本發(fā)明涉及含唑雜環(huán)的嘧啶類化合物，組合物及其用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTKs)通過控制細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等一系列生理生化過程。受體型酪氨酸激酶是一類橫跨細(xì)胞膜相對(duì)較大的激酶，其具有配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸殘基并且由此影響細(xì)胞增殖的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一般人類癌癥中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已發(fā)現(xiàn)所述激酶的異常表達(dá)。蛋白酪氨酸激酶已成為抗腫瘤藥物研究開發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase，EGFR)是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白酪氨酸激酶之一，EGFR的胞內(nèi)區(qū)有ATP結(jié)合位點(diǎn)，EGFR抑制劑可以競(jìng)爭(zhēng)性與ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而抑制EGFR的磷酸化過程，阻斷下游信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移(Yun,et al.Cancer Cell 2007,11,217-227)。EGFR作為抗腫瘤靶點(diǎn)的生化過程已被闡明，其晶體結(jié)構(gòu)和活性部位也已比較清楚，以此為靶點(diǎn)的藥物吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)等已經(jīng)應(yīng)用于臨床，且隨著EGFR結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系的深入研究，許多效果更佳優(yōu)秀的EGFR抑制劑(EP0566226、WO9961428、WO0051587、WO0375947、WO0132651、WO9633980、WO9630347、US7709479、US6716847、US6593333、US6251912、CN201080060451.4、CN201110191525.4等)已被發(fā)現(xiàn)。然而這些藥物不可避免地存在著抗耐藥性差的問題。研究表明：氨基酸The790到Met790的突變(T790M)是此類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要誘因。有臨床案例數(shù)據(jù)顯示，大約有60％的患者獲得性耐藥都源于T790M位點(diǎn)的突變所致。因此開發(fā)抗耐藥性更強(qiáng)、毒性更小、活性更強(qiáng)的新型EGFR抑制劑具有非常重要現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

Osimertinib(AZD9291)是口服不可逆的，T790M突變選擇性EGFR抑制劑，在LoVo細(xì)胞中對(duì)Exon 19缺失的EGFRL858R/T790M和EGFR^WT的IC₅₀分別為11.44和493.8nM，于2015年12被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市(WO2013014448)用于治療EGFR^T790M耐藥型肺癌。Rociletinib(CO-1686,AVL-301)是另一種不可逆的，突變選擇性EGFR^T790M抑制劑，在無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)中作用于EGFR^T790M和EGFR^WT的IC₅₀分別為21.5nM和303.3nM，目前處于臨床Ⅲ期研究研究(WO 2012061299)。其它如HM61713，EGF816，PF-06747775，Avitinib，ASP8273也是進(jìn)入臨床研究的新型EGFR抑制劑(Ma et al.,J.Med.Chem.,2016，DOI:10.1021/acs.jmedchem.5b00840.)，涉及的專利如：US20120157426、US8563568B2、CN102740847、CN102083800。

鑒于治療癌癥的迫切需要，本領(lǐng)域有必要開發(fā)新的效果更佳良好的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種含唑雜環(huán)的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該類化合物具有良好的抗腫瘤活性。

本發(fā)明的另一目的在于提供含所述含唑雜環(huán)的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述含唑雜環(huán)的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或所述組合物的用途。

為此，一方面，本發(fā)明提供一種通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述通式(Ⅰ)所示的化合物具有如下結(jié)構(gòu)：

其中，

R¹選自選氯、氫、氟、三氟甲基或硝基；

R²選自氫、氯、氟、甲基或甲氧基；

Z選自-OCH₂CH₂-、-CH₂-、-NHC(＝O)CH₂-、直接的單鍵、-OCH₂CH₂CH₂-，當(dāng)Z兩端含有雜原子O或N時(shí)，該雜原子與苯環(huán)相連；

X選自CH或N；

Y選自CH或N。

作為本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式，本發(fā)明所述通式(Ⅰ)所示的化合物具有I-1～I(xiàn)-39所示的結(jié)構(gòu)：

如上所示結(jié)構(gòu)化合物為含唑雜環(huán)的嘧啶類化合物，本發(fā)明抗腫瘤活性篩選顯示，大部分此類化合物具有較強(qiáng)的抑制非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞增殖能力，部分化合物顯示出比Rociletinib更加優(yōu)良的抗EGFR^T790M活性。作為一類結(jié)構(gòu)新穎的分子，本發(fā)明中的化合物具有開發(fā)成新型高效EGFR抑制劑的潛力，對(duì)治療相關(guān)的腫瘤疾病尤其是非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌有較大的應(yīng)用價(jià)值。

前述I-1～I(xiàn)-39所示的結(jié)構(gòu)分別具有如下名稱：

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-三唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-3)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-6)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-7)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙酰氨基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-8)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[(1H-咪唑基)]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-9)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-10)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[3-(1H-四氮唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-11)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-12)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-13)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-14)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-15)N-[3-[[5-氟-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-16)N-[3-[[5-氟-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-17)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-18)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-19)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-20)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-21)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-22)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-23)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-24)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-25)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-26)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-27)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-28)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-29)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-30)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-31)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-32)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-33)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-34)N-[3-[[2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-35)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-36)N-[3-[[2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-37)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-38)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

(I-39)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有有效劑量的本發(fā)明所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，及藥用載體。

本發(fā)明所述化合物由于它們?cè)谒幬镏械目赡苡猛?，?Ⅰ)化合物的鹽優(yōu)選藥物可接受的鹽。本發(fā)明的化合物為堿，其中所需鹽形式可以通過本領(lǐng)域已知的合適方法制備，包括用無(wú)機(jī)酸處理游離堿，所述無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有機(jī)酸處理游離堿、所述有機(jī)酸例如乙酸、三氟乙酸、馬來酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羥基乙酸、水楊酸、吡喃糖苷酸(pyranosidy1acid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羥基酸，例如檸檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)施例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙酸鹽(propiolates)、草酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽(phenylbutrates)、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥基乙酸鹽、酒石酸鹽、苦杏仁酸鹽和磺酸鹽、例如二甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽和萘-2-磺酸鹽。

本發(fā)明的藥物組合物通常含有一種本發(fā)明化合物。然而，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有超過一種本發(fā)明的化合物。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可任選包括一種或多種其它藥學(xué)活性化合物。

本發(fā)明還提供所述含唑雜環(huán)的嘧啶類化合物或其藥學(xué)上可接受的載體，所述藥物組合物通過抑制EGFR表皮因子受體酪氨酸激酶進(jìn)而抑制腫瘤增殖的用途。具體地，該用途主要為制備用于治療非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。

本發(fā)明提供所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或本發(fā)明所述的藥物組合物在制備EGFR表皮因子受體蛋白酪氨酸激酶抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供所述通式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或本發(fā)明所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌或小細(xì)胞肺癌，進(jìn)一步優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌。更優(yōu)選地，所述用途主要通過抑制EGFR表皮因子受體蛋白酪氨酸激酶實(shí)現(xiàn)的。

附圖說明

圖1為化合物I-5在50nmol/L濃度下引起H1975細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

圖2為空白條件下引起H1975細(xì)胞凋亡的結(jié)果。.

圖3為化合物I-5在500nmol/L濃度下引起H1975細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

圖4為化合物I-5在200nmol/L濃度下引起H1975細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

圖5為空白條件及化合物I-5在5～15μM/L下引起H1975細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步描述解釋本發(fā)明，但這些實(shí)施例并非意味著限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照原料或商品制造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場(chǎng)購(gòu)買的常規(guī)試劑。

實(shí)施例1目標(biāo)分子的制備

薄層層析硅膠板使用煙臺(tái)黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅胺板采用的規(guī)格是0.15mm-0.2mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm-0.5mm。

本發(fā)明使用的原料主要購(gòu)自可購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化學(xué)試劑有限公司、達(dá)瑞化學(xué)品等公司。

實(shí)施例中無(wú)特殊說明，溶液是指水溶液。

實(shí)施例中無(wú)特殊說明，反應(yīng)的溫度為室溫，為20℃-30℃。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

化合物(Ⅰ)的合成路線.試劑及條件:(a)間硝基苯胺,DIPEA,1,4-二氧六環(huán),rt,2h,91％；b)DIPEA,1,4-二氧六環(huán),60℃,2h,49–72％；(c)Fe-NH₄Cl,MeOH-H₂O,80℃至rt,62–85％；(d)丙烯酰氯,NaHCO₃,丙酮,10min,43–68％，上述路線中各取代基的定義同上。

I-b的合成

取I-a(23.44mmol)和DIPEA(4.5g,35.16mmol)于50mL二氧六環(huán)中，慢慢加入3-硝基苯胺(3.8g,23.44mmol)，升溫60℃，反應(yīng)5小時(shí)后，反應(yīng)完畢，冷卻，加入400mL水，析出黃白色固體，抽濾，烘干，得白色固體，未純化直接下一步反應(yīng)。

I-c的合成

取I-b(23.44mmol)和三氟乙酸(4.5g,35.16mmol)于2-BuOH(50ml)中，慢慢加入取代芳胺(I-f,3.44mmol)，升溫100℃，反應(yīng)8小時(shí)后，反應(yīng)完畢，冷卻，倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，析出固體，抽濾，水洗，烘干硅膠柱層析分離，得淺褐色固體。

I-d的合成

取I-c(1.9g,6.8mmol)和氯化銨(0.73g,13.6mmol)于反應(yīng)瓶，加入MeOH(15mL)和水(15mL)，攪拌下加入鐵粉(1.5g,27.2mmol)，升溫60℃反應(yīng)2小時(shí)，趁熱抽濾，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得黃色半固體I-d。

目標(biāo)物(Ⅰ)的合成

取I-d(2.1g,9.7mmol)溶于20mL乙腈中，加入碳酸氫鈉(1.6g,19.4mmol)，和甲基哌嗪(1.2g,11.64mmol)，升溫60℃反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)完畢后抽干溶劑，加水200mL，未析出固體，水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得目標(biāo)分子(Ⅰ)。

根據(jù)以上方法合成了目標(biāo)分子，所合成目標(biāo)分子的理化數(shù)據(jù)如下：

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 476.16[M+H]⁺。

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-三唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.07(s,2H),4.26(s,2H),5.70(d,J＝12.0Hz,1H),6.19(d,J＝16.8Hz,1H),6.39(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.64(s,2H),6.84(s,1H),7.17(s,1H),7.24-7.29(m,2H),7.44-7.48(m,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),8.84(s,1H),9.13(s,1H),10.15(s,1H).MS(ESI)m/z 475.15[M+H]⁺。

(I-3)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(t,J＝4.0Hz,2H)),4.31(t,J＝4.0Hz,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.0Hz,2H),6.91(s,1H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.29(d,J＝12.0Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.69(s,1H),7.93(s,1H),8.07(s,1H),9.01(s,1H),9.39(s,1H),10.15(s,1H).MS(ESI)m/z 460.19[M+H]⁺。

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.78(s,3H),5.05(s,2H),5.74(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(s,1H),8.95(s,1H),10.14(s,1H).MS(ESI)m/z 476.16[M+H]⁺。

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(s,1H),7.30(d,J＝6.0Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(s,1H),7.85(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.37(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI)m/z 446.14[M+H]⁺。

(I-6)N-[3-[[5-氟-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.04(s,2H),5.76(dd,J＝2.0,10.0Hz,1H),6.26(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.50(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.88(s,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,2H),7.09(s,1H),7.27(d,J＝6.0Hz,1H),7.43(d,J＝6.0Hz,1H),7.51(d,J＝6.0Hz,1H),7.64(s,1H),7.69(s,1H),7.93(s,1H),8.11(s,1H),9.24(s,1H),9.46(s,1H),10.16(s,1H).MS(ESI)m/z 430.17[M+H]⁺。

(I-7)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙酰氨基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.07(s,2H),5.71(d,J＝10.0Hz,1H),6.21(d,J＝16.8Hz,1H),6.40(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.88(s,1H),7.01(s,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝6.0Hz,1H),7.52(d,J＝6.0Hz,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.69(s,1H),7.83(s,1H),7.95(s,1H),8.51(s,1H),9.04(s,1H),10.32(s,1H).MS(ESI)m/z 500.17[M+H]⁺。

(I-8)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.67(d,J＝10.0Hz,1H),6.19(d,J＝16.8Hz,1H),6.29(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.01(s,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝6.0Hz,1H),7.38(d,J＝6.0Hz,1H),7.41(s,1H),7.43(s,1H),7.86(s,1H),8.02(s,1H),8.96(s,1H),9.23(s,1H),10.29(s,1H).MS(ESI)m/z 443.15[M+H]⁺。

(I-9)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.86(m,2H),4.07(t,J＝4.0Hz,2H),4.57(t,J＝4.0Hz,2H),5.72(d,J＝10.0Hz,1H),6.17(d,J＝16.8Hz,1H),6.21(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.03(s,1H),9.45(s,1H),10.27(s,1H).MS(ESI)m/z 501.20[M+H]⁺。

(I-10)N-[3-[[5-硝基-2-[[4-[2-(1H-四氮唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.87(m,2H),4.10(t,J＝4.0Hz,2H),4.62(t,J＝4.0Hz,2H),5.75(d,J＝10.0Hz,1H),6.18(d,J＝16.8Hz,1H),6.25(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.45(s,1H),6.67(d,J＝8.4Hz,1H),6.87(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝6.0Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,2H),7.71(s,1H),7.88(s,1H),8.15(s,1H),9.13(s,1H),9.55(s,1H),10.26(s,1H).MS(ESI)m/z 525.17[M+H]⁺。

(I-11)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.66(s,3H),4.13(s,2H),4.35(s,2H),5.76(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.19(s,1H),10.28(s,1H).MS(ESI),m/z:490.17[M+H]⁺。

(I-12)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.19(s,2H),4.41(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.76(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.96(s,1H),9.28(s,1H),10.26(s,1H).MS(ESI),m/z:510.11[M+H]⁺。

(I-13)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.27(s,2H),4.42(s,2H),5.33(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),8.97(s,1H),9.28(s,1H),10.36(s,1H).MS(ESI),m/z:506.16[M+H]⁺。

(I-14)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.76(s,3H),4.23(s,2H),4.35(s,2H),5.76(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.77(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.14(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI),m/z:474.20[M+H]⁺。

(I-15)N-[3-[[5-氟-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.09(s,2H),4.26(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.76(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.74(s,1H),7.89(s,1H),8.20(s,1H),8.96(s,1H),9.28(s,1H),10.36(s,1H).MS(ESI),m/z:494.14[M+H]⁺。

(I-16)N-[3-[[5-氟-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.17(s,2H),4.33(s,2H),5.43(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),9.05(s,1H),9.18(s,1H),10.27(s,1H).MS(ESI),m/z:490.19[M+H]⁺。

(I-17)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.17(s,2H),4.42(s,2H),5.53(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),8.99(s,1H),9.18(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI),m/z:506.16[M+H]⁺。

(I-18)N-[3-[[5-氟-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.09(s,2H),4.22(s,2H),5.37(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.76(s,1H),7.90(s,1H),8.15(s,1H),8.99(s,1H),9.21(s,1H),10.24(s,1H).MS(ESI),m/z:490.19[M+H]⁺。

(I-19)N-[3-[[5-氯-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ2.89(s,3H),5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(s,1H),7.30(d,J＝6.0Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(s,1H),7.85(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.37(s,1H),10.18(s,1H).MS(ESI),MS(ESI),m/z:46016[M+H]⁺。

(I-20)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(s,1H),7.39(d,J＝6.0Hz,2H),7.58(d,J＝6.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.77(s,1H),7.89(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.49(s,1H),10.28(s,1H).MS(ESI),m/z:480.10[M+H]⁺。

(I-21)N-[3-[[5-氯-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.78(s,3H),5.05(s,2H),5.74(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(s,1H),8.95(s,1H),10.14(s,1H).MS(ESI)m/z 476.16[M+H]⁺。

(I-22)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ2.89(s,3H),5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.04(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(s,1H),7.30(d,J＝6.0Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(s,1H),8.05(s,1H),8.64(s,1H),9.17(s,1H),9.78(s,1H),10.38(s,1H).MS(ESI),m/z:471.18[M+H]⁺。

(I-23)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ5.02(s,2H),5.75(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.25(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.47(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.86(s,1H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(s,1H),7.39(d,J＝6.0Hz,2H),7.58(d,J＝6.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.77(s,1H),7.89(s,1H),8.14(s,1H),8.97(s,1H),9.69(s,1H),10.39(s,1H).MS(ESI),m/z:491.13[M+H]⁺。

(I-24)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.58(s,3H),5.15(s,2H),5.79(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.99(d,J＝6.0Hz,1H),8.02(s,1H),8.51(s,1H),9.15(s,1H),10.34(s,1H).MS(ESI),m/z:487.18[M+H]⁺。

(I-25)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.78(s,3H),5.05(s,2H),5.74(dd,J＝2.4,10.0Hz,1H),6.24(dd,J＝2.0,16.8Hz,1H),6.42(dd,J＝10.0,17.2Hz,1H),6.66(d,J＝8Hz,1H),6.88(s,1H),6.97(s,1H),7.15(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(s,1H),7.79(s,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),7.92(s,1H),8.11(s,1H),8.95(s,1H),10.14(s,1H).MS(ESI),m/z:487.18[M+H]⁺。

(I-26)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.76(s,3H),4.19(s,2H),4.38(s,2H),5.76(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.86(s,1H),7.97(s,1H),8.40(s,1H),8.99(s,1H),9.49(s,1H),10.38(s,1H).MS(ESI),m/z:501.19[M+H]⁺。

(I-27)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.29(s,2H),4.41(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.76(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.97(s,1H),8.40(s,1H),8.96(s,1H),9.48(s,1H),10.36(s,1H).MS(ESI),m/z:521.14[M+H]⁺。

(I-28)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.27(s,2H),4.66(s,2H),5.73(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.86(s,1H),8.02(s,1H),8.65(s,1H),9.10(s,1H),9.37(s,1H),10.40(s,1H).MS(ESI),m/z:517.19[M+H]⁺。

(I-29)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.17(s,2H),4.33(s,2H),5.43(s,1H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,1H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.89(s,1H),8.15(s,1H),9.05(s,1H),9.18(s,1H),10.27(s,1H).MS(ESI),m/z:517.19[M+H]⁺。

(I-30)N-[3-[[5-硝基-2-[[2-甲基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.91(m,2H),4.09(t,J＝4.0Hz,2H),4.57(t,J＝4.0Hz,2H),5.72(d,J＝10.0Hz,1H),6.17(d,J＝16.8Hz,1H),6.21(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.18(s,1H),9.64(s,1H),10.37(s,1H).MS(ESI),m/z:515.21[M+H]⁺。

(I-31)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-氯-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.77(m,2H),4.09(t,J＝4.0Hz,2H),4.67(t,J＝4.0Hz,2H),5.78(d,J＝10.0Hz,1H),6.20(d,J＝16.8Hz,1H),6.29(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.03(s,1H),9.55(s,1H),10.38(s,1H).MS(ESI),m/z:535.15[M+H]⁺。

(I-32)N-[3-[[5-硝基-2-[[3-甲氧基-4-[3-(1H-咪唑基)丙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ3.66(m,2H),4.12(t,J＝4.0Hz,2H),4.77(t,J＝4.0Hz,2H),5.79(d,J＝10.0Hz,1H),6.18(d,J＝16.8Hz,1H),6.26(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H),6.39(s,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),7.61(s,1H),7.82(s,1H),8.05(s,1H),9.13(s,1H),9.49(s,1H),10.29(s,1H).MS(ESI),m/z:531.20[M+H]⁺。

(I-33)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 510.18[M+H]⁺。

(I-34)N-[3-[[2-[[4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.77(dd,J＝4.0Hz,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 442.19[M+H]⁺。

(I-35)N-[3-[[5-三氟甲基-2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 480.17[M+H]⁺。

(I-36)N-[3-[[2-[[4-[(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,3H),7.66(s,1H),7.77(dd,J＝4Hz,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 412.18[M+H]⁺。

(I-37)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-(1H-咪唑-1-亞甲基)苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,2H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 464.13[M+H]⁺。

(I-38)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氯-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(s,2H),4.31(s,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.70(s,2H),6.90(s,1H),7.22(s,1H),7.29-7.31(m,2H),7.44-7.49(m,2H),7.66(s,1H),7.87(s,1H),8.10(s,1H),8.90(s,1H),9.18(s,1H),10.20(s,1H).MS(ESI)m/z 510.11[M+H]⁺。

(I-39)N-[3-[[5-氯-2-[[3-氟-4-[2-(1H-咪唑基)乙氧基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺；

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ4.12(t,J＝4.0Hz,2H)),4.31(t,J＝4.0Hz,2H),5.75(d,J＝12.0Hz,1H),6.24(d,J＝16.8Hz,1H),6.44(dd,J＝12.0,16.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.0Hz,2H),6.91(s,1H),7.24(d,J＝6.0Hz,1H),7.29(d,J＝12.0Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(s,1H),7.93(s,1H),8.07(s,1H),9.01(s,1H),9.39(s,1H),10.15(s,1H).MS(ESI)m/z 494.14[M+H]⁺。

目標(biāo)分子成鹽的方法

無(wú)機(jī)酸鹽的制備方法：取目標(biāo)分子(1mmol)溶于10mL無(wú)水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加無(wú)機(jī)酸(1mmol)的5mL無(wú)水甲醇溶液，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除甲醇，即得目標(biāo)分子的無(wú)機(jī)酸鹽。通過該方法制備了化合物I-5的鹽酸鹽(I-5-1)、氫溴酸鹽(I-5-2)、硫酸鹽鹽(I-5-3)及氫溴酸鹽(I-5-4)；

有機(jī)酸鹽的制備方法：取目標(biāo)分子(1mmol)溶于10mL無(wú)水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有機(jī)酸(1mmol)的5mL干燥乙醚，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除溶劑，即得目標(biāo)分子的有機(jī)酸鹽。通過該方法制備了化合物I-9的馬來酸鹽(I-9-5)、琥珀酸鹽(I-9-6)及富馬酸鹽(I-9-7)。

兩個(gè)目標(biāo)分子混合物的制備

取等摩爾量(1mmol)的上述兩個(gè)目標(biāo)分子于無(wú)水甲醇中(5mL)，室溫?cái)嚢?0分鐘，常溫蒸除溶劑，即得目標(biāo)分子的混合物。通過該方法制備了(I-5)-(I-6)、(I-5)-(I-9)、(I-6)-(I-10)三個(gè)組合物。

實(shí)施例2目標(biāo)分子生物活性評(píng)價(jià)

1、體外對(duì)受體酪氨酸激酶抑制活性測(cè)試方法

制備激酶檢測(cè)緩沖液

①在室溫融解激酶檢測(cè)緩沖液(Kinase Detection Buffer)，觀察是否有沉淀。

②如果出現(xiàn)沉淀，就在37℃孵育(Kinase Detection Buffer)15分鐘并經(jīng)常搖動(dòng)，溶解沉淀。或者，小心吸走上清，去除沉淀。

制備激酶檢測(cè)試劑

①使用前在室溫平衡激酶檢測(cè)緩沖液(Kinase Detection Buffe)和(Kinase Detection Substrate)。

②將激酶檢測(cè)緩沖液(Kinase Detection Buffer)全部倒進(jìn)裝有激酶檢測(cè)底物(Kinase Detection Substrate)的棕色瓶中，使凍干粉底物溶解，這樣就制成了激酶檢測(cè)試劑。

③輕輕震蕩、渦旋或顛倒混勻，成為均質(zhì)溶液，底物應(yīng)在1分鐘內(nèi)溶解。

④激酶檢測(cè)試劑配好后應(yīng)立即使用，或分裝存于-20℃，我們認(rèn)為配好的試劑經(jīng)過幾次凍融后循環(huán)信號(hào)活性都沒有損失。

制作ATP轉(zhuǎn)化成ADP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

①用1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinase reaction buffer)稀釋試劑盒提供的Ultra Pure ATP和ADP，制成900μL 50μM ATP和500μL 50μM ADP。

②將上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示在384孔板A1-A12中混合，模擬每個(gè)轉(zhuǎn)化百分比的ATP和ADP的濃度，混合好。

表1.制備50μM系列ATP+ADP標(biāo)準(zhǔn)品

③每孔加入5μL的ADP-Glo^TM試劑來終止激酶反應(yīng)。在室溫孵育40分鐘。

④每孔加入10μL激酶檢測(cè)試劑(Kinase Detection Reagent)將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，并引進(jìn)螢光素酶和螢光素來檢測(cè)ATP。

⑤在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量螢光并記錄螢光值。

⑥繪制ATP轉(zhuǎn)化成ADP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

確定激酶抑制物的IC₅₀值

①按照promega試劑盒說明書配制1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinase reaction buffer)，2.5×50ng/μL激酶和2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在無(wú)酶對(duì)照孔中加入3μL 1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinase reaction buffer)，2μL2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在陰性對(duì)照孔中加入1μL 1×激酶反應(yīng)緩沖液(kinase reaction buffer)，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在測(cè)試孔中加入1μL 5×待測(cè)藥物，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好平板，孵育60分鐘。

④每孔加入5μL的ADP-Glo^TM試劑來終止激酶反應(yīng)。在室溫孵育40分鐘。

⑤每孔加入10μL激酶檢測(cè)試劑(Kinase Detection Reagent)將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，并引進(jìn)螢光素酶和螢光素來檢測(cè)ATP。在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量螢光并記錄螢光值。

⑥結(jié)果分析，結(jié)果是表2所示。

2、細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(MTT檢測(cè)法)

細(xì)胞接種：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,以每孔7×10³個(gè)細(xì)胞,每孔體積100μL接種到96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)；

細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞貼壁后，0％FBS RPMI-1640饑餓8h,對(duì)照組用10％FBSRPMI-1640培養(yǎng),，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(按實(shí)驗(yàn)要求分別培養(yǎng)不同時(shí)間)；

呈色：三組細(xì)胞分別于培養(yǎng)72h后加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，4h后終止培養(yǎng)，每孔加入100μL三聯(lián)液，于搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解；

比色：在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光度值(OD值)，選擇570nm波長(zhǎng)，以無(wú)細(xì)胞的即RPMl-1640培養(yǎng)液空白孔調(diào)零，測(cè)各孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次

記錄結(jié)果：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(對(duì)照組吸光度值一實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100％，細(xì)胞增殖率＝(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100；

繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，抑制率/增殖率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

在GraphPad軟件中的GraphPad Prism作圖軟件中針對(duì)抑制劑濃度做圖，以便由log[抑制劑]相對(duì)于反應(yīng)，可變斜率模型估算出IC₅₀。

測(cè)試結(jié)果如表2所示，表2顯示所獲得的化合物在抑制EGFR酪氨酸激酶和抗腫瘤細(xì)胞增殖中的活性效果^a。

表2

表3

a:H1975為EGFR^T790M突變細(xì)胞株，A431EGFR^WT細(xì)胞.b:IC₅₀：半數(shù)有效抑制濃度.

3、細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))

3.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑

H1975細(xì)胞，RAPI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone公司，cat:SH30022.01B)，F(xiàn)BS胎牛血清(GIBCO公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:SV30010)，低速離心機(jī)(上海貝恩生物科技有限公司，cat:TDZ4B-WS)，CO₂培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:BC-J160S)，超凈工作臺(tái)(上海博訊型號(hào)SW-CJ-2FD)，倒置熒光電子顯微鏡(Leica DMI3000B)。

3.2實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1擴(kuò)大培養(yǎng)H1975細(xì)胞；

3.2.2藥物處理：用不同濃度藥物處理細(xì)胞48小時(shí)。

3.2.3藥物處理后細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集細(xì)胞1～5×10⁵細(xì)胞；

3.2.4加入500μL的AnnexinV結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)懸浮細(xì)胞；

3.2.5加入5μL AnnexinV-FITC混勻后，加入5μL碘化丙錠(Propidium Iodide，(周期檢測(cè)只加5uL碘化丙錠)，混勻；

3.2.6避光、室溫反應(yīng)10min；

3.2.7用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Ex＝488nm；Em＝530nm)細(xì)胞凋亡和周期的情況。

測(cè)試結(jié)果如圖1～圖5所示，下圖顯示所獲得的化合物I-5在不同濃度下引起H1975細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

以上生物活性結(jié)果表明，本發(fā)明中的分子對(duì)EGFR和EGFR^T790M激酶有強(qiáng)烈的抑制效果，大部分化合物達(dá)到納摩爾水平的活性級(jí)別，且有將近一半的化合物的有效抑制濃度IC₅₀值小于100nM，化合物I-3(9.1nM)，I-5(3.3nM)，I-6(9.0nM)對(duì)EGFR^T790M的IC₅₀更是達(dá)到10nM以下，明顯優(yōu)于吉非替尼和Rociletinib，此外，本發(fā)明所涉及的化合物在激酶選擇性上較好，尤其是化合物I-5(SI＝303)，其選擇性是先導(dǎo)化合物Rociletinib(SI＝21.9)的13.8倍，結(jié)果預(yù)示著化合物I-5作用更專一，因此可能的毒副作用會(huì)更小?？辜?xì)胞增殖活性結(jié)果揭示，大部分化合物對(duì)肺癌耐藥型細(xì)胞H1975有非常有效的抑制作用，其中化合物I-5(118nM)和I-9(129nM)明顯優(yōu)于Rociletinib(137nM)的活性，另外，大部分化合物對(duì)人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE的抑制作用較弱，在其發(fā)揮抑制H1975細(xì)胞的有效濃度下，幾乎對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，證明此類化合物的毒性更小，流式細(xì)胞凋亡的結(jié)果揭示I-5能夠?qū)1975引起細(xì)胞凋亡，且凋亡數(shù)目呈現(xiàn)劑量依賴性。預(yù)示此類分子有極大可能開發(fā)成新型高效EGFR抑制劑的潛力，對(duì)治療相關(guān)的腫瘤疾病尤其是非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌有較大的應(yīng)用價(jià)值。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)先實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。