本發(fā)明涉及一種提高豬體細(xì)胞核移植效率的方法。
背景技術(shù)：
體細(xì)胞核移植技術(shù)誕生于1997年，最先在綿羊中獲得成功。其主要方法是通過(guò)顯微操作和細(xì)胞融合技術(shù)，將已經(jīng)分化完全的供體細(xì)胞移入去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)成重構(gòu)胚，激活重構(gòu)胚后進(jìn)行培養(yǎng)和移植，最后獲得完整個(gè)體。因?yàn)楂@得的個(gè)體與供體細(xì)胞的基因型完全一致，所以該技術(shù)也稱為體細(xì)胞克隆技術(shù)。因其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，體細(xì)胞克隆技術(shù)在動(dòng)物育種、疾病模型構(gòu)建、瀕危動(dòng)物保護(hù)、治療性克隆以及藥用蛋白生產(chǎn)等方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。自1997年第一只克隆羊“多莉”出生以來(lái)，體細(xì)胞克隆技術(shù)相繼在豬、牛、狗、兔、貓等多種哺乳動(dòng)物中獲得成功。盡管經(jīng)過(guò)二十年的發(fā)展，克隆技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，有一套包括卵母細(xì)胞采集、培養(yǎng)、供體細(xì)胞分離、培養(yǎng)、卵的激活、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植等整體技術(shù)，但是到目前為止，豬體細(xì)胞克隆的整體效率還很低，大約在1％左右。另外克隆豬常出現(xiàn)不健全的發(fā)育異常表現(xiàn)，如大舌頭、肺部發(fā)育不全等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種提高豬體細(xì)胞核移植效率的方法。
本發(fā)明提供了一種重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液，其中含有50nM BIX-01294和0.5nM毛殼素。
所述重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液以胚胎培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
所述胚胎培養(yǎng)液為PZM-3培養(yǎng)液。
所述重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液由BIX-01294、毛殼素和所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成。
本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液的應(yīng)用，為(a1)或(a2)：
(a1)培養(yǎng)重構(gòu)胚胎；
(a2)制備用于培養(yǎng)重構(gòu)胚胎的試劑盒。
本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液的試劑盒；所述試劑盒的用途為培養(yǎng)重構(gòu)胚胎。
本發(fā)明還保護(hù)一種用于培養(yǎng)重構(gòu)胚胎的試劑盒，所述試劑盒包括BIX-01294和毛殼素；所述BIX-01294和毛殼素的配比關(guān)系為50nmol BIX-01294：0.5nmol毛殼素。
所述試劑盒還包括以上任一所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
本發(fā)明還保護(hù)一種動(dòng)物體細(xì)胞核移植的方法，包括如下步驟：用以上任一所述重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)重構(gòu)胚胎。
所述方法包括兩個(gè)階段；第一階段，用以上任一所述重構(gòu)胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)重構(gòu)胚胎；第二階段，在不含有BIX-01294和毛殼素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)重構(gòu)胚胎。
所述第一階段為14-16h，具體為16h。
所述不含有BIX-01294和毛殼素的培養(yǎng)液具體可為以上任一所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
所述重構(gòu)胚胎的制備方法具體可為：將一個(gè)供體細(xì)胞注入至去核后的卵母細(xì)胞的卵周隙中，電擊融合并激活重構(gòu)胚胎。
所述電擊融合的條件具體可為：150v/mm、100μs、2DC的直流電脈沖。
所述“去核后的卵母細(xì)胞”的制備方法具體可為：采用盲吸法去除動(dòng)物成熟卵母細(xì)胞第一極體和細(xì)胞核。
所述供體細(xì)胞具體可為動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞。
所述動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞的制備方法具體可包括如下步驟(b1)和步驟(b2)：
(b1)取離體胎兒，剪去除頭、四肢和內(nèi)臟，將剩余部分剪碎并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，在37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)；
(b2)完成步驟(b1)后，向所述培養(yǎng)皿中加入含有15％(體積百分含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)并傳代，取傳代至第3-5代(具體可為第3代)的接觸抑制的胎兒成纖維細(xì)胞。
所述動(dòng)物成熟卵母細(xì)胞的制備方法具體可包括如下步驟：(c1)-(c3)：
(c1)取離體動(dòng)物卵巢，抽取卵泡中的卵泡液，從中挑選出包裹有3-5層卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)；
(c2)將步驟(c1)得到的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)轉(zhuǎn)移到IVM液中，在39℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h。
(c3)完成步驟(c2)后，用0.1％透明質(zhì)酸酶消化后去除卵丘細(xì)胞，挑選具有第一極體且胞質(zhì)均勻致密的成熟卵母細(xì)胞。
所述IVM液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及IVM液中的濃度為：所述溶質(zhì)及其在IVM液中的濃度為：199培養(yǎng)基0.987g/100mL、卵泡液10mL/100mL、表皮生長(zhǎng)因子1μg/100mL、促卵泡激素50mg/100mL、促黃體激素50mg/100mL、半胱氨酸7μg/100mL；所述溶劑為純水。
以上任一所述動(dòng)物具體可為哺乳動(dòng)物，更具體可為豬。
本發(fā)明通過(guò)在PZM-3培養(yǎng)液中添加一定濃度的BIX-01294和毛殼素聯(lián)合處理早期克隆胚胎，能顯著提高克隆胚胎的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)，顯著提高豬克隆胚胎的發(fā)育效率，比單獨(dú)使用BIX-01294或者毛殼素處理的效果更好，本發(fā)明對(duì)提高豬體細(xì)胞核移植技術(shù)的整體效率有重要意義。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
199培養(yǎng)基：Gibco，貨號(hào)：31100-035。
表皮生長(zhǎng)因子：Promega，貨號(hào)：G5021。
促卵泡激素：Sigma，貨號(hào)：F8174。
促黃體激素：Sigma，貨號(hào)：L5269。
IVM液(體外成熟培養(yǎng)液)由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其在IVM液中的濃度為：199培養(yǎng)基0.987g/100mL、卵泡液10mL/100mL、表皮生長(zhǎng)因子1μg/100mL、促卵泡激素50mg/100mL、促黃體激素50mg/100mL、半胱氨酸7μg/100mL；所述溶劑為純水。
BIX-01294：Sigma，貨號(hào)：B9311；BIX-01294的分子式為C28H38N6O2·3HCl，CAS號(hào)：1392399-03-9，結(jié)構(gòu)式如下：
毛殼素：Sigma，貨號(hào)：C9492；毛殼素的分子式為C30H28N6O684，CAS號(hào)：28097-03-2，結(jié)構(gòu)式如下：
DPBS緩沖液：Sigma，貨號(hào)：D5652。
實(shí)施例1、豬體細(xì)胞核移植
一、豬卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)
從屠宰場(chǎng)取豬卵巢，用含有100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的生理鹽水沖洗三遍，然后用10mL規(guī)格的一次性注射器和18號(hào)針頭抽取直徑為3-6mm的卵泡中的卵泡液，從中挑選出包裹有3-5層卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。COCs用含有100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的生理鹽水沖洗兩遍，然后轉(zhuǎn)移到IVM液中，在39℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42h。
二、豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
依次按照如下步驟制備豬胎兒成纖維細(xì)胞：
1、從妊娠35天的懷孕母豬的子宮中取出胎兒，用含有100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DPBS緩沖液沖洗。
2、取步驟1得到的胎兒，在超凈工作臺(tái)中用眼科剪去除頭、四肢和內(nèi)臟，將剩余部分用DPBS緩沖液沖洗后用滅菌的眼科剪剪碎并轉(zhuǎn)移到100mm培養(yǎng)皿中，在37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時(shí)。
3、完成步驟2后，向所述培養(yǎng)皿中加入含有15％(體積百分含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為90％時(shí)傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)液為含有15％(體積百分含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
4、用傳代至第3代的接觸抑制的胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
三、體細(xì)胞核移植
1、取完成步驟一的COCs，用0.1％透明質(zhì)酸酶消化后去除卵丘細(xì)胞，然后在IVM液中清洗三遍，挑選具有第一極體且胞質(zhì)均勻致密的成熟卵母細(xì)胞。
2、取步驟1得到的“具有第一極體且胞質(zhì)均勻致密的成熟卵母細(xì)胞”，去除第一極體及其周圍的細(xì)胞質(zhì)，然后注入一個(gè)供核細(xì)胞(供核細(xì)胞即步驟二得到的胎兒成纖維細(xì)胞)，并使其位于卵周隙中。
3、完成步驟2后，將注入供核細(xì)胞的卵母細(xì)胞移到融合槽中，采用150v/mm、100μs、2DC的直流電脈沖電擊融合并激活重構(gòu)胚胎。
4、將步驟3得到的重構(gòu)胚胎按照進(jìn)行如下分組培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為：39℃、飽和濕度、5％CO2)：
對(duì)照組：將重構(gòu)胚胎放入PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
實(shí)驗(yàn)組A：將重構(gòu)胚胎放入含有50nMBIX-01294的PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)16h，之后轉(zhuǎn)移至PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
實(shí)驗(yàn)組B：將重構(gòu)胚胎放入含有0.5nM毛殼素的PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)16h，之后轉(zhuǎn)移至PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
實(shí)驗(yàn)組C：將重構(gòu)胚胎放入含有50nMBIX-01294和0.5nM毛殼素的PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)16h，之后轉(zhuǎn)移至PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
實(shí)驗(yàn)組D：將重構(gòu)胚胎放入含有50nMBIX-01294和1.0nM毛殼素的PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)16h，之后轉(zhuǎn)移至PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天。
3、在培養(yǎng)的第24小時(shí)和第7天時(shí)觀察記錄卵裂數(shù)和囊胚數(shù)。結(jié)果如表1所示。
表1不同組別卵裂數(shù)和囊胚數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
注：統(tǒng)計(jì)分析4次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算其平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列中的不同小寫(xiě)字母上標(biāo)代表差異顯著(P＜0.05)
結(jié)果表明，使用50nMBIX-01294和0.5nM毛殼素同時(shí)處理的豬克隆胚胎，第7天時(shí)囊胚率顯著高于對(duì)照組、單獨(dú)使用BIX-01294處理和單獨(dú)使用毛殼素處理的胚胎。