本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種乙肝重組抗原及其表達(dá)基因、構(gòu)建方法、病毒樣顆粒及其制備方法、應(yīng)用與疫苗。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎作為人類主要傳染性疾病之一，在全球范圍內(nèi)影響達(dá)3億人之多。據(jù)調(diào)查，中國(guó)有約十分之一的人是乙型肝炎病毒攜帶者。乙型肝炎病毒感染可以引起人的急性和慢性肝炎，而肝炎可以發(fā)展成更嚴(yán)重的疾病，比如肝硬化和肝癌等。乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)，簡(jiǎn)稱乙肝病毒，屬于嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)，其對(duì)人和猩猩有易感性。乙型肝炎病毒顆粒的表面存在三種抗原分子，分別是小蛋白(thesmallprotein，s蛋白)，中蛋白(themiddleprotein，m蛋白)和大蛋白(thelargeprotein，l蛋白)，它們錨定在病毒的脂質(zhì)雙分子層膜中。上述三種蛋白質(zhì)都包含一段由226個(gè)氨基酸組成的肽段，稱為乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitisbsurfaceantigen，hbsag)。目前，臨床上使用的乙型肝炎病毒的疫苗主要成分是滅活的以s蛋白為主的乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)，接種該疫苗(hbsag)的大部分人可產(chǎn)生抗體并有效抵抗乙型肝炎病毒的感染。但是，依然有少數(shù)人(約5％～10％)接種該疫苗不能產(chǎn)生抗體。因此，傳統(tǒng)的乙型肝炎病毒的疫苗的免疫原性較差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要針對(duì)傳統(tǒng)的乙型肝炎病毒的疫苗的免疫原性較差的問題，提供一種免疫原性相對(duì)較好的乙肝重組抗原及其表達(dá)基因、構(gòu)建方法、病毒樣顆粒及其制備方法、應(yīng)用與疫苗。一種乙肝重組抗原，由seqidno.1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸表達(dá)得到。一種乙肝重組抗原，其氨基酸序列如seqidno.2所示。一種乙肝重組抗原的表達(dá)基因，其堿基序列如seqidno.1所示。一種乙肝重組抗原表達(dá)基因的構(gòu)建方法，包括：將乙型肝炎病毒的pres序列分別與流感病毒血凝素的信號(hào)肽區(qū)，以及流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)相連接，得到所述乙肝重組抗原表達(dá)基因；其中，所述流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)的堿基序列如seqidno.3所示；其中，所述流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列如seqidno.4所示；其中，所述乙型肝炎病毒的pres區(qū)域的堿基序列如seqidno.5所示；其中，所述乙肝重組抗原表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.1所示。一種乙肝重組抗原病毒樣顆粒，包括乙肝重組抗原和流感病毒基質(zhì)蛋白m1，所述乙肝重組抗原的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.1所示，所述流感病毒基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.6所示。一種乙肝重組抗原病毒樣顆粒的制備方法，包括：將流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列插入第一表達(dá)載體，得到m1-表達(dá)載體質(zhì)粒，其中，流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.6所示；將如權(quán)利要求3所述的乙肝重組抗原的表達(dá)基因插入第二表達(dá)載體，得到pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒；將所述pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒和所述m1-表達(dá)載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的所述宿主細(xì)胞，產(chǎn)生乙肝重組抗原病毒樣顆粒。如上任一實(shí)施例中所述的乙肝重組抗原在制備乙肝防治藥物領(lǐng)域和制備乙肝疫苗領(lǐng)域中的用途。如上任一實(shí)施例中所述的乙肝重組抗原的表達(dá)基因在制備乙肝防治藥物領(lǐng)域和制備乙肝疫苗領(lǐng)域中的用途。如上任一實(shí)施例中所述乙肝重組抗原病毒樣顆粒在制備乙肝防治藥物領(lǐng)域和制備乙肝疫苗領(lǐng)域中的用途。一種乙肝防治的疫苗，包括如上任一實(shí)施例中所述乙肝重組抗原病毒樣顆粒。本發(fā)明通過將乙型肝炎病毒的pres區(qū)域與流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)拼接在一起而得到的乙肝重組抗原表達(dá)基因，并將其成功表達(dá)后得到乙肝重組抗原，免疫原性較好，能夠在對(duì)接種傳統(tǒng)疫苗不能產(chǎn)生抗體的少數(shù)人(約5％～10％)人身上使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時(shí)，基于pres區(qū)域?qū)σ腋尾《镜牟豢苫蛉钡闹匾?，可以針?duì)pres區(qū)域制備出適應(yīng)人群更廣的疫苗，即，既能在大部分人身上起到免疫應(yīng)答，同時(shí)，也能在對(duì)傳統(tǒng)疫苗不起反應(yīng)的5％～10％比例的人身上使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。還能夠?qū)σ腋尾《酒鸬筋A(yù)防感染和清除的作用，有潛力轉(zhuǎn)化到醫(yī)學(xué)上成為一種新穎的預(yù)防性和治療性乙肝疫苗。附圖說明圖1a為乙肝病毒表面蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖；圖1b為乙肝病毒表面蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；圖2a為本發(fā)明的乙肝重組抗原表達(dá)基因構(gòu)建策略圖；圖2b為本發(fā)明的乙肝重組抗原表達(dá)基因構(gòu)建流程圖；圖3a為pres-ha-pcaggs質(zhì)粒、m1-pcaggs質(zhì)粒和pres-pet28b質(zhì)粒的sds-page鑒定結(jié)果；圖3b為pres-pet28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌后所表達(dá)的pres蛋白sds-page鑒定結(jié)果；圖3c為pres多克隆抗體的sds-page鑒定結(jié)果；圖4為乙肝重組抗原病毒樣顆粒的westernblotting鑒定結(jié)果；圖5為乙肝重組抗原病毒樣顆粒的透射電子顯微鏡分析結(jié)果；圖6a為qpcr實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙肝重組抗原表達(dá)基因和流感病毒的基質(zhì)蛋白m1序列的轉(zhuǎn)錄情況；圖6b為轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的免疫熒光成像；圖6c為轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的免疫熒光成像；圖7a為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞沉淀和上清中乙肝重組抗原的表達(dá)情況的westernblot分析結(jié)果；圖7b為蔗糖密度梯度離心法所得各個(gè)組分樣品的sds-page分析結(jié)果；圖7c為大腸桿菌中表達(dá)的pres蛋白和蔗糖密度梯度離心法所得各個(gè)組分樣品的sds-page分析結(jié)果；圖7d為pres病毒樣顆粒(presvlp)的電鏡透射結(jié)果；圖7e為40％蔗糖液中的基質(zhì)蛋白m1和乙肝重組抗原的lc-ms/ms鑒定結(jié)果；圖8a為血清中anti-pres抗體滴度的elisa法檢測(cè)分析結(jié)果；圖8b為血清中anti-pres抗體滴度的elisa法檢測(cè)分析結(jié)果；圖8c為血清中anti-pres抗體滴度的elisa法檢測(cè)分析結(jié)果；圖8d為血清中anti-pres抗體滴度的elisa法檢測(cè)分析結(jié)果；圖9a為乙肝重組抗原病毒樣顆粒引起的小鼠t細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果；圖9b為乙肝重組抗原病毒樣顆粒引起的小鼠t細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果；圖9c為乙肝重組抗原病毒樣顆粒引起的小鼠t細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果；圖9d為乙肝重組抗原病毒樣顆粒引起的小鼠t細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果；圖9e為乙肝重組抗原病毒樣顆粒引起的小鼠t細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果；圖10a為小鼠肝組織中乙肝rna的qpcr法檢測(cè)分析結(jié)果；圖10b為小鼠肝組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；圖10c為小鼠肝組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；圖10d為小鼠肝組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；圖10e為小鼠肝組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；圖10f為小鼠血清中hbsag檢測(cè)分析結(jié)果；圖10g為小鼠血清中hbeag檢測(cè)分析結(jié)果；圖10h為小鼠血清中andanti-pres抗體滴度的elisa檢測(cè)分析結(jié)果；圖11a為小鼠脾淋巴細(xì)胞的t細(xì)胞分析結(jié)果；圖11b為小鼠脾淋巴細(xì)胞的t細(xì)胞分析結(jié)果；圖11c為小鼠脾淋巴細(xì)胞的t細(xì)胞分析結(jié)果；圖11d為小鼠脾淋巴細(xì)胞的t細(xì)胞分析結(jié)果；圖11e為小鼠脾淋巴細(xì)胞的t細(xì)胞分析結(jié)果；圖11f為小鼠肝淋巴細(xì)胞的t細(xì)胞分析結(jié)果。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。如本文所用的術(shù)語“乙型肝炎病毒的pres序列”，是表達(dá)乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,簡(jiǎn)稱hbv)的pres的基因，這里的基因，更具體講，是指dna堿基序列。乙型肝炎病毒的pres是表達(dá)乙型肝炎病毒在其表面延伸出的一段肽段。請(qǐng)一并參閱圖1a及圖1b，乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,簡(jiǎn)稱hbv)顆粒的表面存在三種抗原分子，分別是小蛋白(thesmallprotein，s蛋白)，中蛋白(themiddleprotein，m蛋白)和大蛋白(thelargeprotein，l蛋白)，它們錨定在病毒的脂質(zhì)雙分子層膜中，上述三種蛋白質(zhì)都包含一段由226個(gè)氨基酸組成的肽段，稱為hbsag(hepatitisbsurfaceantigen)。s蛋白全部由hbsag組成。m蛋白在s蛋白的n端延伸出55個(gè)氨基酸肽段，這55個(gè)氨基酸組成的肽段稱為pres2。l蛋白在m蛋白的基礎(chǔ)上在n端繼續(xù)延伸出119個(gè)氨基酸(基因型a和c)或者108個(gè)氨基酸(基因型d)，延伸出的肽段稱為pres1。請(qǐng)一并參閱圖1a及圖1b，全長(zhǎng)presag包括pres1和pres2兩個(gè)部分。如本文所用的術(shù)語“流感病毒血凝素”，是指血凝素突起(hemagglutinin,ha)，其作用是幫助病毒吸附到宿主細(xì)胞(被侵染細(xì)胞)的細(xì)胞膜上，并進(jìn)一步侵入細(xì)胞。它是病毒致病的重要因素。不同毒株和亞型的流感病毒感染性不同，就是因?yàn)樗鼈儠?huì)有各自不同的ha糖蛋白突起(結(jié)構(gòu)和抗原特性的不同)。呈柱狀，能與人、鳥、豬豚鼠等動(dòng)物紅細(xì)胞表面的受體相結(jié)合引起凝血，故而被稱作血凝素。血凝素蛋白水解后分為輕鏈和重鏈兩部分，重鏈可以與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體相結(jié)合，輕鏈則可以協(xié)助病毒包膜與宿主細(xì)胞膜相互融合。血凝素在病毒導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程中扮演了重要角色。如本文所用的術(shù)語“vlp”，是指病毒樣顆粒(viruslikeparticle，簡(jiǎn)稱vlp)，在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上類似具有感染性的病毒，但由于它不包含病毒基因成分，因此沒有傳染性。表達(dá)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，比如包膜或核衣殼，這些蛋白可自組裝成病毒樣顆粒。本身作為抗原的病毒樣顆粒，由于其很高的免疫原性和安全性，病毒樣顆粒有望成為新型病毒疫苗。病毒樣顆粒可以引起更強(qiáng)大和廣泛的免疫反應(yīng)，分泌高水平的中和抗體來保護(hù)機(jī)體免受病毒感染。如本文所用的，“有效劑量”一般指足以誘導(dǎo)免疫力、預(yù)防和/或改善乙肝的至少一種癥狀、和/或增強(qiáng)另一個(gè)劑量的疫苗的效力的本發(fā)明疫苗的量。有效劑量可以指足以延遲乙肝感染發(fā)作或使之最小化的疫苗的量。有效劑量還可以指在乙肝的治療或管理中提供治療益處的疫苗的量。此外，有效劑量是就單獨(dú)或與其它療法組合在乙肝病毒感染的治療或管理中提供治療益處的本發(fā)明疫苗而言的量。有效劑量還可以是足以增強(qiáng)受試者(例如人)自己針對(duì)后來與乙肝病毒接觸的免疫應(yīng)答的量。免疫力的水平可以通過例如測(cè)量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量來加以監(jiān)測(cè)，所述測(cè)量例如通過噬斑中和(plaqueneutralization)、補(bǔ)體結(jié)合(complementfixation)、酶聯(lián)免疫吸附、或微中和(microneutralization)測(cè)定來進(jìn)行。在疫苗的情況下，“有效劑量”是預(yù)防疾病或降低癥狀嚴(yán)重性的劑量。如本文所用的，“表達(dá)載體”是能夠促進(jìn)納入其中的核酸的表達(dá)和復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒。典型地，要表達(dá)的核酸與啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子“可操作地連接”，并受該啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前以s蛋白為主的乙型肝炎hbsag疫苗在約5％～10％比例的人身上不能引起免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。有研究(glebed,urbans,knoopev,cagn,krassp,gruns,bulavaitea,sasnauskask,gerlichwh.mappingofthehepatitisbvirusattachmentsitebyuseofinfection-inhibitingpres1lipopeptidesandtupaiahepatocytes.gastroenterology2005；129:234-245)表明pres1的2-38位氨基酸是人乙型肝炎病毒發(fā)揮附著和感染作用所必需的位點(diǎn)。pres2區(qū)域在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞和病毒從胞漿中釋放的過程中起著至關(guān)重要的作用，去除pres1區(qū)域的c末端和pres2的n末端，用這樣缺失的乙型肝炎病毒基因組dna感染肝細(xì)胞，不能分泌成熟的病毒顆粒(leseyecj,chouteaup,canniei,gugen-guillouzoc,griponp.roleofthepre-s2domainofthelargeenvelopeproteininhepatitisbvirusassemblyandinfectivity.j.virol.1998；72:5573-5578)。因此，pres區(qū)域在乙型肝炎病毒的生活周期中起著不可或缺的作用，對(duì)其進(jìn)一步研究成為本發(fā)明的探索方向。更重要的是，在對(duì)s區(qū)域不起免疫反應(yīng)的b10.s小鼠，當(dāng)抗原分別加入pres2和全長(zhǎng)pres時(shí)，可以引起免疫反應(yīng)，分泌s-特異性抗體。進(jìn)一步地，在對(duì)s區(qū)域和pres2區(qū)域均不起免疫反應(yīng)的b10.m小鼠，當(dāng)抗原加入pres1區(qū)域時(shí)，可以引起免疫反應(yīng)，分泌s-特異性抗體和pres2-特異性抗體。因此，pres可以使不起反應(yīng)的小鼠產(chǎn)生中和抗體。那么，presvlp很可能使對(duì)經(jīng)典乙肝疫苗不起免疫反應(yīng)的5％～10％人產(chǎn)生中和抗體。pres區(qū)域有望在不能對(duì)以s蛋白為主的乙型肝炎hbsag疫苗起免疫應(yīng)答的人群身上起作用。本發(fā)明提供一種由乙型肝炎病毒的pres區(qū)域與流感病毒血凝素(haemagglutinin,ha)信號(hào)肽區(qū)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)拼接在一起而得到的pres-ha融合基因，即為乙肝重組抗原的表達(dá)基因，其堿基序列如seqidno.1所示。本發(fā)明提供一種乙肝重組抗原，由seqidno.1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸表達(dá)得到，例如，乙肝重組抗原的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.1所示。又如，一種乙肝重組抗原，由seqidno.1所示的核苷酸序列組成的多核苷酸表達(dá)得到，其氨基酸序列如seqidno.2所示。本發(fā)明還提供一種乙肝重組抗原，其氨基酸序列如seqidno.2所示。本發(fā)明通過將乙型肝炎病毒的pres區(qū)域與流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)拼接在一起而得到的pres-ha融合基因，并將其成功表達(dá)后得到pres-ha嵌合蛋白，即為乙肝重組抗原，免疫原性較好，能夠在對(duì)傳統(tǒng)的乙型肝炎病毒的疫苗不起反應(yīng)的少數(shù)人身上使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時(shí)，基于pres區(qū)域?qū)σ腋尾《镜牟豢苫蛉钡闹匾?，可以針?duì)pres區(qū)域制備出適應(yīng)人群更廣的疫苗，即，既能在大部分人身上起到免疫應(yīng)答，同時(shí)，也能在對(duì)傳統(tǒng)疫苗不起反應(yīng)的5％～10％比例的人身上使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。能夠理解，感染了乙肝病毒的患者體內(nèi)，容易出現(xiàn)免疫耐受的情況。如何使pres區(qū)域能夠更好地被機(jī)體識(shí)別，產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的免疫反應(yīng)以清除乙肝病毒或者被乙肝病毒感染了的細(xì)胞對(duì)于乙肝病毒的清除至關(guān)重要。pers區(qū)域雖然對(duì)乙肝病毒不可或缺，如何更好的將pers區(qū)域展示給免疫系統(tǒng)，如何使其能夠更好的被展示到細(xì)胞膜的表面，以使pres區(qū)域能夠更好地被機(jī)體識(shí)別是一個(gè)較為棘手的問題。例如，將流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)以及流感病毒的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)與乙型肝炎病毒的pres區(qū)域拼接，其中，流感病毒的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)作為一個(gè)整體，該整體與乙型肝炎病毒的pres區(qū)域拼接，又如，將乙型肝炎病毒的pres區(qū)域分別與該整體以及流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)進(jìn)行拼接；這樣，基于流感病毒的易感性，一方面能夠使pers區(qū)域能夠較好地被展示到細(xì)胞膜的表面，另一方面，還可以表達(dá)出含量較高以及免疫原性較強(qiáng)的pres-ha嵌合蛋白，以促使機(jī)體能夠產(chǎn)生更強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實(shí)施例中，流感病毒為a/sw/spain/53207/04，可以理解，本發(fā)明亦可采用其它流感病毒實(shí)現(xiàn)。例如，本發(fā)明還提供一種乙肝重組抗原，其為pres-ha融合基因編碼表達(dá)，其具有seqidno.2所示的氨基酸序列。將pres-ha融合基因轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞后，其得到較好的表達(dá)?；蛘哒f，乙肝重組抗原亦可理解為pres-ha嵌合蛋白。本實(shí)施例中，通過將流感病毒血凝素ha的dna分子進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)的堿基序列以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列。本實(shí)施例中，流感病毒血凝素ha的氨基酸序列如seqidno.7所示，流感病毒血凝素ha的dna分子堿基序列如seqidno.8所示。本實(shí)施例中，流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)的堿基序列如seqidno.3所示，流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列如seqidno.4所示。又如，流感病毒血凝素信號(hào)肽由流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)表達(dá)。又如，流感病毒血凝素信號(hào)肽包括流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列。又如，流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列為流感病毒血凝素的第521-566位的氨基酸序列。其中，流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列如seqidno.9所示，流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸序列如seqidno.10所示。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列的末端還連接有taa的終止子，即，流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列的末端gcatt后面還有taa序列。又如，本發(fā)明還提供如上pres-ha融合基因的構(gòu)建方法，pres-ha融合基因的構(gòu)建方法包括：將乙型肝炎病毒的pres序列分別與流感病毒血凝素的信號(hào)肽區(qū)，以及流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)相連接，得到所述乙肝重組抗原表達(dá)基因；亦即，將乙型肝炎病毒的pres序列分別與流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)和流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)相連接；其中，流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)的堿基序列如seqidno.3所示；其中，流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列如seqidno.4所示；其中，乙型肝炎病毒的pres區(qū)域的堿基序列如seqidno.5所示。例如，pres-ha融合基因即為乙肝重組抗原表達(dá)基因。本實(shí)施例中，流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)為編碼流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸的dna分子，流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列如seqidno.9所示。本實(shí)施例中，流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為編碼流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸的dna分子，流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸序列如seqidno.10所示。如何使乙肝重組抗原能夠在免疫耐受的情況下引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種乙肝重組病毒樣顆粒，將乙肝重組抗原嵌合于流感病毒基質(zhì)蛋白的表面，以使其具有更大的展示面積。這也從后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。例如，本發(fā)明還提供一種乙肝重組抗原病毒樣顆粒，包括流感病毒基質(zhì)蛋白m1和乙肝重組抗原，其中，乙肝重組抗原的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.1所示，流感病毒基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.6所示。乙肝重組抗原嵌合于流感病毒基質(zhì)蛋白的表面。乙肝重組抗原病毒樣顆粒簡(jiǎn)稱為presvlp。例如，本發(fā)明還提供一種presvlp的制備方法，presvlp的制備方法包括：將流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列插入第一表達(dá)載體，得到m1-表達(dá)載體質(zhì)粒，其中，流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.6所示；將如上任一實(shí)施例所述的pres-ha融合基因插入第二表達(dá)載體，得到pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒；將pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒和m1-表達(dá)載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生presvlp。例如，presvlp即為乙肝重組抗原病毒樣顆粒。為了增強(qiáng)對(duì)流感病毒顆粒的釋放，本實(shí)施例中，將流感病毒基質(zhì)蛋白m1的第41位氨基酸突變成為丙氨酸(ala)，以增強(qiáng)對(duì)病毒性顆粒的釋放，達(dá)到提高后續(xù)制備得到的presvlp的產(chǎn)量的效果。通過將m1-表達(dá)載體質(zhì)粒和pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，能夠更好地使pres-ha嵌合蛋白能夠較好的被展示在細(xì)胞膜上，甚至分泌至細(xì)胞外，從而能夠便于后續(xù)對(duì)presvlp或者pres-ha嵌合蛋白的提取。同時(shí)，基于流感病毒基質(zhì)蛋白的球狀結(jié)構(gòu)特性，可以使pres-ha嵌合蛋白結(jié)合在m1蛋白的表面，從而使得pres-ha嵌合蛋白具有更大的展示面積以展示給機(jī)體，以促使機(jī)體能夠產(chǎn)生更強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。需要說明的是，pres-ha嵌合蛋白即為乙肝重組抗原。具體實(shí)施例中，第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體可以相同，也可以相異。例如，第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體相同。本實(shí)施例中，第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體為質(zhì)粒載體。又如，質(zhì)粒載體為pcaggs載體，又如，質(zhì)粒載體為pcaggs載體，宿主細(xì)胞為293t細(xì)胞，這樣，能夠使pres-ha嵌合蛋白較好地表達(dá)。需要說明的是，現(xiàn)有應(yīng)用的pers蛋白，主要是由大腸桿菌中表達(dá)并純化得到的。用于人體時(shí)，異源性強(qiáng)，安全隱患高。因此，有必要提供一種人源性的pers蛋白，以提高將其用做預(yù)防或治療乙肝的藥物或者疫苗時(shí)的安全性。通過將載體為pcaggs載體，宿主細(xì)胞為293t細(xì)胞，能夠獲得人源性的pres-ha嵌合蛋白，以提高將其用做預(yù)防或治療乙肝的藥物或者疫苗時(shí)的安全性。又一實(shí)施例中，質(zhì)粒載體為pfastbac1載體，又如，質(zhì)粒載體為pfastbac1baculovirustransfervectorplasmid載體，又如，載體為pfastbac1載體，宿主細(xì)胞為sf9細(xì)胞，這樣，能夠使pres-ha嵌合蛋白被大量表達(dá)，pres-ha嵌合蛋白的產(chǎn)量較高，便于生產(chǎn)和提純。例如，本發(fā)明還提供一種重組載體，該表達(dá)載體含有如seqidno.1所示核苷酸序列。例如，重組載體為pcaggs載體。又如，重組載體為pfastbac1載體。例如，本發(fā)明還提供一種presvlp(乙肝重組抗原病毒樣顆粒)的制備方法，presvlp的制備方法包括：將流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列插入第一表達(dá)載體，得到m1-表達(dá)載體質(zhì)粒，其中，流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的表達(dá)基因的堿基序列如seqidno.6所示；將如上的pres-ha融合基因插入第二表達(dá)載體，得到pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒；將pres-ha-表達(dá)載體質(zhì)粒和m1-表達(dá)載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生presvlp。例如，第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體為pcaggs，宿主細(xì)胞為293t細(xì)胞。又如，第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體為pfastbac1載體，宿主細(xì)胞為sf9細(xì)胞。例如，本發(fā)明還提供一種presvlp(乙肝重組抗原病毒樣顆粒)，采用如上任一presvlp的制備方法制備得到。例如，本發(fā)明提供的pres-ha融合基因(乙肝重組抗原表達(dá)基因)在制備預(yù)防或治療乙肝藥物中的用途，即上述任一實(shí)施例所述pres-ha融合基因在制備預(yù)防或治療乙肝藥物中的用途或應(yīng)用。基于基因疫苗或者dna疫苗的技術(shù)，本發(fā)明提供的pres-ha融合基因有潛力或能夠應(yīng)用于預(yù)防或治療乙肝藥物或疫苗中?；蛘哒f，pres-ha融合基因有潛力或能夠應(yīng)用于在制備乙肝防治藥物中。需要說明的是，疫苗也可以理解為藥物，同時(shí)，對(duì)將pres-ha融合基因應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)制劑過程中，亦可當(dāng)作其為藥物的用途，比如，將其應(yīng)用于car-t細(xì)胞療法中。例如，本發(fā)明提供的pres-ha嵌合蛋白(乙肝重組抗原)在制備預(yù)防或治療乙肝疫苗中的用途，即上述任一實(shí)施例所述pres-ha嵌合蛋白在制備預(yù)防或治療乙肝疫苗中的用途或應(yīng)用。本發(fā)明提供的pres-ha嵌合蛋白有潛力或能夠應(yīng)用于預(yù)防或治療乙肝藥物或疫苗中?；蛘哒f，pres-ha嵌合蛋白有潛力或能夠應(yīng)用于在制備乙肝防治疫苗中。例如，本發(fā)明提供presvlp(乙肝重組抗原病毒樣顆粒)在制備預(yù)防或治療乙肝藥物中的用途，即上述任一實(shí)施例所述presvlp。在制備預(yù)防或治療乙肝藥物中的用途或應(yīng)用。本發(fā)明提供的presvlp有潛力應(yīng)用于預(yù)防或治療乙肝藥物或疫苗中?；蛘哒f，presvlp有潛力應(yīng)用于在制備乙肝防治疫苗中。例如，本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療乙肝的疫苗，包括如上乙肝重組抗原病毒樣顆粒。又如，所述疫苗包括有效量如上presvlp。例如，有效量為10微克。又如，有效量為0.0000001～0.5微克/g體重，此為從后期小鼠的實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)出，以六周齡的小鼠體重約計(jì)20～30克計(jì)算?；蛘哒f，本發(fā)明還提供一種乙肝防治的疫苗，包括有效量的如上presvlp。本發(fā)明通過將乙型肝炎病毒的pres區(qū)域與流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)拼接在一起而得到的乙肝重組抗原表達(dá)基因，并將其成功表達(dá)后得到乙肝重組抗原，免疫原性較好，能夠在對(duì)接種傳統(tǒng)疫苗不能產(chǎn)生抗體的少數(shù)人(約5％～10％)人身上使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時(shí)，基于pres區(qū)域?qū)σ腋尾《镜牟豢苫蛉钡闹匾?，可以針?duì)pres區(qū)域制備出適應(yīng)人群更廣的疫苗，即，既能在大部分人身上起到免疫應(yīng)答，同時(shí)，也能在對(duì)傳統(tǒng)疫苗不起反應(yīng)的5％～10％比例的人身上使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。還能夠?qū)σ腋尾《酒鸬筋A(yù)防感染和清除的作用，有潛力轉(zhuǎn)化到醫(yī)學(xué)上成為一種新穎的預(yù)防性和治療性乙肝疫苗。下面結(jié)合具體實(shí)施例繼續(xù)對(duì)本發(fā)明予以說明。實(shí)施例11、質(zhì)粒的構(gòu)建(1)、pres-ha融合基因的構(gòu)建pres-ha融合基因構(gòu)建策略請(qǐng)見圖2a及圖2b。從流感病毒血凝素的ha序列中獲得流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。其中，流感病毒血凝素的ha的堿基序列如seqidno.8所示，流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)的堿基序列如seqidno.3所示，流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的堿基序列如seqidno.4所示。流感病毒血凝素信號(hào)肽區(qū)為編碼流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸的dna分子，流感病毒血凝素的第1～20位氨基酸序列如seqidno.9所示。流感病毒血凝素的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)為編碼流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸的dna分子，流感病毒血凝素的第521-566位氨基酸序列如seqidno.10所示。其中，流感病毒為a/sw/spain/53207/04。從乙肝病毒中獲取pres區(qū)域的序列，乙型肝炎病毒的pres區(qū)域的堿基序列如seqidno.5所示，乙型肝炎病毒的pres區(qū)域的氨基酸序列如seqidno.11所示。請(qǐng)參閱圖2a，通過將乙型肝炎病毒的pres區(qū)域連接在流感病毒血凝素的信號(hào)肽區(qū)(singelpeptidefromha)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(transmembranedomainandcytoplasmictailofha，hatm/ct)之間，或者說，將乙型肝炎病毒的pres區(qū)域插入至流感病毒血凝素的信號(hào)肽區(qū)(singelpeptidefromha)以及流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(hatm/ct)之間，來制備pres-ha融合基因，其所表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原能夠基于流感病毒血凝素較強(qiáng)的免疫原性，在體內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，使得機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)pres的免疫反應(yīng)，從而減少或者清除乙肝病毒。尤其需要說明的是，乙型肝炎病毒的pres區(qū)域能夠較為方便地插入流感病毒血凝素的n端，使得pres-ha融合基因的制備較為便捷。更具體的，乙型肝炎病毒的pres區(qū)域能夠較為方便地插入流感病毒血凝素流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的n端，使得pres-ha融合基因的制備較為便捷。通過pcr制備pres-ha融合基因。pres-ha融合基因的堿基序列如seqidno.1所示，pres-ha融合基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno.2所示。請(qǐng)參閱圖2b，其為構(gòu)建pres-ha融合基因的流程。fragment1為流感病毒血凝素的信號(hào)肽區(qū)(signalpeptidefromha)，其堿基序列如seqidno.3所示。fragment2為乙型肝炎病毒的pres區(qū)域的堿基序列(sequenceofpres)，其堿基序列如seqidno.5所示。fragment3為流感病毒跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(transmembranedomainandcytoplasmictailofha)，其堿基序列如seqidno.4所示。其中，pcr引物如下：presi、presii、presiii、presiv、presv及presvi，其中，presi的堿基序列如seqidno.12所示，presii的堿基序列如seqidno.13所示，presiii的堿基序列如seqidno.14所示，presiv的堿基序列如seqidno.15所示，presv的堿基序列如seqidno.16所示，presvi的堿基序列如seqidno.17所示。presi為如圖2b所示i，其為fragment1正鏈的引物。presii為如圖2b所示ii，其為fragment1反鏈的引物。presiii為如圖2b所示iii，其為fragment2正鏈的引物。presiv為如圖2b所示iv，其為fragment2反鏈的引物。presv為如圖2b所示v，其為fragment3正鏈的引物。presvi為如圖2b所示vi，其為fragment3反鏈的引物。又如，presi、presiii和presv為正向引物，presii、presiv和presvi為反向引物。例如，反鏈即為負(fù)鏈。本實(shí)施例中，通過pcr反應(yīng)制備pres-ha融合基因。例如，pcr反應(yīng)包括：第一pcr反應(yīng)、第二pcr反應(yīng)、第三pcr反應(yīng)、第四pcr反應(yīng)、第五pcr反應(yīng)及第六pcr反應(yīng)。通過第一pcr反應(yīng)、第二pcr反應(yīng)、第三pcr反應(yīng)分別制備fragment1、fragment2和fragment3。第一pcr反應(yīng)以流感病毒的血凝素ha序列或者pcaggs-ha質(zhì)粒為模版，以presi為正鏈引物，以presii為反鏈引物，擴(kuò)增而得到fragment1。其中，pcaggs-ha質(zhì)粒采用本實(shí)驗(yàn)室制備品，亦可采用其它來源的pcaggs-ha質(zhì)粒(例如，可由淼靈質(zhì)粒平臺(tái)采購(gòu)，貨號(hào)：vt1017)。流感病毒的血凝素ha的dna分子的提取和獲得可參照現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明在此不再贅述。第二pcr反應(yīng)以乙肝病毒的pres序列或者pet28b-pres質(zhì)粒為模版，以presiii為正鏈引物，以presiv為反鏈引物，擴(kuò)增而得到fragment2。其中，pet28b-pres質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室之前制備得到(lianm,zhoux,weil,qius,zhout,lil,etal.serumlevelsofpresantigen(hbpresag)inchronichepatitisbvirusinfectedpatients.virolj2007；4:93)，乙肝病毒的pres序列的提取和獲得可參照現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明在此不再贅述。又如，pres序列為adwsubtype,accessionnumberagw20902。第三pcr反應(yīng)以流感病毒的血凝素ha序列或者pcaggs-ha質(zhì)粒為模版，以presi為正鏈引物，以presiv為反鏈引物，擴(kuò)增而得到fragment3。第四pcr反應(yīng)以fragment1和fragment2為模版，以presi為正鏈引物，以presiv為反鏈引物，擴(kuò)增得到將fragment1和fragment2連接后的產(chǎn)物，即為fragment4。例如，fragment4為fragment1和fragment2連接后的產(chǎn)物。第五pcr反應(yīng)以fragment2和fragment3為模版，以presiii為正鏈引物，以presvi為反鏈引物，擴(kuò)增得到將fragment2和fragment3連接后的產(chǎn)物，即為fragment5?；蛘呖梢岳斫鉃?，fragment5為fragment2和fragment3連接后的產(chǎn)物。第六pcr反應(yīng)以fragment4和fragment5為模版，以presi為正鏈引物，以presvi為反鏈引物，擴(kuò)增得到將fragment4和fragment5連接后的產(chǎn)物，即為fragment6。例如，fragment6為fragment4和fragment4連接后的產(chǎn)物。fragment6即為pres-ha融合基因。本實(shí)施例中，pcr反應(yīng)的體系為：dna模版1μl，10μm的正鏈引物1μl，10μm的反鏈引物1μl，雙蒸水22μl，2×pfupcrstarmix25μl。具體在各pcr反應(yīng)中，dna模版為各pcr反應(yīng)中的模版，當(dāng)各pcr反應(yīng)中有兩個(gè)模版時(shí)，則兩個(gè)模版分別為0.5μl。當(dāng)然，本反應(yīng)體系的2×pfupcrstarmix也可以是其它的taq酶、dntp、mg2+、緩沖液替代。本實(shí)施例中，pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃持續(xù)5min，擴(kuò)增循環(huán)步驟，72℃持續(xù)5min，4℃持續(xù)30min。其中，擴(kuò)增循環(huán)步驟的一個(gè)循環(huán)依次包括：95℃持續(xù)30s、50℃持續(xù)30s和72℃持續(xù)60s，可以根據(jù)需要設(shè)置擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)。例如，擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為30次。通過上述pcr反應(yīng)，即能夠制備得到pres-ha融合基因。本實(shí)施例中，將第六pcr反應(yīng)的產(chǎn)物跑膠，即可純化得到純度較高的pres-ha融合基因。當(dāng)然，在第一pcr反應(yīng)、第二pcr反應(yīng)、第三pcr反應(yīng)、第四pcr反應(yīng)、第五pcr反應(yīng)及第六pcr反應(yīng)中，可以將其pcr反應(yīng)產(chǎn)物直接用來跑膠，純化后得到目標(biāo)產(chǎn)物后再進(jìn)行下一步反應(yīng)，也可以直接pcr反應(yīng)產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)，只是使得后續(xù)的純化步驟變得較為繁瑣。(2)、pres-ha-pcaggs質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例中，將pres-ha融合基因插入質(zhì)粒pcaggs上，從而制得pres-ha-pcaggs質(zhì)粒。在反應(yīng)中，將pcaggs使用saci和xmai酶切，在將fragment6連接在質(zhì)粒pcaggs上。其中，saci的酶切位點(diǎn)為gagctc，xmai的酶切位點(diǎn)為cccggg。一實(shí)施例中，還對(duì)fragment6使用saci和xmai酶切，其中，saci的酶切位點(diǎn)為gagctc，xmai的酶切位點(diǎn)為cccggg。其中，pcaggs的酶切操作的反應(yīng)體系為：按50μl的體系計(jì)：pcaggs溶液43μl、10×buffer5μl、saci酶1μl和xmai酶1μl。酶切操作的反應(yīng)條件為：37℃酶切過夜。又如，過夜是指反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)～18小時(shí)。待酶切操作之后得到pcaggs酶切液，將pcaggs酶切液65℃水浴20min，滅活內(nèi)切酶saci和xmai，得到酶切后的pcaggs。其中，fragment6的酶切操作的反應(yīng)體系為：按50μl的體系計(jì)：fragment6溶液43μl、10×buffer5μl、saci酶1μl和xmai酶1μl。酶切操作的反應(yīng)條件為：37℃酶切過夜。又如，過夜是指4小時(shí)～18小時(shí)。待酶切操作之后得到fragment6酶切液，將fragment6酶切液65℃水浴20min，滅活內(nèi)切酶saci和xmai，得到酶切后的fragment6。將酶切后的pcaggs和酶切后的fragment6進(jìn)行連接操作，得到pres-ha-pcaggs質(zhì)粒。其中，連接操作的反應(yīng)體系為：10μl連接反應(yīng)體系計(jì)：t4連接酶1μl，10×t4buffer1μl，酶切后的pcaggs1μl，酶切后的fragment6或者融合基因pres-ha7μl。連接操作的反應(yīng)在37℃持續(xù)2h。(3)、m1-pcaggs質(zhì)粒的構(gòu)建將流感病毒的基質(zhì)蛋白m1序列插入pcaggs空載，形成一個(gè)m1-pcaggs質(zhì)粒。其中，流感病毒的基質(zhì)蛋白m1的堿基序列如seqidno.6所示，或者說，其由如seqidno.6所示的核苷酸所表達(dá)，m1的氨基酸序列如seqidno.18所示，為了增強(qiáng)對(duì)流感病毒顆粒的釋放，本實(shí)施例中，將m1的第41位氨基酸突變成為了丙氨酸(ala)，以增強(qiáng)對(duì)病毒性顆粒的釋放，達(dá)到提高后續(xù)制備得到的presvlp的產(chǎn)量的效果。其中，流感病毒的基質(zhì)蛋白m1序列編碼的基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如seqidno.18所示。本實(shí)施例子中，質(zhì)粒pcaggs的酶切位點(diǎn)是saci(gagctc)和xmai(cccggg)。其中，流感病毒為a/sw/spain/53207/04。2、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入293t細(xì)胞將質(zhì)粒m1-pcaggs和質(zhì)粒pres-ha-pcaggs共轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中共表達(dá)蛋白，這些蛋白可自組裝成pres病毒樣顆粒，即為presvlp。一實(shí)施例中，在共轉(zhuǎn)染操作中，使用聚乙烯亞胺(polyethylenimine，pei)轉(zhuǎn)染法。為了檢測(cè)將質(zhì)粒pcaggs-m1和pcaggs-pres-ha轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中后，presvlp蛋白是否表達(dá)，采用如下方法：當(dāng)將質(zhì)粒pcaggs-m1，pcaggs-pres-ha，或兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)被轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞后，細(xì)胞中的總rna用qiagenrneasyminikit提取，來分析m1和pres-ha的轉(zhuǎn)錄情況。3、制備pres多克隆抗體為了檢測(cè)presvlp的表達(dá)，可以用pres多克隆抗體作為一抗，通過westernblotting進(jìn)行檢測(cè)。首先，構(gòu)建pres-pet28b質(zhì)粒，將pres區(qū)域插入至pet28b質(zhì)粒中，形成pres-pet28b質(zhì)粒，將pres-pet28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中大腸桿菌(e.coli)中，使pres-pet28b質(zhì)粒于e.coli中表達(dá)pres蛋白。然后收集培養(yǎng)后的大腸桿菌，用buffer(50mmtris-hcl,ph8.0,500mmnacl)重懸，超聲破菌，18000rpm離心30min，收集上清液，將上清液上樣到ni柱，使用buffer(50mmtris-hcl,ph8.0,500mmnacl,500mmimidazole)洗脫，并收集100％洗脫峰，得到pres濃縮液，將pres濃縮液經(jīng)陽離子交換柱和分子篩進(jìn)一步純化，得到純度較高的pres。pres-pet28b質(zhì)粒的構(gòu)建過程以及pres-pet28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌中表達(dá)的pres蛋白的具體純化過程請(qǐng)參見文獻(xiàn)(lianm,zhoux,weil,qius,zhout,lil,etal.serumlevelsofpresantigen(hbpresag)inchronichepatitisbvirusinfectedpatients.virolj2007；4:93)。將純化的pres蛋白作為抗原，免疫新西蘭白兔，經(jīng)過3～4次免疫之后，使用抗原親和純化的方法獲得針對(duì)pres蛋白的特異性多克隆抗體，即為pres多克隆抗體。4、表達(dá)和純化pres病毒樣顆粒疫苗將m1-pcaggs質(zhì)粒和pres-ha-pcaggs質(zhì)粒兩個(gè)質(zhì)粒使用聚乙烯亞胺(polyethylenimine，pei)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入293t細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的293t細(xì)胞使用含有10％fbs(fetalbovineserum，胎牛血清)的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)后，將培養(yǎng)液4℃,5000rpm～6000rpm離心15min，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。將上清液于4℃,22000rpm～25000rpm超速離心3個(gè)小時(shí)，得到沉淀，棄上清。將沉淀用buffer(1.5％tritonx-100,20mmtris,150mmnacl,2mmdtt,ph7.5)重懸后得到重懸液，將重懸液上樣到5％～50％蔗糖梯度離心管中，其中，該蔗糖梯度由buffer(20mmtris,150mmnacl,ph7.5)制備而成。將上樣后的5％～50％蔗糖梯度離心管于40000rpm，4℃，離心6.5小時(shí)。收集presvlp所處梯度帶，于4℃，33000rpm超速離心5小時(shí)去蔗糖，即得到純化pres病毒樣顆粒疫苗，即為presvlp。然后采用westernblotting鑒定presvlp。其中，在轉(zhuǎn)染后使用熒光免疫檢驗(yàn)法檢測(cè)m1-pcaggs質(zhì)粒和pres-ha-pcaggs質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入293t細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后，并將293t細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)之后，使用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定細(xì)胞后，將細(xì)胞分成兩組，第一組使用0.2％tritonx-100的通透劑處理5分鐘，第二組不使用通透劑進(jìn)行處理。將兩組細(xì)胞使用含有5％羊血清的pbs封閉后，使用pres多克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行4℃過夜孵化。孵化后，使用alexa488-conjugatedgoatanti-rabbitsecondaryantibody對(duì)細(xì)胞第二次孵化，第二次孵化為在37℃的溫度下孵化1小時(shí)。將經(jīng)過第二次孵化后的細(xì)胞使用pbs清洗后，使用dapi染色10分鐘，之后將其上樣到載玻片上進(jìn)行熒光檢測(cè)。使用zeiss510激光共聚焦顯微鏡100倍下隨機(jī)取樣觀察。其中，m1和pres-ha的表達(dá)進(jìn)一步通過液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms/ms)來進(jìn)行分析。將梯度離心后收集的含有m1基質(zhì)蛋白和pres-ha嵌合蛋白的40％的蔗糖，將其進(jìn)行12％sds-page凝膠電泳，使用考馬斯亮藍(lán)r250進(jìn)行染色，將考馬斯亮藍(lán)r250染色后的凝膠切掉，對(duì)切出的凝膠使用含有胰蛋白酶(promega,enzyme:protein＝1:50(wt/wt))的碳酸氫銨緩沖液對(duì)其消化，消化溫度37℃，消化時(shí)間為12小時(shí)，碳酸氫銨緩沖液的濃度為25mm。將經(jīng)過胰蛋白酶消化后的樣品重新溶解在含有2％乙腈和0.1％甲酸的溶液中，并將其上樣到chromxpc18(3μm,)中的奈米微粒捕集柱上，線上的分離和脫鹽操作使用溶劑a在2μl/min的流速下持續(xù)10分鐘，其中溶劑a包括體積比為98：2：0.1的水、乙腈和甲酸，溶劑b包括體積比為2：98：0.1的水、乙腈和甲酸。然后在分析柱(75μmx15cmc18-3μmchromxpeksigent)使用5-35％的乙腈(含有0.1％的甲酸)梯度洗脫60分鐘，之后將洗脫液使用液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms/ms)進(jìn)行分析，液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms/ms)分析系統(tǒng)使用tripletof5600system(absciex,concord,on)裝有nanosprayiiisource(absciex,concord,on)。數(shù)據(jù)的獲得通過使用2.5kv的離子噴涂電壓、30psi的氣簾氣、5psi的霧化氣體及界面加熱溫度到150℃而獲得。ms中使用質(zhì)譜掃描操作，使用ida在250毫秒獲得掃描數(shù)據(jù)，在90毫秒的離子掃描下收集多達(dá)25個(gè)產(chǎn)物，收集的條件為超過150個(gè)/秒計(jì)數(shù)閾值以及在+2到+4的充電狀態(tài)下。動(dòng)碰撞能量設(shè)置適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)的解離，動(dòng)態(tài)排除被設(shè)定為1/2峰寬(～12s)，數(shù)據(jù)分析中，文件通過proteinpilot5處理。搜索是針對(duì)本地?cái)?shù)據(jù)庫包括m1和pres-ha嵌合蛋白序列下進(jìn)行，使用默認(rèn)設(shè)置。最終獲得m1和pres-ha的氨基酸序列。4、透射電子顯微鏡觀察presvlp超微結(jié)構(gòu)將400目碳膜銅網(wǎng)于純化的presvlp溶液中漂浮浸泡2分鐘，銅網(wǎng)用buffer(20mmtris,ph7.4,120mmkcl)清洗，用1％磷鎢酸負(fù)染色，染色數(shù)分鐘后，用濾紙吸干染液，在透射電子顯微鏡下觀察presvlp的超微結(jié)構(gòu)。從圖5及圖7d可以證實(shí)，presvlp為包含一個(gè)球形的包膜顆粒，在顆粒外緣有刺突樣結(jié)構(gòu)。這表明了乙肝重組抗原被成功嵌合于流感病毒基質(zhì)蛋白的表面，即，成功將pres-ha嵌合蛋白包裝在vlp的表面，以使其有更多被展示的表面積，以使其進(jìn)入機(jī)體后以帶來更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。5、疫苗接種實(shí)驗(yàn)將上述制備得到的presvlp用于小鼠實(shí)驗(yàn)。其目的是通過檢測(cè)中和抗體水平以及細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)來評(píng)估presvlp疫苗的免疫原性。將6到8周雌性balb/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只小鼠。即，空白對(duì)照一組，肌注pres蛋白+佐劑一組，肌注pres蛋白一組，肌注presvlp+佐劑一組和肌注presvlp一組。其中，pres蛋白為pres-pet28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌所表達(dá)。各小組分別于第0天、22天，給各小組的老鼠后肢肌內(nèi)注射，空白對(duì)照組小鼠于后肢肌內(nèi)注射100μlpbs，其他小組在加與不加氫氧化鋁佐劑情況下，分別于后肢肌內(nèi)注射10μgpres蛋白、10μgpresvlp疫苗。分別于第30天、第52天、第70天、第90天、第112天采血，用于測(cè)定中和抗體滴度。第67天時(shí)，各組取一只小鼠將小鼠處死，取脾臟分離淋巴細(xì)胞用于評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。取每組小鼠未分離的脾細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(1～2)×106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，(1～2)×105細(xì)胞/100μl/孔，每組設(shè)3孔。于37℃與hbvpres抗原(5μg/ml)孵育4天，每孔加入氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷([3h]-胸苷)繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。根據(jù)氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷的滲入率測(cè)定t細(xì)胞增殖水平。試驗(yàn)結(jié)果以刺激指數(shù)(stimulationindex，si)表示。第70天時(shí)，通過水動(dòng)力注射1.3拷貝乙肝病毒基因組的質(zhì)粒(10μg)來制備乙肝病毒復(fù)制模型，第77天，收集肝組織用于檢測(cè)乙肝rna或免疫組織化學(xué)染色或分析t細(xì)胞反應(yīng)。并分別于第70、72、74和77天，采血制備血清樣品，用于檢測(cè)hbsag、hbeag、hbcag以及anti-pres中和抗體。(1)、elisa法測(cè)定小鼠血清中的抗體滴度采用elisa法測(cè)定血清的抗體滴度。血清為疫苗接種實(shí)驗(yàn)中所采集的血液中的血清。取200μl血清樣品，適當(dāng)稀釋，分別加到含有pres多克隆抗體的磁珠的各個(gè)孔中。室溫孵育18小時(shí)后，超純水清洗磁珠除去未結(jié)合的抗體。磁珠與biotin-taggedpres和peroxidase-conjugatedrabbitanti-biotin于40℃水浴孵育2小時(shí)。清洗，磁珠被轉(zhuǎn)移到各個(gè)試驗(yàn)管中，將300μlo-phenylenediamine·2hcl加入到各個(gè)管中。室溫孵育30分鐘，加入1ml1mh2so4終止反應(yīng)，于492nm:600nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。圖8a至圖8d可以證實(shí)，presvlp具有更高的免疫原性，即使presvlp沒有使用任何佐劑。(2)、elispot法測(cè)定t細(xì)胞反應(yīng)cd4+和cd8+t細(xì)胞反應(yīng)通過干擾素γ(ifn-γ)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)和白介素2(il-2)等細(xì)胞因子染色試驗(yàn)來評(píng)估。使用小鼠淋巴細(xì)胞分離液從脾臟中分離得到淋巴細(xì)胞。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(elispot試驗(yàn))測(cè)定小鼠ifn-γ分泌性t細(xì)胞、tnf-α分泌性t細(xì)胞和il-2分泌性t細(xì)胞的數(shù)量。圖9a至圖9d可以證實(shí)，presvlp可以引起很強(qiáng)的具有清除乙肝病毒作用的pres-特異性cd8+t細(xì)胞。(3)、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)淋巴細(xì)胞增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過程的一個(gè)重要階段。檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平可以評(píng)估免疫小鼠后，小鼠免疫功能的變化。取每組小鼠未分離的脾細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1～2×106個(gè)/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，1～2×105細(xì)胞/100μl/孔，每組設(shè)3孔。于37℃與hbvpres抗原(5μg/ml)孵育4天，每孔加入氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷([3h]-胸苷)繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。根據(jù)氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷的滲入率測(cè)定t細(xì)胞增殖水平。試驗(yàn)結(jié)果以刺激指數(shù)(stimulationindex，si)表示。圖11a至圖11f的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)，presvlp的保護(hù)效果與記憶t細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)，表明presvlp能夠引起很強(qiáng)的anti-pres中和抗體和pres-特異性t細(xì)胞反應(yīng)，可以起到預(yù)防感染的作用，有潛力轉(zhuǎn)化到醫(yī)學(xué)上成為一種新穎的預(yù)防性或治療性乙肝疫苗。6、治療性疫苗接種試驗(yàn)為了進(jìn)一步探討presvlp是否可以成為一種治療性疫苗，對(duì)hbv感染小鼠模型進(jìn)行疫苗接種試驗(yàn)。雌性，6～8周，c57bl/6小鼠，于小鼠尾靜脈水動(dòng)力注射10μgpaav/hbv1.2plasmiddna(包含hbv全長(zhǎng)基因組dna)可制備hbv感染模型。第3天、5天和7天，空白對(duì)照組小鼠于后肢肌內(nèi)注射100μlpbs，其他小組在加與不加氫氧化鋁佐劑情況下，分別于后肢肌內(nèi)注射10μgpres蛋白、10μgpresvlp疫苗。即，空白對(duì)照一組，肌注pres蛋白+佐劑一組，肌注pres蛋白一組，肌注presvlp+佐劑一組和肌注presvlp一組。例如，給各小組注射的時(shí)間為第3天、5天和7天。分別于第10天和17天采血，測(cè)定anti-pres，anti-hbsag，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)，hbeag，hbsag和hbvdna。第17天，將小鼠處死，取脾臟，分離淋巴細(xì)胞，分別用于測(cè)定t細(xì)胞反應(yīng)和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。第17天，取小鼠肝臟，用于檢測(cè)hbcag+肝細(xì)胞的百分率。試驗(yàn)結(jié)果說明如下。請(qǐng)參閱圖3a，其為質(zhì)粒構(gòu)建后的sds-page鑒定結(jié)果，成功構(gòu)建pres-ha-pcaggs質(zhì)粒、flum1-pcaggs質(zhì)粒和pres-pet28b質(zhì)粒。請(qǐng)參閱圖3b，其為pres-pet28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌后表達(dá)并純化得到的pres蛋白的sds-page鑒定結(jié)果，可以看出，成功純化得到pres蛋白。該pres蛋白為pres-pet28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染如大腸桿菌中，表達(dá)并純化得到pres蛋白。請(qǐng)參閱圖3c，其為pres多克隆抗體sds-page鑒定結(jié)果，成功制備pres多克隆抗體。抗體純化后純度在95％以上。請(qǐng)參閱圖4，其為presvlp的westernblotting鑒定結(jié)果。由此可見，成功表達(dá)和純化presvlp。請(qǐng)參閱圖5，其為presvlp透射電子顯微鏡分析結(jié)果。結(jié)果顯示，presvlp為包含一個(gè)球形的包膜顆粒，在顆粒外緣有刺突樣結(jié)構(gòu)。這表明了乙肝重組抗原被成功嵌合于流感病毒基質(zhì)蛋白的表面，即，成功將pres-ha嵌合蛋白包裝在vlp的表面，以使其有更多被展示的表面積，以使其進(jìn)入機(jī)體后以帶來更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。其參閱圖6a、圖6b及圖6c，其中的結(jié)果為presvlp的構(gòu)建與表達(dá)的驗(yàn)證結(jié)果。例如，本實(shí)施例設(shè)計(jì)了pres病毒樣顆粒(presvlp)，即流感病毒的基質(zhì)蛋白m1和血凝素ha的跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)形成納米顆粒骨架，與ha融合的乙肝病毒pres抗原被展示在納米顆粒的表面。ha的信號(hào)肽被加到pres序列的n端，該信號(hào)肽在嵌合蛋白表達(dá)時(shí)被移除了。此外，通過將m1蛋白的第41位脯氨酸被突變成丙氨酸，以增強(qiáng)病毒樣顆粒的釋放。當(dāng)pcaggs-m1質(zhì)粒，pcaggs-pres-ha質(zhì)粒，或兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)被轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞，細(xì)胞中的總rna用qiagenrneasyminikit提取，來分析m1和pres-ha的轉(zhuǎn)錄情況。請(qǐng)參閱圖6a，qpcr結(jié)果表明轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，m1和pres-ha基因均有發(fā)生轉(zhuǎn)錄。請(qǐng)一并參閱圖6b和圖6c，其為細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，當(dāng)共轉(zhuǎn)染兩個(gè)pcaggs質(zhì)粒至293t細(xì)胞，即將pres-ha-pcaggs質(zhì)粒和m1-pcaggs質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞時(shí)，通過細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到細(xì)胞膜上pres抗原的表達(dá)。在圖6b中，293t細(xì)胞被pcaggs-m1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或者被pcaggs-pres-ha質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,或被pcaggs-m1質(zhì)粒和pcaggs-pres-ha質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞沒有經(jīng)過通透化處理，細(xì)胞核用dapi染色，pres抗原用anti-pressera反應(yīng)，再用alexa488-conjugatedgoatanti-rabbitsecondaryantibody檢測(cè)pres抗原的表達(dá)情況。圖6c中的細(xì)胞與圖6b中細(xì)胞處理步驟的一致，除了細(xì)胞在染色前用tritonx-100進(jìn)行通透化處理。從圖6b及圖6c可以看出，只使用anti-pres時(shí)，只有pres-ha和m1蛋白共表達(dá)時(shí)，pres才能被展示在細(xì)胞膜外。而在使用tritonx-100進(jìn)行通透化處理后，可以見到細(xì)胞內(nèi)也大量表達(dá)出了pres-ha嵌合蛋白。這與pres-ha嵌合蛋白/pres-ha嵌合蛋白的構(gòu)建一致，因?yàn)閔a的跨膜區(qū)使pres-ha嵌合蛋白維持在細(xì)胞膜上。當(dāng)m1蛋白沒有共表達(dá)時(shí)，pres-ha嵌合蛋白不能將pres抗原展示在細(xì)胞膜外，因?yàn)橛胻ritonx-100進(jìn)行透膜化處理后檢測(cè)不到pres的表達(dá)。同時(shí)從圖6a中的westernblot實(shí)驗(yàn)也證明了293t細(xì)胞中pres-ha的表達(dá)。并且，從圖6b及6c可以看出，只有當(dāng)m1共表達(dá)時(shí)，才能檢測(cè)到上清中pres-ha的存在，這表明m1對(duì)于pres-ha從293t細(xì)胞中分泌出去是必需的。也就是說，通過將pcaggs-m1質(zhì)粒和pcaggs-pres-ha質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于293t細(xì)胞中后，m1的表達(dá)可以促使pres-ha嵌合蛋白被分泌至細(xì)胞外，在培養(yǎng)293t細(xì)胞的上清液中即可檢測(cè)到pres-ha嵌合蛋白。請(qǐng)一并參閱圖7a、圖7b、圖7c、圖7d及圖7e，其為presvlp的純化和293t細(xì)胞被轉(zhuǎn)染pcaggs-m1和pcaggs-pres-ha，將轉(zhuǎn)染后的293t細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)基，低速離心去除細(xì)胞沉淀，取上清，高速離心濃縮得到病毒樣顆粒沉淀，將病毒樣顆粒沉淀用pbs重懸，上樣至20-60％的蔗糖密度梯度溶液，于beckmansw41ti轉(zhuǎn)子，30000rpm，4℃，離心3小時(shí)。然后收集40％蔗糖液組分。其中，圖7a為westernblot分析質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞沉淀和上清中pres-ha的表達(dá)情況，可以看出pcaggs-m1和pcaggs-pres-ha在上清液中都有檢測(cè)出。圖7b為sds-page分析蔗糖密度梯度離心法所得各個(gè)組分樣品，可以看出，主要的蛋白組分在40％蔗糖液中。圖7c為westernblot分析結(jié)果顯示，左邊第一列是大腸桿菌中表達(dá)的pres蛋白，第二列和第三列是蔗糖液組分中的pres-ha。圖7d為電鏡結(jié)果展示pres病毒樣顆粒(presvlp)，放大倍數(shù)為11,000×，其中的黑點(diǎn)即為pres病毒樣顆粒，黑點(diǎn)較大的為多個(gè)pres病毒樣顆粒聚集下的影像。圖7e為lc-ms/ms鑒定40％蔗糖液中的m1和pres-ha，得出的m1序列和pres-ha序列，其中，多肽可信度:gray,nomatch；red,>0and<50％；yellow,>＝50％and<95％；green,>＝95％。將40％蔗糖液組分進(jìn)行分析。從圖7b及圖7c可以看出，通過sds-page和westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到pres-ha嵌合蛋白的表達(dá)。從圖7d可以看出，負(fù)染色電鏡結(jié)果顯示樣品中含有病毒樣顆粒。樣品進(jìn)一步通過lc-ms/ms進(jìn)行檢測(cè)。從圖7e可以看出，質(zhì)譜鑒定到的m1序列占其全長(zhǎng)序列的90％以上。然而，只鑒定到2個(gè)高可信度的(>＝95％)pres-ha肽段，這可能是因?yàn)閜res發(fā)生了糖基化修飾。上述數(shù)據(jù)表明包含m1和pres-ha的病毒樣顆粒被成功純化得到。請(qǐng)一并參閱圖8a至圖8d、圖9a至圖9d，其為免疫presvlp的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。請(qǐng)一并參閱圖8a、圖8b、圖8c及圖8d，將采集小鼠血制備到的血清樣品，所有血清被稀釋100倍，并通過elisa法檢測(cè)anti-pres抗體滴度。elisa板用1μg/mlpresvlp包被用于檢測(cè)30天免疫反應(yīng)的總igg。elisa板用5μg/ml重組pres包被用于檢測(cè)30天及90天的總igg、igg1及igg2a。從圖8a及圖8b可以看出，相比于重組pres蛋白，presvlp能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的總igg。從圖8c可以看出，相比于重組pres蛋白，presvlp能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的總igg1。從圖8d可以看出，相比于重組pres蛋白，presvlp能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的總igg2a。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明相比于重組pres蛋白，presvlp具有更高的免疫原性，即使presvlp沒有使用任何佐劑。尤其是，presvlp引起很高水平的總igg包括anti-presigg1(th2isotype)和igg2a(th1isotype)。請(qǐng)參閱圖9a、圖9b、圖9c及圖9d，t細(xì)胞反應(yīng)在誘導(dǎo)體液免疫中扮演重要角色，同時(shí)對(duì)治療性乙肝疫苗也是起著不可或缺的作用。為了評(píng)估pres-特異性t細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生，第67天時(shí)，各組取一只小鼠并將其殺死，小鼠脾淋巴細(xì)胞被分離和培養(yǎng)。用pres-特異性t細(xì)胞表位多肽(請(qǐng)參閱表1)刺激6小時(shí)后，t細(xì)胞被用來分析cd4,cd8和inf-γ的表達(dá)情況。從圖9a、圖9b、圖9c及圖9d可以看出，在免疫presvlp的小鼠中,cd4+和cd8+t細(xì)胞的水平比免疫重組pres蛋白的高。cd8+t細(xì)胞或cd4+t細(xì)胞的數(shù)量與inf-γ+cd8+t細(xì)胞或inf-γ+cd4+t細(xì)胞的數(shù)量一致。inf-γ的分泌，通常被認(rèn)為是控制和清除乙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵，inf-γ的分泌用elispot法分析。結(jié)果顯示，當(dāng)小鼠被免疫presvlp時(shí)，pres-特異性inf-γ的表達(dá)量更高(圖9e)。這表明presvlp可以引起很強(qiáng)的具有清除乙肝病毒作用的pres-特異性cd8+t細(xì)胞。表1epitoperesiduesaminoacidsequence1pres110-19plgffpdhql2pres141-56wpaanqvgvgafgpgl3pres2109-134mqwnstafhqalqdprvrglylpagg同時(shí)，這也說明，pres-ha嵌合蛋白或者presvlp能夠引起較為強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，既能作為疫苗，同時(shí)，也能應(yīng)用在細(xì)胞免疫治療之中，即，將pres-ha融合基因、pres-ha嵌合蛋白或者presvlp用作刺激t細(xì)胞從初始t細(xì)胞開始特異性分化并成熟的刺激物。考慮到近年來較為盛行的dna疫苗，因此，pres-ha融合基因也有作為基因疫苗的潛力。請(qǐng)參考圖10a至圖10h，其中的結(jié)果可以證實(shí)，免疫presvlp可以起到預(yù)防保護(hù)和治療的作用。第70天時(shí)，通過水動(dòng)力注射1.3拷貝乙肝病毒基因組的質(zhì)粒(10μg)來制備乙肝病毒復(fù)制模型。第77天，收集肝組織用于檢測(cè)乙肝rna或免疫組織化學(xué)染色或分析t細(xì)胞反應(yīng)。hbvrna拷貝數(shù)用qpcr法檢測(cè)，從圖10a可以看出，免疫presvlp的小鼠中hbvrna的水平比免疫重組pres蛋白的明顯低很多。通過進(jìn)一步的染乙肝核心抗原的肝組織切片的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，請(qǐng)一并參閱圖10b、圖10c、圖10d及圖10e，免疫presvlp的小鼠中hbcag陽性的肝細(xì)胞幾乎被清除干凈，而免疫重組pres蛋白的小鼠中hbcag陽性的肝細(xì)胞仍然數(shù)量較多。第70，72，74和77天，采血制備血清樣品。從圖10f可以看出，hbsag水平在presvlp免疫小鼠中幾乎檢測(cè)不到，而免疫重組pres蛋白小鼠的在第74天上升到較高水平。從圖10g可以看出，hbeag水平在presvlp免疫小鼠中也是幾乎檢測(cè)不到，而免疫重組pres小鼠的在第74天先稍微上升然后再降低。從圖10h可以看出，hbsag和hbeag的清除與anti-pres中和抗體的產(chǎn)生相一致。因此，免疫presvlp可以控制和清除乙肝病毒的復(fù)制。請(qǐng)參考圖11a至圖11f，從圖中的結(jié)果可以證實(shí)，presvlp的保護(hù)效果與記憶t細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。既然cd8t細(xì)胞反應(yīng)在乙肝病毒的清除過程中扮演重要角色，t細(xì)胞記憶反應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。從圖11a、圖11b、圖11c及圖11d可以看出，免疫presvlp小鼠中，cd8+t細(xì)胞和cd4+t細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對(duì)照組和免疫重組pres蛋白組，inf-γ+cd8+t細(xì)胞或inf-γ+cd4+t細(xì)胞的數(shù)量也同樣較高。值得注意的是，免疫presvlp小鼠中cd8+t細(xì)胞的數(shù)量明顯高于免疫pres組，揭示presvlp可以激活具有清除病毒作用的記憶t細(xì)胞。此外，小鼠脾淋巴細(xì)胞(圖11e)和肝淋巴細(xì)胞(圖11f)中的t細(xì)胞記憶反應(yīng)也通過ifn-γelispot實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)。從圖11e及圖11f可以看出，免疫presvlp小鼠中pres-特異性t細(xì)胞反應(yīng)明顯強(qiáng)于免疫重組pres組，表明pres-特異性t細(xì)胞介導(dǎo)感染肝細(xì)胞中乙肝病毒的清除?？偠灾?，presvlp引起很強(qiáng)的anti-pres中和抗體和pres-特異性t細(xì)胞反應(yīng)，可以起到預(yù)防感染的作用，有潛力轉(zhuǎn)化到醫(yī)學(xué)上成為一種新穎的預(yù)防性或治療性乙肝疫苗。通過實(shí)施例1可以看出，本發(fā)明所提供的pres-ha融合基因能夠在預(yù)防或治療乙肝的疫苗或者藥物中應(yīng)用。通過實(shí)施例1中的細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)，本發(fā)明所提供的pres-ha融合基因能夠被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中表達(dá)。并且結(jié)合對(duì)照組中的重組pres實(shí)驗(yàn)，可以證實(shí)本發(fā)明所提供的pres-ha融合基因所表達(dá)的嵌合蛋白相對(duì)于對(duì)比組，能夠清除和控制乙肝病毒。通過實(shí)施例1的小鼠實(shí)驗(yàn)也可以推導(dǎo)出，pres-ha融合基因(乙肝重組抗原表達(dá)基因)、pres-ha嵌合蛋白(乙肝重組抗原)及presvlp(乙肝重組抗原病毒樣顆粒)有潛力應(yīng)用于預(yù)防、控制或清楚乙肝病毒中。因此，本發(fā)明所提供的pres-ha融合基因和蛋白，能夠?qū)σ腋尾《酒鸬筋A(yù)防感染和清除的作用，還能夠?qū)臃Nhbsag疫苗后不能產(chǎn)生抗體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有潛力轉(zhuǎn)化到醫(yī)學(xué)上成為一種新穎的預(yù)防性和治療性乙肝疫苗。同時(shí)，基于小鼠實(shí)驗(yàn)的注射劑量，可以推導(dǎo)出presvlp(乙肝重組抗原病毒樣顆粒)的有效量為10微克。又或者說，以六周齡的小鼠體重約計(jì)20～30克計(jì)算，將上述10微克除以體重，可以推導(dǎo)出有效量為0.0000001～0.5微克/g體重。這樣，有望提供一種乙肝防治的疫苗組合物疫苗，包括有效量的如上presvlp。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。sequencelisting<110>北京大學(xué)深圳研究生院<120>乙肝重組抗原及其表達(dá)基因、構(gòu)建方法、病毒樣顆粒及其制備方法、應(yīng)用與疫苗<130>乙肝重組抗原及其表達(dá)基因、構(gòu)建方法、病毒樣顆粒及其制備方法、應(yīng)用與疫苗<160>18<170>patentinversion3.3<210>1<211>678<212>dna<213>乙肝病毒、流感病毒<400>1atggaagcaaaattgtttgtattattctgtgcattcactgcactgaaagctatggggacg60aatctttctgttcccaaccctctgggattctttcccgatcatcagttggaccctgcattc120ggagccaactcaaacaatccagattgggacttcaaccccatcaaggaccactggccagca180gccaaccaggtaggagtaggagcattcgggccagggctcacccctccacacggcggtatt240ttggggtggagccctcaggctcagggcatattgaccacagtgtcaacaattcctcctcct300gcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccatctctccacctctaagagac360agtcatcctcaggccatgcagtggaattccactgccttccaccaagctctgcaggatccc420agagtcaggggtctgtatcttcctgctggtggctccagttcaggaacagtaaaccctgct480ccgaatattgcctctcacatctcgtcaatctccgcgaggactggggaccctgtgacgaac540aaactagaatcagtgggagttcatcagattttggcgatctactccacagtcgccagttcc600ctggtattgctagtctccctgggggcaatcagcttctggatgtgctctaatgggtcattg660caatgcagaatatgcatt678<210>2<211>226<212>prt<213>乙肝病毒，流感病毒<400>2metglualalysleuphevalleuphecysalaphethralaleulys151015alametglythrasnleuservalproasnproleuglyphephepro202530asphisglnleuaspproalapheglyalaasnserasnasnproasp354045trpasppheasnproilelysasphistrpproalaalaasnglnval505560glyvalglyalapheglyproglyleuthrproprohisglyglyile65707580leuglytrpserproglnalaglnglyileleuthrthrvalserthr859095ileproproproalaserthrasnargglnserglyargglnprothr100105110proileserproproleuargaspserhisproglnalametglntrp115120125asnserthrala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