本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種深層液體發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶酶制劑的方法。

背景技術(shù)：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，god)系統(tǒng)名為β-d-葡萄糖氧化還原酶(ec1.1.3.4)。它能專一地將β-d-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫。該酶是一種用途廣泛的食品添加劑，可以用于除去食品中的葡萄糖，從而防止食品發(fā)生褐變或獲得純度較高的低聚糖；利用葡萄糖氧化酶氧化蛋白質(zhì)的巰基產(chǎn)生的二硫鍵來改善面團(tuán)的烘焙性質(zhì)，替代溴酸鉀，用作一種更為安全的面粉改良劑；葡萄糖氧化酶因能去除食品包裝中少量殘留氧而使食品保質(zhì)期延長(zhǎng)，改善食品風(fēng)味，如去除啤酒中溶解氧及瓶頸氧，從而防止啤酒老化,保持啤酒原有風(fēng)味,延長(zhǎng)保質(zhì)期。在制藥行業(yè)中可以用于制作血糖和尿糖試紙，用于快速檢測(cè)葡萄糖的含量；在發(fā)酵工業(yè)中，葡萄糖氧化酶的催化產(chǎn)物為葡萄糖酸，可用于生產(chǎn)葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅等。另外，紡織業(yè)中還利用葡萄糖氧化酶生成的過氧化氫進(jìn)行漂白。目前，葡萄糖氧化酶的制備方法中以微生物發(fā)酵法使用最為廣泛。

天然god熱穩(wěn)定性較差，在加工和使用過程中容易受熱失活。如何有效地解決god在高溫工藝條件下酶活力的穩(wěn)定問題，如何使含god的產(chǎn)品在生產(chǎn)工藝流程中不用顧忌高溫是高效利用god的關(guān)鍵。利用生物工程生產(chǎn)新一代高穩(wěn)定性、高耐熱性的god是當(dāng)前god開發(fā)最重要的途徑。現(xiàn)有的葡萄糖氧化酶的制備方法生產(chǎn)效率不夠高，成本較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1.要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種以嗜熱擬青霉作為菌種的深層液體發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶酶制劑的方法，其生產(chǎn)效率高，成本較低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；且該生產(chǎn)方法制備的葡萄糖氧化酶具有耐高溫、耐酸、酶活性強(qiáng)、酶回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

2.技術(shù)方案

為解決上述問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種深層液體發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶酶制劑的方法，包括如下步驟：

a.發(fā)酵菌種的活化：將保藏號(hào)為cgmccno.13182的嗜熱擬青霉xzpt6在pda培養(yǎng)基平板上劃線活化，而后倒置于40～42℃恒溫培養(yǎng)箱中24～48h進(jìn)行活化培養(yǎng)；

b.制備嗜熱擬青霉孢子懸液：從步驟a活化好的菌種中用接種環(huán)刮取嗜熱擬青霉菌絲，轉(zhuǎn)移至嗜熱擬青霉孢子培養(yǎng)基上，置于37～40℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)出孢子，經(jīng)兩次傳代培養(yǎng)恢復(fù)其活力，以含有0.01％吐溫80的無菌水多次洗滌、收集孢子，制備孢子含量為1.0×10⁸cfu/ml的孢子懸液，備用；

c.一級(jí)嗜熱擬青霉種子液的制備：將步驟b中制備好的嗜熱擬青霉孢子懸液按照5～6％(v/v)的接種量接入裝有150～200ml種子培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，37～42℃搖床培養(yǎng)32～48h，轉(zhuǎn)速160～180r/min；

d.葡萄糖氧化酶的攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵：將8l發(fā)酵培養(yǎng)基裝入15l的攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐夾套升溫至95℃，再將蒸汽直接通入發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃滅菌30min，將溫度逐漸降至40～45℃，將步驟c所得的種子液按照5～10％(v/v)的量接入發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐壓為0.05mpa；初始發(fā)酵0～48h，發(fā)酵控制條件為：37～45℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.5～6.0，初始通氣量1.0～1.2l/min，攪拌轉(zhuǎn)速260～280r/min；發(fā)酵2～4d，發(fā)酵溫度降為35～40℃，無菌空氣通氣量1.5～1.7l/min，同時(shí)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速280～350r/min，調(diào)整通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速保證溶解氧不低于35％，ph調(diào)節(jié)至6.0～6.5；發(fā)酵過程中定時(shí)補(bǔ)料添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液葡萄糖氧化酶活力達(dá)到278u/l；

e.葡萄糖氧化酶酶液的提純和濃縮：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，去除菌絲，收集濾液，濾液8000r/min、離心20min，棄去雜質(zhì)等沉淀，保留上清；采用超濾膜過濾，第一次采用截留分子質(zhì)量為120～150kda的超濾膜過濾，保留濾出液，第二次用20～30kda的超濾膜過濾，濾液濃縮3～5倍，保存截留液；粗酶液在50～60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空濃縮，進(jìn)一步將酶液濃縮至原體積的10～20％；

f.葡萄糖氧化酶酶液的冷凍干燥：向濃縮后的粗酶液中加入保護(hù)劑：2～3wt％的糊精、1～3wt％的可溶性淀粉、0.1～0.2wt％的山梨酸鉀；充分?jǐn)嚢璺稚⒑螅?20℃冷凍8～10h，真空度30～40pa、溫度-35℃下，冷凍15～18h；粉碎，即得到葡萄糖氧化酶酶制劑。

進(jìn)一步地，步驟a中pda培養(yǎng)基的制備方法為：分別取土豆浸出液100ml，無機(jī)鹽液1ml，蔗糖2g，瓊脂粉1.5g；在ph值為5.0～6.0，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌15min。

進(jìn)一步地，步驟b中嗜熱擬青霉孢子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取土豆浸出液50ml，麩皮浸出液50ml，蔗糖1g，瓊脂粉1.5g；在ph值為5.0～6.0，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌15min。

進(jìn)一步地，步驟c中一級(jí)種子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取麩皮粉5g，麥芽糖4g，蔗糖3g，蛋白胨5g，玉米漿10g，尿素2g，微量元素4～5ml，混合均勻，加去離子水至1000ml；在ph值為5.5，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌20min。

進(jìn)一步地，步驟d中發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：分別取麩皮粉8g，花生殼粉5g，豆餅粉12～15g，纖維素粉3～5g，玉米漿10～15g，蛋白胨5～10g，尿素3～4g，(nh4)2so43～5g，牛肉膏2～5g，nacl2～5g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.04g、cacl20.3～0.5g，吐溫202g，微量元素4～5ml，去離子水1000ml；在ph值為6.5～6.8，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌30min。

進(jìn)一步地，步驟d發(fā)酵過程中的補(bǔ)料操作具體為：發(fā)酵48h后，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料體積每次50～100ml，共補(bǔ)料2～4次；補(bǔ)料培養(yǎng)基的制備方法為：分別取蔗糖200g，nh4no310g，麩皮浸出液700ml，去離子水補(bǔ)充至1000ml；在溫度為121℃的環(huán)境中滅菌20min。

進(jìn)一步地，所述土豆浸出液的制備方法為：土豆削皮、切成1cm³的小塊，稱取200g，加入1000ml水，煮沸30min，過濾，定容到1000ml。

進(jìn)一步地，所述麩皮浸出液的制備方法為：50g麩皮加入300ml水，煮沸30min，過濾，定容到200ml。

3.有益效果

(1)本發(fā)明以嗜熱擬青霉為菌種，菌種的培養(yǎng)需在高溫環(huán)境中進(jìn)行，且葡萄糖氧化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基的酸性較強(qiáng)，故而制得的葡萄糖氧化酶具有耐高溫、耐酸的性能，有效地解決了葡萄糖氧化酶在高溫工藝條件下酶活力的穩(wěn)定問題，使含有葡萄糖氧化酶的產(chǎn)品在生產(chǎn)工藝流程中不用顧忌高溫，可實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效利用。

(2)本發(fā)明的發(fā)酵過程采用了分階段控制的攪拌式深層液體通風(fēng)發(fā)酵罐發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵過程分兩階段控制，發(fā)酵過程中，添加的補(bǔ)料用補(bǔ)料培養(yǎng)基取代尿素溶液，不僅能提供氮源，還能提供碳源和生長(zhǎng)因子，有助于促進(jìn)酶的生產(chǎn)；根據(jù)菌種的生長(zhǎng)特性以及產(chǎn)酶規(guī)律，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度、通風(fēng)量、攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵液ph，并根據(jù)產(chǎn)酶速度和原料消耗情況合理補(bǔ)料，精確地控制通氣、ph、溫度等參數(shù)，方便地控制發(fā)酵產(chǎn)酶條件，有利于實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效發(fā)酵生產(chǎn)，具有重要的應(yīng)用前景。分階段控制發(fā)酵參數(shù)及補(bǔ)料方法和發(fā)酵培養(yǎng)基的獨(dú)特配方。

(3)本發(fā)明的具體步驟內(nèi)容可體現(xiàn)出本制備方法具有發(fā)酵周期短的優(yōu)點(diǎn)；發(fā)酵過程中，分階段控制發(fā)酵參數(shù)、補(bǔ)料方法及發(fā)酵培養(yǎng)基的獨(dú)特配方使得發(fā)酵液葡萄糖氧化酶活力達(dá)到278u/l，可體現(xiàn)制得的葡萄糖氧化酶具有活力較高的優(yōu)點(diǎn)；酶制劑根據(jù)分子量的超濾濃縮技術(shù)提純使酶制劑收率達(dá)到85％以上，體現(xiàn)制得的葡萄糖氧化酶具有酶回收率高的優(yōu)點(diǎn)。

(4)本發(fā)明所用的各種培養(yǎng)基的配方所采用的原料多為廉價(jià)易得的農(nóng)副產(chǎn)品，在滿足各培養(yǎng)物的要求下，有利于降低成本。

(5)本發(fā)明發(fā)酵結(jié)束后的葡萄糖氧化酶粗酶液先經(jīng)離心去雜質(zhì)等沉淀，再經(jīng)由兩次超濾膜過濾，最后在50～60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空濃縮，達(dá)到提純的目的；之后添加保護(hù)劑，再采用冷凍干燥技術(shù)使酶液固化，粉碎之后即得到葡萄糖氧化酶酶制劑。此提純和干燥技術(shù)有利于本發(fā)明的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明所提供的生產(chǎn)方法的生產(chǎn)效率高，成本較低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；且該生產(chǎn)方法制備的葡萄糖氧化酶具有耐高溫、耐酸、酶活性強(qiáng)、酶回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中葡萄糖氧化酶的最適作用溫度折線圖；

圖2為實(shí)施例中葡萄糖氧化酶的最適作用ph值折線圖；

圖3為實(shí)施例中葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性折線圖；

圖4為實(shí)施例中葡萄糖氧化酶的ph穩(wěn)定性折線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例

本實(shí)施例以嗜熱擬青霉xzpt6作為菌種通過深層液體發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶酶制劑，包括如下步驟：

a.發(fā)酵菌種的活化：將保藏號(hào)為cgmccno.13182的嗜熱擬青霉xzpt6在pda培養(yǎng)基平板上劃線活化，而后倒置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中35h進(jìn)行活化培養(yǎng)；

b.制備嗜熱擬青霉孢子懸液：從步驟a活化好的菌種中用接種環(huán)刮取嗜熱擬青霉菌絲，轉(zhuǎn)移至嗜熱擬青霉孢子培養(yǎng)基上，置于40℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)出孢子，經(jīng)兩次傳代培養(yǎng)恢復(fù)其活力，以含有0.01％吐溫80的無菌水多次洗滌、收集孢子，制備孢子含量為1.0×10⁸cfu/ml的孢子懸液，備用；

c.一級(jí)嗜熱擬青霉種子液的制備：將步驟b中制備好的嗜熱擬青霉孢子懸液按照5％(v/v)的接種量接入裝有180ml種子培養(yǎng)基的1000ml錐形瓶中，40℃搖床培養(yǎng)40h，轉(zhuǎn)速180r/min；

d.葡萄糖氧化酶的攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵：將8l發(fā)酵培養(yǎng)基裝入15l的攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐夾套升溫至95℃，再將蒸汽直接通入發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃滅菌30min，將溫度逐漸降至42℃，將步驟c所得的種子液按照8％(v/v)的量接入發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐壓為0.05mpa；初始發(fā)酵24h，發(fā)酵控制條件為：40℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.7，初始通氣量1.0l/min，攪拌轉(zhuǎn)速260r/min；發(fā)酵3d，發(fā)酵溫度降為37℃，無菌空氣通氣量1.6l/min，同時(shí)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，調(diào)整通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速保證溶解氧不低于35％，ph調(diào)節(jié)至6.3；發(fā)酵過程中定時(shí)補(bǔ)料添加補(bǔ)料培養(yǎng)基；發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶的酶活力為276u/ml。

e.葡萄糖氧化酶酶液的提純和濃縮：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，去除菌絲，收集濾液，濾液8000r/min、離心20min，棄去雜質(zhì)等沉淀，保留上清；采用超濾膜過濾，第一次采用截留分子質(zhì)量為130kda的超濾膜過濾，保留濾出液，第二次用25kda的超濾膜過濾，濾液濃縮4倍，保存截留液；粗酶液在55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空濃縮，進(jìn)一步將酶液濃縮至原體積的15％；

f.葡萄糖氧化酶酶液的冷凍干燥：向濃縮后的粗酶液中加入保護(hù)劑：3wt％的糊精、2wt％的可溶性淀粉、0.2wt％的山梨酸鉀；充分?jǐn)嚢璺稚⒑螅?20℃冷凍9h，真空度35pa、溫度-35℃下，冷凍16h；粉碎，即得到葡萄糖氧化酶酶制劑。

利用本方法制備的酶制劑收獲率達(dá)到85％以上。

在本實(shí)施例中，步驟a中pda培養(yǎng)基的制備方法為：分別取土豆浸出液100ml，無機(jī)鹽液1ml，蔗糖2g，瓊脂粉1.5g；在ph值為5.5，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌15min。

在本實(shí)施例中，步驟b中嗜熱擬青霉孢子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取土豆浸出液50ml，麩皮浸出液50ml，蔗糖1g，瓊脂粉1.5g；在ph值為5.5，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌15min。

在本實(shí)施例中，步驟c中一級(jí)種子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取麩皮粉5g，麥芽糖4g，蔗糖3g，蛋白胨5g，玉米漿10g，尿素2g，微量元素5ml，加去離子水至1000ml；在ph值為5.5，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌20min。

在本實(shí)施例中，步驟d中發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：分別取麩皮粉8g，花生殼粉5g，豆餅粉13g，纖維素粉4g，玉米漿13g，蛋白胨8g，尿素3g，(nh4)2so44g，牛肉膏3g，nacl3g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.04g、cacl20.4g，吐溫202g，微量元素5ml，去離子水1000ml；在ph值為6.7，溫度為121℃的環(huán)境中滅菌30min。

在本實(shí)施例中，步驟d發(fā)酵過程中的補(bǔ)料操作具體為：發(fā)酵48h后，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料體積每次50～100ml，共補(bǔ)料2～4次；補(bǔ)料培養(yǎng)基的制備方法為：分別取蔗糖200g，nh4no310g，麩皮浸出液700ml，去離子水補(bǔ)充至1000ml；在溫度為121℃的環(huán)境中滅菌20min。

上述土豆浸出液的制備方法為：土豆削皮、切成1cm³的小塊，稱取200g，加入1000ml水，煮沸30min，過濾，定容到1000ml；上述麩皮浸出液的制備方法為：50g麩皮加入300ml水，煮沸30min，過濾，定容到200ml。

下面對(duì)本實(shí)施例中取得的葡萄糖氧化酶進(jìn)行部分性能測(cè)定：

(1)酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定

將發(fā)酵制備的酶制劑在不同的溫度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)下測(cè)定其葡萄糖氧化酶酶的活力(ph5.0)，并將最高的酶活力定義為100％，計(jì)算不同溫度條件下葡萄糖氧化酶的活力。

結(jié)果如圖1所示，葡萄糖氧化酶從35℃到65℃，隨著溫度升高酶活性逐漸增加，溫度達(dá)到65℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值。以后隨著溫度升高，酶活逐漸降低，故酶的葡萄糖氧化酶最適作用溫度為65℃。整體看葡萄糖氧化酶是高溫酶，在50℃～70℃之間酶的酶活都在80％以上，故在這個(gè)溫度范圍內(nèi)酶制劑都會(huì)發(fā)揮高效的酶解作用。

(2)酶作用最適ph測(cè)定

將葡萄糖氧化酶酶液分別在不同的ph2.0、3.0、4.0、5.0、6.o、7.0、8.0、9.0)下測(cè)定其葡萄糖氧化酶酶活力。將最高的酶活力定義為100％，分別計(jì)算不同ph值條件下葡萄糖氧化酶的相對(duì)酶活。所用緩沖液為：ph2.0～3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，ph3.0～4.0檸檬酸磷酸緩沖液，ph4.0～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph5.0～7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，ph7.0～9.0tris-hcl緩沖溶液。以酶在最適ph值下所測(cè)酶活為100％，其它ph值下所測(cè)為對(duì)其相對(duì)酶活。酶制劑在以上不同ph緩沖體系中，在65℃下測(cè)定葡萄糖氧化酶酶活性。

結(jié)果如圖2所示，葡萄糖氧化酶在ph3.0～7.0之間酶活性在80％以上，最適作用ph為5.0。整體看酶制劑適合在酸性條件下酶解反應(yīng)。

(3)酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將葡萄糖氧化酶酶液，分別置于不同的溫度條件下(60℃、65℃、67℃、70℃)保溫不同的時(shí)間(ph＝4.5)，然后立即放置于4℃的環(huán)境中復(fù)性2h以上，再按標(biāo)準(zhǔn)的酶活測(cè)定方法測(cè)定其剩余酶活力。以未經(jīng)保溫失活處理的酶活力為100％，分別計(jì)算不同溫度條件下葡萄糖氧化酶的相對(duì)剩余酶活。

結(jié)果如圖3所示，酶基本隨溫度的上升以及熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力逐漸降低，在溫度高于75℃時(shí)，葡萄糖氧化酶酶活性下降顯著。酶在75℃以下，保溫時(shí)間3小時(shí)以內(nèi)酶活保存率都在80％以上；65℃以下，熱處理3小時(shí)剩余酶活都在90％以上。因此酶制劑的耐熱性非常好，屬于是耐高溫型。

(4)ph值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

另將葡萄糖氧化酶酶液分別置于不同的ph條件下(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，分別于40℃保溫24h，然后立即轉(zhuǎn)移至ph為4.5、再測(cè)定其剩余酶活力。以酶在最穩(wěn)定ph下所測(cè)酶活為100％，其它ph下所測(cè)為對(duì)其相對(duì)酶活。

結(jié)果如圖4所示，40℃，ph2.0～8.0范圍內(nèi)24h葡萄糖氧化酶酶活性基本不發(fā)生變化，活性穩(wěn)定，相對(duì)酶活均在80％以上。但在堿性條件下，酶活下降比較嚴(yán)重，ph8.0以后，隨著ph增加，酶活逐漸降低。整體看酶制劑具有較廣的酸堿穩(wěn)定性，在酸性條件下性質(zhì)更為穩(wěn)定。

(5)酶制劑的保存時(shí)間對(duì)酶活性的影響

將制備好的固體酶制劑分別在4℃和室溫下保存，每一個(gè)月檢測(cè)一次酶活力，共檢測(cè)6個(gè)月，查看酶活保留情況。結(jié)果如表1所示：

表1分別在4℃和室溫下保存的葡萄糖氧化酶酶活保存率

在半年時(shí)間內(nèi)，4℃下葡萄糖氧化酶酶活保存率都在90％以上，室溫條件下酶活也在80％以上，可以看出酶的穩(wěn)定性好。

由上述可知，本發(fā)明所得的酶制劑能達(dá)到以下指標(biāo)：葡萄糖氧化酶酶活力574u/g；產(chǎn)品棕褐色固體粉末、可以溶于水、無異味；產(chǎn)品熱穩(wěn)定性好，35℃下，保存6個(gè)月后酶活力仍大于90％；酶催化活性強(qiáng)，最適作用溫度在45℃～70℃之間；本產(chǎn)品最適作用ph值范圍在4.5～7.0。

本發(fā)明生產(chǎn)的葡萄糖氧化酶耐熱性好，即75℃下，保溫3小時(shí)，殘余酶活達(dá)85％；另外，發(fā)酵制備的葡萄糖氧化酶耐酸性強(qiáng)，在ph2.0～8.0范圍內(nèi)24h葡萄糖氧化酶酶活性基本不發(fā)生變化，活性穩(wěn)定，相對(duì)酶活均在80％以上；發(fā)酵產(chǎn)量高，即發(fā)酵液酶活達(dá)278u/ml；酶回收率高，即總酶活回收率大于85％、酶凍干粉酶活力單位達(dá)到574u/g；能有效的降低生產(chǎn)成本；同時(shí)采用的提純和干燥技術(shù)也有利于該生產(chǎn)方法的工業(yè)化生產(chǎn)。

本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非用作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。

應(yīng)用例

下面探究葡萄糖氧化酶對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

選取體格健壯、體重相似、采食良好、產(chǎn)蛋性能相似的產(chǎn)蛋高峰期30周齡的海蘭褐蛋雞為試驗(yàn)蛋雞，隨機(jī)分為2組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為30只雞；以玉米-豆粕一雜粕型日糧為基礎(chǔ)日糧；其中對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組是在基礎(chǔ)日糧中添加葡萄糖氧化酶。添加方法為：將制備的葡萄糖氧化酶固態(tài)酶制劑以基礎(chǔ)日糧為載體做成1％葡萄糖氧化酶預(yù)混劑，試驗(yàn)組為正常營(yíng)養(yǎng)水平上添加0.5％的葡萄糖氧化酶酶制劑。試驗(yàn)雞舍為上中下三層階梯式舍飼籠養(yǎng)，自然通風(fēng)，光照采用人工早晚補(bǔ)光，保證光照時(shí)間為16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度10～15lx。每天喂料三次，仔細(xì)觀察雞群健康狀況，認(rèn)真作好試驗(yàn)記錄。試驗(yàn)經(jīng)一周的預(yù)試期進(jìn)入正試期，試驗(yàn)期42天。在正試期中，記錄產(chǎn)正常蛋數(shù)、異常蛋數(shù)(包括軟蛋、破蛋、畸形蛋)、日采食量、料蛋比等生產(chǎn)性能指標(biāo)。

產(chǎn)蛋量(克/天﹒只)＝產(chǎn)蛋總重/每天飼養(yǎng)只數(shù)。

日采食量(克/天﹒只)＝給料量-剩料量/每天飼養(yǎng)只數(shù)。

料蛋比＝每周耗料總量(千克)/每周產(chǎn)蛋總量(千克)。

產(chǎn)蛋率(％)＝每天產(chǎn)蛋只數(shù)/飼養(yǎng)只數(shù)

根據(jù)上述公式統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，在正常營(yíng)養(yǎng)水平上，在蛋雞飼料中添加葡萄糖氧化酶酶制劑能明顯提高了蛋雞的總產(chǎn)蛋率，比對(duì)照組提高了15％；試驗(yàn)組的軟破畸形蛋率比對(duì)照組降低62.02％，表明飼料中添加葡萄糖氧化酶能明顯提高蛋殼品質(zhì)；試驗(yàn)組的料蛋比平均比對(duì)照組降低11.71％，說明葡萄糖氧化酶能夠明顯提高飼料轉(zhuǎn)化率；死淘率顯示，葡萄糖氧化酶添加組的死淘率為0，說明葡萄糖氧化酶能提高蛋雞的抗病能力。

表2葡萄糖氧化酶酶制劑對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

注：表中日采食量、日產(chǎn)蛋量、日產(chǎn)蛋率均為平均值。