本實(shí)用新型屬于生物技術(shù)領(lǐng)域一種核酸快速分離富集提取柱的改良方法,所述核酸提取柱包括一級(jí)過(guò)濾柱、二級(jí)吸附柱和收集管,且可實(shí)現(xiàn)過(guò)濾柱、吸附柱、收集管三者自由組合。

背景技術(shù)：

核酸是生物體內(nèi)廣泛存在的一類十分重要的生物大分子，包括核糖核酸和脫氧核糖核酸兩大類，幾乎所有的核酸檢測(cè)技術(shù)均圍繞二者展開(kāi)。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，對(duì)于核酸檢測(cè)領(lǐng)域更提出了新的要求，特別是低豐度核酸的富集分離。目前，為了獲得足夠量的核酸樣本，多種核酸分離富集方法被開(kāi)發(fā)，如磁珠法、硅膠膜法等，其中，以硅膠膜吸附柱應(yīng)用最為廣泛。硅膠膜吸附柱主要以硅膠膜作為吸附材料制備的吸附柱，當(dāng)核酸樣品在外力作用下通過(guò)硅膠膜時(shí)，會(huì)被硅膠膜吸附，借助有機(jī)溶劑洗滌以凈化核酸，最后洗脫獲得核酸樣本，從而實(shí)現(xiàn)核酸樣品快速分離和制備。傳統(tǒng)方法中，組織細(xì)胞樣本或體外擴(kuò)增核酸片段需要被破裂或溶解后才能通過(guò)硅膠膜吸附柱而被提取，而硅膠膜吸附柱本身只是一種核酸吸附柱，由于前期樣本制備帶入的不必要的色素因子和大量雜質(zhì)等將嚴(yán)重影響后續(xù)核酸的吸附和分離，進(jìn)而影響后續(xù)基于核酸的多種研究，包括核酸的酶切、連接和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。更為嚴(yán)重地，傳統(tǒng)溶膠制備核酸時(shí)，由于溶膠的時(shí)間較長(zhǎng)或凝膠不能完全溶解時(shí)，將導(dǎo)致硅膠膜吸附柱堵塞，不僅影響核酸提取的效率，而且嚴(yán)重增加實(shí)驗(yàn)的成本。

本發(fā)明在傳統(tǒng)核酸提取柱的基礎(chǔ)上增加了一級(jí)過(guò)濾柱，該過(guò)濾柱整合低分子量孔徑濾膜和活性炭層，不僅可實(shí)現(xiàn)生物樣本雜質(zhì)的有效過(guò)濾，而且可實(shí)現(xiàn)色素因子等有機(jī)分子的有效吸附。同時(shí)，二級(jí)硅膠吸附柱采用改良的硅膠膜，可大大增加核酸的吸附量。二者可與收集管獨(dú)立組合或整體組合以實(shí)現(xiàn)過(guò)濾、吸附和過(guò)濾/吸附的目的，具有操作簡(jiǎn)單、核酸提取效率高、純度高、成本低及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型的目的是基于傳統(tǒng)硅膠膜吸附柱提出一種新型的具有一級(jí)過(guò)濾、二級(jí)吸附功能的核酸提取柱，該核酸提取柱具有核酸樣品雜質(zhì)分離、色素吸附、核酸純化等功能，可大大提高核酸提取的產(chǎn)量和純度，并可縮短實(shí)驗(yàn)流程，降低實(shí)驗(yàn)成本，具體結(jié)構(gòu)分述如下：

1) 一級(jí)過(guò)濾柱由柱體和過(guò)濾膜層組成，過(guò)濾膜層置于柱體內(nèi)層底部。

上述1)中所述過(guò)濾柱柱體底部采用具有均勻孔徑的平底或尖底以支撐過(guò)濾膜層，以平底最佳；

上述1)中所述過(guò)濾膜共分三層，包括上層0.45μm的過(guò)濾膜層、中間活性炭層和下層0.45μm或0.22μm的過(guò)濾膜層，下層的過(guò)濾膜層的孔徑可根據(jù)具體需求選擇。

2) 二級(jí)吸附柱由柱體和吸附膜層組成，吸附膜層置于柱體內(nèi)層底部。

上述2)中所述吸附柱柱體底部采用具有均勻孔徑的平底或尖底以支撐過(guò)濾膜層，以平底最佳；

上述2)中所述吸附膜共一層，采用加厚處理，可增加核酸的吸附量。

上述步驟1)、2)所述柱子與步驟3)所述收集管可自由組合，1)和3)組合可獲得過(guò)濾柱，具有不同樣本雜質(zhì)和色素吸附功能；2)和3)組合可獲得核酸吸附柱，具有核酸吸附提純功能；1)，2)和3)組合可獲得過(guò)濾吸附柱，具有樣本一級(jí)過(guò)濾、二級(jí)吸附提純的功能。

本實(shí)用新型基于傳統(tǒng)吸附柱進(jìn)行了改良，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)核酸樣品的一級(jí)除雜和色素吸附，而且可實(shí)現(xiàn)核酸樣品的高產(chǎn)量富集及分離，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1. 一級(jí)過(guò)濾柱示意圖。

圖2. 二級(jí)吸附柱示意圖。

圖3. 收集管示意圖。

圖4. 核酸過(guò)濾柱示意圖。

圖5. 核酸吸附柱示意圖。

圖6. 核酸過(guò)濾吸附柱示意圖。

圖中: 1). 收集管；2). 一級(jí)過(guò)濾柱；3). 二級(jí)吸附柱。

圖7. 核酸提取柱對(duì)小鼠糞便溶解液的過(guò)濾吸附特性檢測(cè)。

圖8. 核酸提取柱對(duì)金屬鹽混合溶液的過(guò)濾吸附特性檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但下述實(shí)施例僅是一個(gè)例子，并不作為本實(shí)用新型發(fā)明的限制，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方式。

實(shí)施例１

小鼠糞便溶解液過(guò)濾吸附特性全波段掃描

1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯勘緦?shí)用新型核酸提取柱對(duì)小鼠糞便溶解液的過(guò)濾吸附特性；

2. 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組和活性炭組，對(duì)照組為未經(jīng)本實(shí)用新型核酸提取柱過(guò)濾樣品，活性炭組為經(jīng)本實(shí)用新型核酸提取柱過(guò)濾樣品；

3. 實(shí)驗(yàn)步驟：

1) 樣品制備：選取新鮮小鼠糞便組織一顆，加入200μl含有5%葡萄糖的10mM Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液，室溫振蕩孵育30min，5000rpm離心5min，收集上清；

2) 樣品過(guò)濾：將上述制備的樣品吸取100μl作為對(duì)照組，另外100μl加入核酸提取柱，室溫孵育15min，12000rpm離心5min，收集過(guò)濾液作為活性炭組；

3) 全波段掃描：將上述制備的對(duì)照組和活性炭組樣品采用酶標(biāo)儀進(jìn)行全波段掃描，掃描范圍為230nm-760nm。

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖7所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)核酸提取柱過(guò)濾后可除去小鼠糞便溶解液中的大量雜志及色素等，說(shuō)明本實(shí)用新型核酸提取柱具有明顯的雜質(zhì)過(guò)濾和色素吸附特性。

實(shí)施例2

混合金屬鹽溶液過(guò)濾吸附特性全波段掃描

1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯勘緦?shí)用新型核酸提取柱對(duì)混合金屬鹽溶液的過(guò)濾吸附特性；

2. 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組和活性炭組，對(duì)照組為未經(jīng)本實(shí)用新型核酸提取柱過(guò)濾樣品，活性炭組為經(jīng)本實(shí)用新型核酸提取柱過(guò)濾樣品；

3. 實(shí)驗(yàn)步驟：

1) 樣品制備：分別稱取適量氯化鈉，氯化鉀和氯化鎂配置成0.5M金屬鹽混合液；

2) 樣品過(guò)濾：將上述制備的樣品吸取100μl作為對(duì)照組，另外100μl加入核酸提取柱，室溫孵育15min，12000rpm離心5min，收集過(guò)濾液作為活性炭組；

3) 全波段掃描：將上述制備的對(duì)照組和活性炭組樣品采用酶標(biāo)儀進(jìn)行全波段掃描，掃描范圍為230nm-760nm。

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖8所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)核酸提取柱過(guò)濾后混合金屬鹽溶液基本沒(méi)有影響，說(shuō)明本實(shí)用新型核酸提取柱幾乎不影響緩沖液特性。