本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說，涉及利用KASP技術(shù)檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米的引物及方法。
背景技術(shù)：
：對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的檢測是轉(zhuǎn)基因生物安全管理的基礎(chǔ)。目前大部分轉(zhuǎn)基因作物品種都含有NOS終止子這個外源成分，因此對NOS終止子的篩查是轉(zhuǎn)基因檢測當(dāng)中最重要的檢測項目之一。目前常用的轉(zhuǎn)基因的檢測方法為普通PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，但二者均存在不足與缺陷，限制了轉(zhuǎn)基因檢測的推廣。普通PCR技術(shù)需要電泳以及紫外觀察的過程，操作繁瑣，耗時長，難以實現(xiàn)高通量檢測。熒光定量PCR技術(shù)的不足包括：(1)檢測成本昂貴。熒光定量PCR使用的熒光探針是基因特異性探針，成本很高。如果探針的效果不好，還需要重新設(shè)計探針。(2)難以實現(xiàn)高通量檢測。一般情況下，一臺熒光定量PCR儀器一次只能做96或者384個反應(yīng)，能檢測的樣本數(shù)量有限，不適合大批量檢測。(3)自動化程度不高。目前情況下，構(gòu)建熒光定量PCR反應(yīng)體系的過程主要依靠手工操作，容易導(dǎo)致實驗誤差和實驗污染。因此，亟需開發(fā)一種高通量、低成本、簡單快捷以及低錯誤率的轉(zhuǎn)基因作物的檢測方法。競爭性等位基因PCR(kompetitiveallelespecificPCR，KASP)是一種基于熒光檢測的基因分型技術(shù)。進行檢測的時候，每個反應(yīng)孔采用雙色熒光(一般是FAM熒光和HEX熒光)檢測樣本某一位點可能的兩種基因型。該技術(shù)現(xiàn)階段主要被應(yīng)用于SNP基因分型研究中，成為分子輔助育種、性狀基因的精細(xì)定位以及種子資源鑒定的主要技術(shù)手段。但是目前尚未見到利用KASP技術(shù)來檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種高通量檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米的引物及方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了用于檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米的引物組合，包括：(1)NOS終止子特異性檢測引物：NOS終止子正向引物：5’-CGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；NOS終止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；(2)內(nèi)源基因zSSIIb特異性檢測引物：zSSIIb正向引物：5’-ATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。進一步地，為了適用于KASP反應(yīng)檢測，在上述正向引物的5’端連接熒光標(biāo)簽序列，如下：(1)NOS終止子特異性檢測引物：連接FAM熒光標(biāo)簽序列的NOS終止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’(下劃線處是FAM標(biāo)簽序列)；NOS終止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；(2)內(nèi)源基因zSSIIb特異性檢測引物：連接HEX熒光標(biāo)簽序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’(下劃線處是HEX標(biāo)簽序列)；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。檢測內(nèi)源基因的目的在于監(jiān)控DNA提取和KASP反應(yīng)等過程中是否出現(xiàn)了問題。進一步地，含有前述引物組合的試劑和試劑盒也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。第二方面，本發(fā)明提供了前述引物組合在檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。具體可體現(xiàn)為一種檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米的方法，包括如下步驟：S1、提取樣品基因組DNA；S2、以基因組DNA為模板，利用前述引物組合進行KASP反應(yīng)檢測；其中，NOS終止子正向引物的5’端連接FAM熒光標(biāo)簽序列，zSSIIb正向引物的5’端連接HEX熒光標(biāo)簽序列；即：連接FAM熒光標(biāo)簽序列的NOS終止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’(下劃線處是FAM標(biāo)簽序列)；NOS終止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；連接HEX熒光標(biāo)簽序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’(下劃線處是HEX標(biāo)簽序列)；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’；S3、KASP反應(yīng)結(jié)束后檢測產(chǎn)物的熒光信號，如果從樣品中僅檢測到HEX熒光，則判定該樣品為不含NOS終止子的玉米；如果從樣品中同時檢測到HEX熒光和FAM熒光時，則判定該樣品為含NOS終止子的玉米。作為優(yōu)選，本發(fā)明優(yōu)化了KASP反應(yīng)的反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴增反應(yīng)，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個TouchDown循環(huán)(每個循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃)；第二步擴增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個循環(huán)。滿足上述條件的KASP反應(yīng)，能提高擴增產(chǎn)物的特異性。進一步地，本發(fā)明優(yōu)化了KASP反應(yīng)的反應(yīng)體系，具體為：反應(yīng)體系組分終濃度體積(μL)100μMNOS終止子正向引物0.17μM0.0051100μMNOS終止子反向引物0.42μM0.0126100μMzSSIIb正向引物0.17μM0.0051100μMzSSIIb反向引物0.42μM0.01262xKASPMasterMix1x1.5超純水1.4646總體積3(注：為節(jié)省反應(yīng)體積，DNA模板已經(jīng)提前加入到PCR反應(yīng)板中并且烘干。)更進一步地，為了提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明檢測方法中還設(shè)有正對照模板，負(fù)對照模板以及空白對照。其中，正對照模板為含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米DNA以及含NOS終止子的質(zhì)粒；負(fù)對照模板為不含NOS終止子的非轉(zhuǎn)基因玉米DNA；空白對照為水。通過LGCSNPLine儀器平臺的replicator或者96通道的移液器將玉米樣品及其對照樣品的DNA轉(zhuǎn)移到384孔反應(yīng)板中，DNA樣品分配之后，反應(yīng)板在2000rpm離心5分鐘，然后放在65℃溫箱里干燥30分鐘，之后取出備用。KASP反應(yīng)完成后利用LGCSNPLine儀器平臺的Pherastar對KASP反應(yīng)產(chǎn)物進行掃描并且將收集到的熒光信號轉(zhuǎn)化成樣品基因分型的散點圖。在散點圖中，橫坐標(biāo)是代表是KASP反應(yīng)產(chǎn)物的FAM熒光值，縱坐標(biāo)代表的它的HEX熒光值。根據(jù)樣品產(chǎn)物熒光值可以判斷它們是否含有NOS終止子。如果從某樣品中僅檢測到HEX熒光，則判定該樣品為不含NOS終止子的玉米；如果從某樣品中同時檢測到HEX熒光和FAM熒光時，則判定該樣品為含NOS終止子的玉米；當(dāng)樣品出現(xiàn)在原點附近，即該樣品通過KASP反應(yīng)沒有生成zSSIIb或NOS終止子，表明該樣品在DNA提取或者KASP反應(yīng)體系構(gòu)建過程中出現(xiàn)了問題，需要重新檢測其基因型。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了對含有外源基因片段NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米進行KASP檢測的方法以及相應(yīng)的引物組合。所述引物組合中，一對引物用于擴增植物內(nèi)源基因，另外一對引物用于擴增外源NOS終止子片段。在引物設(shè)計的時候，內(nèi)源基因zSSIIb正向引物的5'端添加了HEX的標(biāo)簽序列，外源NOS終止子的正向引物的5'端添加了FAM的標(biāo)簽序列。本發(fā)明通過對引物設(shè)計與嚴(yán)格篩選，選擇到了一組特異性好、靈敏度高的引物組合。該引物組合應(yīng)用于KASP檢測時，能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分含有NOS終止子的玉米和不含NOS終止子的玉米。不僅如此，本發(fā)明還具有以下優(yōu)勢：(1)高通量：不同于熒光定量PCR是每個循環(huán)都進行熒光的檢測，KASP反應(yīng)的熒光掃描是在反應(yīng)終點進行，所以KASP可以先進行大批量的PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后再集中進行熒光掃描檢測。利用水浴PCR儀可以同時進行14塊384孔板即5376個KASP反應(yīng)，目前熒光定量PCR的儀器每次能進行的反應(yīng)數(shù)一般是96或者384，所以KASP檢測的通量是熒光定量PCR的14倍，檢測效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熒光定量PCR。(2)自動化程度高：KASP反應(yīng)體系構(gòu)建已經(jīng)實現(xiàn)了自動化，這樣不僅能省了操作者的時間和人力，而且能有效降低了出錯的概率。(3)低成本：KASP的熒光探針是通用的。試劑盒本身就含有通用的熒光探針，不需要為了某一個基因而去合成特異性的探針，相比于TaqMan探針法熒光定量PCR，能大大地節(jié)省成本。另外KASP的反應(yīng)體系可以少至1～3μL，而熒光定量PCR需要至少5μL，所以KASP節(jié)省了反應(yīng)液的使用。(4)過程簡單：由于KASP檢測是通過熒光掃描的方式對產(chǎn)物進行檢測，整個掃描的過程能在1分鐘之內(nèi)完成，不要做電泳，所以相對普通PCR，KASP檢測能大大地節(jié)省時間。本發(fā)明成功地利用KASP技術(shù)對含有NOS終止子的玉米進行了篩選。由于KASP檢測只需要掃描產(chǎn)物的熒光信號就可以判斷結(jié)果，而不需要進行電泳，因此簡單快捷；不同于熒光定量PCR需要針對目標(biāo)基因設(shè)計特異性的熒光探針，KASP利用的是通用型的探針，極大節(jié)省了成本；另外KASP技術(shù)的操作平臺LGC具有高通量和自動化的優(yōu)點?；谏鲜鰞?yōu)點，KASP方法將有機會在未來的轉(zhuǎn)基因檢測中發(fā)揮重要的作用。附圖說明圖1為KASP法檢測樣品基因型的點簇分布圖。圖2為利用不同引物組合檢測樣品基因型的點簇分布圖。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例11、DNA模板的準(zhǔn)備分別取1個非轉(zhuǎn)基因玉米先玉335和8個含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米樣品(表1)的幼嫩葉片100mg，按照CTAB的方法提取DNA。準(zhǔn)備含NOS終止子的大腸桿菌的質(zhì)粒pLangutou-1，同時準(zhǔn)備pLangutou-1與先玉335DNA的混合物。pLangutou-1是本實驗室構(gòu)建的質(zhì)粒，大小為5865bp。上述DNA將作為KASP反應(yīng)的模板，每個樣品設(shè)2個平行重復(fù)，同時以無菌水代替模板作為陰性對照。表1：樣品的基因型樣品名稱樣品基因型pLangutou-1含NOS終止子pLangutou-1和先玉335混合物含NOS終止子、zSSIIbLPM20含NOS終止子、zSSIIbLPM82含NOS終止子、zSSIIbLPM83含NOS終止子、zSSIIbLPM88含NOS終止子、zSSIIbLPM92含NOS終止子、zSSIIbLPM95含NOS終止子、zSSIIbLPM98含NOS終止子、zSSIIbLPM100含NOS終止子、zSSIIb先玉335含zSSIIb2、引物的設(shè)計和合成根據(jù)Genbank中基因片段的序列及KASP反應(yīng)對引物的要求，我們分別設(shè)計了NOS終止子和玉米內(nèi)源基因zSSIIb特異性引物，其中NOS終止子的正向引物kTNOS-F4的5'端連接FAM標(biāo)簽序列，zSSIIb基因的正向引物zSSIIb-F4的5'端連接HEX標(biāo)簽序列(表2)。引物由invitrogen公司合成。表2：KASP反應(yīng)的引物注:kTNOS-F4引物序列中下劃線區(qū)域為FAM標(biāo)簽序列，zSSIIb-F4引物序列中下劃線區(qū)域為HEX標(biāo)簽序列3、KASP反應(yīng)體系的構(gòu)建為了減少DNA所占體積，首先在PCR反應(yīng)板中加入適量DNA，一般情況下玉米樣品的DNA上樣量為60ng，pLangutou-1上樣量為0.0001ng。DNA樣品轉(zhuǎn)移到PCR板的過程是通過LGCSNPLine儀器平臺的全自動化液體處理工作站Replicator實現(xiàn)的。DNA樣品轉(zhuǎn)移完成之后，將PCR反應(yīng)板在2000rpm離心1分鐘，然后放在65℃溫箱里烘干30分鐘，之后取出反應(yīng)板放置常溫備用。將KASPMasterMix、NOS終止子引物(kTNOS-F4和kTNOS-R4)以及zSSIIb引物(zSSIIb-F4和zSSIIb-R4)按表4所示的比例進行混合，其中KASPMasterMix從LGC公司購買，它含有FAM、HEX熒光染料、淬滅基團、高保真的Taq酶、dNTP以及緩沖液。通過LGCSNPLine儀器平臺的Meridian將表3的混合液轉(zhuǎn)移到到步驟1中已經(jīng)加了DNA模板的PCR反應(yīng)板。加樣完成之后，反應(yīng)板需要封膜和離心。表3：KASP反應(yīng)體系的構(gòu)建反應(yīng)體系組分終濃度體積(μL)100μMkTNOS-F40.17μM0.0051100μMkTNOS-R40.42μM0.0126100μMzSSIIb-F40.17μM0.0051100μMzSSIIb-R40.42μM0.01262xKASPMasterMix1x1.5超純水1.4646總體積3(注：為節(jié)省反應(yīng)體積，DNA模板已經(jīng)提前加入到PCR反應(yīng)板中并且烘干。)3、KASP反應(yīng)將加樣完畢的PCR反應(yīng)板放置于LGCSNPLine儀器平臺的水浴PCR儀中進行KASP反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴增反應(yīng)，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個TouchDown循環(huán)(每個循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃)；第二步擴增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個循環(huán)。4、結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后，利用LGCSNPLine儀器平臺的Pherastar對KASP反應(yīng)產(chǎn)物進行掃描，可以得到每一個樣品產(chǎn)物的FAM和HEX熒光值。系統(tǒng)對這些熒光值處理并且生成散點圖，圖形中每一個點代表相對應(yīng)了一個樣品的熒光值，橫坐標(biāo)是代表是這個樣品KASP反應(yīng)產(chǎn)物的FAM熒光值，縱坐標(biāo)代表的它的HEX熒光值。根據(jù)樣品產(chǎn)物熒光值可以判斷它們是否含有NOS終止子。如果從某樣品中僅檢測到HEX熒光，則判定該樣品為不含NOS終止子的玉米；如果從某樣品中能檢測到HEX熒光和FAM熒光時，則判定該樣品為含NOS終止子的玉米；如果從樣品中僅檢測到FAM熒光，則判定該樣品為含NOS終止子的質(zhì)粒。由表4可以發(fā)現(xiàn)對樣品基因型的判定和它們本身基因型的信息是完全一致的，表明在該檢測中所使用的引物以及方法是準(zhǔn)確和可靠的。表4：對檢測樣品基因型的判定實施例2引物的選擇在KASP檢測當(dāng)中，引物對于樣品基因型的鑒別至關(guān)重要。為了能準(zhǔn)確和高效地鑒定含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米，為NOS終止子和zSSIIb各設(shè)計了三對特異性擴增的引物(表5)并且進行了兩兩配組(表6)，利用不同的引物配組對表1的樣品進行了檢測。根據(jù)KASP產(chǎn)物的基因型點簇分布圖(圖2)可以發(fā)現(xiàn)：當(dāng)利用引物配組A、B、C、D、E、F、I進行KASP檢測時，檢測的結(jié)果跟樣品本身的基因型不完全一致。利用引物配組G和H進行KASP檢測，檢測的結(jié)果跟樣品本身的基因型一致，但是引物配組H的效果要優(yōu)于G。因此選擇引物配組H來進行NOS終止子檢測。表5：NOS終止子和zSSIIb的引物序列表6：NOS終止子和zSSIIb的KASP引物配組實施例3與TaqMan探針法熒光定量PCR的一致性為了驗證本發(fā)明的準(zhǔn)確性，實驗室選取了101份未知基因型的玉米葉片樣本，分別采用TaqMan探針法熒光定量PCR與KASP方法對樣品進行了檢測，分析兩種方法檢測結(jié)果的一致性。由表7可以看出，在101份樣品中，只有3份樣品的結(jié)果不一致，兩種方法檢測結(jié)果的一致性達(dá)97％，因此認(rèn)為用KASP檢測含NOS終止子玉米的方法是準(zhǔn)確和可靠的。表7:不同方法檢測結(jié)果的對比分析雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>華智水稻生物技術(shù)有限公司<120>一種高通量檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因玉米的引物及方法<130>KHP161117614.2<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1cgttcaaacatttggcaataaa22<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2aagaccggcaacaggattc19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3atctgctccgaagcaaagtc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4cactcgttccgttttgcatt20<210>5<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaggtgaccaagttcatgctcgttcaaacatttggcaataaa43<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>6gaaggtcggagtcaacggattatctgctccgaagcaaagtc41當(dāng)前第1頁1 2 3