本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種重組腺病毒，具體涉及重組腺病毒在抗腫瘤方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

ASPP2(apoptosis stimulating protein of p53 2)，又被稱為53BP2L，是p53結(jié)合蛋白家族的一個促凋亡成員。ASPP2蛋白全長含有1128個氨基酸，包含了多個結(jié)構(gòu)和功能區(qū)：N端具有β-Grasp泛素樣折疊和α螺旋結(jié)構(gòu)域，中間部分是脯氨酸富含區(qū)，C末端部分是Ank-SH3結(jié)構(gòu)域，包含4個Ankyrin重復序列和1個SH3結(jié)構(gòu)域(Src同源3結(jié)構(gòu)域)。ASPP2的不同結(jié)構(gòu)域都有相互作用蛋白，其中C末端介導了P53、Bcl-2等大部分的蛋白間相互作用。ASPP2最被熟知的功能即調(diào)節(jié)p53及其家族成員(p63和p73)的促凋亡能力。ASPP2增強p53家族成員的活力并特異性促進促凋亡靶基因而不是細胞周期抑制基因的表達。體外研究證實ASPP2通過p53或非P53介導通路抑制細胞生長，促進細胞凋亡,ASPP2能夠以p53依賴和非依賴途徑，增強藥物促凋亡和治療的敏感性，說明ASPP2可以通過促進藥物誘導的凋亡作用來抑制腫瘤。動物實驗發(fā)現(xiàn)ASPP2等位基因敲除小鼠模型易于造成自發(fā)腫瘤和γ射線誘導腫瘤的形成，ASPP2限制癌基因Ras的入侵前特性并抑制體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。臨床研究顯示ASPP2在人類癌癥組織中常常表達下調(diào)，這種表達受抑與腫瘤的發(fā)生進展以及不良預后密切相關(guān)。提示ASPP2是一個腫瘤抑制基因，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用，可能是腫瘤治療的重要靶點，也可能是基因治療的重要切入點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種ASPP2重組腺病毒，所述重組腺病毒包含ASPP2全長基因序列。本發(fā)明所述的重組腺病毒，其制備方法如下：

步驟1、將ASPP2基因與穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)相連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ASPP2；

步驟2、再將重組穿梭質(zhì)粒線性化后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組，構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-ASPP2；

步驟3、將重組腺病毒載體Ad-ASPP2在293T細胞中擴增，經(jīng)過提取分離純化得到。

以下具體說明本發(fā)明腺病毒的制備方法：

材料來源

Pcr3.1-ASPP2質(zhì)粒由北京市肝病研究所構(gòu)建；大腸桿菌BJ5183、穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1購自Strategene公司。293細胞購構(gòu)自ATCC。

制備方法及結(jié)果

1 構(gòu)建重組重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ASPP2

Pcr3.1-ASPP2質(zhì)粒經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切出Kb的目的基因，瓊脂糖凝膠電泳，glassmilk法凝膠回收目的片段，亞克隆至經(jīng)同樣酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，形成pAdTrack-CMV-ASPP2。

2 細菌內(nèi)同源重組構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-ASPP2

pAdTrack-CMV-ASPP2用PmeI線性化后，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收目的片段，用牛小腸堿性酶去磷酸化，乙醇沉淀備用。制備BJ5183點穿孔菌，pAdTrack-CMV-ASPP2和pAdEasy-1質(zhì)粒電穿孔(電穿孔條件：2500V，280Ω，200μF)法共轉(zhuǎn)染，電穿孔后取適量的細胞在50mg/L卡那霉素的培養(yǎng)板中，在37℃培養(yǎng)16-20h，挑取克隆，抽提的質(zhì)粒即為重組病毒質(zhì)粒Ad-ASPP2。

3 Ad-ASPP2擴增、純化

用重組腺病毒Ad-ASPP2感染293細胞，在48-72h左右出現(xiàn)CPE效應(yīng)后收集細胞。細胞反復凍融裂解細胞，12000rpm離心，小心取上清，裝入超速離心管，取1.25g/mlCsCl溶液，緩慢注入超速離心管底，65000rpm離心3h。在病毒帶處收集液體，將液體加入超速濃縮離心管中，并加入等體積的2×病毒緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0,100mM NaCl),5000rpm離心2次，收集病毒。

4 Ad-ASPP2鑒定

提取病毒基因組DNA，對重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)基因E2B和目的基因ASPP2進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分子量鑒定。E2B區(qū)引物序列為：上游引物5’-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3’，下游引物5’-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3’；擴增片段大小為880bp；擴增條件為：94℃變性5min；94℃變性20s，55℃復性30s，72℃延伸1min，共40個循環(huán)；72℃延伸5min。ASPP2的引物序列為：上游引物

5’-AGCTGCCATGGAGACCATCT-3’，下游引物5’-ACTGTTCTCCGTACTGGCAC-3’；擴增片段大小為220bp；擴增條件為：95℃變性3min；94℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸1min，共3個循環(huán)；94℃變性30s，55℃復性45s，72℃延伸45s，共27個循環(huán)；72℃延伸5min。

本發(fā)明還包括含有本發(fā)明所述的重組腺病毒的藥物制劑。所述的藥物制劑，其中還含有藥學上可接受的載體，所述制劑優(yōu)選為注射劑。

本發(fā)明還包括，本發(fā)明的重組腺病毒在制備抗腫瘤的基因藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述腫瘤包括:肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、皮膚癌、宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、白血病、淋巴癌、鼻咽癌等。特別是，本發(fā)明的ASPP2重組腺病毒在治療肝癌方面具有非常好的效果，尤其對P53突變和P53野生肝癌效果好。

本發(fā)明所述腺病毒可以高效感染肝癌細胞，體外抑制肝癌細胞增殖，體內(nèi)瘤體內(nèi)直接注射抑制肝癌組織生長并具有協(xié)同P53、奧沙利鉑和索拉菲尼的作用。

本發(fā)明所述的重組腺病毒的抗腫瘤活性，所采用的腫瘤細胞為人肝癌hepG2,Huh7,Hep3B細胞株。

以下通過實驗數(shù)據(jù)進一步說明本發(fā)明腺病毒的抗腫瘤活性：

一、Ad-ASPP2體外對肝癌細胞的抑制作用

1 Ad-ASPP2體外對肝癌細胞的抑制作用

MTT法結(jié)果顯示：與陰性對照相比，Ad-ASPP2在不同時間段(24-72h)都存在不同程度的生長抑制作用。當Ad-ASPP2在1×10⁸pfu/mL滴度下作用Huh7細胞72h時的生長抑制率為61.69％；當Ad-ASPP2在5×10⁷pfu/mL滴度下作用HepG2細胞72h時的生長抑制率為50.5％；當Ad-ASPP2在1×10⁸pfu/mL滴度下作用Hep3B細胞72h時的生長抑制率為73.06％，說明Ad-ASPP2對肝癌HepG2、Huh7和Hep3B細胞都具有明顯的生長抑制作用。

平板克隆形成能力方面：與陰性對照相比180.33±30.00，Ad-ASPP2可以明顯抑制HepG2細胞形成的細胞克隆數(shù)95.66±11.59。

2 Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對肝癌細胞的抑制作用

Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-p53作用時，三種細胞表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。

HepG2和Huh7細胞:在作用48-72h，Ad-ASPP2對細胞抑制作用大于Ad-p53，二者具有協(xié)同抑制細胞生長的作用。說明Ad-ASPP2對于P53野生和突變的細胞作用大于Ad-p53。

Hep3B細胞：Ad-ASPP2對細胞抑制作用小于Ad-p53，二者協(xié)同抑制細胞生長的作用不顯著。說明Ad-ASPP2對于P53缺失的細胞作用不明顯。

3 Ad-ASPP2體外聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細胞的抑制作用

HepG2和Hep3B細胞：索拉菲尼能夠以劑量依賴性方式抑制HepG2和Hep3B細胞的增殖。我們在不同濃度梯的索拉菲尼作用下時給予滴為1×10⁷pfu/mL的ASPP-rAd干預，MTT實驗結(jié)果顯示，ASPP2-rAd可以促進索拉菲尼在1.56μM、3.12μM和6.25μM三個濃度下對HepG2細胞的增殖抑制作用。

3 Ad-ASPP2體外聯(lián)合奧沙利鉑對肝癌細胞的抑制作用

HepG2和Hep3B細胞：Ad-ASPP2(1.25×10⁸,6.125×10⁷pfu/mL)可以增強奧沙利鉑(10，20μg/ml)的對肝癌細胞的抑制作用oxa1:20μg/ml；oxa2:10μg/ml；ASPP2-1:1.25×10⁸pfu/ml Ad-ASPP2；ASPP2-2:6.125×10⁷pfu/ml Ad-ASPP2.

二、Ad-ASPP2體內(nèi)對肝癌移植瘤的抑制作用

1 單純Ad-ASPP2肝癌移植瘤的抑制作用

Ad-ASPP2(1×10⁸pfu/次)可以明顯抑制HepG2(p53野生型)移植瘤和Huh7(p53突變型)移植瘤的生長，相對腫瘤增殖率(T/C％)分別為37.27％和53.77％(評判標準T/C<60％)，說明對具有明顯的體內(nèi)抑制肝癌移植瘤的作用。HepG2^p53-/-和Hep3B(p53缺失型)的移植瘤具有一定的移植趨勢。

2 Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對肝癌移植瘤的抑制作用

對于HepG2和Huh7肝癌移植瘤，Ad-ASPP2的抑制作用大于Ad-P53；但Ad-ASPP2和Ad-P53協(xié)同作用不顯著。

3 Ad-ASPP2聯(lián)合索拉菲尼對肝癌移植瘤的抑制作用

Ad-ASPP2和索拉菲尼單獨對hepG2^p53-/-移植瘤抑制作用不顯著，但二者聯(lián)合對hepG2^p53-/-移植瘤的抑制作用顯著。

4 Ad-ASPP2聯(lián)合奧沙利鉑對肝癌移植瘤的抑制作用

Ad-ASPP2和奧沙利鉑單獨對hep3B移植瘤抑制作用不顯著，但二者聯(lián)合對hep3B移植瘤的抑制作用顯著。

本發(fā)明和現(xiàn)有同類重組腺病毒相比，具有以下優(yōu)越性：

制備方法采用Pcr3.1-ASPP2質(zhì)粒，表達率高于現(xiàn)有技術(shù)15％。

具有優(yōu)良的抗肝癌的作用。

具有優(yōu)良的抗肝癌轉(zhuǎn)移癌的作用。

對其他腫瘤的作用均遜于上述本發(fā)明實驗的瘤株。如對肺癌效果不佳，對胃癌效果不佳，對乳腺癌效果不佳。

【附圖說明】

圖1，ASPP2和E2B基因的PCR產(chǎn)物圖：其中，1-3為ASPP2的基因擴增產(chǎn)物，1:陰性對照；2:293T細胞；3:純化后的Ad-ASPP2，4-6為E2B的基因擴增產(chǎn)物,4:293T細胞；5:純化后的Ad-ASPP2；6:陰性對照；M:DNA marker 2000。

圖2A，Ad-ASPP2體外對肝癌細胞Huh7的抑制作用，

圖2B，Ad-ASPP2體外對肝癌細胞hepG2的抑制作用，

圖2C，Ad-ASPP2體外對肝癌細胞Hep3B的抑制作用，

與陰性對照相比180.33±30.00，Ad-ASPP2可以明顯抑制HepG2細胞形成的細胞克隆數(shù)95.66±11.59。

圖3A，Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對HepG2細胞相對生存率影響

圖3B，Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對HepG2細胞生長狀態(tài)影響(白光，40倍)圖3C，Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對Huh7細胞相對生存率影響

圖3D，Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對Huh7細胞生長狀態(tài)影響(白光，40倍)

圖3E，Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對Hep3B細胞相對生存率影響

圖3F,Ad-ASPP2體外聯(lián)合Ad-p53對Hep3B細胞生長狀態(tài)影響(白光，40倍)活細胞百分率(Cell survival rate,％)＝處理組OD值/對照組OD值×100％。

圖4A，Ad-ASPP2體外聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細胞hepG2的抑制作用

圖4B，Ad-ASPP2體外聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細胞Hep3B的抑制作用

圖5A，Ad-ASPP2體外聯(lián)合奧沙利鉑對肝癌細胞hepG2的抑制作用(24H)

圖5B，Ad-ASPP2體外聯(lián)合奧沙利鉑對肝癌細胞hepG2的抑制作用(48H)

圖5C，Ad-ASPP2體外聯(lián)合奧沙利鉑對肝癌細胞Hep3B的抑制作用(24H)

圖5D，Ad-ASPP2體外聯(lián)合奧沙利鉑對肝癌細胞Hep3B的抑制作用(48H)

其中，oxa1:20μg/ml；oxa2:10μg/ml；ASPP2-1:1.25×10⁸pfu/ml Ad-ASPP2；ASPP2-2:6.125×10⁷pfu/ml Ad-ASPP2.

圖6A，Ad-ASPP2對HepG2皮下移植瘤的抑制作用

圖6B，Ad-ASPP2對Huh7皮下移植瘤的抑制作用

圖6C，Ad-ASPP2對HepG2^p53-/-皮下移植瘤的抑制作用

圖6D，Ad-ASPP2對Hep3B皮下移植瘤的抑制作用

圖7A，Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對HepG2皮下移植瘤相對腫瘤體積的影響

圖7B，Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對HepG2皮下移植瘤裸鼠體重的影響

圖7C活體成像法觀測Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對HepG2皮下移植瘤的影響

圖7D，Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對HepG2移植瘤的相對腫瘤增殖率的影響

圖8A，Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對Huh7皮下移植瘤相對腫瘤體積的影響

圖8B，Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對Huh7皮下移植瘤裸鼠體重的影響

圖8C，活體成像法觀測Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對Huh7皮下移植瘤的影響

圖8D，Ad-ASPP2聯(lián)合Ad-P53對Huh7移植瘤的相對腫瘤增殖率的影響

圖9A，Ad-ASPP2聯(lián)合索拉菲尼對HepG2^p53-/-皮下移植瘤相對腫瘤體積的影響

圖9B，Ad-ASPP2聯(lián)合索拉菲尼對HepG2^p53-/-皮下移植瘤裸鼠體重的影響

圖9C，活體成像法觀測Ad-ASPP2聯(lián)合索拉菲尼對HepG2^p53-/-皮下移植瘤的影響

圖9D，Ad-ASPP2聯(lián)合索拉菲尼對HepG2^p53-/-皮下移植瘤總光密度的影響

圖10A，大體觀測Ad-ASPP2聯(lián)合奧沙利鉑對Hep3B皮下移植瘤的影響

圖10B，小動物B超觀測Ad-ASPP2聯(lián)合奧沙利鉑對Hep3B皮下移植瘤內(nèi)部血供的影響

圖10C，Ad-ASPP2聯(lián)合奧沙利鉑對Hep3B皮下移植瘤裸鼠體重的影響

圖10D，Ad-ASPP2聯(lián)合奧沙利鉑對Hep3B皮下移植瘤相對腫瘤體積的影響

【具體實施方式】

以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明

實施例1

制備方法詳述

本發(fā)明腺病毒的制備方法，原材料來源，產(chǎn)物的鑒定等內(nèi)容：

材料來源

Pcr3.1-ASPP2質(zhì)粒由北京市肝病研究所構(gòu)建；大腸桿菌BJ5183、穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1購自Strategene公司。293細胞購構(gòu)自ATCC。

制備方法及結(jié)果

1 構(gòu)建重組重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ASPP2

Pcr3.1-ASPP2質(zhì)粒經(jīng)KpnI和XbaI雙酶切出Kb的目的基因，瓊脂糖凝膠電泳，glassmilk法凝膠回收目的片段，亞克隆至經(jīng)同樣酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，形成pAdTrack-CMV-ASPP2。

2 細菌內(nèi)同源重組構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-ASPP2

pAdTrack-CMV-ASPP2用PmeI線性化后，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收目的片段，用牛小腸堿性酶去磷酸化，乙醇沉淀備用。制備BJ5183點穿孔菌，pAdTrack-CMV-ASPP2和pAdEasy-1質(zhì)粒電穿孔(電穿孔條件：2500V，280Ω，200μF)法共轉(zhuǎn)染，電穿孔后取適量的細胞在50mg/L卡那霉素的培養(yǎng)板中，在37℃培養(yǎng)16-20h，挑取克隆，抽提的質(zhì)粒即為重組病毒質(zhì)粒Ad-ASPP2。

3 Ad-ASPP2擴增、純化

用重組腺病毒Ad-ASPP2感染293細胞，在48-72h左右出現(xiàn)CPE效應(yīng)后收集細胞。細胞反復凍融裂解細胞，12000rpm離心，小心取上清，裝入超速離心管，取1.25g/mlCsCl溶液，緩慢注入超速離心管底，65000rpm離心3h。在病毒帶處收集液體，將液體加入超速濃縮離心管中，并加入等體積的2×病毒緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0,100mM NaCl),5000rpm離心2次，收集病毒。

4 Ad-ASPP2鑒定

提取病毒基因組DNA，對重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)基因E2B和目的基因ASPP2進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分子量鑒定。E2B區(qū)引物序列為：上游引物5’-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3’，下游引物5’-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3’；擴增片段大小為880bp；擴增條件為：94℃變性5min；94℃變性20s，55℃復性30s，72℃延伸1min，共40個循環(huán)；72℃延伸5min。ASPP2的引物序列為：上游引物

5’-AGCTGCCATGGAGACCATCT-3’，下游引物5’-ACTGTTCTCCGTACTGGCAC-3’；擴增片段大小為220bp；擴增條件為：95℃變性3min；94℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸1min，共3個循環(huán)；94℃變性30s，55℃復性45s，72℃延伸45s，共27個循環(huán)；72℃延伸5min。

本發(fā)明所述ASPP2是已知產(chǎn)物，其蛋白序列如下：

MMPMFLTVYLSNNEQHFTEVPVTPETICRDVVDLCKEPGESDCH

LAEVWCGSERPVADNERMFDVLQRFGSQRNEVRFFLRHERPPGRDIVSGPRSQDPSLKRNGVKVPGEYRRKENGVNSPRMDLTLAELQEMASRQQQQIEAQQQLLATKEQRLKFLKQQDQRQQQQVAEQEKLKRLKEIAENQEAKLKKVRALKGHVEQKRLSNGKLVEEIEQMNNLFQQKQRELVLAVSKVEELTRQLEMLKNGRIDSHHDNQSAVAELDRLYKELQLRNKLNQEQNAKLQQQRECLNKRNSEVAVMDKRVNELRDRLWKKKAALQQKENLPVSSDGNLPQQAASAPSRVAAVGPYIQSSTMPRMPSRPELLVKPALPDGSLVIQASEGPMKIQTLPNMRSGAASQTKGSKIHPVGPDWSPSNADLFPSQGSASVPQSTGNALDQVDDGEVPLREKEKKVRPFSMFDAVDQSNAPPSFGTLRKNQSSEDILRDAQVANKNVAKVPPPVPTKPKQINLPYFGQTNQPPSDIKPDGSSQQLSTVVPSMGTKPKPAGQQPRVLLSPSIPSVGQDQTLSPGSKQESPPAAAVRPFTPQPSKDTLLPPFRKPQTVAASSIYSMYTQQQAPGKNFQQAVQSALTKTHTRGPHFSSVYGKPVIAAAQNQQQHPENIYSNSQGKPGSPEPETEPVSSVQENHENERIPRPLSPTKLLPFLSNPYRNQSDADLEALRKKLSNAPRPLKKRSSITEPEGPNGPNIQKLLYQRTTIAAMETISVPSYPSKSASVTASSESPVEIQNPYLHVEPEKEVVSLVPESLSPEDVGNASTENSDMPAPSPGLDYEPEGVPDNSPNLQNNPEEPNPEAPHVLDVYLEEYPPYPPPPYPSGEPEGPGEDSVSMRPPEITGQVSLPPGKRTNLRKTGSERIAHGMRVKFNPLALLLDSSLEGEFDLVQRIIYEVDDPSLPNDEGITALHNAVCAGHTEIVKFLVQFGVNVNAADSDGWTPLHCAASCNNVQVCKFLVESGAAVFAMTYSDMQTAADKCEEMEEGYTQCSQFLYGVQEKMGIMNKGVIYALWDYEPQNDDELPMKEGDCMTIIHREDEDEIEWWWARLNDKEGYVPRNLLGLYPRIKPRQRSLA"

編碼ASPP2蛋白的基因也是已知序列，序列如下：