗體，提高了試劑的敏感性，同時特異性也得到了提高。另外，由于第三代試劑能檢出IgM抗體，因此可以起到縮短窗口期的作用。有報道稱，與第二代產(chǎn)品相比，第三代HIV抗體檢測試劑檢出窗口期的時間平均可提前5天。第四代試劑為HIV-1P24抗原和HIV抗體聯(lián)合檢測試劑。為進一步縮短窗口期，此類試劑將HIV抗原和抗p24抗體同時包被聚苯乙烯板，再加入生物素標記P24抗體及待檢血清，最后加入酶標記的抗原和鏈霉親和素，從而能同時檢測出血清中的抗體和抗原。這種試劑能夠檢測早期的血清陽轉(zhuǎn)，進一步提高輸血的安全性。檢測界對HIV各代酶聯(lián)檢測試劑的窗口期一直是：第一代6周，第二代5周，第三代3周，第四代2周，相應(yīng)地使輸血的殘余危險度進一步降低，第四代試劑用于大規(guī)模獻血員篩查可以提高輸血安全性，具有明顯的檢測優(yōu)勢。目前在臨床和血液篩查中使用最為普遍的是第三代雙抗原夾心法試劑，但隨著自身的不斷成熟和完善，第四代試劑將逐步作為主流試劑用于血液篩查。國內(nèi)艾滋病檢測試劑目前基本上只針對HIV-1亞型抗體和HIV-2亞型抗體，并沒有針對HIV-O亞型抗體。雖然HIV-O亞型在中國分布極少，但是隨著國內(nèi)外人員流動的不斷加強，中國HIV-O亞型感染有加強的趨勢；另一方面，國內(nèi)艾滋病檢測試劑也會出口到HIV-O亞型感染較為嚴重的國家和地區(qū)，所以現(xiàn)有試劑對HIV-O亞型的漏檢風險越來越大。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種能夠用于檢測HIV-O亞型的HIV重組抗原。此外還有必要提供用于表達上述HIV重組抗原的表達基因和表達載體，以及含有上述HIV重組抗原的HIV檢測試劑盒。一種HIV重組抗原，包括依次連接的HIV-1亞型段、HIV-2亞型段和HIV-O亞型段；所述HIV-O亞型段為由SEQIDNo.3所示的核苷酸序列編碼得到的多肽。在一個實施例中，所述HIV-1亞型段為由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列編碼得到的多肽，或者所述HIV-1亞型段為由SEQIDNo.4所示的核苷酸序列編碼得到的多肽。在一個實施例中，所述HIV-2亞型段為由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列編碼得到的多肽。一種表達基因，包括依次連接的HIV-1片段、HIV-2片段和HIV-O片段；所述HIV-O片段的序列如SEQIDNo.3所示。在一個實施例中，所述HIV-1片段的序列如SEQIDNo.1所示，或者所述HIV-1片段的序列如SEQIDNo.4所示。在一個實施例中，所述HIV-2片段的序列如SEQIDNo.2所示。一種表達載體，包括上述的表達基因。在一個實施例中，所述表達載體為pET-24a(+)或PGEX4T-1。一種HIV檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的HIV重組抗原、標記物標記的所述HIV重組抗原、第一抗P24單克隆抗體、第二抗P24單克隆抗體和第三抗P24單克隆抗體。在一個實施例中，所述第一抗P24單克隆抗體為雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4分泌的單克隆抗體，所述雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4的保藏編號為CCTCCNO：C2016211；所述第二抗P24單克隆抗體為雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2分泌的單克隆抗體，所述雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2的保藏編號為CCTCCNO：C2016212；所述第三抗P24單克隆抗體為雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9分泌的單克隆抗體，所述雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9的保藏編號為CCTCCNO：C2016213。這種HIV重組抗原中含有HIV-O片段，從而可以用于檢測HIV-O亞型。在具體的試驗中，包括這種HIV重組抗原的HIV檢測試劑盒在檢測HIV-O亞型時表現(xiàn)出較高的特異性和靈敏性。附圖說明圖1為實施例1制得的包被抗原以及標記抗原的SDS-PAGE電泳圖，其中，泳道1為marker，泳道2為包被抗原，泳道3為標記抗原；圖2為實施例2中由三株P(guān)24雜交瘤細胞制備的小鼠腹水純化得到的三株抗P24單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖，其中，泳道1為marker，泳道2～4為純化后的抗P24單克隆抗體。具體實施方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。本發(fā)明公開了一實施方式的HIV重組抗原，包括依次連接的HIV-1亞型段、HIV-2亞型段和HIV-O亞型段。HIV-1亞型段為由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列編碼得到的多肽，或者HIV-1亞型段為由SEQIDNo.4所示的核苷酸序列編碼得到的多肽。HIV-2亞型段為由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列編碼得到的多肽。HIV-O亞型段為由SEQIDNo.3所示的核苷酸序列編碼得到的多肽。本發(fā)明還公開了用于表達上述HIV重組抗原的表達基因。用于表達上述HIV重組抗原的表達基因包括依次連接的HIV-1片段、HIV-2片段和HIV-O片段。HIV-1片段的序列如SEQIDNo.1所示，或者HIV-1片段的序列如SEQIDNo.4所示。HIV-2片段的序列如SEQIDNo.2所示。HIV-O片段的序列如SEQIDNo.3所示。由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列記為HⅠ，由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列記為HⅡ，由SEQIDNo.3所示的核苷酸序列記為O，由SEQIDNo.4所示的核苷酸序列記為HⅠA。上述基因片段為采用基因工程技術(shù)手段，通過大量分子生物學分析軟件分析篩選出來的優(yōu)勢表位基因區(qū)段。HⅠ為HIV-1亞型的gp41蛋白的優(yōu)勢表位基因區(qū)段。HⅡ為HIV-2亞型的gp36蛋白的優(yōu)勢表位基因區(qū)段。O為HIV-O亞型的gp41蛋白的優(yōu)勢表位基因區(qū)段。HⅠA為HⅠ進行點突變得到的片段，突變位點為HIV-1亞型的gp41蛋白的T67A和D121E。本發(fā)明還公開了包括上述表達基因的表達載體。包括上述表達基因的表達載體可以為pET-24a(+)或PGEX4T-1。具體的，上述表達基因的表達載體為pET-24a(+)時，表達得到的上述HIV重組抗原在HIV-O亞型段遠離HIV-1型段的一端有His-tag。具體的，上述表達基因的表達載體為PGEX4T-1時，表達得到的上述HIV重組抗原在HIV-1型段遠離HIV-O亞型段的一端有GST。包括上述表達基因(以HⅠA-HⅡ-O為例)的表達載體可以通過如下操作得到：按照上述表達基因的序列設(shè)計引物擴增目的片段，HⅠA片段上游引物帶有BamHI位點，下游引物帶有EcoRI酶切位點，HⅡ片段上游引物帶有EcoRI位點，下游引物帶有SalI酶切位點，O片段上游引物帶有SalI位點，下游引物帶有XhoI酶切位點，PCR的片段經(jīng)回收用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，HⅠA片段連接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表達載體pET-24a(+)中，得到重組質(zhì)粒pET-24a(+)-HⅠA，之后用EcoRI及SalI酶切pET-24a(+)-HⅠA，將HⅡ片段連入，之后用SalI及XhoI酶切pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ，將O片段連入，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表達基因的表達載體pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O。經(jīng)測序正確后用BamHI及XhoI酶切重組質(zhì)粒pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O，切下片段HⅠA-HⅡ-O，連入載體PGEX4T-1中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表達基因的表達載體PGEX4T-1-HⅠA-HⅡ-O。包括上述表達基因的表達載體pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O以及包括上述表達基因的表達載體PGEX4T-1-HⅠA-HⅡ-O均可以用于上述HIV重組抗原的表達。上述HIV重組抗原可以應(yīng)用于HIV檢測領(lǐng)域，下面以應(yīng)用于HIV檢測試劑盒為例進行簡單介紹。本發(fā)明公開了一實施方式的HIV檢測試劑盒，包括上述HIV重組抗原、標記物標記的上述HIV重組抗原、第一抗P24單克隆抗體、第二抗P24單克隆抗體和第三抗P24單克隆抗體。這種HIV檢測試劑盒為第四代HIV檢測試劑，上述pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O表達出來的重組抗原作為包被抗原，PGEX4T-1-HⅠA-HⅡ-O表達出來的重組抗原作為標記抗原。標記物優(yōu)選為HRP。第一抗P24單克隆抗體、第二抗P24單克隆抗體為包被抗體，第三抗P24單克隆抗體為標記抗體。具體的，第一抗P24單克隆抗體為雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4分泌的單克隆抗體。雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4于2016年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo：C2016211，分類命名：雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4。具體的，第二抗P24單克隆抗體為雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2分泌的單克隆抗體。雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2于2016年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo：C2016212，分類命名：雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2。具體的，第三抗P24單克隆抗體為雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9分泌的單克隆抗體。雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9于2016年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo：C2016213，分類命名：雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9。以下為具體實施例。實施例中采用藥物和儀器如非特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)選擇。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻、書本中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。實施例1、包被抗原及標記抗原的制備采用基因工程技術(shù)手段，通過大量的分子生物學分析軟件分析篩選出HIV-1的gp41蛋白，O亞型的gp41蛋白，HIV-2的gp36蛋白的優(yōu)勢表位基因區(qū)段，序列為SEQIDNo.1(命名為HⅠ)，SEQIDNo.2(命名為HⅡ),SEQIDNo.3(命名為O)，設(shè)計引物擴增目的片段，為提高試劑盒特異性對HⅠ片段進行點突變，突變位點為HIV-1gp41T67A及D121E，突變后的序列命名為HⅠA(SEQIDNo.4)。HⅠA片段上游引物帶有BamHI位點，下游引物帶有EcoRI酶切位點，HⅡ片段上游引物帶有EcoRI位點，下游引物帶有SalI酶切位點，O片段上游引物帶有SalI位點，下游引物帶有XhoI酶切位點，PCR的片段經(jīng)回收用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，HⅠA片段連接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表達載體pET-24a(+)中，得到重組質(zhì)粒pET-24a(+)-HⅠA，之后用EcoRI及SalI酶切pET-24a(+)-HⅠA，將HⅡ片段連入，之后用SalI及XhoI酶切pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ，將O片段連入，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表達基因的表達載體pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O。經(jīng)測序正確后用BamHI及XhoI酶切重組質(zhì)粒pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O，切下片段HⅠA-HⅡ-O，連入載體PGEX4T-1中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)pLysS，得到包括上述表達基因的表達載體PGEX4T-1-HⅠA-HⅡ-O。含有表達載體pET-24a(+)-HⅠA-HⅡ-O的BL21(DE3)pLysS菌用含100μg/mL硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，以下簡稱生工，貨號A506636)的500mLLB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.0左右，用終濃度為0.25mM的IPTG(生工，貨號A100487)28℃誘導6小時。4℃7000rpm離心3分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20mL裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，500mMNaCl)重懸，超聲破碎，4℃12000g離心20分鐘，收集上清過NI柱(BufferA:50mMTirs-HCl，500mMNaClpH8.0；BufferB:50mMTirs-HCl，500mMNaCl，200mM咪唑，pH8.0)。用10倍柱床體積的BufferA平衡Ni-NTA親和柱之后，加入蛋白樣，用10倍介質(zhì)體積的BufferA洗去未結(jié)合的蛋白，之后用25％BufferB洗去雜蛋白，100％BufferB洗脫目的蛋白，此蛋白記為HⅠA-HⅡ-O-His-tag，作為包被抗原，見圖1泳道2，-20℃保存?zhèn)溆?。含有表達載體PGEX4T-1-HⅠA-HⅡ-O的BL21(DE3)pLysS菌用含100μg/mL氨芐青霉素(生工，貨號A100741)的500mLLB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG(生工，貨號A100487)37℃誘導4小時。4℃7000rpm離心3分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20mL裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，500mMNaCl，pH8.0)重懸，超聲破碎，4℃12000g離心20分鐘，收集上清過GST柱(BufferA:20mMPB+150mMNaCl，Ph7.4；BufferB:25mMTirs-HCl+10mMGSH，pH8.0)。用10倍柱床體積的BufferA平衡Ni-NTA親和柱之后，加入蛋白樣，用10倍介質(zhì)體積的BufferA洗去未結(jié)合的蛋白，之后用10％BufferB洗去雜蛋白，100％BufferB洗脫目的蛋白，此蛋白記為GST-HⅠA-HⅡ-O，作為標記抗原，見圖1泳道3，-20℃保存?zhèn)溆?。對包被抗原HⅠA-HⅡ-O-His-tag以及標記抗原GST-HⅠA-HⅡ-O進行SDS-PAGE電泳，得到圖1。由圖1可以看出，HⅠA-HⅡ-O-His-tag以及GST-HⅠA-HⅡ-O的大小正確，純度均為90％以上。實施例2、抗人HIV-1P24雜交瘤細胞株的建立及其單克隆抗體的制備1.重組P24抗原免疫小鼠將P24重組抗原(P24-Ag，菲鵬生物股份有限公司)稀釋到1.0mg/mL，與弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich公司，貨號：F5881)等體積混合，并充分乳化，得到油狀乳液。將該乳液以0.2mL的劑量皮下施給BALB/c小鼠(廣東省醫(yī)學實驗動物中心：廣東省佛山市南海黃岐鄱陽路119號，6周齡雌性，5只)背部位點。第一次免疫14天后腹腔增強免疫，即等量抗原與弗氏不完全佐劑(Sigma-Aldrich公司，F(xiàn)5506)等體積混合，增強免疫到四針后，采尾血，分離血清，用間接ELISA法測定效價，效價高于1∶10000即可用于融合。融合前3天，用相同劑量抗原與等體積0.9％氯化鈉注射液混合腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。2.雜交瘤細胞系的制備(1)飼養(yǎng)細胞的制備以BALB/c鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)細胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉頸處死，75％酒精全身浸泡，超凈臺內(nèi)，無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液5mL，反復沖洗，回收沖洗液，1000rpm，離心5分鐘，留沉淀，用RPMI1640篩選培養(yǎng)液(含HAT的RPMI1640完全培養(yǎng)液中)重懸，調(diào)整細胞濃度1×105個/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。(2)免疫脾細胞的制備小鼠末次免疫后三天，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次，放于小燒杯的尼龍網(wǎng)上磨碎過濾，制成細胞懸液。離心，棄上清，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如此重復三次，計數(shù)。(3)骨髓瘤細胞的制備小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0(菲鵬生物股份有限公司保存)經(jīng)8-氮鳥嘌呤篩選后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取兩大瓶制成細胞懸液，離心，棄上清，用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如些重復三次，計數(shù)。(4)細胞融合及HAT選擇雜交瘤將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1:10比例混合，在50mL塑膠離心管內(nèi)用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗1次，1200rpm，離心8分鐘。棄上清，將細胞混勻，緩慢加入1mL50％的PEG1500融合，融合1分鐘后加入15mL的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細胞融合。1000rpm，離心5分鐘。棄上清，用50mL的RPMI1640篩選培養(yǎng)液輕輕混懸，平分于10塊鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)至第六天，換HT培養(yǎng)液(含HT的RPMI1640完全培養(yǎng)液)兩次。(5)抗體的檢測用0.06MpH9.6碳酸緩沖溶液稀釋P24-Ag蛋白使其終濃度為2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小時或4℃過夜。次日，用含10％小牛血清或1％脫脂奶粉的0.02MpH7.2PBS，0.15mL/孔，37℃封閉2小時，用于檢測。上述雜交瘤細胞重組融合后第七天，取細胞上清稀釋不同倍數(shù)后取0.1mL于上述96孔檢測板中，37℃30分鐘，PBST洗五次后加入2000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG(羊抗鼠IgG-HRP，菲鵬生物股份有限公司)，37℃30分鐘同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)鄰苯二胺，0.1％(V/V)雙氧水，pH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，測450nm吸收值。RPMI1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照，共檢測有雜交瘤細胞的258孔，最終獲得29株穩(wěn)定分泌P24抗體的細胞株。細胞培養(yǎng)上清效價2.54×103以上。取其中的三株雜交瘤細胞保藏分別命名為雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4、雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2和雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9。雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4于2016年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo：C2016211，分類命名：雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4。雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2于2016年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo：C2016212，分類命名：雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2。雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9于2016年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo：C2016213，分類命名：雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9。雜交瘤細胞株P(guān)24-2F4分泌的單克隆抗體記為第一抗P24單克隆抗體，雜交瘤細胞株P(guān)24-5C2分泌的單克隆抗體記為第二抗P24單克隆抗體，雜交瘤細胞株P(guān)24-3B9分泌的單克隆抗體記為第三抗P24單克隆抗體。3.單克隆抗體的制備選健壯的BALB/c小鼠(廣東省醫(yī)學實驗動物中心：廣東省佛山市南海黃岐鄱陽路119號，6周齡雌性)，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后分別腹腔注射1×106個P24-2F4雜交瘤細胞、1×106個P24-5C2雜交瘤細胞和1×106個P24-3B9雜交瘤細胞。接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10mL腹水。收集腹水，離心取上清，用3倍體積的PBS稀釋后濾紙過濾。將所得的濾液在1mL/min的流速下加到一個已用PBS平衡的蛋白G親和層析柱(GE公司)。然后用PBS以1mL/min的流速洗滌未被蛋白G吸附的物質(zhì)直至在OD280nm下的吸附值達到基線為止。再用0.1M的甘氨酸洗脫液(pH2.5)洗脫并回收該抗體。所回收的抗體立即用1.5MTris(pH8.8)中和，跑SDS-PAGE膠，見圖2。由圖2可以看出，三株抗P24單克隆抗體的純度在95％以上。上述可分泌抗P24雜交瘤腹水抗體效價均在2.91×106以上。4.單克隆抗體表位鑒定用0.06MpH9.6碳酸緩沖溶液稀釋純化好的待鑒定單抗使其終濃度為1μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小時或4℃過夜。次日,用含10％小牛血清或1％脫脂奶粉的0.02MpH7.2PBS，0.15mL/孔，37℃封閉2小時，加入2000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的P24表位鑒定抗原(P24-Ag2、P24-Ag3、P24-Ag4、P24-Ag5，菲鵬生物股份有限公司)，37℃30分鐘，PBST洗5次，拍干，每孔加入100μL含0.1％(M/V)鄰苯二胺，0.1％(V/V)雙氧水，pH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，37℃15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，測450nm吸收值，根據(jù)反應(yīng)區(qū)分表位，篩選不同表位抗體進行混合優(yōu)化摸索。實施例3、HIV檢測試劑盒的制備及調(diào)試1.HRP標記抗原的制備采用NaIO4氧化法。稱取8mg辣根過氧化物酶(HRP，英國Biozymelaboratories公司，貨號：HRP4)溶解于0.4mL超純水中，再緩慢滴加0.4mL超純水新鮮配制的20mg/mLNaIO4溶液，室溫下避光輕柔攪拌40分鐘后加入48μL乙二醇(取8μL乙二醇溶于40μL蒸餾水中)溶液，室溫下避光攪拌40分鐘。然后立即加入事先對20mM，pH9.51碳酸鹽緩沖液透析2小時，2mg/mL的實施例1得到的純化好的標記抗原GST-HⅠA-HⅡ-O1mL，4℃避光對20mM，pH9.51碳酸鹽緩沖液透析過夜。次日，向混合物中滴加80μL新鮮配制的5mg/mLNaBH4溶液，混勻，4℃靜置2小時。將上述液裝入透析袋中，對PBS緩沖液(150mM，pH7.4)透析，4℃過夜。加入酶保護劑及終濃度50％的甘油混勻后-20℃避光保存?zhèn)溆?。標記抗原GST-HⅠA-HⅡ-O標記HRP之后的綴合物在以下的文字中稱為GST-HⅠA-HⅡ-O-HRP。2.生物素標記抗P24單克隆抗體將實施例2得到的第三抗P24單克隆抗體稀釋至1mg/mL，用20mM的PBpH7.4透析24h；稱取生物素溶于H2O中配成10mM/L；將處理好的生物素加入透析袋內(nèi)，PBpH7.4透析液透析12h，得到的生物素標記的第三抗P24單克隆抗體加入終濃度15％的NBS和50％的甘油保存，備用。3.HIV第四代檢測方法對基因工程重組包被抗原、標記抗原，及抗P24單克隆抗體進行有條件的優(yōu)化篩選后，建立本發(fā)明HIV第四代ELISA檢測方法。1)包被：將實施例1得到的包被抗原HⅠA-HⅡ-O-Histag、第一抗P24單克隆抗體和第二抗P24單克隆抗體按質(zhì)量比1:10:10(0.2μg:2μg:2μg)加入50mMpH9.6的CB中，混勻進行包被，每孔加入100μL，4℃包被過夜(約22h)；2)封閉：將包被好的板從4℃取出，平衡至室溫，洗板2次；每孔加入120μL封閉液，4℃封閉過夜(約20h)或37℃封閉2h；甩干晾干后待用；3)加樣：將生物素標記的第三抗P24單克隆抗體按體積比1：1000加入生物素稀釋液中，混勻。先每孔中加入25μLP24生物素標記試劑，然后分別在相應(yīng)孔加入待檢標本、陰性、陽性對照75μL，置37℃溫育60min。4)洗滌：棄去孔板中液體，用洗板液洗板5次，每次浸泡30秒；5)加酶：將標記物GST-HⅠA-HⅡ-O-HRP、親和素酶(SA-HRP，菲鵬生物股份有限公司)分別按體積比1:20000、1:30000加入酶稀釋液中，混勻。每孔加入酶工作液100μL，置37℃溫育30min；6)洗滌：棄去孔板中液體，用洗板液洗板5次，每次浸泡30秒；7)顯色：每孔加入顯色劑A液和B液各50μL，輕輕振蕩混勻，置37℃避光顯色30min；8)終止：每孔加終止液50μL終止液，輕輕振蕩混勻；9)讀值：在酶標儀上，于450nm，630nm處讀取OD值。實施例4、實施例3得到的HIV檢測試劑盒的靈敏度和特異性測試1、靈敏度、特異性比較a)分別選取了知名的國外(公司A)和國內(nèi)(公司B)各一家HIV第四代檢測試劑產(chǎn)品為對照，對HIV三代國家標準盤同時進行了如下比較，其OD值結(jié)果如下表1所示。表1：實施例3得到的HIV檢測試劑盒與現(xiàn)有產(chǎn)品的標準盤檢測對比b)為了進一步考查本試劑盒在臨床上的表現(xiàn)，選擇了用日本Dainabot有限公司生產(chǎn)的免疫層析法試劑盒(DetermineHIV-1/2)驗證之后的198份陽性以及3000份陰性標本，進行檢測，結(jié)果如下表2所示。表2：實施例3得到的HIV檢測試劑盒與現(xiàn)有產(chǎn)品的陽性和陰性檢測對比由表1和表2可以看出，實施例3得到的HIV檢測試劑盒與國內(nèi)外同類產(chǎn)品的靈敏度、特異性均有一定優(yōu)勢。2、對HIV-O亞型檢測的比較為了驗證三種試劑對HIV-O亞型的檢測效果，將購自英國國家生物標準與檢定所(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl,NIBSC)的HIV-O型標本進行了檢測，其結(jié)果(OD值)如下表3所示。表3：實施例3得到的HIV檢測試劑盒與現(xiàn)有產(chǎn)品的HIV-O檢測對比菲鵬公司A公司BHIV-O標本Ⅰ1.5881.2480.025HIV-O標本Ⅱ1.0210.9880.175HIV-O標本Ⅲ0.6650.1420.115由表3可以看出，在對HIV-O標本的檢測上，實施例3得到的HIV檢測試劑盒比現(xiàn)有知名的國外公司A檢測靈敏度略占優(yōu)勢，較國內(nèi)公司B具有明顯優(yōu)勢。3、對HIV-1P24檢測的比較為了驗證三種試劑對HIV-1P24標本的檢測效果，用上述三種HIV第四代檢測試劑對P24中檢所盤進行了檢測，檢出差異標本，其結(jié)果(OD值)如下表4所示。表4：實施例3得到的HIV檢測試劑盒與現(xiàn)有產(chǎn)品的P24中檢所盤檢測對比標本編號菲鵬公司A公司BP50.9440.6330.406P60.5690.3210.434P103.0120.9450.569由表4可以看出，在對P24中檢所盤的檢測上，實施例3得到的HIV檢測試劑盒比現(xiàn)有產(chǎn)品有更高的靈敏度，而且可能防止漏檢。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。SEQUENCELISTING<110>菲鵬生物股份有限公司<120>HIV重組抗原、表達基因、表達載體以及HIV檢測試劑盒<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>384<212>DNA<213>HⅠ<400>1gcagcaggaagcactatgggcgcggcgtcaataacgctgacggtacaagccagacaattg60ttgtctggtatagtgcaacagcaaagcaatttgctgagagctatagaggcgcaacagcat120ctgttgcaactcacagtctggggcattaagcagctacagacaagagtcctggctatagaa180agatacctaaaggatcaacagctcctagggctttggggctgctctggaaaaaccatctgc240actactgctgtaccttggaactccagttggagtaacaaatctcaacatgagatttgggat300aacatgacctggctgcagtgggataaggaaattagtaattacacaaacacaatatacaag360ttgcttgaagactcgcaaatccag384<210>2<211>372<212>DNA<213>HⅡ<400>2gggatagtgcagcaacagcaacagctgttggacgtggtcaagagacaacaagagatgttg60cgactgaccgtctggggaacaaaaaatctccaggcaagagtcactgctatagagaagtac120ctaaaggaccaggcgcagctaaattcatggggatgtgcgtttagacaagtctgccacact180actgtaccatgggtaaatgattccttaacacctgagtgggacaatatgacgtggcaggaa240tgggaacgacaggtccgccacctggaggcaaatatcagtcaaagcttagaacaagcacaa300atccagcaggaaaagaatatgtatgagctacaaaaattaaatagctgggatgtttttggc360aactggtttgac372<210>3<211>300<212>DNA<213>O<400>3ctgcgtgcgattcaggcgcagcgtcagctgctgaaactgagcgtgtggggtattcgtcaa60cttcgtgcgcgtctgctggcgctggaaacctttattcagaatcaacaactgcttaatctg120tggggctgcaaaggcaaactgatttgctataccagcgtgaaatggaatgaaacctggaag180ggcaatagcgatacaagcctggagaaaatttgggaaaatctgacctggcaggaatgggat240cagcagatcaataacattagcagcaccatttatgatgagatccagaaagcgcaggtgcag300<210>4<211>384<212>DNA<213>HⅠA<400>4gcagcaggaagcactatgggcgcggcgtcaataacgctgacggtacaagccagacaattg60ttgtctggtatagtgcaacagcaaagcaatttgctgagagctatagaggcgcaacagcat120ctgttgcaactcacagtctggggcattaagcagctacaggcaagagtcctggctatagaa180agatacctaaaggatcaacagctcctagggctttggggctgctctggaaaaaccatctgc240actactgctgtaccttggaactccagttggagtaacaaatctcaacatgagatttgggat300aacatgacctggctgcagtgggaaaaggagattagtaattacacaaacacaatatacaag360ttgcttgaagactcgcaaatccag384當前第1頁1 2 3