本發(fā)明涉及飼料生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑及青貯飼料的制備方法。

背景技術(shù)：

青貯飼料是將新鮮的青綠飼料進(jìn)行適當(dāng)?shù)募庸ぬ幚砗?，在厭氧條件下經(jīng)過乳酸菌等微生物的發(fā)酵作用而調(diào)制保存的多汁飼料，其不僅能夠很好地保持原料青綠多汁的特性，而且具有特殊的酸香氣味，質(zhì)地柔軟，營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性好。近年來，隨著畜牧經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，采用青貯全年均衡供應(yīng)青綠多汁飼料，已成為奶業(yè)健康發(fā)展的重要手段。為了獲得理想的發(fā)酵品質(zhì)，青貯原料中的乳酸菌數(shù)量應(yīng)達(dá)到10⁵cfu/g或以上。然而，在一般情況下，飼料作物上附著的乳酸菌數(shù)量不足，青貯早期繁殖緩慢，而有害微生物繁殖較快，導(dǎo)致難以獲得品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料。因此，需額外添加優(yōu)質(zhì)乳酸菌制劑，以保證青貯發(fā)酵初期的乳酸菌數(shù)量及乳酸菌發(fā)酵能力。

申請(qǐng)?zhí)枮镃N1409985A的專利公開了一種青貯專用乳酸菌接種劑，含兩種活性干菌原粉，纖維素酶，半纖維素酶，碳水化合物，硫酸錳，硅藻土等。該青貯飼料專用乳酸菌接種劑由中溫減壓干燥和明膠-淀粉雙包被法或活菌冷凍干燥法制得。該青貯接種劑在短時(shí)間內(nèi)的發(fā)酵力度不夠，使青貯速度達(dá)到pH值為4的時(shí)間較長(zhǎng)，并且對(duì)雜菌的抑制力度缺乏，容易造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑及青貯飼料的制備方法，該復(fù)合菌種發(fā)酵劑能夠較好保持青貯玉米中的營(yíng)養(yǎng)成分，提高青貯全株玉米的品質(zhì)。

本發(fā)明提供了一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑，包括以下組分：

植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌。

優(yōu)選地，所述植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌的數(shù)量比為1～2:1～2:1。

優(yōu)選地，所述植物乳桿菌為植物乳桿菌ATCC 8014。

優(yōu)選地，所述屎腸球菌為屎腸球菌ATCC 35667。

優(yōu)選地，所述布氏乳桿菌為布氏乳桿菌ATCC 11307。

本發(fā)明提供了一種青貯飼料的制備方法，包括以下步驟：

將上述技術(shù)方案所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑接種至青貯原料，得到青貯飼料。

優(yōu)選地，所述青貯飼料為全株玉米青貯飼料。

優(yōu)選地，所述青貯飼料的pH值≤4.0；所述青貯飼料的乳酸質(zhì)量含量≥7.5％；所述青貯飼料的氨態(tài)氮的質(zhì)量含量≤2.5％。

本發(fā)明提供了一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑，包括以下組分：植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌。在全株玉米青貯時(shí)添加該復(fù)合菌種發(fā)酵劑，能較好保持青貯玉米中的營(yíng)養(yǎng)成分，迅速降低全株玉米青貯的pH值，降低氨態(tài)氮含量，提高乳酸含量，增加乳酸菌數(shù)量，提高青貯全株玉米的品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過添加本本發(fā)明的復(fù)合菌種發(fā)酵劑得到的全株玉米青貯的pH值≤4.0；乳酸質(zhì)量含量≥7.5％；氨態(tài)氮的質(zhì)量含量≤2.5％。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑，包括以下組分：

植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑包括植物乳桿菌。在本發(fā)明中，所述植物乳桿菌優(yōu)選為植物乳桿菌ATCC 8014。植物乳桿菌是厭氧細(xì)菌(兼性好氧)，在繁殖過程中能產(chǎn)出特有的乳酸桿菌素。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑包括屎腸球菌。所述屎腸球菌優(yōu)選為屎腸球菌ATCC 35667。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑包括布氏乳桿菌。所述布氏乳桿菌優(yōu)選為布氏乳桿菌ATCC 11307。布氏乳桿菌能夠產(chǎn)生較高比例的乙酸，抑制青貯飼料中的真菌，從而使青貯飼料暴露于空氣中時(shí)不易發(fā)生好氧變質(zhì)。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑中植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌的數(shù)量比優(yōu)選為1～2:1～2:1。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：

分別將植物乳桿菌菌種、屎腸球菌菌種和布氏乳桿菌菌種接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到植物乳桿菌菌液、屎腸球菌菌液和布氏乳桿菌菌液；

將所述植物乳桿菌菌液、屎腸球菌菌液和布氏乳桿菌菌液混合，制得復(fù)合菌種發(fā)酵劑。

在本發(fā)明中，植物乳桿菌菌液、屎腸球菌菌液和布氏乳桿菌菌液混合的體積比優(yōu)選為1～2:1～2:1。

在本發(fā)明中，所述MRS肉湯培養(yǎng)基組成(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉粉10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、硫酸鎂0.1、醋酸鈉5.0、檸檬酸銨2.0、磷酸氫二鉀2.0、硫酸錳0.05、吐溫80 1.0。所述MRS肉湯培養(yǎng)基的pH值為7.3±0.2。

具體地，本發(fā)明優(yōu)選將植物乳桿菌菌種、屎腸球菌菌種和布氏乳桿菌菌種，上述三株菌種由斜面挑取一環(huán)至200mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，三種菌液按1:1:1、2:1:1、1:2:1、2:2:1的體積比例配成20mL的復(fù)合菌種發(fā)酵劑。

在本發(fā)明中，每種菌液優(yōu)選培養(yǎng)菌種數(shù)量至10⁵～10⁶cfu/mL。

本發(fā)明還提供了一種青貯飼料的制備方法，包括以下步驟：

將上述技術(shù)方案所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑接種至青貯原料，得到青貯飼料。

本發(fā)明提供的復(fù)合菌種發(fā)酵劑作為制備青貯飼料時(shí)的添加劑。

在本發(fā)明中，所述青貯原料優(yōu)選為全株玉米，更優(yōu)選為切碎的全株玉米，所述切碎的全株玉米的長(zhǎng)度優(yōu)選為1～3cm。所述青貯飼料優(yōu)選為全株玉米青貯飼料。所述全株玉米青貯飼料的pH值≤4.0；所述全株玉米青貯飼料的乳酸質(zhì)量含量?jī)?yōu)選≥7.5％；所述全株玉米青貯飼料的氨態(tài)氮的質(zhì)量含量?jī)?yōu)選≤2.5％。

在本發(fā)明中，所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑在全株玉米青貯飼料制備中的應(yīng)用具體包括：

將全株玉米切碎，然后接種上述技術(shù)方案所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑，真空包裝，貯藏。

本發(fā)明優(yōu)選將全株玉米切碎至長(zhǎng)度1～3cm。所述復(fù)合菌種發(fā)酵劑的體積和全株玉米的質(zhì)量比優(yōu)選為(18～23)mL：(0.98～1.1)kg。所述貯藏的溫度優(yōu)選為20℃～40℃。

本發(fā)明在貯藏0天、3天、7天、15天和30天開封，檢測(cè)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)和微生物指標(biāo)；所述常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)包括粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)；所述發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)包括pH值、乳酸、乙酸和氨態(tài)氮；所述微生物指標(biāo)包括乳酸菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌。本發(fā)明測(cè)定開封得到的青貯樣品的干物質(zhì)(DM)質(zhì)量含量。

開封后，本發(fā)明將青貯樣品加入滅菌蒸餾水，充分揉搓，浸泡，取上清液，稀釋，接種至MRS平板培養(yǎng)基、PDA平板培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后計(jì)算乳酸菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌的菌落總數(shù)。

在本發(fā)明中，所述MRS平板培養(yǎng)基包括(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉粉5.0、酵母粉4.0、葡萄糖20.0、吐溫80 1.0mL、磷酸氫二鉀(7·H₂O)2.0、乙酸鈉(3·H₂O)5.0、檸檬酸三銨2.0、硫酸鎂(7·H₂O)0.2、硫酸錳(4·H₂O)0.05、瓊脂15.0。所述MRS平板培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為6.2±0.2。

在本發(fā)明中，所述PDA平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；PDA平板培養(yǎng)基的組分包括(g/L)：馬鈴薯浸粉5.0、葡萄糖20.0、瓊脂20.0、氯霉素0.1。

在本發(fā)明中，所述NA培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。NA培養(yǎng)基的組分包括(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉粉3.0、氯化鈉5.0、瓊脂15.0。

本發(fā)明優(yōu)選將余下的浸提液過濾，所得濾液用于檢測(cè)pH值、乳酸、乙酸和氨態(tài)氮(NH₃-N)。

本發(fā)明將青貯樣品烘干，粉碎過1mm篩，檢測(cè)其中的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量。

本發(fā)明提供了一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑，包括以下組分：植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌。在全株玉米青貯時(shí)添加該復(fù)合菌種發(fā)酵劑，能較好保持青貯玉米中的營(yíng)養(yǎng)成分，迅速降低全株玉米青貯的pH值，降低氨態(tài)氮含量，提高乳酸含量，增加乳酸菌數(shù)量，提高青貯全株玉米的品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過添加本本發(fā)明的復(fù)合菌種發(fā)酵劑得到的全株玉米青貯的pH值≤4.0；乳酸質(zhì)量含量≥7.5％；氨態(tài)氮的質(zhì)量含量≤2.5％。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑及青貯飼料的制備方法進(jìn)行詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

1.1菌種

試驗(yàn)所用復(fù)合菌種包括植物乳桿菌菌種ATCC 8014、屎腸球菌菌種ATCC35667和布氏乳桿菌菌種ATCC 11307，上述三株菌種由斜面挑取一環(huán)至200mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，三種菌液按1:1:1、2:1:1、1:2:1、2:2:1的體積比例配成20mL復(fù)合菌劑，分別記為實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組C、實(shí)驗(yàn)組D。

1.2全株玉米來源

全株玉米采自北京北六環(huán)外大東流村一農(nóng)戶家自種玉米。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

全株玉米收割后，切碎至1～3cm，混勻后接種青貯菌劑(對(duì)照組CK不接種，四個(gè)試驗(yàn)組分別接種實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組C、實(shí)驗(yàn)組D四種不同比例的復(fù)合菌劑)，然后裝入真空包裝袋中(每袋約1kg)，用真空包裝機(jī)抽真空并封口，室溫貯藏，分別在0天，3天，7天，15天，30天開封，檢測(cè)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)(粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維)、發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)(pH、乳酸、乙酸、氨態(tài)氮)和微生物指標(biāo)(乳酸菌、酵母菌、好氧性細(xì)菌)等指標(biāo)。

青貯樣品開封后，取10g樣品，加入滅菌蒸餾水90mL，充分揉搓，浸泡20～30min，吸取上清液1mL，用滅菌蒸餾水做遞減稀釋至10^-7，接種至MRS平板培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后計(jì)算乳酸菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌的菌落總數(shù)。余下的浸提液過濾，所得濾液用于檢測(cè)pH、乳酸、乙酸和氨態(tài)氮(NH₃-N)。其他的青貯樣品進(jìn)行烘干后，粉碎過1mm篩，檢測(cè)粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)。

1.4檢測(cè)結(jié)果

本發(fā)明對(duì)全株玉米青貯過程中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1，表1為全株玉米青貯過程中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)變化：

表1全株玉米青貯過程中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)變化

從表1可知，添加了上述復(fù)合菌種后，全株玉米青貯的DM、CP、EE、NDF和ADF等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分在青貯過程中幾乎無損失，這與一般青綠飼料在成熟曬干后營(yíng)養(yǎng)損失高達(dá)30％左右相比，很好地達(dá)到了青貯飼料營(yíng)養(yǎng)損失少的目的。

全株玉米青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)變化，見表2：

表2全株玉米青貯過程在發(fā)酵品質(zhì)變化

注：—表示未檢出；同列肩標(biāo)不同表示差異顯著(P＜0.05)。

全株玉米青貯過程中微生物變化結(jié)果見表3：

表3全株玉米青貯過程中微生物變化

由表2和表3可知，在玉米青貯過程中，乳酸菌大量繁殖，進(jìn)行乳酸發(fā)酵，并通過發(fā)酵作用，逐漸產(chǎn)生乳酸并累積，使青貯料的pH值下降，從而抑制酵母菌和好養(yǎng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。且在此過程中，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組CK均有明顯的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組的pH值下降均快于對(duì)照組，乳酸生成量均顯著高于對(duì)照組，且氨態(tài)氮含量顯著低于對(duì)照組，說明添加復(fù)合菌劑后，顯著提高了全株玉米青貯品質(zhì)。

本發(fā)明提供了一種復(fù)合菌種發(fā)酵劑，包括以下組分：植物乳桿菌、屎腸球菌和布氏乳桿菌。在全株玉米青貯時(shí)添加該復(fù)合菌種發(fā)酵劑，能較好保持青貯玉米中的營(yíng)養(yǎng)成分，迅速降低全株玉米青貯的pH值，降低氨態(tài)氮含量，提高乳酸含量，增加乳酸菌數(shù)量，提高青貯全株玉米的品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過添加本本發(fā)明的復(fù)合菌種發(fā)酵劑得到的全株玉米青貯的pH值≤4.0；乳酸質(zhì)量含量≥7.5％；氨態(tài)氮的質(zhì)量含量≤2.5％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。