本發(fā)明涉及一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)及方法，屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，適合于要求高通量，在線檢測(cè)以及對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行完全定量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種非常重要的核酸分析方法，得益于能夠快速對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行富集，為下一步分析準(zhǔn)備，故其廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物研究領(lǐng)域，大大加快了生物基因組結(jié)構(gòu)研究進(jìn)程。傳統(tǒng)的PCR儀器由于液體體積量大，故需要循環(huán)復(fù)雜的加熱和冷卻循環(huán)，消耗大量能源，缺少實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)同時(shí)不能夠進(jìn)行絕對(duì)定量分析。數(shù)字PCR技術(shù)是近年快速發(fā)展的新型PCR技術(shù)，可進(jìn)行絕對(duì)定量的核酸檢測(cè)術(shù)?；驹硎峭ㄟ^將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至多包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其應(yīng)用領(lǐng)域包括：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。

基于這些優(yōu)勢(shì)液滴數(shù)字PCR被廣泛的應(yīng)用低模板濃度目標(biāo)分子的檢測(cè)?，F(xiàn)有基于液滴數(shù)字PCR設(shè)備通常將整個(gè)循環(huán)分為三個(gè)部分：液滴發(fā)生裝置(2)，熱循環(huán)控制器和液滴熒光檢測(cè)器，需要液滴在各個(gè)模塊中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在移動(dòng)和熱循環(huán)過程中容易造成液滴破碎以及液滴之間相互融合導(dǎo)致不均勻，并且極易造成試劑之間的交叉污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明技術(shù)解決問題：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)及方法，具有高度的一體化設(shè)計(jì)，集成承壓能力強(qiáng)的液滴發(fā)生裝置(2)以及采用剛性熱循環(huán)流道裝置，具有高導(dǎo)熱性的同時(shí)能夠有效的抑制液滴破碎與樣品之間的交叉污染。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)，包括：動(dòng)力裝置、液滴發(fā)生裝置、液滴PCR反應(yīng)模組、熒光檢測(cè)控制器、PC控制模塊；動(dòng)力裝置包括反應(yīng)試劑推進(jìn)器(6)及油相推進(jìn)器(7)；液滴PCR反應(yīng)模組(3)包括剛性熱循環(huán)模塊(8)和熱循環(huán)溫度控制模塊(15)；

試劑通過反應(yīng)試劑推進(jìn)器(6)以及油相推進(jìn)器(7)分三路推進(jìn)入液滴發(fā)生裝置(2)中，在液滴發(fā)生裝置(2)中產(chǎn)生大量油包反應(yīng)試劑納升級(jí)液滴，通過反應(yīng)試劑推進(jìn)器(6)以及油相推進(jìn)器(7)來調(diào)節(jié)液滴發(fā)成裝置(2)的進(jìn)出口流量，進(jìn)而形成對(duì)液滴生成以及液滴大小的控制；液滴發(fā)生裝置(2)的出口與剛性熱循環(huán)模塊(8)上的熱剛性流道(9)入口相連接，同時(shí)熱循環(huán)溫度控制模塊(15)對(duì)剛性流道(9)表面溫度進(jìn)行控制；液滴在剛性熱循環(huán)模塊(8)經(jīng)過熱循環(huán)后進(jìn)入熒光檢測(cè)控制器(4)，熒光檢測(cè)控制器(4)對(duì)已經(jīng)通過熱循環(huán)后的液滴進(jìn)行實(shí)時(shí)在線熒光檢測(cè)，同時(shí)PC控制模塊(5)對(duì)液滴熒光檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，整個(gè)系統(tǒng)形成以前端液滴生成，PCR反應(yīng)熱循環(huán)以及末端液滴熒光實(shí)時(shí)在線檢測(cè)的一體化設(shè)計(jì)。

上述的剛性熱循環(huán)模塊(8)主要由剛性流道(9)，剛性圓柱體(11)，圓柱形加熱裝置孔槽(12)以及熱電偶安置孔槽(13)，其中剛性流道(9)是一個(gè)呈8字形均勻的纏繞于具有兩個(gè)不同溫度區(qū)的剛性圓柱體(11)上，液滴在高導(dǎo)熱剛性流道(9)兩個(gè)溫度區(qū)間來回穩(wěn)定流動(dòng)，同時(shí)剛性圓柱體(11)中間部位有安置圓柱形加熱裝置的孔槽，剛性圓柱體(11)端部緊貼有一熱電偶傳感器用于檢測(cè)導(dǎo)熱部件溫度。

上述的熱循環(huán)溫度控制模塊(15)包括熱電偶傳感器(14)，PC客戶端軟件模塊(16)，單片機(jī)(17)，控制電路(18)，DC電源(19)以及安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器(20)。其中，熱電偶傳感器(14)與剛性熱循環(huán)模塊中的剛性圓柱體(11)熱接觸，實(shí)時(shí)返回溫度數(shù)據(jù)給安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器(20)，安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器通過TCP/IP接口(或者GPIB接口)將采集到的溫度數(shù)據(jù)上傳到PC端，被PC客戶端軟件模塊(16)收集處理，通過PID邏輯計(jì)算得出需要發(fā)送給單片機(jī)(17)的程控信號(hào)。PC客戶端軟件同時(shí)通過可編程儀器標(biāo)準(zhǔn)指令(SCPI)控制安捷倫儀器的數(shù)據(jù)采集參數(shù)(采樣時(shí)間，采樣模式，采樣開始和結(jié)束)。由PC客戶端軟件計(jì)算得到的控制信號(hào)經(jīng)由USB接口傳送到單片機(jī)(17)，單片機(jī)按照程控信號(hào)的指令調(diào)節(jié)PWM輸出口的占空比，從而控制晶體管(10)的開關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)DC電源(19)的輸出功率，而功率的改變引起剛性熱循環(huán)模塊的溫度變化，這樣完成一個(gè)溫度控制循環(huán)過程。

上述動(dòng)力裝置(1)包括反應(yīng)試劑推進(jìn)器(6)以及油相推進(jìn)器(7)。通過反應(yīng)試劑推進(jìn)器(6)以及油相推進(jìn)器(7)將試劑分三路推進(jìn)入液滴發(fā)生裝置(2)中，在液滴發(fā)生裝置中產(chǎn)生大量油包反應(yīng)試劑納升級(jí)液滴。通過反應(yīng)試劑推進(jìn)器(6)以及油相推進(jìn)器(7)來調(diào)節(jié)液滴發(fā)成裝置(2)的進(jìn)出口流量來影響流道內(nèi)壓力差，進(jìn)而形成對(duì)液滴生成以及液滴大小的控制。

上述熒光檢測(cè)控制器(4)組成部分包括改進(jìn)的進(jìn)樣針(24)，熒光檢測(cè)器(25)(guava easyCyte 5，Merck Millipore，美國)以及熒光數(shù)據(jù)收集分析軟件(26)。剛性流道(9)末端與改進(jìn)進(jìn)樣針(24)進(jìn)行對(duì)接，接入熒光檢測(cè)器，而后經(jīng)過數(shù)據(jù)收集分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

本發(fā)明的工作原理是：對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后，通過功率裝置以及液滴發(fā)生器生成部分包含樣品的液滴，通過熱循環(huán)控制裝置，使得包含樣品液滴性狀改變，從而改變被測(cè)樣本的受激發(fā)光的強(qiáng)度，通過末端光學(xué)部件對(duì)包含樣品液滴進(jìn)行激發(fā)后，計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度，并經(jīng)過一定的數(shù)據(jù)處理獲取最終獲取樣品具有的生物信息如附圖6所示。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果如下：

(1)本發(fā)明與現(xiàn)有數(shù)字PCR儀器的主要區(qū)別在于整個(gè)系統(tǒng)形成以前端液滴生成，PCR反應(yīng)熱循環(huán)以及末端液滴熒光實(shí)時(shí)在線檢測(cè)的一體化設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增與檢測(cè)一步操作，能夠有效減小現(xiàn)有分體式多步驟操作帶來樣品污染以及液滴融合等問題。

(2)本發(fā)明采用了剛性管道，得益于剛性流道為具有非彈性壁面能夠有效抑制液滴在熱循環(huán)運(yùn)輸過程，由于管道變形導(dǎo)致管內(nèi)水利條件變化而造成液滴破裂與融合。同時(shí)由于具有高熱傳導(dǎo)系數(shù)(16W/M-K.20℃下測(cè)量)，相比于常規(guī)采用的聚四氟乙烯管(0.27W/M-K.20℃下測(cè)量)導(dǎo)熱效率有很大的提升。

(3)本發(fā)明采用了末端熒光檢測(cè)，在傳統(tǒng)離線的檢測(cè)有三點(diǎn)缺陷；由于含有目標(biāo)模板的液滴其密度比作為連續(xù)相的礦物油的密度要大很多，隨著檢測(cè)時(shí)間的推移，液滴就會(huì)順著重力的方向往下沉，這樣經(jīng)過一定時(shí)間后，液滴將完全沉積在檢測(cè)管底端；傳統(tǒng)熒光檢測(cè)儀器中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)置中，為保護(hù)進(jìn)樣針，特意讓進(jìn)樣針針端與樣品管底端之間保留了一段距離，以免其不小心觸碰到管底，造成損傷。在這種情況下，當(dāng)檢測(cè)進(jìn)行到一定時(shí)間后，流式細(xì)胞儀便會(huì)因?yàn)檫M(jìn)樣針抽取不到沉降在樣品管底部大量的液滴而導(dǎo)致無法正常檢測(cè)出熒光信號(hào)；由于采用油包試劑模式，故在一定時(shí)間內(nèi)液滴收集的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)比油的體積小的多，所以單個(gè)樣品管內(nèi)能收集到的液滴十分有限，這樣就需要連續(xù)收集多管，就會(huì)造成實(shí)驗(yàn)效率降低。本發(fā)明得益于進(jìn)樣針的改造，用內(nèi)徑為200um的玻璃毛細(xì)管替代流式細(xì)胞儀自帶的進(jìn)樣針，新進(jìn)樣針能直接與擴(kuò)增系統(tǒng)相連，使得儀器能對(duì)微液滴進(jìn)行實(shí)時(shí)，連續(xù)，高通量，檢測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)流程圖；

圖2為圖1中生成液滴裝置示意圖；

圖3為圖1中剛性通道具體纏繞結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明采用的熒光檢測(cè)改進(jìn)后進(jìn)樣針；

圖5為本發(fā)明采用的熱循環(huán)溫度控制方式；

圖6是一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR熒光檢測(cè)結(jié)果圖，其中左圖表示液滴大小與負(fù)責(zé)度分布情況，右圖表示左圖選中區(qū)域(R1)中液滴時(shí)實(shí)熒光檢測(cè)分布情況。

具體實(shí)施方式

如圖1所示，本發(fā)明包括動(dòng)力裝置1、液滴發(fā)生裝置2、液滴PCR反應(yīng)模組3、熒光檢測(cè)控制器4和PC控制模塊5。在該實(shí)例中，采用添加EM90的礦物油作連續(xù)相流體，含有目標(biāo)DNA模板的樣品則作分散相流體，以此來產(chǎn)生含有模板分子的單分散液滴。其中，礦物油內(nèi)所含的EM90體積分?jǐn)?shù)為2％，含有DNA模板的樣品具體配比如下：每1mL PCR Mix反應(yīng)試劑中含873μLddH2O、100μL 10*Buffer、20μL dNTP Mix、0.9μL Lib5S1、0.9μL Lib3A2以及5μL Pfu酶5U/mL，待上述配比完成后，再向其中加入4％的EvaGreen染料,該染料能與特定模板結(jié)合后，受特定波長的光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生熒光，其熒光強(qiáng)度可用于表征本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率。通過反應(yīng)試劑推進(jìn)器6以及油相推進(jìn)器7將試劑分三路推進(jìn)入液滴發(fā)生裝置2中，在液滴發(fā)生裝置中產(chǎn)生大量油包反應(yīng)試劑納升級(jí)液滴；液滴發(fā)生裝置2出口與剛性熱循環(huán)模塊8上的剛性流道9入口相連接，同時(shí)熱循環(huán)溫度控制模塊15對(duì)剛性流道9溫度進(jìn)行控制；液滴在剛性熱循環(huán)模塊8經(jīng)過熱循環(huán)后進(jìn)入熒光檢測(cè)控制器4，熒光檢測(cè)控制器對(duì)已經(jīng)通過熱循環(huán)后的液滴進(jìn)行實(shí)時(shí)在線熒光檢測(cè)，同時(shí)PC控制模塊5對(duì)液滴熒光檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。整個(gè)系統(tǒng)形成以前端液滴生成，PCR反應(yīng)熱循環(huán)以及末端液滴熒光實(shí)時(shí)在線檢測(cè)的一體化設(shè)計(jì)。

如圖2所示為液滴發(fā)生裝置2，包括擰緊螺母21，液滴發(fā)生裝置主體22以及適配器23。動(dòng)力裝置1將包含樣品的試劑推入液滴發(fā)生裝置2其中一個(gè)入口，同時(shí)將油相推入與反應(yīng)試劑入口互相垂直的兩個(gè)入口，由于流體剪切力的作用后而生成大量油包反應(yīng)試劑納升級(jí)液滴。動(dòng)力裝置1是通過毛細(xì)玻璃管27將試劑推進(jìn)到液滴發(fā)生裝置中。在準(zhǔn)備連接用的毛細(xì)管時(shí)，應(yīng)該使用專業(yè)的切割工具毛細(xì)管環(huán)形刀來裁剪，以此確保斷面的平整性，避免出現(xiàn)玻璃破碎剝落，堵塞接頭的現(xiàn)象。此外，對(duì)裁剪完的玻璃毛細(xì)管需進(jìn)行顯微鏡觀察，如發(fā)現(xiàn)有不平整之處，便可使用陶瓷片將切口輕輕磨平。由于該種液滴發(fā)生裝置2的組裝和拆卸都非常方便，于是在實(shí)驗(yàn)正式開始前的準(zhǔn)備過程中，通常將還未組裝好的接頭部件先直接放入超聲清洗器中清洗一遍，之后向接頭內(nèi)部通入酒精再次清洗，最后用氮?dú)膺M(jìn)行吹干。在裝配時(shí)將毛細(xì)玻璃管伸入適配器23中，再采用擰緊螺母21將其擰緊在液滴發(fā)生裝置主體22上。液滴發(fā)生裝置2安裝完成后，開啟反應(yīng)試劑推進(jìn)器6以及油相推進(jìn)器7將試劑推入液滴發(fā)生裝置2中，通過調(diào)整推進(jìn)器流量來控制液滴發(fā)生裝置所生成液滴大小。

如圖3所示為剛性流道9具體纏繞結(jié)構(gòu)示意圖。剛性熱循環(huán)模塊8主要由剛性流道9，剛性圓柱體11，圓柱形加熱裝置孔槽12以及熱電偶安置孔槽13組成，其中剛性流道9是一個(gè)呈8字形均勻的纏繞于兩個(gè)不同溫度的剛性圓柱體11上，液滴在剛性流道9中沿著兩個(gè)不同溫度區(qū)的剛性圓柱體11來回穩(wěn)定流動(dòng)，同時(shí)剛性圓柱體11中間部位有安置圓柱形加熱裝置的孔槽，同時(shí)熱電偶安置孔槽13內(nèi)安放熱電偶傳感器14與剛性熱循環(huán)模塊中的剛性圓柱體11進(jìn)行熱接觸，實(shí)時(shí)返回溫度數(shù)據(jù)。

剛性流道9為高導(dǎo)熱剛性流道，采用的是304不銹鋼毛細(xì)管，管壁厚0.1mm，管內(nèi)徑0.35mm，其導(dǎo)熱系數(shù)為16W/M-K(20℃下測(cè)量)，相比于常規(guī)采用同樣管徑的聚四氟乙烯管0.27W/M-K(20℃下測(cè)量)導(dǎo)熱效率有極大的提升。

如圖4所示為本發(fā)明采用的熒光檢測(cè)改進(jìn)后進(jìn)樣針24，其中包括處理后的玻璃毛細(xì)管28，為進(jìn)樣針主體29。采用的玻璃毛細(xì)管的內(nèi)徑為200um，外徑為360um。將玻璃毛細(xì)管作為檢測(cè)窗口部分放置在溫度為200度濃硫酸中經(jīng)過一小時(shí)后去除表面涂層替代流式細(xì)胞儀自帶的進(jìn)樣針，其中在玻璃毛細(xì)管中間部分去除表面涂層的部分作為檢測(cè)窗口。新進(jìn)樣針能直接與剛性流道9末端相連后液滴經(jīng)過熒光檢測(cè)控制器4檢測(cè)窗口，實(shí)現(xiàn)對(duì)微液滴進(jìn)行在線實(shí)時(shí)、連續(xù)檢測(cè)。

如圖5所示為本發(fā)明采用的熱循環(huán)溫度控制方式，主要熱電偶傳感器14，PC客戶端軟件模塊16，單片機(jī)17，DC電源19以及安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器20。其中，熱電偶傳感器14與剛性熱循環(huán)模塊中的剛性圓柱體3-2熱接觸，實(shí)時(shí)返回溫度數(shù)據(jù)給安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器20，安捷倫數(shù)據(jù)采集儀器通過TCP/IP接口或者GPIB接口將采集到的溫度數(shù)據(jù)上傳到PC端，被PC客戶端軟件模塊16收集處理，通過PID邏輯計(jì)算得出需要發(fā)送給單片機(jī)17的程控信號(hào)。PC客戶端軟件同時(shí)通過可編程儀器標(biāo)準(zhǔn)指令SCPI控制安捷倫儀器的數(shù)據(jù)采集參數(shù)采樣時(shí)間，采樣模式，采樣開始和結(jié)束。由PC客戶端軟件計(jì)算得到的控制信號(hào)經(jīng)由USB接口傳送到單片機(jī)17，單片機(jī)按照程控信號(hào)的指令調(diào)節(jié)PWM輸出口的占空比，從而控制晶體管10的開關(guān)，進(jìn)而調(diào)節(jié)DC電源19的輸出功率。而功率的改變勢(shì)必改變剛性熱循環(huán)模塊的溫度，這樣完成一個(gè)溫度控制循環(huán)過程。

如圖6所示是一體式剛性流道液滴數(shù)字PCR結(jié)合實(shí)例得到的熒光檢測(cè)結(jié)果圖。由于熒光檢測(cè)控制器4采用的是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量，通常用兩種散射方向的散射光進(jìn)行測(cè)量：前向角散射FSC和側(cè)向散射SSC。前向角散射光FSC的強(qiáng)度與顆粒的大小有關(guān)，對(duì)于同種顆粒群體，前向角散射光強(qiáng)隨顆粒截面積的增大而增大；對(duì)于球形顆粒，則在小立體角范圍內(nèi)前向角散射光強(qiáng)基本上和顆粒截面積的大小成線性關(guān)系。而側(cè)向散射光SSC的測(cè)量主要是用來獲取關(guān)于顆粒內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的信息。因此，在本實(shí)驗(yàn)中液滴熒光檢測(cè)結(jié)果中，前向散射光FSC的測(cè)量值反映的便是液滴的大小，而側(cè)向散射光SSC的測(cè)量值反映的則是液滴的內(nèi)部結(jié)構(gòu)?；谠谥暗臉悠放渲浦?，使用的熒光染色劑Evagreen染料，其與特定模板結(jié)合后，受到激光的激發(fā)便會(huì)發(fā)出綠色的熒光，故在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只需測(cè)定綠色熒光的值便可判定實(shí)驗(yàn)效果。隨著液滴連續(xù)不斷地經(jīng)過進(jìn)樣針24進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)，可以從PC控制模塊5上得到圖6所示的檢測(cè)結(jié)果，其圖6左圖橫坐標(biāo)FSC值反映液滴大小均穩(wěn)定在15000FSC-HLin，即說明液滴尺寸基本保持不變，整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到驗(yàn)證。隨著檢測(cè)時(shí)間的推移，液滴熒光值基本保持不變，其中含有模板分子的液滴被準(zhǔn)確識(shí)別出來，其熒光值保持在1400GRN-HLog，而不含有模板分子液滴的熒光值保持在450GRN-HLog。這就表明：在兩溫度段的循環(huán)擴(kuò)增系統(tǒng)內(nèi)，包裹在液滴中的目標(biāo)DNA分子確實(shí)進(jìn)行了穩(wěn)定有效的擴(kuò)增，即擴(kuò)增系統(tǒng)的有效性得到了驗(yàn)證。

提供以上實(shí)施案例僅僅是為了描述本發(fā)明的目的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。不脫離本發(fā)明的精神和原理而做出的各種等同替換和修改，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。