本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類化合物及其合成方法。

背景技術(shù)：

腫瘤已嚴(yán)重威脅到人類的健康，尋找有效安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤藥物研發(fā)工作者孜孜以求的目標(biāo)。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展，以吡唑環(huán)為結(jié)構(gòu)母核的化合物在腫瘤治療中的作用引起廣泛關(guān)注。

甘草查爾酮A被視為脹果甘草的種屬特異性成分，其結(jié)構(gòu)如下。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降脂、解痙和抗瘧抗寄生蟲(chóng)等多種生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。甘草查爾酮A是平面性強(qiáng)的分子，水溶性差，因而通過(guò)合理、安全的結(jié)構(gòu)修飾增強(qiáng)甘草查爾酮A的水溶性，開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物甘草查爾酮A的更多生物活性，成為亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類化合物及其合成方法。

本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：

結(jié)構(gòu)通式（I）所示的化合物，

其中：R為氫基，C1-C4的烷基，鹵素取代或未取代的苯基，氨基。

結(jié)構(gòu)通式（I）所示的化合物的合成方法，其特征在于：由甘草查爾酮A、氨基脲類化合物為原料，以有機(jī)堿為催化劑進(jìn)行合成；

。

具體包含如下步驟：

（1）向反應(yīng)器中按摩爾比為1:1~1:1.5加入甘草查爾酮A和氨基脲類化合物，加入有機(jī)溶劑混合均勻，加入有機(jī)堿催化劑，80℃~120℃回流反應(yīng)3~8小時(shí)；

（2）將步驟（1）反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，柱層析分離提純，干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟（1）中所述的甘草查爾酮A：氨基脲類化合物的摩爾比范圍為1:1 ~1:1.3；有機(jī)溶劑為甲苯或DMF；反應(yīng)溫度為105℃~115℃；有機(jī)堿催化劑為三乙胺。

吡唑環(huán)是很多天然化合物和合成藥物中的核心結(jié)構(gòu)單元，作為雜環(huán)化合物中的一個(gè)重要分支，吡唑類化合物因其具有高效、低毒，以及其環(huán)上取代基可以多方位的變換而在藥物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。將吡唑環(huán)引入甘草查爾酮A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，可以增強(qiáng)其生物活性，提高選擇性，具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：原料環(huán)保，生產(chǎn)成本低，操作安全性高，反應(yīng)條件溫和，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)原料的充分利用，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低的問(wèn)題，同時(shí)將吡唑環(huán)引入到甘草查爾酮A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，對(duì)探究該類化合物的生物活性與總結(jié)構(gòu)效關(guān)系具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅是出于解釋說(shuō)明的目的，而不限制本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。

一種具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類化合物的合成方法具體包含如下步驟：

（1）向反應(yīng)器中按摩爾比為1:1~1:1.5加入甘草查爾酮A、氨基脲類化合物，加甲苯或DMF混合均勻，其中溶劑體積小于反應(yīng)器容積的2/3，加入有機(jī)堿催化劑三乙胺，置于磁力攪拌器上攪拌，加熱到80℃~120℃，回流反應(yīng)3~8小時(shí)；

（2）反應(yīng)過(guò)程中使用薄層色譜追蹤，及時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度，待原料反應(yīng)完全后停止加熱，撤去冷凝裝置；

（3）將步驟（2）反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮，濃縮液過(guò)柱層析，得到目標(biāo)產(chǎn)物粗品，加有機(jī)溶劑重結(jié)晶，過(guò)濾，干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。

本發(fā)明部分優(yōu)選實(shí)施方案中的化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：

實(shí)施例1

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-吡唑-1-甲酰胺（1）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和57.68mg(1.3mmol) 氨基脲，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到100℃，磁力攪拌回流反應(yīng)6小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（113.41mg），總收率48.65%。

棕色結(jié)晶性粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 9.68 (2H, s),7.74 (2H, t),7.30 (1H, s), 6.82 (2H, t), 6.45 (1H, s), 6.20 (3H, m), 5.00-4.90 (3H, m), 3.69-3.94 (5H, m), 1.46 (6H, s); ¹³C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 160.8, 155.3, 155.1, 154.7, 153.9, 148.8, 129.1, 128.3, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 62.4, 56.1, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 340.18, found: 340.29.

實(shí)施例2

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-N-苯基-4,5-二氫-1H-吡唑-1甲酰胺（2）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和116.15mg(1.3mmol) N-苯基肼甲酰胺，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到80℃，磁力攪拌回流反應(yīng)3小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（143.58mg），總收率51.52%。

棕黃色粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K): d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.50 ( 2H, m), 7.37 (3H, m), 7.07 ( 1H, t), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 3.96 (2H, m), 3.72 (3H, s),1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.9, 151.9, 148.8, 139.4, 129.1, 128.9, 128.3, 128.0, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 62.4, 56.1, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 472.45, found: 472.38.

實(shí)施例 3

N-（3-氯苯基）-5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫 -1H-吡唑-1-甲酰胺（3）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和142.61mg(1.3mmol) N-（3-氯苯基）肼甲酰胺，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到100℃，磁力攪拌回流反應(yīng)5小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（125.89mg），總收率42.01%。

棕黃色結(jié)晶性粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.90 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.46 ( 2H, m), 7.27 (1H, s), 7.16 (1H, d), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 3.96 (2H, m), 3.72 (3H, s),1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 138.4, 134.5, 130.3, 129.1, 125.2, 121.6, 119.7, 116.0, 111.1, 103.8, 62.4, 56.1, 39.8,39.7, 19.8;HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 506.33, found: 506.29.

實(shí)施例 4

N-（4-氯苯基）-5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫 -1H-吡唑-1-甲酰胺（4）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和142.61mg(1.3mmol) N-（4-氯苯基）肼甲酰胺，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到120℃，磁力攪拌回流反應(yīng)6小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（146.01mg），總收率48.82%。

黃色粉末固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.72( 2H, t), 7.40 ( 2H, m), 7.27 (1H, s), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 3.96 (2H, m), 3.72 (3H, s),1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 137.5, 133.3, 129.1, 129.0, 128.3, 125.2, 121.6, 120.8, 116.0, 111.1, 103.8, 62.7, 56.1, 39.8,39.7, 19.8; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 506.45, found：506.56.

實(shí)施例 5

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-吡唑-1-硫代酰肼（5）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和81.55mg(1.3mmol) 肼硫代酰肼，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到115℃，磁力攪拌回流反應(yīng)8小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（128.37mg），總收率50.92%。

褐色結(jié)晶固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K): d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.30 (1H, s), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (2H, m), 3.92 (2H, m), 3.72 (3H, s), 3.21(2H, s), 1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 181.5, 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 129.1, 129.0, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 67.5, 56.1, 40.4, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 427.32， found：427. 63.

實(shí)施例 6

5-（4-羥基-2-甲氧基-5-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-吡唑-1-碳酰肼（6）的制備。

在反應(yīng)器中加入200mg(0.6mmol)甘草查爾酮A和69.21mg(1.3mmol) 肼基酰肼，加50ml甲苯和5mLDMF作反應(yīng)溶劑，加入0.5mL三乙胺作為催化劑，電熱套加熱到105℃，磁力攪拌回流反應(yīng)6小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，柱層析，脫干得到棕色粉末（117.08mg），總收率48.26%。

褐色結(jié)晶固體。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K): d 9.68 (2H, s), 8.80 (1H, s), 7.74 (2H, t), 7.30 (1H, s), 6.82 (2H, d), 6.45 (1H, s), 6.30 (1H, m), 5.00-4.98 (3H, m), 4.35(2H, s), 3.92 (2H, m), 3.72 (3H, s), 1.46 ( 6H, s); ¹³CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 153.0, 151.9, 148.8, 129.1, 129.0, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 67.5, 56.1, 40.4, 39.8, 28.6; HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd:411.43, found:411.35.

實(shí)施例 7 本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測(cè)試

對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn),試驗(yàn)方法采用常規(guī)的MTT法。

細(xì)胞株選用：人前列腺癌(PC-3)，人胃腺癌細(xì)胞(SGC-7901)，人肺癌細(xì)胞(A-549)。培養(yǎng)液為DMEM+15%NBS+雙抗。

樣品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均勻的混懸液，然后用DMSO的PBS(-)稀釋，最終濃度分別為0.1,1,10,20,40,60,80,100 μmol/L。

將抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶 (5-FU) 以同樣的條件配成對(duì)照品溶液。

細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各100萬(wàn)U/L）的 1640 培養(yǎng)液中，置于 37℃，5% CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每 2～3 天傳代 1 次，傳代時(shí)首先倒出培養(yǎng)液，PBS洗 2 次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及IC₅₀的測(cè)定：

實(shí)驗(yàn)原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將黃色的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜 (MTT formazan),并沉積在細(xì)胞中，生成的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。DMSO能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，顏色深淺與所含的量成正比，因此用酶標(biāo)儀測(cè)定的光吸收值可反映細(xì)胞存活率。

實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以 3×105/mL 的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。培養(yǎng) 24小時(shí)后，將待測(cè)化合物以0.1,1,10,20,40,60,80,100 μmol/L濃度處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以含0.4% DMSO的培養(yǎng)液作對(duì)照。藥物作用 48小時(shí)后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽）(1mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí)，棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度值，采用 IC₅₀ 計(jì)算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1，其中，樣品是指相應(yīng)實(shí)施例中制備的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類衍生物，樣品編號(hào)對(duì)應(yīng)制備實(shí)施例中所得到的化合物的具體編號(hào)。

表1 化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC₅₀（單位：μmol/L）

表1結(jié)果顯示，化合物1-6在所測(cè)試的3種細(xì)胞株中均表現(xiàn)出了不同程度的抗腫瘤活性，其中化合物1和5的活性較好，對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑制效果，在特定細(xì)胞株中抗腫瘤活性優(yōu)于或等同于5-氟尿嘧啶，對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株具有明顯選擇性。綜上，本發(fā)明的甘草查爾酮A二氫吡唑甲酰胺類衍生物可作為抗腫瘤候選藥物進(jìn)一步進(jìn)行臨床前研究，也可以作為抗腫瘤先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究。