本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種具有腦靶向功能的多肽分子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，腦部相關(guān)疾病的發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，其中，腦瘤及腦轉(zhuǎn)移瘤、缺血性腦損傷以及各類病毒炎癥相關(guān)疾病的上升趨勢(shì)尤其明顯。

在對(duì)腦部相關(guān)疾病的治療方面，血腦屏障被認(rèn)為是阻止化療藥物進(jìn)入腦組織進(jìn)而影響療效的主要原因。血腦屏障是指腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，是機(jī)體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之一，由介于血循環(huán)與腦實(shí)質(zhì)間的軟腦膜、脈絡(luò)叢的腦毛細(xì)血管壁和包于壁外的膠質(zhì)膜所組成，能阻擋病原生物和其他大分子物質(zhì)由血循環(huán)進(jìn)入腦組織和腦室。這種結(jié)構(gòu)可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。然而，正因如此，基本上100％的大分子藥物，包括多肽、重組蛋白、單克隆抗體、基于RNA干擾技術(shù)的藥物、基因治療相關(guān)藥物等都無(wú)法穿越血腦屏障，且大于98％的小分子藥物也無(wú)法穿過(guò)血腦屏障。因此，血腦屏障在阻擋有害物質(zhì)的同時(shí)，也對(duì)應(yīng)用藥物對(duì)腦部相關(guān)疾病的治療產(chǎn)生了巨大的障礙。

肽是α－氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，通常由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物都可以成為叫多肽。多肽也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。由于其具有極性末端和非極性末端，因此在體內(nèi)有較高的利用度。由于多肽本身為內(nèi)源性物質(zhì)，所以毒性小，但是多肽直接作為藥物依然在很多方面受到較大的限制，例如，多肽易氧化，且多肽中的肽鍵易水解斷裂，導(dǎo)致其穩(wěn)定性差，不能口服。近年來(lái)，多肽作為藥物輔助功能的應(yīng)用逐漸成為了新藥研制的熱點(diǎn)之一。細(xì)胞穿膜肽是20世紀(jì)中期開(kāi)始認(rèn)識(shí)到的一類具特殊功能的多肽分子，它們通常由5～30個(gè)氨基酸組成，典型的一般由8～16個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有生物膜穿透功能，還可攜帶其它分子甚至超分子顆粒進(jìn)入細(xì)胞中。正是因?yàn)檫@種特殊的功能，它們被看作生物活性分子有效的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)工具，具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，近些年來(lái)多肽和藥物通過(guò)共價(jià)方式形成組合物的例子越來(lái)越多，例如：多肽Penetratin和阿霉素共價(jià)耦合用于治療乳腺癌；多肽TAT和藥物P53共價(jià)耦合用于治療眼癌轉(zhuǎn)移；多肽YTA4與甲氨蝶呤共價(jià)耦合治療乳腺癌。但是，目前對(duì)于能夠有效穿過(guò)血腦屏障并可作為釋藥載體，而對(duì)腦部相關(guān)疾病進(jìn)行治療的多肽研究并不確切。

因此，開(kāi)發(fā)一種能夠有效穿過(guò)血腦屏障，并通過(guò)化學(xué)合成的方法與多種能夠治療腦部相關(guān)疾病的藥物進(jìn)行偶聯(lián)而作為釋藥載體，而達(dá)到藥物腦靶向釋放的目的多肽分子尤為重要。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種具有腦靶向功能的多肽分子，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的大分子無(wú)法穿越血腦屏障的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種具有腦靶向功能的多肽分子的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種具有腦靶向功能的多肽分子作為釋藥載體的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的多肽直接作為藥物穩(wěn)定性差，且治療腦部相關(guān)疾病的藥物不能夠完全達(dá)到腦靶向釋放的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供的一種具有腦靶向功能的多肽分子，所述多肽分子由4個(gè)氨基酸或者所述4個(gè)氨基酸的重復(fù)序列組成，所述多肽分子的氨基酸序列為：(CXQK)_n，其中，X為氨基酸，n為正整數(shù)。

進(jìn)一步地，所述X為丙氨酸A。

進(jìn)一步地，所述X為甘氨酸G。

進(jìn)一步地，所述n的值為1、2、3、4或5。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種制備上述多肽分子的方法，采用液相合成或固相合成的方法。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種上述的具有腦靶向功能的多肽分子作為釋藥載體的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為將所述多肽分子與抗腫瘤藥物，通過(guò)酸酐類化合物橋接為偶聯(lián)物。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為將所述多肽分子與治療缺血性腦損傷的藥物，通過(guò)酸酐類化合物橋接為偶聯(lián)物。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為將所述多肽分子與納米銀，通過(guò)酸酐類化合物橋接為偶聯(lián)物。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為將所述多肽分子與小分子多肽藥物，通過(guò)酰胺鍵連接為偶聯(lián)物。

本發(fā)明通過(guò)液相合成或固相合成的方法合成的一種具有腦靶向功能的多肽分子，能夠穿過(guò)血腦屏障，且由于多肽分子不具有免疫原性，可避免引起人體不良免疫反應(yīng)；本發(fā)明提供的多肽分子還可作為釋藥載體與治療腦部疾病的相關(guān)藥物偶聯(lián)為偶聯(lián)物，使治療腦部相關(guān)疾病的藥物能夠通過(guò)血腦屏障直接作用于患處，能夠有效提升腦部相關(guān)疾病的治愈率和治愈速度。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1a為本發(fā)明納米銀－多肽偶聯(lián)物穿越血腦屏障體內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果圖；

圖1b為本發(fā)明納米銀－多肽偶聯(lián)物穿越血腦屏障體內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供了一種具有腦靶向功能的多肽分子，該多肽分子由4個(gè)氨基酸或者所述4個(gè)氨基酸的重復(fù)序列組成，氨基酸的序列為：

CAQK(SEQ ID NO 1)或

CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)或

CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)或

CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)或

CGQK(SEQ ID NO 5)或

CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)或

CGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 7)或

CGQKCGQKCGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 8)。

上述多肽分子本身不具有生理活性，但是具有透過(guò)血腦屏障的作用，此外，本發(fā)明還涉及該多肽分子的制備方法及其作為釋藥載體的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的具有腦靶向功能的多肽分子采用液相合成或固相合成兩種方式實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明提供的液相合成多肽的方法為：

選用的氨基酸為：H－Cys(Trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、H－Lys(Boc)－Ome；

選用的縮合劑為：HOAT(1－羥基－7－偶氮苯并三氮唑)或HOBT(1－羥基苯并三氮唑)或HOCT(1－羥基－1H－1，2，3－三唑－4－羧酸乙酯)或DIC(N，N＇－二異丙基碳二亞胺)；

選用的溶劑為：DCM(二氯甲烷)；

選用的縮合堿為：DIEA(N，N－二異丙基乙胺)或者DMAP(4－二甲氨基吡啶)；

選用的脫保護(hù)試劑為：哌啶；

C末端按照H－Lys(Boc)－Ome、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Gly－OH、H－Cys(Trt)－OH的順序進(jìn)行縮合反應(yīng)，氨基酸比例為1：1，從C末端到N末端依次偶聯(lián)，縮合劑與氨基酸的比例1：1－1：1.2，縮合劑與縮合堿比例為1：2，使多肽分子在合成的過(guò)程中依次從C末端向N末端延伸。

本發(fā)明提供的固相合成多肽的方法為：

選用的固相樹(shù)脂為：wang樹(shù)脂、2－cl－trt樹(shù)脂，樹(shù)脂替代度0.4－0.8；

選用的保護(hù)氨基酸為：Fmoc－Lys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH；

選用的脫保護(hù)試劑為：哌啶，哌啶在所使用溶液中的濃度為15％－50％；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，哌啶在所使用溶液中的濃度為20％；

選用的偶聯(lián)試劑為：

HATU(2－(7－氧化苯并三氮唑)－N，N，N＇，N＇－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、HBTU(O－苯并三氮唑－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、HCTU(6－氯苯并三氮唑－1，1，3，3－四甲基脲六氟磷酸酯)

/HOBT/DIEA(DMAP)、DIC/HOBT/DIEA(DMAP)，其中DIEA可由DMAP替代；

選用的切割試劑為：TFA(三氟乙酸)/TIS(三異丙基硅烷)/H₂O，比例為：95：2.5：2.5；

選用HPLC純化粗肽。

本發(fā)明提供的具有腦靶向功能的多肽分子可作為釋藥載體，如：將本發(fā)明提供的多肽分子通過(guò)酸酐類化合物與抗腫瘤藥物橋接為偶聯(lián)物；將本發(fā)明提供的多肽分子通過(guò)酸酐類化合物與治療缺血性腦損傷的藥物橋接為偶聯(lián)物；將本發(fā)明提供的多肽分子通過(guò)酸酐類化合物與納米銀橋接為偶聯(lián)物；將本發(fā)明提供的多肽分子通過(guò)酰胺鍵與小分子多肽藥物連接為偶聯(lián)物。

酸酐類化合物為丁二酸酐，戊二酸酐或馬來(lái)酸酐。

以本發(fā)明提供的多肽分子為釋藥載體，使治療腦部相關(guān)疾病的藥物能夠通過(guò)血腦屏障直接作用于患處，能夠有效提升腦部相關(guān)疾病的治愈率和治愈速度。

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所使用的氨基酸均購(gòu)自上海吉爾公司，實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

液相合成CGQK(SEQ ID NO 5)

合成所用試劑選擇：

(1)氨基酸：H－Cys(Trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、H－Lys(Boc)－Ome；

(2)縮合劑：DIC或者HOBT；

(3)溶劑：DCM；

(4)縮合堿：DMAP；

(5)脫保護(hù)試劑：哌啶；

(6)切割液：TFA/TIS/H₂O，比例為：95：2.5：2.5；

反應(yīng)在圓底燒瓶中進(jìn)行，用磁子攪拌，第一步反應(yīng)：

將H－Lys(Boc)－Ome、Fmoc－Gln－OH，縮合劑、縮合堿按照1：1：1：1的比例同時(shí)加入到燒瓶中攪拌，控溫在25℃下反應(yīng)4小時(shí)，加入脫保護(hù)劑至濃度為20％，反應(yīng)30分鐘，旋蒸除去反應(yīng)溶液，加入溶劑DCM進(jìn)行下一步反應(yīng)：將Fmoc－Gly－OH、縮合劑、縮合堿按照1：1：1的比例加入燒瓶中，控溫在25℃下反應(yīng)4小時(shí)，旋蒸除去反應(yīng)溶液后，再將H－Cys(Trt)－OH、縮合堿按照1：1的比例，和DCM加入到燒瓶中，控溫在25℃下反應(yīng)4小時(shí)后旋蒸，加入切割液，攪拌2小時(shí)，旋蒸去除切割液，HPLC純化，純化條件：梯度液相，流動(dòng)相A：1％TFA/乙腈；流動(dòng)相B：1％TFA/H₂O，20min從10％流動(dòng)相A到60％流動(dòng)相B。

實(shí)施例2

固相合成CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用SyroII公司生產(chǎn)的Biotage型儀器進(jìn)行CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)的合成。操作方法按照生產(chǎn)商的儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

合成所用試劑選擇：

(1)固相樹(shù)脂：2－cl－trt樹(shù)脂，樹(shù)脂替代度0.75；

(2)保護(hù)氨基酸：Fmoc－Cys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH；

(3)脫保護(hù)試劑：哌啶，哌啶在所使用溶液中的濃度為15％－50％；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，哌啶在所使用溶液中的濃度為20％；

(4)偶聯(lián)試劑：HATU/HOBT/DIEA，比例為1：1：2

(5)切割試劑：TFA/TIS/H₂O，比例為：95：2.5：2.5；

選用HPLC純化粗肽。純化條件：梯度液相，流動(dòng)相A：1％TFA/乙腈；流動(dòng)相B：1％TFA/H2O，20min從10％流動(dòng)相A到60％流動(dòng)相B。利用MS確定所得純品分子量，用HPLC確定樣品純度，純度大于95％經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQIDNO 4)多肽分子凍干粉。

實(shí)施例3

固相合成CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用SyroII公司生產(chǎn)的Biotage型儀器進(jìn)行CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)的合成。操作方法按照生產(chǎn)商的儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

合成所用試劑選擇：

(1)載體樹(shù)脂：Fmoc－Lys－wang－rink，替代度：0.8

(2)保護(hù)氨基酸：Fmoc－Cys(Boc)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH，反應(yīng)中所用保護(hù)氨基酸5倍過(guò)量。

(3)脫保護(hù)試劑：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例為20：80。

(4)偶聯(lián)試劑：DIC/HOBT，比例為1：1.5。

(5)切割試劑：TFA/TIS/水，比例為：95：2.5：2.5。

將制得的多肽使用HPLCC18半制備柱進(jìn)行純化，檢測(cè)條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm，流動(dòng)相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流動(dòng)相B：水(含0.1％三氟乙酸)，洗脫條件：30分鐘內(nèi)由35％A－50％A，利用MS確定所得純品分子量，用HPLC確定樣品純度，純度大于95％經(jīng)脫鹽及冷凍干燥得到CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)多肽分子凍干粉。

實(shí)施例4

本發(fā)明提供的多肽分子CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)與抗腫瘤藥物紫杉醇的偶聯(lián)方法

50mL反應(yīng)瓶中加入1.50g(1.72mmol)紫杉醇，0.52g(5.20mmol)丁二酸酐，30mLTHF(四氫呋喃)，滴加0.66g(5.12mmol)DIEA，27℃攪拌6h，蒸干溶劑得蠟狀物，加水?dāng)嚢瑁悬S色固體析出，抽濾，水洗兩次，干燥，得黃色固體1.15g，所得黃色固體為紫杉醇－丁二酸酐偶聯(lián)物。

50mL反應(yīng)瓶中加入0.22g(0.32mmol)紫杉醇－丁二酸酐偶聯(lián)物，0.10g(0.31mmol)O－苯并三氮唑－N，N，N＇，N＇－四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，5mLDMF，氮?dú)獗Ｗo(hù)，滴加0.08g(0.62mmol)DIEA，27℃攪拌1h后，加入0.10g多肽，27℃攪拌3h后，終止反應(yīng)。使用MS－IT－TOF確定分子量，使用HPLC純化粗產(chǎn)物，既得多肽分子與抗腫瘤藥物紫杉醇的偶聯(lián)物。

實(shí)施例5

本發(fā)明提供的多肽分子CAQK(SEQ ID NO 1)與治療缺血性腦損傷藥物洛伐他汀的偶聯(lián)方法

在本實(shí)施例中，CAQK(SEQ ID NO 1)采用固相合成的方法，載體樹(shù)脂選用Fmoc－Lys(Mtt)－wang，替代度為0.8，保護(hù)氨基酸選用Fmoc－Cys(trt)－OH、Fmoc－Ala－OH、Fmoc－Gln－OH，本實(shí)施例所使用的脫保護(hù)試劑為：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例為20：80，本實(shí)施例所使用的偶聯(lián)試劑為：DIC/HOBT，比例為1：1.5。在本實(shí)施例中，固相合成CAQK(SEQ ID NO 1)后，先不進(jìn)行整體切割，利用1％1TFA/DCM先切割Lys(Mtt)的側(cè)鏈Mtt，利用丁二酸酐與Lys暴露的氨基進(jìn)行耦合，DCM洗滌5次后，使用HATU/HOBT與洛伐他汀偶聯(lián)，偶聯(lián)之后進(jìn)行切割，所使用的切割試劑為：TFA/TIS/水，比例為：95：2.5：2.5。

實(shí)施例6

本發(fā)明提供的多肽分子與納米銀的偶聯(lián)方法

取6.1mg鞣酸和1g檸檬酸三鈉溶于50ml水中制備為緩沖液，待用。

取252mg AgNO₃粉末，溶解于2.5L水中，60℃下攪拌加熱，然后加入上述待用的緩沖液50mL。加熱至沸騰，并保持沸騰狀態(tài)20分鐘，制成納米銀溶液。

在本發(fā)明提供的多肽分子CAQK(SEQ ID NO 1)或CAQKCAQK(SEQ ID NO 2)或CAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 3)或CAQKCAQKCAQKCAQKCAQK(SEQ ID NO 4)或CGQK(SEQ ID NO 5)或CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)或CGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 7)或CGQKCGQKCGQKCGQKCGQK(SEQ ID NO 8)的氨基上形成馬來(lái)酸酐修飾，利用賴氨酸側(cè)鏈與馬來(lái)酸酐直接耦合，比例為多肽：馬來(lái)酸酐：DIEA＝1：1：1，然后與納米銀進(jìn)行反應(yīng)，納米銀與多肽直接混合。反應(yīng)物在UV－400nm下進(jìn)行收集，得到納米銀－多肽偶聯(lián)物。

實(shí)施例7

本發(fā)明提供的多肽分子CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)與小分子多肽藥物胸腺五肽偶聯(lián)物的制備方法

在本實(shí)施例中，載體樹(shù)脂選用Fmoc－Lys(Trtt)－wang，替代度為0.65，所選用的保護(hù)氨基酸為Fmoc－Cys(trt)－OH、Fmoc－Gly－OH、Fmoc－Gln－OH、Fmoc－Lys(Trtt)，本實(shí)施例所使用的脫保護(hù)試劑為：哌啶/N，N－二甲基甲酰胺，比例為20：80，本實(shí)施例所使用的偶聯(lián)試劑為：DIC/1－羥基苯并三唑(HOBT)，比例為1：1.5。固相合成CGQKCGQK(SEQ ID NO 6)后，直接偶聯(lián)胸腺五肽，胸腺五肽購(gòu)買(mǎi)自：上海吉爾生化有限公司，偶聯(lián)之后進(jìn)行切割，所使用的切割試劑為：TFA/TIS/水，比例為：95：2.5：2.5。

為了有助于充分的說(shuō)明本發(fā)明提供的具有腦靶向功能的多肽分子作為釋藥載體的效果，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)詳細(xì)介紹如下。

需要注意的是，如未明確指出，本實(shí)驗(yàn)例中提到的試劑、儀器或者設(shè)備均為常規(guī)的試劑、儀器或者設(shè)備，所用到的方法，均為常規(guī)的方法。

偶聯(lián)物透過(guò)血腦屏障的體外評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)中，采用的細(xì)胞為：Hela，SK－BR－3，NIH3T3(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)，將細(xì)胞接種于24孔板中，濃度為2×10⁵/孔，培養(yǎng)過(guò)夜，將實(shí)施例4、實(shí)施例5或?qū)嵤├?提供的任意一種偶聯(lián)物用PBS溶解，與細(xì)胞孵育使其終濃度為10umol/L。

本實(shí)驗(yàn)中，使用免疫熒光染色，染色步驟如下：

(1)用4％的甲醛在4℃下固定細(xì)胞10分鐘；

(2)用3％冷Triton－X100緩沖液在4℃滲透細(xì)胞20分鐘；

(3)用2％的BSA封閉緩沖液在室溫下封閉細(xì)胞30分鐘；

(4)羊抗人－FLAGmAb在室溫下孵育細(xì)胞1小時(shí)；

(5)用2mg/mL Streptavidin－Alexa499在室溫下孵育細(xì)胞1小時(shí)；

以上每步均用PBS沖洗至少兩遍。

(6)用0.3％Triton－X100緩沖液洗20分鐘；

(7)置細(xì)胞于顯微鏡及共聚顯微鏡下觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞內(nèi)均有染色，即表明偶聯(lián)物可通過(guò)細(xì)胞膜。

納米銀－多肽偶聯(lián)物穿越血腦屏障的體內(nèi)評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腦內(nèi)熒光方法，進(jìn)行納米銀－多肽偶聯(lián)物的血腦屏障穿越功能的評(píng)價(jià)。

實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射實(shí)施例6提供的35nM的納米銀－多肽偶聯(lián)物，注射體積為1ml，6小時(shí)后，組織樣本進(jìn)行HE染色及顯微鏡觀察。

對(duì)照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，注射體積為1ml，6小時(shí)后，組織樣本進(jìn)行HE染色及顯微鏡觀察。

觀察發(fā)現(xiàn)多肽偶聯(lián)后大大提高了納米銀在腦中的富集，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1a和圖1b。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)，本發(fā)明提供的具有腦靶向功能的多肽分子能夠介導(dǎo)納米銀穿越血腦屏障。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津世傳生物科技有限公司

<120> 具有腦靶向功能的多肽分子及其制備方法和作為釋藥載體的應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Ala Gln Lys

1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys Cys Ala Gln Lys

1 5 10 15

Cys Ala Gln Lys

20

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Cys Gly Gln Lys

1

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5 10

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys Cys Gly Gln Lys

1 5 10 15

Cys Gly Gln Lys

20