本公開涉及植物基因工程領域，具體地，涉及一種誘導型啟動子及其應用。

背景技術(shù)：

沉香屬白木香(Aquilaria sinensis)為我國特有的珍稀瀕危植物，是我國生產(chǎn)名貴芳香類藥材沉香的唯一正品植物來源。研究表明，倍半萜類物質(zhì)是沉香藥材的最主要成分，也是其精油的主要成分(Hashimoto et al.,1985；Chen et al.,2011,Chen et al.,2012)。沉香倍半萜在健康白木香樹中幾乎沒有，是樹體受到傷害誘導后啟動相應代謝途徑合成的。

倍半萜合酶是倍半萜生物合成途徑中催化FPP合成倍半萜的關鍵酶。倍半萜合酶基因ASS1是典型的誘導表達基因，而且在轉(zhuǎn)錄水平存在重要調(diào)控。然而，關于沉香倍半萜合酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制還未見報道。

啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的一段DNA序列，位于基因5′端上游轉(zhuǎn)錄起始位點附近，是基因表達調(diào)控的重要組成元件，控制基因表達的起始時間和表達程度(Hernandez-Garcia and Finer，2014)。啟動子片段中存在大量的順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子通過與順式作用元件結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，使基因具有時空表達特異性。所以，啟動子的分離和功能分析是基因工程研究的重要內(nèi)容。

在轉(zhuǎn)基因育種操作中，目前較多使用的啟動子種類是組成型啟動子。這類啟動子的作用特點是：表達具持續(xù)性，RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對恒定，表達量不表現(xiàn)時空特異性也不受外界因素的誘導。然而，在轉(zhuǎn)基因植物中，組成型啟動子持續(xù)過量表達往往阻礙植物的正常生長，甚至降低其產(chǎn)量；而誘導型啟動子可使目的基因只在特殊的誘導條件下才大量表達，不會造成浪費或影響植物生長發(fā)育，在基因工程育種中具有很好的應用前景。因此，對誘導型啟動子進行開發(fā)和利用有助于基因工程技術(shù)的發(fā)展和進步。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本公開的目的是提供一種誘導型啟動子及其應用。

為了實現(xiàn)上述目的，本公開的第一個方面提供一種誘導型啟動子，所述誘導型啟動子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，該誘導型啟動子長度為243-3000bp，并且所述誘導型啟動子能夠在存在誘導信號分子的條件下啟動目標基因的轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)選的，所述誘導型啟動子具有如SEQ ID NO.2所示的核酸片段，所述誘導型啟動子為白木香倍半萜合酶基因的誘導型啟動子。

本公開的第二個方面提供一種重組表達載體，所述重組表達載體含有本公開第一個方面所述的誘導型啟動子。

本公開的第三個方面提供一種含有本公開的第二個方面所述的重組表達載體的宿主細胞。

本公開的第四個方面提供本公開第一方面所述的誘導型啟動子在調(diào)控目標基因表達中的應用。

優(yōu)選的，包括如下1)-2)中任意一種：

1)不存在信號誘導分子的條件下，抑制目標基因轉(zhuǎn)錄；

2)在存在信號誘導分子的條件下，啟動目標基因轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)選的，所述信號誘導分子為茉莉酸、過氧化氫、水楊酸和脫落酸中的至少一種。

優(yōu)選的，所述目標基因為白木香倍半萜合酶基因或報告基因。

本公開的第五個方面提供誘導型啟動子在研究與白木香倍半萜合成相關機制中的用途，其中，所述誘導型啟動子為本公開第一個方面所述的誘導型啟動子。

本公開的第六個方面提供所述誘導型啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的用途。

通過上述技術(shù)方案，本公開提供了誘導型啟動子，該誘導型啟動子具有在誘導條件下啟動下游結(jié)構(gòu)蛋白基因表達的功能。為利用其誘導表達機制、提高白木香倍半萜的合成表達量、了解與白木香倍半萜合酶基因的創(chuàng)傷誘導表達相關的機制提供了技術(shù)支持。

本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構(gòu)成對本公開的限制。在附圖中：

圖1是不同長度啟動子的誘導表達活性的示意圖。

圖2是擬南芥GUS染色觀察結(jié)果。

圖3是外源激素處理ASS1P:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性檢測結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。

本公開提供了一種誘導型啟動子，所述誘導型啟動子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，該誘導型啟動子長度為243-3000p，并且所述誘導型啟動子能夠在存在誘導信號分子的條件下啟動目標基因的轉(zhuǎn)錄。

本公開所提供的誘導型啟動子至少具有如下特點，在沒有誘導信號分子作用的條件下，不能啟動下游結(jié)構(gòu)基因序列的轉(zhuǎn)錄或目的基因表達量極低。在信號誘導分子的作用下，啟動子活化從而啟動下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄過程。其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段屬于該啟動子的核心調(diào)控序列，存在信號誘導分子時，可以啟動下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，在沒有信號誘導分子結(jié)合作用的情況下，可以調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因不開始轉(zhuǎn)錄。

在本公開中，單個轉(zhuǎn)錄抑制子或是起抑制作用的復合物可以結(jié)合在所述啟動子的核心調(diào)控區(qū)段(SEQ ID NO.1所示的序列)，信號誘導分子可以解除抑制，從而啟動基因表達。

其中，所述信號誘導分子可以為在創(chuàng)傷誘導條件下植物所分泌的物質(zhì)，例如在物理傷害、化學傷害、微生物感染等條件下合成和/或分泌的物質(zhì)。

可以通過對植物進行創(chuàng)傷處理來獲得存在信號誘導分子的條件，也可以通過外源添加信號誘導分子的方式來獲得存在信號誘導分子的條件。

在本公開的一種優(yōu)選的實施方式中，能夠作為信號誘導分子的物質(zhì)包括但不限于茉莉酸、過氧化氫、水楊酸和脫落酸等。

SEQ ID NO.1所示的片段是使得核酸序列能夠具有誘導型啟動子特征的必要條件；也可以在該核心片段的兩端進行適當?shù)难娱L直至達到243-3000bp的長度，只要延長后得到的核酸還能夠受到信號誘導分子的調(diào)控即可。

值得注意的，本領域技術(shù)人員能夠從本公開的技術(shù)內(nèi)容認識和理解到，將SEQ ID NO.1所示的序列構(gòu)建在其他組成型啟動子上游所形成的重組片段也具有誘導啟動的能力，也屬于本公開的保護范圍，應用SEQ ID NO.1所示序列對除白木香倍半萜合酶基因之外其他的基因的表達進行調(diào)控的技術(shù)方案也屬于本公開的保護范圍。

其中，優(yōu)選地，所述誘導型啟動子具有如SEQ ID NO.2所示的核酸片段。

值得注意的，本領域技術(shù)人員能夠從本公開的技術(shù)內(nèi)容認識和理解到，當刪除SEQ ID NO.2所示的核酸序列中如SEQ ID NO.1所示的核酸序列后，獲得的剩余的序列依然能夠啟動下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄過程，但是這種啟動過程不再受信號誘導分子的誘導和調(diào)節(jié)，也就是說通過這種方式獲得的序列具有組成型啟動子的特征。更具體的，在一種實施方式中，當刪除白木香倍半萜合酶基因啟動子中SEQ ID NO.1所示的核酸序列后，可以使得白木香倍半萜合酶在不需要信號誘導分子的情況下大量表達。

本發(fā)明還提供了一種重組表達載體，該重組表達載體能夠允許插入閱讀框并使所插入的閱讀框在宿主細胞中表達出蛋白質(zhì)，其中，所述重組表達載體中的啟動子包括如上所述的誘導型啟動子。

其中，待表達的蛋白質(zhì)的閱讀框序列可以通過查詢或測序的方式確定，待表達的蛋白質(zhì)的閱讀框的DNA可以通過常規(guī)的分子生物學手段獲得，例如全序列合成、PCR擴增和限制性酶切。通常地，所述重組表達載體上可以具有一些常規(guī)的元件，例如復制起始點、篩選基因、多克隆位點和轉(zhuǎn)錄終止信號等。

優(yōu)選的，所述待表達的蛋白質(zhì)為白木香倍半萜合酶或者報告基因所編碼的蛋白，所述報告基因可以為編碼抗生素抗性蛋白的基因或者可以為熒光蛋白基因。特別優(yōu)選的，所述待表達的蛋白質(zhì)為白木香倍半萜合酶。

本公開還提供了含有所述重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞的種類可以為微生物細胞或植物細胞，只要能夠在轉(zhuǎn)化所述重組表達載體后，通過所述誘導型啟動子啟動下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄即可。

其中，所述微生物細胞可以為常規(guī)使用的各種生物工程用的微生物，例如酵母菌或大腸桿菌。

優(yōu)選的，所述宿主細胞為植物細胞，例如可以為白木香細胞、洋蔥細胞、擬南芥細胞、煙草細胞等，特別優(yōu)選為白木香細胞。

本公開的一個方面還提供了所述誘導型啟動子在調(diào)控目標基因表達中的應用。

其中，所述目標基因可以為任何能夠在細胞中通過所述誘導型啟動子啟動轉(zhuǎn)錄并完成蛋白質(zhì)合成過程的基因。

可選的，所述目標基因為白木香倍半萜合酶基因或者報告基因，特別優(yōu)選的，所述目標基因為白木香倍半萜合酶基因。

可選的，所述應用包括如下1)-2)中任意一種：

1)不存在信號誘導分子的條件下，抑制目標基因轉(zhuǎn)錄；

2)在存在信號誘導分子的條件下，啟動目標基因轉(zhuǎn)錄。

其中，所述信號誘導分子為茉莉酸、過氧化氫、水楊酸和脫落酸中的至少一種。

在本公開的一種具體的實施方式中，所述應用包括制備目標基因在維管束中高效穩(wěn)定表達的植物。

在本公開的一種具體的實施方式中，可以通過向目標植物中導入含有所述誘導型啟動子和目標基因的重組表達載體來實現(xiàn)目標基因的誘導表達?？梢酝ㄟ^對目標植物施加外源傷害或者提供信號誘導分子來使得所述誘導型啟動子啟動下游目標基因的表達。

本發(fā)明還提供了如上所述的誘導型啟動子在制備重組表達載體和/或表達質(zhì)粒中的用途?？梢詫⒁延械闹亟M表達載體和/或表達質(zhì)粒中的啟動子中的一個或多個用常規(guī)的基因工程手段(例如限制性酶切和/或PCR的方式)替換為本發(fā)明如上所述的誘導型啟動子。

本公開還提供了誘導型啟動子在研究與白木香倍半萜合成相關機制中的用途。可以利用所述誘導型啟動子研究與其具有直接或間接相互作用關系的元件，為了解和應用白木香倍半萜誘導啟動機制提供有力支持。

具體的，可以利用所述誘導型啟動子通過例如酵母單雜交實驗篩選與該啟動子結(jié)合的有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。

本公開還提供了所述誘導型啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的用途。制備獲得的轉(zhuǎn)基因植物可以在誘導條件下啟動下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。所述轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于白木香、洋蔥、擬南芥和煙草等，特別優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因植物為白木香，所述下游結(jié)構(gòu)基因為白木香倍半萜合酶。

以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。

實施例1

(1)表達載體構(gòu)建

以白木香基因組DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，得到四個不同的啟動子片段。分別對四個不同的啟動子片段進行SacI和SpeI酶切，得到酶切后產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切得到的pAN580(含有綠色熒光蛋白GFP)載體大片段連接，得到連接產(chǎn)物pAN580-ASS1P1-GFP(標記為GFP1)，pAN580-ASS1P2-GFP(標記為GFP2)，pAN580-ASS1P3-GFP(標記為GFP3)，pAN580-ASS1P4-GFP(標記為GFP41)，四個構(gòu)建分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒酶切、測序，確保構(gòu)建正確。

其中，GFP1的啟動子序列為SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的1-973bp區(qū)域所示序列。

GFP2的啟動子序列為SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的243-973bp區(qū)域所示序列。

GFP3的啟動子序列為SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的544-973bp區(qū)域所示序列。

GFP4的啟動子序列為SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的783-973bp區(qū)域所示序列。

(2)ASS1P:GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮的熒光觀察

提取上述步驟(1)構(gòu)建正確的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，利用基因槍法分別轉(zhuǎn)化洋蔥表皮。黑暗培養(yǎng)16h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)光情況。全長啟動子ASS1P驅(qū)動的GFP熒光強度相比較最弱(GFP1)，而刪除上游242bp片段后，GFP熒光增強(GFP2)，外源MeJA處理GFP熒光同樣增強。直到刪除191bp，啟動子仍然具有較強的活性和誘導表達活性(GFP4)，結(jié)果如圖1所示。

該實驗的結(jié)果證明ASS1啟動子為誘導型；啟動子上游242bp片段對啟動子的活性有抑制作用，將其刪除后啟動子活性增強。

(3)分段刪除ASS1P:GUS融合表達載體的構(gòu)建：

構(gòu)建四個長度的片段。分別以正向引物：

GUS1-f:5′-cccAAGCTTCTCATGTTTTTCAAGGATGCTGTC-3′；

GUS2-f:5′-cccAAGCTTGATGCGTATTTGTTCTTTCTTTTCG-3′；

GUS3-f:5′-cccAAGCTTGTTGTACATGCTCTTACGGCTTCTC-3′；

GUS4-f:5′-cccAAGCTTACAAAAGGTTT CTGGAAGATAATGG-3′；

和反向引物：GUS-r:5′-cgGAATTCCAAGAA GTTGGAAGAATGAGTGAGG-3′進行PCR擴增，得到四個不同的啟動子片段。將產(chǎn)物克隆測序以確保正確性。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Hind III和EcoR I酶切，得到酶切后產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切得到的pCAMBIA1391(含有GUS報告基因)載體大片段連接，得到連接產(chǎn)物pCAMBIA1391-ASS1P1-GUS(標記為GUS1)，pCAMBIA1391-ASS1P2-GUS(標記為GUS2)，pCAMBIA1391-ASS1P3-GUS(標記為GUS3)，pCAMBIA1391-ASS1P4-GUS(標記為GUS4)，四個構(gòu)建分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒酶切、測序，確保構(gòu)建正確。

(4)ASS1P:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將上述表達載體GUS1-4轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，得到重組菌落。利用花侵染法侵染野生型擬南芥。得到T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥。T0代收獲種子，播種繼續(xù)傳代，篩選至T3代純合體待用。

(5)轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色觀察

對轉(zhuǎn)上述表達載體GUS1-4的擬南芥進行GUS染色觀察，實驗結(jié)果顯示(如圖2所示)，MS培養(yǎng)基上生長10天的幼苗，GUS1轉(zhuǎn)基因株系幾乎都沒有染色，而其他轉(zhuǎn)基因株系GUS正常染色，GUS2，GUS3，GUS4具有相似的表達水平。與GFP的結(jié)果相一致，直到刪除3’端的191bp序列，啟動子片段仍然具有很高的表達水平。對GUS2的不同組織器官染色發(fā)現(xiàn)，除了角果和種子，啟動子ASS1P驅(qū)動的GUS在根、莖、葉片、花中都有表達，而且在這些器官的維管束組織中表達較強烈。

該實驗的結(jié)果證明啟動子上游242bp片段對啟動子的活性有抑制作用，將其刪除后啟動子活性增強，可以正常驅(qū)動目的基因表達。

(6)外源激素處理ASS1P:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性檢測

三周的擬南芥幼苗頁面噴施100μM的水楊酸(SA)或茉莉酸甲酯(MeJA)，以噴施1％的乙醇溶液為對照，5小時后取樣液氮速凍，保存在-80℃。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，進行熒光定量PCR檢測，以actin為內(nèi)參。每一個數(shù)值都是三次獨立生物學重復的平均值。結(jié)果如圖2所示，SA和MeJA都誘導GUS的表達。但GUS1受誘導最強，MeJA使其相對表達量升高了23倍，SA使其相對表達量升高了12倍GUS2，GUS3，GUS4具有相似的誘導程度，MeJA使其相對表達量升高2.3-3.5倍，SA對其表達影響不明顯。單純比較相應的四個對照的轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)，GUS1的表達量很低，而刪除上游242bp后，GUS2的表達量顯著升高了10倍之多，GUS3和GUS4活性和GUS2差不多。這些結(jié)果表明ASS1是一個顯著受誘導表達的基因，而且SEQ ID NO.1所示核酸片段對ASS1的活性具有抑制作用，將其刪除后ASS1能夠高表達，活性檢測結(jié)果如圖3所示。

該實驗的結(jié)果證明ASS1啟動子活性可以受外源信號分子SA和MeJA的誘導，而且上游242bp片段是響應傷害信號的核心區(qū)段。

以上結(jié)合附圖詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內(nèi)容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所

<120> 一種誘導型啟動子及其應用

<130> 4743CAMS

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 242

<212> DNA

<213> Aquilaria sinensis

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(242)

<400> 1

ctcatgtttt tcaaggatgc tgtcgagtat ggtgttggtg atctataaat taatattgtc 60

cgccgcacct gagtccgtct tggaggcaga atgggtctgg agcggcgctg accgtcggct 120

tgtgagttgg tttacaattc ctctgtcttt tttgtctttt ttctactttg ggcaatgaag 180

ataggacatt tatatatcta tatttggtat attggagggg gcgaatggca agtggcaaag 240

tt 242

<210> 2

<211> 973

<212> DNA

<213> Aquilaria sinensis

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(973)

<400> 2

ctcatgtttt tcaaggatgc tgtcgagtat ggtgttggtg atctataaat taatattgtc 60

cgccgcacct gagtccgtct tggaggcaga atgggtctgg agcggcgctg accgtcggct 120

tgtgagttgg tttacaattc ctctgtcttt tttgtctttt ttctactttg ggcaatgaag 180

ataggacatt tatatatcta tatttggtat attggagggg gcgaatggca agtggcaaag 240

ttgatgcgta tttgttcttt cttttcgaac ggcaacaacc aatgaattta tctctaagag 300

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tacagccaat tactgacaga agccttcggg ttctcatacc attcaaacca tgagcacttt 420

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ccacttactg taagttgttc atctttgaaa actaggccgt ttctactatt caaaattctt 540

catgttgtac atgctcttac ggcttctcaa atcagcctct attctttgtt cttaaattgc 600

ccagacttgt cgttcataac ttccacaaga aaatctaaat ctaataataa taattttacg 660

gctattgaac aaattgaatt attttcaccc aaacgtgttt ttttttaaaa aagttttaca 720

gcccacgtgg tcatacaagt ctgagcgctt gcagtcaaca gattatttgt atgtttgtag 780

ggacaaaagg tttctggaag ataatggtac gttgtcaagc aagtgcgctt tctagtgcag 840

ccatgtaatc gagcaggtgc ctcggaatct gtctataaat acctgagaaa tggaactcaa 900

ctttcatcgc tcaaaacagc aaacttgtta ttacaagaaa tttttttgct ttttgcacca 960

aaagaacaga aaa 973

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 3

cccaagcttc tcatgttttt caaggatgct gtc 33

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 4

cccaagcttg atgcgtattt gttctttctt ttcg 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 5

cccaagcttg ttgtacatgc tcttacggct tctc 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 6

cccaagctta caaaaggttt ctggaagata atgg 34

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 7

cggaattcca agaagttgga agaatgagtg agg 33