本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP分子標(biāo)記、以及檢測水稻鎘低積累基因OsHMA3的方法。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)系譜法育種是近年來最為普遍的水稻育種方法，也因此誕生了大量的高產(chǎn)量優(yōu)質(zhì)水稻品種。但是傳統(tǒng)的雜交結(jié)合表型的選育方法往往因?yàn)楹暧^上表型把握不準(zhǔn)而需要加大回交群體，這極大的增加了育種工作量與成本。分子標(biāo)記輔助育種可以從遺傳基礎(chǔ)上跟蹤目標(biāo)性狀，選擇含有目標(biāo)基因的單株進(jìn)行雜交(回交)，這樣不但能準(zhǔn)確的進(jìn)行目標(biāo)性狀方向的育種，而且能減小回交群體的大小，節(jié)省成本。SNP是singlenucleotidepolymorphism的縮寫，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。SNP包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，也包括插入或缺失，在整個(gè)基因組上具有高密度性，因此比較容易找到目標(biāo)基因的SNP。利用目標(biāo)基因的SNP標(biāo)記可以在育種過程中進(jìn)行相關(guān)性狀的精準(zhǔn)選育，也可以將相關(guān)的SNP錨定進(jìn)芯片，在進(jìn)行全基因組標(biāo)記選擇的同時(shí)選擇含有此目標(biāo)基因的個(gè)體(單株)。水稻籽粒鎘含量是由數(shù)量性狀(QTL)控制的，目前通過遺傳群體定位并被克隆的主效基因只有OsHMA3，因此此基因在水稻籽粒低鎘含量育種上具有重要作用。使用含有此基因的水稻供體材料與大面積推廣的高鎘品種(常規(guī)稻)雜交，并通過連續(xù)的回交使目標(biāo)基因進(jìn)入要改良的品種中，這樣就可以在水稻籽粒鎘含量性狀上達(dá)到低鎘的要求。同時(shí)待改良的雜交稻雙親中如果導(dǎo)入此基因，則含有此基因的雜交稻籽粒中鎘含量會(huì)大大降低。在水稻的改良和育種中，通過開發(fā)目標(biāo)基因的分子標(biāo)記來追蹤目標(biāo)基因。而SNP分子標(biāo)記在基因組上的密度大，也最容易找到，所以開發(fā)低鎘SNP分子標(biāo)記并以此輔助低鎘育種具有重要意義。以檢測水稻相關(guān)基因的SNP來預(yù)測其基因的存在已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在水稻育種上。在品種選育或是目標(biāo)性狀的改良過程中，使用基因芯片技術(shù)，Taqman技術(shù)，分子信標(biāo)技術(shù)和焦磷酸測序法、變相高效液相色譜等手段來測定每一個(gè)實(shí)驗(yàn)單株，選擇含有目標(biāo)基因的SNP單株再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這樣就可以改變傳統(tǒng)育種的盲目性，而且極大的減小了群體大小，節(jié)省成本。由于水稻籽粒鎘含量性狀是由數(shù)量性狀控制，表型值又不易準(zhǔn)確測定，因此目前克隆的主效基因非常少，而真正針對(duì)主效基因設(shè)計(jì)的SNP標(biāo)記也比較少?，F(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于水稻籽粒鎘含量這一性狀的SNP分子標(biāo)記基本都是根據(jù)QTL來設(shè)計(jì)的，因此這樣的SNP標(biāo)記在實(shí)際育種中價(jià)值較小。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種檢測水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP標(biāo)記的引物及含有該引物的試劑盒。本發(fā)明的再一目的在于提供鑒定或輔助鑒定低積累鎘水稻品種的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種用于檢測水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記檢測水稻第7號(hào)染色體第7431781bp處SNP變異，該SNP分子標(biāo)記的多態(tài)性為A/G。本發(fā)明提供了用于檢測水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP分子標(biāo)記的引物組合，包括：(1)兩條特異性引物：引物X：5’-ATGCCTGTTAGAGACAAAACTG-3’；引物Y：5’-ATAATGCCTGTTAGAGACAAAACTA-3’。(2)一條通用引物：引物C：5’-GGTTGACCTTCACTCCATTC-3’本發(fā)明提供了上述SNP分子標(biāo)記或引物組合在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述SNP分子標(biāo)記或引物組合在鑒定鎘低積累水稻品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述SNP分子標(biāo)記或引物組合在鑒定鎘低積累水稻基因型中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種檢測鎘低積累水稻的方法，包括以下步驟：(1)提取待測水稻基因組DNA，以其為模板，利用本發(fā)明的上述引物組合進(jìn)行KASP反應(yīng)檢測；(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段的第22bp處的堿基種類，若堿基種類為A，則待測水稻為鎘低積累水稻，若堿基種類為G，則判定待測水稻不是鎘低積累水稻。所述擴(kuò)增產(chǎn)物序列如SEQIDNO.1所示。步驟(1)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以3μl計(jì)為：20ng模板DNA，烘干后加入100UM的引物X和Y各0.0050μL，100UM的通用引物0.0125μL，2×KASPMasterMix1.4792μl，余量為超純水。步驟(1)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：驟(1)PCR擴(kuò)增在水浴熱循環(huán)儀中完成，TouchdownPCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃；第二步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用掃描儀Pherastar對(duì)KASP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取，熒光掃描的結(jié)果會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)化成圖形。含有本發(fā)明上述特異性引物的輔助鑒定水稻籽粒鎘低積累基因OsHMA3的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了上述試劑盒在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述試劑盒在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述試劑盒在檢測水稻籽粒鎘低積累的水稻品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述試劑盒在鑒定鎘低積累水稻基因型中的應(yīng)用。由于水稻籽粒鎘含量這個(gè)性狀是由數(shù)量性狀控制，表型值又不易準(zhǔn)確測定，因此目前克隆的主效基因非常少，而真正針對(duì)主效基因設(shè)計(jì)的SNP標(biāo)記也比較少。關(guān)于水稻籽粒鎘含量這一性狀的SNP分子標(biāo)記基本都是根據(jù)QTL來設(shè)計(jì)的，因此這樣的SNP標(biāo)記在實(shí)際育種中價(jià)值可能較小。本發(fā)明是針對(duì)目前根據(jù)遺傳群體定位并克隆的唯一一個(gè)低鎘基因OsHMA3設(shè)計(jì)的，含有OsHMA3基因并且正常表達(dá)的水稻品種基本都為低鎘品種。因此根據(jù)此基因開發(fā)出的低鎘SNP標(biāo)記可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測水稻鎘含量情況，在低鎘水稻育種或是定向改良中實(shí)際應(yīng)用價(jià)值強(qiáng)。本發(fā)明的開發(fā)的水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明所選擇的SNP位點(diǎn)是獨(dú)特的，而且此位點(diǎn)所代表的基因OsHMA3水稻籽粒鎘含量這一性狀的主效基因，具有很高的廣義遺傳力，能比較準(zhǔn)確的預(yù)測水稻籽粒鎘含量。(2)本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記可用于水稻未結(jié)實(shí)之前預(yù)測水稻籽粒鎘含量高低，可進(jìn)行準(zhǔn)確地篩選，顯著促進(jìn)水稻低鎘含量品種的培育。(3)檢測方法準(zhǔn)確可靠，操作簡便，水稻OsHMA3基因的SNP位點(diǎn)的檢出，能夠預(yù)測水稻籽粒鎘含量，從而更好的服務(wù)水稻低鎘品種的選育或是改良，在分子輔助育種領(lǐng)域，為水稻籽粒低鎘含量品種選育或改良提供了科學(xué)依據(jù)。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)施例1水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP分子標(biāo)記的開發(fā)根據(jù)文獻(xiàn)資料將水稻水稻OsHMA3基因定位在第7染色體上物理位置：7405745-7409553區(qū)間內(nèi)。以基因區(qū)間為中心向兩側(cè)各擴(kuò)大了50kb，根據(jù)國際水稻所3000份水稻重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)提取，并根據(jù)PIC值及SNP位點(diǎn)周邊50bp是否有其他SNP位點(diǎn)等進(jìn)行挑選。挑選出的SNP位點(diǎn)，利用BatchPrimer3對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。針對(duì)這些SNP標(biāo)記，對(duì)含有OsHMA3基因的水稻品種Nipponabre和Sasanishiki兩份基因供體材料和確定不具有OsHMA3基因功能的Chokokoku和Habataki兩個(gè)水稻品種，以及其他高鎘低鎘材料19份進(jìn)行KASP反應(yīng)驗(yàn)證，挑選出與抗性供體材料共分離及擴(kuò)增效果好的的SNP標(biāo)記。測試材料與標(biāo)記分型情況如下表1。表1測試材料與分型結(jié)果結(jié)果顯示有7個(gè)SNP在幾乎所有的高鎘材料和低鎘材料中具有多態(tài)性，因此初步確定此7個(gè)SNP為候選的低鎘SNP，見表2。根據(jù)OsHMA3克隆的文章(UenoD,YamajiN,KonoI,etal.Genelimitingcadmiumaccumulationinrice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(38):16500-16505；MiyadateH,AdachiS,HiraizumiA,etal.OsHMA3,aP1BtypeofATPaseaffectsroottoshootcadmiumtranslocationinricebymediatingeffluxintovacuoles[J].NewPhytologist,2011,189(1):190-199.)以及基因分型結(jié)果，本發(fā)明選擇了在這7個(gè)SNP上有差異的兩對(duì)親本材料(日本晴、9311以及日本晴、Cho-Ko-Koku)進(jìn)行雜交，選擇陽性的F1單株，每個(gè)組合混收500粒左右的種子，F(xiàn)2種植于典型的低鎘表型鑒定基地，進(jìn)行表型值測定，采用完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)種植。同時(shí)取F2葉片抽提DNA，進(jìn)行基因分型，結(jié)合表型值對(duì)以上初步確定的7個(gè)SNP進(jìn)行再次驗(yàn)證，以期得到通用的低鎘SNP分子標(biāo)記。同時(shí)，還采用200份具有豐富遺傳基礎(chǔ)的自然群體材料來驗(yàn)證這7個(gè)初步標(biāo)記，200份自然群體材料分別種植于2個(gè)典型低鎘鑒定基地，采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)，三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)內(nèi)種植7×2＝12個(gè)單株，收種子時(shí)排除邊際效應(yīng)，收取中間的5×2＝10株成熟種子，用于測定籽粒鎘含量。取200份自然群體材料苗期葉片CTAB法抽提DNA后進(jìn)行基因分型，基因分型結(jié)果結(jié)合表型結(jié)果對(duì)初步的7個(gè)SNP進(jìn)行驗(yàn)證，得到的結(jié)果與兩個(gè)F2分離群體驗(yàn)證結(jié)果相結(jié)合，得到最終的低鎘SNP標(biāo)記，TagSNP-K_070520，擴(kuò)增其的通用引物和特異性引物見表3、表4的黑色加粗文字。表2候選標(biāo)記及其有利等位基因編號(hào)位置等位基因X等位基因Y有利等位基因K_070505chr7.7366438TCCK_070511chr7.7421206TCTK_070515chr7.7427330GAAK_070517chr7.7430053TCTK_070520chr7.7431781GAAK_070523chr7.7435781GAAK_070151chr7.7401091GAA表3候選標(biāo)記的通用引物編號(hào)位置通用引物K_070505chr7.7366438CCTGATCTCTTCCCCAAAGK_070511chr7.7421206CTTGTAGGAGCACGTCCTTTK_070515chr7.7427330TGGGGTTTTCTATAAAATGAGAK_070517chr7.7430053CCCCATCATCTTCATCAGAK_070520chr7.7431781GGTTGACCTTCACTCCATTCK_070523chr7.7435781CATATTTTTGATGATTGGCTTCK_070151chr7.7401091CTGAATGCTTACATCCAGTTAGATACATTA表4候選標(biāo)記的特異引物實(shí)施例2水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP分子標(biāo)記的應(yīng)用1、提取待測水稻品種的基因組DNA2、擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核苷酸片段針對(duì)實(shí)施例1中篩選到的SNP位點(diǎn)，根據(jù)TagSNP-K_070520的引物(見表2)，以基因組DNA為模板，擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段，如SEQIDNO.1所示。該SNP位點(diǎn)位于PCR擴(kuò)增片段的22bp處，此處堿基多態(tài)性為A或G。KASP反應(yīng)測試在LGCSNPline基因分型平臺(tái)上進(jìn)行。在微孔反應(yīng)板中加入20ngDNA樣品，烘干后加入KASP反應(yīng)混合液，反應(yīng)體系見表5。表5KASP檢測的反應(yīng)體系終濃度體積(μL)100UM引物C0.42UM0.0125100UM引物X0.17UM0.0050100UM引物Y0.17UM0.00502xKASPMasterMix1x1.4792超純水1.4983總體積33、檢測PCR擴(kuò)增片段，獲得SNP分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增在水浴熱循環(huán)儀中完成，TouchdownPCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15分鐘；第一步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8℃；第二步擴(kuò)增反應(yīng)，94℃變性20秒，57℃退火并延伸60秒，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用掃描儀Pherastar對(duì)KASP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取，熒光掃描的結(jié)果會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)化成圖形，根據(jù)結(jié)果分析如果擴(kuò)增的第22位堿基為A，則待測水稻為鎘低積累水稻，若堿基種類為G，則判定待測水稻不是鎘低積累水稻。本發(fā)明中使用的LGCSNPline基因分型平臺(tái)與其配套試劑耗材均購于英國LGC公司。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。<110>華智水稻生物技術(shù)有限公司<120>水稻鎘低積累基因OsHMA3的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130>KHP161117620.2<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>54<212>DNA<213>水稻<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>nisa,org<400>1atgcctgttagagacaaaactncttgggcgaagatgaatggagtgaaggtcaac54<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2atgcctgttagagacaaaactg22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3ataatgcctgttagagacaaaacta25<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ggttgaccttcactccattc20當(dāng)前第1頁1 2 3