一種促進(jìn)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的方法與流程

文檔序號(hào)：11145549閱讀：754來(lái)源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及一種促進(jìn)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，微生物發(fā)酵法和植物抽提法為生產(chǎn)天然黃色素的兩種主要方法。植物來(lái)源的天然黃色素如：梔子黃色素、紅花黃色素、姜黃色素、玉米黃色素、桔皮黃色素、南瓜黃色素等，這些植物來(lái)源的色素在生產(chǎn)過(guò)程中面臨各方面的局限性，一方面抽提過(guò)程中要采用有機(jī)試劑，成本較高，產(chǎn)量及應(yīng)用受限，另一方面其季節(jié)性很強(qiáng)，其生產(chǎn)在季節(jié)的影響下會(huì)導(dǎo)致設(shè)備的利用率低下，造成資源浪費(fèi)。相反，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然黃色素基本安全無(wú)毒，具有十分廣闊的發(fā)展前景。

為提高紅曲黃色素生產(chǎn)水平，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的論文或?qū)＠P(guān)注的重點(diǎn)主要集中在高產(chǎn)紅曲菌種的誘變篩選方面，但收效不大。例如泰國(guó)Yongsmith的科研團(tuán)隊(duì)從20世紀(jì)90年代以來(lái)通過(guò)誘變選育到了單產(chǎn)黃色素的紅曲菌，應(yīng)用于液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素。該菌株生產(chǎn)的紅曲黃色素的最大吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)是370nm。但液態(tài)發(fā)酵法黃色素生產(chǎn)水平非常低，至今尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。該菌固態(tài)發(fā)酵12天生產(chǎn)的紅曲黃(米)色價(jià)達(dá)到2224.63U/gdw，雖然色素生產(chǎn)水平較高，但發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)周波等人通過(guò)誘變選育出了紅曲黃色素產(chǎn)生菌，該菌株生產(chǎn)的紅曲黃色素的最大吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)是410nm，液態(tài)發(fā)酵7天的發(fā)酵液黃色素色價(jià)值僅達(dá)110U/mL。以上幾例由于發(fā)酵色素濃度偏低，發(fā)酵時(shí)間偏長(zhǎng)，均不符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

本實(shí)驗(yàn)室在發(fā)明專利“一種偶聯(lián)原位萃取發(fā)酵紅曲黃色素的雙液相發(fā)酵方法”(專利號(hào)201410116854)中，通過(guò)設(shè)計(jì)合理的碳氮源組分、控制培養(yǎng)基中游離氨基酸的含量以及雙液相發(fā)酵體系，將合成的紅曲黃色素迅速富集到脂溶性溶劑中(所述脂溶性溶劑主要指甘油酯類物質(zhì))，從而大大提高紅曲黃色素的生產(chǎn)效率。但是在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)仍然有產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象，胞內(nèi)色素的分泌仍然會(huì)受到限制，因此有必要使得黃色素產(chǎn)量得以進(jìn)一步提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)紅曲黃色素的合成途徑仍然沒(méi)有得到深入的研究，采用普通的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分，很難達(dá)到高產(chǎn)紅曲黃色素的目的。在原位萃取發(fā)酵的基礎(chǔ)上，產(chǎn)物抑制得到一部分的解除，同時(shí)傳質(zhì)以及傳氧得以部分的提高，但是仍有進(jìn)一步提高紅曲黃色素產(chǎn)量的必要。本發(fā)明通過(guò)添加表面活性劑的方法，增大細(xì)胞膜的通透性，在解除底物抑制的同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)、氧傳遞系數(shù)。該方法操作簡(jiǎn)單，不增加額外的人工和設(shè)備，僅通過(guò)較低的附加投入，就可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成濃度，因而具有重大的經(jīng)濟(jì)效益。

本發(fā)明提供了一種促進(jìn)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的方法，所述方法是在紅曲菌的液態(tài)發(fā)酵初始或者發(fā)酵過(guò)程中加入表面活性劑。

在一種實(shí)施方式中，所述紅曲菌是能夠產(chǎn)紅曲黃色素的紅曲菌。

在一種實(shí)施方式中，所述表面活性劑為Span系列、Tween系列、Triton X-100、PEG系列或者皂角。所述表面活性劑有解除產(chǎn)物抑制以及提高溶氧的作用，可以大幅提高紅曲菌對(duì)黃色素的合成能力和產(chǎn)率。

在一種實(shí)施方式中，所述表面活性劑為Span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG中的任意一種。

在一種實(shí)施方式中，所述表面活性劑的添加量為0.1g/L-15g/L。

在一種實(shí)施方式中，所述表面活性劑的添加時(shí)機(jī)為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)開(kāi)始后0～96h內(nèi)。

在一種實(shí)施方式中，所述表面活性劑的添加時(shí)機(jī)為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)開(kāi)始后24～96h內(nèi)。

在一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)8d。

在一種實(shí)施方式中，所述方法是接種紅曲菌種子液于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵；在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)開(kāi)始后0～96h內(nèi)加入表面活性劑。

在一種實(shí)施方式中，所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是采用含有紅曲菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分的基本培養(yǎng)基。

在一種實(shí)施方式中，所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基是由水相和萃取相組成的雙液相萃取發(fā)酵體系，所述水相是含有紅曲菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分的基本培養(yǎng)基，所述萃取相含有甘油酯類物質(zhì)。

在一種實(shí)施方式中，所述基本培養(yǎng)基含有玉米淀粉20-80g/L，黃豆粉0.05-10g/L，硫酸銨3-10g/L，NaNO₃2-6g/L，酵母膏0.05-5g/L，玉米漿粉0.05-10g/L，硫酸鋅0.1-0.5g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/L。

在一種實(shí)施方式中，所述萃取相中的甘油酯類物質(zhì)作為萃取劑有提高溶氧的作用，可將附著在發(fā)酵液中及紅曲菌球表面的色素萃取富集到萃取劑相中，大幅度提高紅曲液態(tài)發(fā)酵合成黃色素產(chǎn)物的濃度和產(chǎn)率。

在一種實(shí)施方式中，所述甘油酯類物質(zhì)是甘油三酯類物質(zhì)，用量體積占基本培養(yǎng)基體積的10-40％。所述甘油三酯類物質(zhì)可以是三辛酸甘油酯、三異辛酸甘油酯、植物油或其混合物。

在一種實(shí)施方式中，所述萃取相為10份大豆油、8份玉米油、1份三辛酸甘油酯、0.3份二辛酸甘油酯、0.2份辛酸甘油酯的混合。

在一種實(shí)施方式中，所述甘油酯類物質(zhì)除甘油三酯類物質(zhì)，同時(shí)還包括甘油二酯類物質(zhì)、甘油單酯類物質(zhì)或其混合物。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明的提高紅曲黃色素產(chǎn)量的方法，經(jīng)濟(jì)高效，且不會(huì)改變色素的結(jié)構(gòu)，是一種理想的生產(chǎn)方法，在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中的可行性較高。

具體實(shí)施方案

黃色素色價(jià)的測(cè)定方法：

色價(jià)為色素濃度的一種表示方法，大小等于稀釋倍數(shù)與稀釋后的色素溶液在其吸收峰處對(duì)應(yīng)的OD值的乘積，單位為U/mL。

用無(wú)水乙醇對(duì)待測(cè)溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)(將OD值控制在0.2-0.8之間)，并以無(wú)水乙醇的吸光度為空白對(duì)照在200-600nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定400-440nm之間峰值的OD值。

黃色素色價(jià)＝OD_410nm×總稀釋倍數(shù)(U/mL)

實(shí)施例1：

選擇紫色紅曲菌sjs-6、CICC編號(hào)為40225、CICC編號(hào)為40937、CICC編號(hào)為5042的紫色紅曲菌，和CGMCC編號(hào)為3.4701、CGMCC編號(hào)為3.4652、CGMCC編號(hào)為3.465、CGMCC編號(hào)為3.4649的紅色紅曲菌為搖瓶菌種，其發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸銨4，硝酸鈉2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二鉀2，氯化鈣0.1；

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的紅曲菌液體種子以體積比10％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8d。結(jié)束后測(cè)得這八株菌sjs-6、CICC 40225、CICC 40937、CICC 5042、CGMCC 3.4701、CGMCC 3.4652、CGMCC 3.465、CGMCC 3.4649的紅曲黃色素的色價(jià)分別為50U/mL、32U/mL、26U/mL、24U/mL、42U/mL、28U/mL、36U/mL、37U/mL。

實(shí)施例2：

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的紅曲菌液體種子以體積比10％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，同時(shí)分別在發(fā)酵初始時(shí)添加1g/L的span-80、Tween-20、Triton X-100、PEG在轉(zhuǎn)速為180r/min，在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8d。結(jié)束后分別測(cè)得紅曲黃色素的色價(jià)，結(jié)果如表1所示。

表1不同表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)紅曲黃色素的影響

實(shí)施例3：

選擇紫色紅曲菌sjs-6、CICC編號(hào)為40225、CICC編號(hào)為40937、CICC編號(hào)為5042的紫色紅曲菌為搖瓶菌種，其發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉60，硫酸銨4，硝酸鈉2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二鉀2，氯化鈣0.1；

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的紅曲菌液體種子以體積比10％的接種量接入裝有50mL發(fā)酵基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，加入甘油脂類原位萃取相20mL(萃取相為10份大豆油、8份玉米油、1份三辛酸甘油酯、0.3份二辛酸甘油酯、0.2份辛酸甘油酯的混合)，在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度30℃條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)8d。結(jié)束后測(cè)得紅曲黃色素的色價(jià)210U/mL、160U/mL、180U/mL、110U/mL。

實(shí)施例4：