對相關(guān)申請的交叉引用本申請涉及和要求2015年2月5日提交的日本優(yōu)先權(quán)專利申請?zhí)?015-021371，和2015年9月18日提交的日本優(yōu)先權(quán)專利申請?zhí)?015-185254的優(yōu)先權(quán)。這些優(yōu)先權(quán)申請的內(nèi)容通過參考以其整體結(jié)合。在一個非排他性的方面，本公開涉及包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體和含有所述抗體的藥物組合物。還提供編碼這些抗體的核酸和含有所述核酸的宿主細(xì)胞，同樣還有抗體和藥物組合物的用途和生產(chǎn)方法。在另一非排他性的方面，本公開提供fc區(qū)變體和含有所述變體的抗體和含有所述fc區(qū)變體和抗體的藥物組合物。還提供編碼fc區(qū)變體和抗體的核酸，和含有所述核酸的宿主細(xì)胞，以及所述fc區(qū)變體和抗體以及藥物組合物的應(yīng)用和生產(chǎn)方法。在第三個非排他性的方面，本公開提供抗-il-8抗體，含有所述抗體的藥物組合物，編碼所述抗體的核酸，和含有所述核酸的宿主細(xì)胞。還提供il-8抗體和藥物組合物的生產(chǎn)方法和在治療例如il-8相關(guān)病癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：抗體作為藥物引人注意，因為它們在血漿中高度穩(wěn)定并且具有較少的副作用。很多igg-型治療性抗體在市面上，并且甚至現(xiàn)在有很多治療性抗體在開發(fā)中(reichert等人，nat.biotechnol.23：1073-1078(2005)(npl1)；pavlou等人，eur.j.pharm.biopharm.59(3)：389-396(2005)(npl2))。同時，正在對第二代治療性抗體開發(fā)各種技術(shù)；包括用于改善效應(yīng)子功能，抗原結(jié)合能力，藥代動力學(xué)或穩(wěn)定性，和降低免疫原性的風(fēng)險的技術(shù)(kim等人，mol.cells.20(1)：17-29(2005)(npl3))。治療性抗體的劑量通常非常高，并且因此治療性抗體的開發(fā)遇到諸如難以產(chǎn)生皮下制劑和高生產(chǎn)成本的問題。改善治療性抗體藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和抗原結(jié)合性質(zhì)的方法提供降低與治療性抗體相關(guān)的劑量和生產(chǎn)成本的方式。恒定區(qū)中氨基酸殘基的置換(substitution)提供一種用于改善抗體藥代動力學(xué)的方法(hinton等人，j.immunol.176(1)：346-356(2006)(npl4)；ghetie等人，nat.biotechnol.15(7)：637-640(1997))(npl5)。親和力成熟技術(shù)提供用于增強抗體的抗原中和能力的方法(rajpal等人，proc.natl.acad.sci.usa102(24)：8466-8471(2005)(npl6)；wu等人，j.mol.biol.368：652(2007)(npl7))，并且可以在抗體可變結(jié)構(gòu)域的cdrs和/或框架區(qū)中的一個或多個氨基酸殘基中引入一個或多個突變來增加抗原結(jié)合活性。改善抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)可以改善抗體的體外生物學(xué)活性或降低劑量，并且可以進一步改善體內(nèi)(在身體中的)功效(wu等人，j.mol.biol.368：652-665(2007)(npl8))?？梢杂梢粋€抗體分子中和的抗原的量取決于抗體對抗原的親和力；并且因此，可能通過增加親和力以小量的抗體中和抗原?？贵w對于抗原的親和力可以使用各種已知方法增加(參見，例如，rajpal等人，proc.natl.acad.sci.usa102(24)：8466-8471(2005)(npl6))。此外，如果其可以與抗原共價結(jié)合從而使得親和力無窮大，則理論上可能用一個抗體分子中和一個抗原分子(當(dāng)抗體是二價時2個抗原)。盡管如此，迄今治療性抗體開發(fā)的一個限制是一個抗體分子通常僅結(jié)合和中和一個抗原分子(當(dāng)抗體是二價時，2個抗原)。近期已經(jīng)報道，使用以ph-依賴性的方式結(jié)合抗原的抗體(下文中也稱為"ph-依賴性抗體"或"ph-依賴性-結(jié)合抗體")使得一個抗體分子結(jié)合和中和多個抗原分子(參見，例如，wo2009/125825(ptl1)；igawa等人，nat.biotechnol.28：1203-1207(2010)(npl9))。ph-依賴性抗體在血漿中的中性ph條件下強烈結(jié)合抗原，并且在細(xì)胞的內(nèi)體(endosome)內(nèi)的酸性ph條件下從抗原解離。從抗原解離后，抗體通過fcrn再循環(huán)到血漿并且隨后自由結(jié)合和中和另一抗原分子；并且因此一個ph-依賴性抗體可以重復(fù)結(jié)合和中和多個抗原分子。近來已經(jīng)報道，抗體再循環(huán)性質(zhì)可以通過集中于血漿和內(nèi)體之間的鈣(ca)離子濃度的差異，并且使用具有表明鈣依賴性的抗原-抗體相互作用的抗體(下文中也稱為"鈣離子濃度-依賴性抗體")來實現(xiàn)(wo2012/073992(ptl2))。(下文中，ph-依賴性抗體和"鈣離子濃度-依賴性抗體"統(tǒng)稱為"ph/ca濃度-依賴性抗體"。)通過結(jié)合fcrn，igg抗體在血漿中具有長時間的保留。igg抗體和fcrn之間的結(jié)合在酸性ph條件下(例如，ph5.8)強烈，但在中性ph條件下(例如，ph7.4)幾乎沒有結(jié)合。igg抗體非特異性地攝入細(xì)胞中，并且在內(nèi)體中酸性ph條件下通過結(jié)合內(nèi)體中的fcrn返回細(xì)胞表面。igg隨后在血漿中的中性ph條件下從fcrn解離。據(jù)報道，修飾以增加其在中性ph條件下的fcrn結(jié)合的ph-依賴性抗體具有重復(fù)結(jié)合和從血漿去除抗原分子的能力；并且因此使用此種抗體允許從血漿去除抗原(wo2011/122011(ptl3))。根據(jù)該報道，與包含天然igg抗體的fc區(qū)的ph-依賴性抗體相比，修飾以增加其在中性ph條件(例如，ph7.4)下的fcrn結(jié)合的ph-依賴性抗體可以進一步加速抗原的去除(wo2011/122011(ptl3))。同時，當(dāng)向igg抗體的fc區(qū)中引入突變以消除其在酸性ph條件下對fcrn的結(jié)合時，其可能不再從內(nèi)體再循環(huán)入血漿，這顯著削弱了抗體在血漿中的保留。隨即，增加在酸性ph條件下的fcrn結(jié)合的方法報道為用于改善igg抗體的血漿保留的方法。向igg抗體的fc區(qū)中引入氨基酸修飾以增加其在酸性ph條件下的fcrn結(jié)合能夠增強從內(nèi)體再循環(huán)到血漿的效力，其由此導(dǎo)致血漿保留的改善。例如，已經(jīng)報道，修飾m252y/s254t/t256e(yte；dall'acqua等人，j.biol.chem.281：23514-235249(2006)(npl10))，m428l/n434s(ls；zalevsky等人，nat.biotechnol.28：157-159(2010))(npl11)，和n434h(zheng等人，clin.pharm.&ther.89(2)：283-290(2011)(npl12))，導(dǎo)致相對于天然igg1增加的抗體半衰期。然而，除了考慮免疫原性或聚集體發(fā)生率可能在包含此種fc區(qū)變體(其fcrn結(jié)合在中性ph條件或酸性ph條件下增加)的抗體中變差，還進一步報道了增加的對在施用治療性抗體之前存在于患者中的抗藥物抗體(下文中也稱為"預(yù)先存在的(pre-existing)ada")(例如，類風(fēng)濕因子)的結(jié)合(wo2013/046722(ptl4)，wo2013/046704(ptl5))。wo2013/046704(ptl5)報道了，與未修飾的天然fc相比，含有特定突變(由根據(jù)eu編號的q438r/s440e的兩個殘基修飾表示)的fc區(qū)變體增加在酸性ph條件下對fcrn的結(jié)合并且還顯示對類風(fēng)濕因子的結(jié)合的顯著降低。然而，wo2013/046704(ptl5)未具體證明該fc區(qū)變體相對于天然fc區(qū)的抗體具有較好的血漿保留。因此，具有進一步改進的血漿保留的安全和更有利的fc區(qū)變體(其不顯示對預(yù)先存在的ada的結(jié)合)是需要的?？贵w-依賴性細(xì)胞毒性(下文示為"adcc")，補體-依賴性細(xì)胞毒性(下文示為"cdc")，抗體-依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)(其是igg抗體介導(dǎo)的靶細(xì)胞的吞噬作用)報道為igg抗體的效應(yīng)子功能。為了igg抗體介導(dǎo)adcc活性或adcp活性，igg抗體的fc區(qū)必需結(jié)合存在于效應(yīng)細(xì)胞如殺傷細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞或活化的巨噬細(xì)胞表面上的抗體受體(在本文所述的公開a的范圍內(nèi)稱為"fcγ受體"，"fcgr"，"fcγ受體"或"fcγr")。在人中，fcγria，fcγriia，fcγriib，fcγriiia和fcγriiib同種型報道為fcγr家族蛋白，并且也已經(jīng)報道了它們各自的同種異型(jefferis等人，immunol.lett.82：57-65(2002)(npl13))?？贵w對于包括fcγria，fcγriia，fcγriiia或fcγriiib的激活受體的和包括fcγriib的抑制性受體的各自的親和力的平衡是優(yōu)化抗體效應(yīng)子功能的重要要素。迄今已經(jīng)報道了增加或改善治療性抗體對抗原的活性的各種技術(shù)。例如，抗體結(jié)合激活性fcγr(s)的活性在抗體的細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要作用，并且因此，已經(jīng)開發(fā)了靶向膜-型抗原和由于增強的激活性fcγr(s)結(jié)合而具有增加的細(xì)胞毒性的抗體。參見，例如，wo2000/042072(ptl6)；wo2006/019447(ptl7)；lazar等人，proc.nat.acad.sci.usa.103：4005-4010(2006)(npl14)；shinkawa等人，j.biol.chem.278，3466-3473(2003)(npl15)；clynes等人，proc.natl.acad.sci.usa95：652-656(1998)(npl16)；clynes等人，nat.med.6：443-446(2000)(npl17))。類似地，對抑制性fcγr(人中的fcγriib)的結(jié)合活性在免疫抑制活性，激動劑活性中發(fā)揮重要作用，并且因此已經(jīng)存在對靶向膜-類型抗原的具有增加的抑制性fcγr-結(jié)合活性的抗體的研究(li等人，proc.nat.acad.sci.usa.109(27)：10966-10971(2012)(npl18))。此外，結(jié)合可溶性抗原的抗體的fcγr結(jié)合的影響主要從副作用的角度檢查(scappaticci等人，j.natl.cancerinst.99(16)：1232-1239(2007)(npl19))。例如，當(dāng)具有增加的fcγriib結(jié)合的抗體用作藥物時，人們可能從抗藥物抗體的產(chǎn)生預(yù)期降低的風(fēng)險(desai等人，j.immunol.178(10)：6217-6226(2007)(npl20))。近來，已經(jīng)報道，向igg抗體的fc區(qū)中引入氨基酸修飾以增加靶向可溶性抗原的抗體結(jié)合激活和/或抑制性fcγr的活性可以進一步加速從血清去除抗原(wo2012/115241(ptl8)，wo2013/047752(ptl9)，wo2013/125667(ptl10)，wo2014/030728(ptl11))。此外，已經(jīng)鑒別了fc區(qū)變體，其幾乎不顯示其fcγriib-結(jié)合活性從天然igg抗體fc區(qū)的改變，但具有降低的對其他激活性fcγrs的活性(wo2014/163101(ptl12))。與具有fcrn-介導(dǎo)的再循環(huán)機制的抗體相比，可溶性抗原的血漿保留非常短，并且因此可溶性抗原可以通過結(jié)合具有此種再循環(huán)機制的抗體(例如，不具有ph/ca濃度-依賴性抗體的特征的抗體)顯示增加的血漿保留和血漿濃度。因此，例如，當(dāng)血漿中的可溶性抗原具有多種類型的生理功能時，即使一種類型的生理功能由于抗體結(jié)合而被阻斷，抗原的血漿濃度仍可以使由于抗體結(jié)合造成的抗原的增加的血漿保留和/或血漿濃度導(dǎo)致的其他生理功能引起的病理學(xué)癥狀變差。在該情況下，除了對抗體進行上述示例性的修飾以加速抗原去除的方法之外，已經(jīng)報導(dǎo)了，例如，使用來自多種ph/ca濃度-依賴性抗體和多種抗原的多價免疫復(fù)合物的形成，和增加對fcrn，fcγr(s)，補體受體的結(jié)合的方法(wo2013/081143(ptl13))。甚至當(dāng)fc區(qū)未被修飾時，報道了通過修飾一個或多個氨基酸殘基從而改變所述可以暴露在抗體可變區(qū)表面上的一個或多個氨基酸殘基的電荷，以提高或降低抗體的等電點(pi)，可以不考慮抗原或抗體的類型，并且在基本上不降低抗體的抗原結(jié)合活性的情況下控制抗體在血液中的半衰期(wo2007/114319(ptl14)：主要在fr中置換氨基酸的技術(shù)；wo2009/041643(ptl15)：主要在cdr中置換氨基酸的技術(shù))。這些文件表明，可能通過降低抗體的pi延長抗體的血漿半衰期，并且相反通過提高抗體的pi縮短抗體的血漿半衰期。關(guān)于抗體的恒定區(qū)中的氨基酸殘基的電荷的修飾，已經(jīng)報道，在細(xì)胞中攝取抗原可以通過修飾具體一個或多個氨基酸殘基的電荷，特別是在ch3結(jié)構(gòu)域中來促進，從而提高抗體的pi，并且其還描述，該修飾優(yōu)選不干擾對fcrn的結(jié)合(wo2014/145159(ptl16))。還報道了，修飾抗體的恒定區(qū)(主要ch1結(jié)構(gòu)域)中的氨基酸殘基的電荷以降低pi可以延長抗體在血漿中的半衰期，并且與增加fcrn結(jié)合的氨基酸殘基突變結(jié)合，可以增強其對fcrn的結(jié)合和延長抗體的血漿半衰期(wo2012/016227(ptl17))。同時，當(dāng)設(shè)計用于提高或降低抗體的pi的所述修飾技術(shù)與除增加或降低對fcrn或fcγr(s)的結(jié)合的修飾技術(shù)之外的技術(shù)組合時，在促進抗體的血漿保留或抗原從血漿的去除方面是否存在效果是不明確的。胞外基質(zhì)(ecm)是在體內(nèi)覆蓋細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，并且主要由糖蛋白如膠原蛋白、蛋白聚糖、纖連蛋白和層粘連蛋白組成。ecm在體內(nèi)的作用是為細(xì)胞生存產(chǎn)生微環(huán)境，并且ecm在細(xì)胞進行的各種功能中是重要的，如，細(xì)胞增殖和細(xì)胞粘附。已經(jīng)報道ecm參與施用于活體的蛋白的體內(nèi)動力學(xué)。vegf-trap分子(其是vegf受體和fc之間的融合蛋白)的血液濃度，在皮下施用時檢測(holash等人，proc.natl.acad.sci.，99(17)：11393-11398(2002)(npl21))。皮下施用的具有高pi的vegf-trap分子的血漿濃度低，并且因此其生物利用度低。修飾的vegf-trap分子(其pi通過氨基酸置換降低)具有更高血漿濃度，并且其生物利用度可能得到改善。此外，生物利用度的改變與結(jié)合ecm的強度相關(guān)，并且因此變得明顯的是，皮下施用時vegf-trap分子的生物利用度取決于在皮下位點其結(jié)合ecm的強度。wo2012/093704(ptl18)報道了，在對ecm的抗體結(jié)合和血漿保留之間存在反向相關(guān)，并且因此，當(dāng)與結(jié)合ecm的抗體比較時，不結(jié)合ecm的抗體分子具有更好的血漿保留。由此，已經(jīng)報道了為了改善蛋白體內(nèi)生物利用度和血漿保留而降低胞外基質(zhì)結(jié)合的技術(shù)。相反，迄今尚未鑒定增加抗體對ecm的結(jié)合的優(yōu)勢。人il-8(白細(xì)胞介素8)是趨化因子家族成員，其長度為72或77個氨基酸殘基。術(shù)語"趨化因子"是對分子量為8-12kda并且含有4個形成分子間二硫鍵的半胱氨酸殘基的蛋白家族的統(tǒng)稱。趨化因子根據(jù)半胱氨酸排列的特征分類為cc趨化因子，cxc趨化因子，c趨化因子，ca3c趨化因子。il-8分類為cxc趨化因子，并且也稱為cxcl8。il-8在溶液中以單體或同源二聚體形式存在。il-8單體含有反平行β折疊，并且具有其中c-末端α螺旋穿過和覆蓋β折疊的結(jié)構(gòu)。il-8單體，在il-8的72個氨基酸形式的情況下，包括半胱氨酸7和半胱氨酸34之間以及半胱氨酸9和半胱氨酸50之間的兩個二硫鍵交聯(lián)。il-8同源二聚體通過兩個單體的β折疊之間的非共價相互作用來穩(wěn)定，因為在同源二聚體的分子之間沒有共價結(jié)合。響應(yīng)于通過炎性細(xì)胞因子的刺激，在各種細(xì)胞如外周血單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)il-8表達(russo等人，exp.rev.clin.immunol.10(5)：593-619(2014)(npl22))。在正常組織中，趨化因子通常檢測不到，或僅可微弱地檢測到，但在發(fā)炎的位點可強烈檢測到，并且通過促進淋巴細(xì)胞浸潤入發(fā)炎組織位點參與誘導(dǎo)炎癥。il-8是促炎性趨化因子，已知其活化中性粒細(xì)胞、促進細(xì)胞粘附分子的表達，并且增強中性粒細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞。il-8還具有中性粒細(xì)胞趨化能力并且在受損的組織處產(chǎn)生il-8以促進粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞趨化入組織，并且隨中性粒細(xì)胞浸潤誘導(dǎo)炎癥。還已知il-8是內(nèi)皮細(xì)胞的有效血管生成因子并且參與促進腫瘤血管生成。與升高的(例如，過量)il-8水平相關(guān)的炎性疾病包括，皮膚的炎性疾病如炎性角化病(例如，銀屑病)，特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)，接觸性皮炎(contactdermatitis)；慢性炎性病癥(其是自身免疫疾病)，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus)(sle)，和貝切特氏病(behcet'sdisease)；炎性腸病如克羅恩病(crohn'sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)；炎性肝病如乙型肝炎(hepatitisb)，丙型肝炎(hepatitisc)，酒精性肝炎(alcoholichepatitis)，藥物引起的過敏性肝炎；炎性腎病如腎小球性腎炎(glomerulonephritis)；炎性呼吸系統(tǒng)疾病如支氣管炎和哮喘；炎性慢性血管疾病如動脈粥樣硬化；多發(fā)性硬化，口瘡，聲帶炎(chorditis)，和與使用人造器官和/或人工血管相關(guān)的炎癥。升高的(例如，過量)il-8水平還與惡性腫瘤如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、黑素瘤、頭頸癌和腎癌；感染導(dǎo)致的膿毒癥；囊性纖維化；和肺纖維化相關(guān)。(參見，例如，russo等人，exp.rev.clin.immunol.10(5)：593-619(2014)(npl22)，其通過參考以其整體結(jié)合于本文)。對于這些疾病中的多種，已經(jīng)開發(fā)了具有高親和力的人抗-il-8抗體作為藥物組合物(desai等人，j.immunol.178(10)：6217-6226(2007)(npl23))，然而，它們尚未推出。迄今，可獲得僅一種包含il-8抗體的藥物組合物，其是作為外部藥物用于銀屑病的鼠抗-il-8抗體。期望有新的治療疾病的抗-il-8抗體。[引用列表][專利文獻][ptl1]wo2009/125825[ptl2]wo2012/073992[ptl3]wo2011/122011[ptl4]wo2013/046722[ptl5]wo2013/046704[ptl6]wo2000/042072[ptl7]wo2006/019447[ptl8]wo2012/115241[ptl9]wo2013/047752[ptl10]wo2013/125667[ptl11]wo2014/030728[ptl12]wo2014/163101[ptl13]wo2013/081143[ptl14]wo2007/114319[ptl15]wo2009/041643[ptl16]wo2014/145159[ptl17]wo2012/016227[ptl18]wo2012/093704[非專利文獻][npl1]reichert等人，nat.biotechnol.23：1073-1078(2005)[npl2]pavlou等人，eur.j.pharm.biopharm.59(3)：389-396(2005)[npl3]kim等人，mol.cells.20(1)：17-29(2005)[npl4]hinton等人，j.immunol.176(1)：346-356(2006)[npl5]ghetie等人，nat.biotechnol.15(7)：637-640(1997))[npl6]rajpal等人，proc.natl.acad.sci.usa102(24)：8466-8471(2005)[npl7]wu等人，j.mol.biol.368：652(2007)[npl8]wu等人，j.mol.biol.368：652-665(2007)[npl9]igawa等人，nat.biotechnol.28：1203-1207(2010)[npl10]dall'acqua等人，j.biol.chem.281：23514-235249(2006)[npl11]zalevsky等人，nat.biotechnol.28：157-159(2010))[npl12]zheng等人，clin.pharm.&ther.89(2)：283-290(2011)[npl13]jefferis等人，immunol.lett.82：57-65(2002)[npl14]lazar等人，proc.nat.acad.sci.usa.103：4005-4010(2006)[npl15]shinkawa等人，j.biol.chem.278，3466-3473(2003)[npl16]clynes等人，proc.natl.acad.sci.usa95：652-656(1998)[npl17]clynes等人，nat.med.6：443-446(2000)[npl18]li等人，proc.nat.acad.sci.usa.109(27)：10966-10971(2012)[npl19]scappaticci等人，j.natl.cancerinst.99(16)：1232-1239(2007)[npl20]desai等人，j.immunol.178(10)：6217-6226(2007)[npl21]holash等人，proc.natl.acad.sci.，99(17)：11393-11398(2002)[npl22]russo等人，exp.rev.clin.immunol.10(5)：593-619(2014)[npl23]desai等人，j.immunol.178(10)：6217-6226(2007)發(fā)明概述在一個非排他性的方面，公開內(nèi)容a的實施方案的非限制性目的是提供相對抗體具有改善的藥代動力學(xué)性質(zhì)，如改善的抗體半衰期和/或從血漿清除抗原的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合性質(zhì)的分子。在一個非排他性的方面，公開內(nèi)容b的實施方案的非限制性目的是提供具有增加的半衰期和減少的對預(yù)先存在的抗藥物抗體(adas)的結(jié)合的安全和更有益fc區(qū)變體。在一個非排他性的方面，公開內(nèi)容c的實施方案的非限制性目的是提供對il-8具有ph-依賴性結(jié)合親和力的抗-il-8抗體。其他實施方案涉及當(dāng)施用于個體時，與參照抗體相比具有快速去除il-8的效果的抗-il-8抗體。在另一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及當(dāng)施用于個體時能夠穩(wěn)定保持其il-8-中和活性的抗-il-8抗體。在一些實施方案中，抗-il-8抗體呈現(xiàn)降低的免疫原性。在其他實施方案中，公開內(nèi)容c涉及產(chǎn)生和使用上述抗-il-8抗體的方法。公開內(nèi)容c的另一備選非限制性目的是提供可以包括在藥物組合物中的新抗-il-8抗體。在一個非排他性的方面，在如本文中提供的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，離子濃度-依賴性抗體(其是包含離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域("其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域")的抗體)從血漿去除抗原的能力可以通過修飾暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基從而提高其等電點(pi)來促進。在另一非排他性的方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體可以進一步增加抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合。因此，不受限于特定理論，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從血漿去除抗原可以通過增加抗體對胞外基質(zhì)的結(jié)合增加。在一個非排他性的方面，在如本文中提供的公開內(nèi)容b的范圍內(nèi)，本發(fā)明人進行對不顯示對抗藥物抗體(預(yù)先存在的ada)的結(jié)合并且可以進一步改善血漿保留的安全和更有利fc區(qū)變體的深入研究。結(jié)果，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，包括用ala(a)置換根據(jù)eu編號的位置434氨基酸和兩個特定殘基突變(根據(jù)eu編號，由q438r/s440e表示)作為氨基酸殘基突變的組合的fc區(qū)變體，對于保持對類風(fēng)濕因子的結(jié)合的顯著降低，連同實現(xiàn)抗體的血漿保留是優(yōu)選的。在一個非排他性的方面，在如本文中提供的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，本發(fā)明人開發(fā)了很多ph-依賴性抗-il-8抗體(以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的抗-il-8抗體)。從各種驗證的結(jié)果，本發(fā)明人鑒定了當(dāng)施用于個體時，與參照抗體相比具有快速去除il-8的效果的ph-依賴性抗-il-8抗體。在一些實施方案中，公開內(nèi)容c涉及可以穩(wěn)定保持其il-8-中和活性的ph-依賴性抗-il-8抗體。在其他非限制性實施方案中，ph-依賴性抗-il-8抗體具有降低的免疫原性和極佳的表達水平。此外，在公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，本發(fā)明人成功獲得了包含相對于天然fc區(qū)的fcrn-結(jié)合親和力，在酸性ph其fcrn-結(jié)合親和力增加的fc區(qū)的抗-il-8抗體。在備選的方面，本發(fā)明人成功獲得了包括相對于天然fc區(qū)對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力，其對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)的抗-il-8抗體。在備選的方面，本發(fā)明人成功獲得了包含其血漿半衰期相對于天然fc區(qū)的血漿半衰期增加的fc區(qū)的抗-il-8抗體。在備選的方面，本發(fā)明人成功獲得了包含其對效應(yīng)受體的結(jié)合親和力相對于天然存在的fc區(qū)對效應(yīng)受體的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)的ph-依賴性抗-il-8抗體。在不同的方面，本發(fā)明人鑒別了編碼上述抗-il-8抗體的核酸。在另一方面，本發(fā)明人還獲得了包含上述核酸的宿主。在另一方面，本發(fā)明人開發(fā)了用于產(chǎn)生上述抗-il-8抗體的方法，其包括培養(yǎng)上述宿主。在另一方面，本發(fā)明人開發(fā)了相對于參照抗體促進從個體中去除il-8的方法，其包括向個體施用上述抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a，涉及但不限于，[1]包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，其中其等電點(pi)通過修飾可能暴露在抗體表面的至少一個氨基酸殘基來提高；[2][1]所述的抗體，其中所述抗原是可溶性抗原；[3][1]或[2]所述的抗體，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是其抗原結(jié)合活性在高離子濃度條件下比在低離子濃度條件下更高的結(jié)構(gòu)域；[4][1]至[3]中任一項所述的抗體，其中所述離子濃度是氫離子濃度(ph)或鈣離子濃度；[5][4]所述的抗體，其中其在酸性ph范圍與在中性ph范圍中的kd比，kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)，對于抗原，是2或更高；[6][1]至[5]中任一項所述的抗體，其中在所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少一個氨基酸殘基用組氨酸置換，或插入至少一個組氨酸；[7][1]至[6]中任一項所述的抗體，與修飾前的抗體相比，其能夠促進從血漿中去除抗原；[8][1]至[7]中任一項所述的抗體，其中與修飾前的抗體相比，其胞外基質(zhì)結(jié)合活性增強；[9][1]至[8]中任一項所述的抗體，其中所述氨基酸殘基修飾是氨基酸殘基置換；[10][1]至[9]中任一項所述的抗體，其中所述氨基酸殘基修飾選自由以下組成的組：(a)用不帶電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；(b)用帶正電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；和(c)用帶正電的氨基酸殘基置換不帶電的氨基酸殘基；[11][1]至[10]中任一項所述的抗體，其中所述抗體包含可變區(qū)和/或恒定區(qū)，并且氨基酸殘基修飾是在可變區(qū)和/或恒定區(qū)中的氨基酸殘基修飾；[12][11]所述的抗體，其中所述可變區(qū)包含一個或多個互補決定區(qū)(cdr(s))和/或一個或多個框架區(qū)(fr(s))；[13][12]所述的抗體，其中所述可變區(qū)包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，并且至少一個氨基酸殘基在cdr或fr中選自由以下組成的組的位置修飾：根據(jù)kabat編號(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，5，8，10，12，13，15，16，18，19，23，25，26，39，41，42，43，44，46，68，71，72，73，75，76，77，81，82，82a，82b，83，84，85，86，105，108，110，和112；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，7，8，9，11，12，16，17，18，20，22，37，38，39，41，42，43，45，46，49，57，60，63，65，66，68，69，70，74，76，77，79，80，81，85，100，103，105，106，107，和108；以及(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56；[14][13]所述的抗體，其中至少一個氨基酸殘基在cdr或fr中選自由以下組成的組的位置中修飾：(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置8，10，12，13，15，16，18，23，39，41，43，44，77，82，82a，82b，83，84，85，和105；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置16，18，37，41，42，45，65，69，74，76，77，79，和107；以及(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56；[15][11]至[14]中任一項所述的抗體，其中至少一個氨基酸殘基在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置中修飾：根據(jù)eu編號，位置196，253，254，256，258，278，280，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443；[16][15]所述的抗體，其中至少一個氨基酸殘基在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置中修飾：位置254，258，281，282，285，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，418，419，421，433，434，和443；[17][16]所述的抗體，其中至少一個氨基酸殘基在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置修飾：位置282，309，311，315，342，343，384，399，401，402，和413，根據(jù)eu編號；[18][1]至[17]中任一項所述的抗體，其中所述恒定區(qū)具有fcγ受體(fcγr)-結(jié)合活性，并且其中與包含天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，fcγr-結(jié)合活性在中性ph條件下增強；[19][18]所述的抗體，其中所述fcγr是fcγriib；[20][1]至[17]中任一項所述的抗體，其中所述恒定區(qū)具有針對選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib和fcγriia組成的組的一種或多種激活性fcγr，和針對fcγriib的結(jié)合活性，并且與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，所述fcγriib-結(jié)合活性被保持或增強并且對激活性fcγr的結(jié)合活性降低；[21][1]至[20]中任一項所述的抗體，其中所述恒定區(qū)具有fcrn-結(jié)合活性，并且與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，其中fcrn-結(jié)合活性在中性ph條件(例如，ph7.4)下增強；[22][1]至[21]中任一項所述的抗體，其是結(jié)合至少兩種抗原的多特異性抗體；[23][1]至[22]中任一項所述的抗體，其中所述抗體是igg抗體；[24]藥物組合物，其包含[1]至[23]中任一項所述的抗體；[25][24]所述的藥物組合物，其用于促進從血漿去除抗原；[26][24]或[25]所述的藥物組合物，其用于增強抗體對胞外基質(zhì)的結(jié)合；[27]核酸，其編碼[1]至[23]中任一項所述的抗體；[28]載體，其包含[27]所述的核酸；[29]宿主細(xì)胞，其包含[28]所述的載體；[30]用于生產(chǎn)包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)[29]所述的宿主細(xì)胞并且從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集抗體；[30a]用于生產(chǎn)包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，其中所述方法包括修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基從而提高等電點(pi)；[30b][30a]所述的方法，其中至少一個氨基酸殘基在選自以下的位置被修飾(i)在cdr或fr中選自由以下組成的組的位置：根據(jù)kabat編號，(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，5，8，10，12，13，15，16，18，19，23，25，26，39，41，42，43，44，46，68，71，72，73，75，76，77，81，82，82a，82b，83，84，85，86，105，108，110，和112；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，7，8，9，11，12，16，17，18，20，22，37，38，39，41，42，43，45，46，49，57，60，63，65，66，68，69，70，74，76，77，79，80，81，85，100，103，105，106，107，和108；以及(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56；或(ii)在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置：根據(jù)eu編號，位置196，253，254，256，258，278，280，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443；[31][30a]或[30b]所述的方法，其中所述氨基酸殘基修飾包括選自由以下組成的組的修飾：(a)用不帶電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；(b)用帶正電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；(c)用帶正電的氨基酸殘基置換不帶電的氨基酸殘基；以及(d)在cdr或fr中用組氨酸置換或插入。[32][30]，或[30a]至[30c]中任一項所述的方法，其還任選地包括以下中的任意一項或多項：與參照抗體相比，(a)選擇能夠促進從血漿去除抗原的抗體；(b)選擇對胞外基質(zhì)具有增強的結(jié)合活性的抗體；(c)選擇在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有增強的fcγr-結(jié)合活性的抗體；(d)選擇在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有增強的fcγriib-結(jié)合活性的抗體；(e)選擇對優(yōu)選選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib和fcγriia組成的組的一種或多種激活性fcγr具有保持的或增強的fcγriib-結(jié)合活性和減小的結(jié)合活性的抗體；(f)選擇在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有增強的fcrn-結(jié)合活性的抗體；(g)選擇具有提高的等電點(pi)的抗體；(h)確認(rèn)收集的抗體的等電點(pi)，并且隨后選擇具有提高的等電點(pi)的抗體；和(i)選擇其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變或增加的抗體。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及但不限于：[a1]具有恒定區(qū)的抗體，其中恒定區(qū)中選自與[15]或[16]中限定的組中的修飾位點相同的修飾位點的組的至少一個氨基酸殘基被修飾；[a2][a1]所述的抗體，其還具有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)具有一個或多個cdr和/或一個或多個fr，并且其中cdr和/或fr中選自與[13]或[14]中限定的組中的修飾位點相同的修飾位點的組的至少一個氨基酸殘基被修飾；[a3]具有恒定區(qū)的抗體，其中恒定區(qū)中選自與[15]或[16]中限定的組中的修飾位點相同的修飾位點的組中的至少一個氨基酸殘基被修飾以提高其pi；[a4][a3]所述的抗體，其還具有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)具有一個或多個cdr和/或一個或多個fr，并且其中cdr和/或fr中選自與[13]或[14]中限定的組中的修飾位點相同的修飾位點的組的至少一個氨基酸殘基被修飾；[a5]包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，其中所述抗體具有恒定區(qū)，并且其中恒定區(qū)中選自與[15]或[16]中限定的組中的修飾位點相同的修飾位點的組的至少一個氨基酸殘基被修飾；[a6][a5]所述的抗體，其還具有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，其中所述可變區(qū)具有一個或多個cdr和/或一個或多個fr，并且其中cdr和/或fr中選自與[13]或[14]中限定的組中的修飾位點相同的修飾位點的組的至少一個氨基酸殘基被修飾；[a7][1]至[23]和[a1]至[a6]中任一項所述的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于促進從血漿去除抗原；[a8][1]至[23]和[a1]至[a6]中任一項所述的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于增加胞外基質(zhì)結(jié)合；[a9][1]至[23]和[a1]至[a6]中任一項所述的抗體用于從血漿去除抗原的用途；和[a10][1]至[23]和[a1]至[a6]中任一項所述的抗體用于增加胞外基質(zhì)結(jié)合的用途。[a11][30]，[30a]，[30b]，[31]，[32]中任一項所述的方法獲得的抗體。根據(jù)各種實施方案，公開內(nèi)容a包括上述[1]至[30]，[30a]，[30b]，[31]，[32]和[a1]至[a11]中任一項中所述的一個或多個要素的組合(部分或全部)，只要該組合技術(shù)上與本領(lǐng)域中的普通技術(shù)知識不矛盾即可。例如，在一些實施方案中，公開內(nèi)容a包括用于生產(chǎn)包含與抗體修飾前相比促進從血漿去除抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾的抗體的方法，其中所述方法包括：(a)修飾可以暴露在抗體的表面上的至少一個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基在以下中的位置處：(i)在cdr或fr中選自由以下組成的組的位置：根據(jù)kabat編號，(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，5，8，10，12，13，15，16，18，19，23，25，26，39，41，42，43，44，46，68，71，72，73，75，76，77，81，82，82a，82b，83，84，85，86，105，108，110，和112；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，7，8，9，11，12，16，17，18，20，22，37，38，39，41，42，43，45，46，49，57，60，63，65，66，68，69，70，74，76，77，79，80，81，85，100，103，105，106，107，和108；以及(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56；或(ii)在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置：根據(jù)eu編號，位置196，253，254，256，258，278，280，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443；(b)以得到的抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的方式修飾抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述(a)和(b)可以同時或順序進行；(c)培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達編碼修飾的抗體的核酸；和(d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集修飾的抗體。在另一個實施方案中，所述方法任選地還包括以下中的一項或多項：與修飾前的抗體相比，(e)選擇能夠促進從血漿去除抗原的抗體；(f)選擇具有增強的對胞外基質(zhì)的結(jié)合活性的抗體；(g)選擇在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有增強的fcγr-結(jié)合活性的抗體；(h)選擇在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有增強的fcγriib-結(jié)合活性的抗體；(i)選擇具有保持的或增強的fcγriib-結(jié)合活性和對一種或多種激活性fcγr，優(yōu)選選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib和fcγriia組成的組的fcγr減小的結(jié)合活性的抗體；(j)選擇在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有增強的fcrn-結(jié)合活性的抗體；(k)選擇具有提高的等電點(pi)的抗體；(l)確認(rèn)收集的抗體的等電點(pi)，并且隨后選擇具有提高的等電點(pi)的抗體；和(m)選擇其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變或增加的抗體。公開內(nèi)容a的另一個實施方案涉及，例如，但不限于：[d1]用于產(chǎn)生與抗體修飾前相比其在血漿中的半衰期延長或降低的修飾的抗體的方法，其中所述方法包括：(a)修飾編碼修飾前的抗體的核酸以改變選自由以下組成的組的位置處的至少一個氨基酸殘基的電荷：根據(jù)eu編號，位置196，253，254，256，258，278，280，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達核酸；和(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集抗體；或[d2]用于延長或降低抗體在血漿中的半衰期的方法，其中所述方法包括在選自由以下組成的組的位置處修飾至少一個氨基酸殘基：根據(jù)eu編號，位置196，253，254，256，258，278，280，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b涉及，例如，但不限于：[33]包括fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體，其中fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括根據(jù)eu編號在位置434處的ala；在位置438處的glu，arg，ser，或lys；和在位置440處的glu，asp，或gln；[34][33]所述的fc區(qū)變體，其中所述fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括根據(jù)eu編號在位置434處的ala；在位置438處的arg或lys；和在位置440處的glu或asp；[35][33]或[34]所述的fc區(qū)變體，其中所述fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包括根據(jù)eu編號在位置428處的ile或leu；和/或在位置436處的ile，leu，val，thr，或phe；[36][35]所述的fc區(qū)變體，其中所述fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括根據(jù)eu編號在位置428處的leu；和/或在位置436處的val或thr；[37][33]至[36]中任一項所述的fc區(qū)變體，其中所述fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括選自由以下組成的組的氨基酸置換的組合：根據(jù)eu編號，n434a/q438r/s440e；n434a/q438r/s440d；n434a/q438k/s440e；n434a/q438k/s440d；n434a/y436t/q438r/s440e；n434a/y436t/q438r/s440d；n434a/y436t/q438k/s440e；n434a/y436t/q438k/s440d；n434a/y436v/q438r/s440e；n434a/y436v/q438r/s440d；n434a/y436v/q438k/s440e；n434a/y436v/q438k/s440d；n434a/r435h/f436t/q438r/s440e；n434a/r435h/f436t/q438r/s440d；n434a/r435h/f436t/q438k/s440e；n434a/r435h/f436t/q438k/s440d；n434a/r435h/f436v/q438r/s440e；n434a/r435h/f436v/q438r/s440d；n434a/r435h/f436v/q438k/s440e；n434a/r435h/f436v/q438k/s440d；m428l/n434a/q438r/s440e；m428l/n434a/q438r/s440d；m428l/n434a/q438k/s440e；m428l/n434a/q438k/s440d；m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；m428l/n434a/y436t/q438r/s440d；m428l/n434a/y436t/q438k/s440e；m428l/n434a/y436t/q438k/s440d；m428l/n434a/y436v/q438r/s440e；m428l/n434a/y436v/q438r/s440d；m428l/n434a/y436v/q438k/s440e；m428l/n434a/y436v/q438k/s440d；l235r/g236r/s239k/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；和l235r/g236r/a327g/a330s/p331s/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；[38][37]所述的fc區(qū)變體，其中所述fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括選自由以下組成的組的氨基酸置換的組合：根據(jù)eu編號，n434a/q438r/s440e；n434a/y436t/q438r/s440e；n434a/y436v/q438r/s440e；m428l/n434a/q438r/s440e；m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；m428l/n434a/y436v/q438r/s440e；l235r/g236r/s239k/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；和l235r/g236r/a327g/a330s/p331s/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；[39][33]至[38]中任一項所述的fc區(qū)變體，其中與天然igg的fc區(qū)相比，其fcrn-結(jié)合活性在酸性ph條件(例如，ph5.8)下增強；[40][33]至[39]中任一項所述的fc區(qū)變體，其中與天然igg的fc區(qū)相比，其與抗藥物抗體(ada)的結(jié)合活性在中性ph條件下不顯著增強；[41][40]所述的fc區(qū)變體，其中所述抗藥物抗體(ada)是類風(fēng)濕因子(rf)；[42][33]至[41]中任一項所述的fc區(qū)變體，其中與天然igg的fc區(qū)相比，其血漿清除率(cl)降低，血漿保留時間增加，或血漿半衰期(t1/2)增加；[43][33]至[42]中任一項所述的fc區(qū)變體，其中與包含根據(jù)eu編號的氨基酸置換n434y/y436v/q438r/s440e的組合的參照fc區(qū)變體相比，其血漿保留增加；[44]抗體，其包含[33]至[43]中任一項所述的fc區(qū)變體；[45][44]所述的抗體，其中所述抗體是igg抗體；[46]藥物組合物，其包含[44]或[45]所述的抗體；[47][46]所述的藥物組合物，其用于增加抗體在血漿中的保留；[48]核酸，其編碼[33]至[43]中任一項所述的fc區(qū)變體或[44]或[45]所述的抗體；[49]載體，其包含[48]的核酸；[50]宿主細(xì)胞，其包含[49]所述的載體；[51]用于生產(chǎn)包含fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體的方法，其包括培養(yǎng)[50]所述的宿主細(xì)胞，并且隨后從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體；[52][51]所述的方法，其還任選地包括選自由以下組成的組的任意一項或多項：(a)選擇與天然igg的fc區(qū)相比在酸性ph條件下具有增強的fcrn-結(jié)合活性的fc區(qū)變體；(b)選擇與天然igg的fc區(qū)相比其與抗藥物抗體(ada)的結(jié)合活性在中性ph條件下不顯著增強的fc區(qū)變體；(c)選擇與天然igg的fc區(qū)相比具有增加的血漿保留的fc區(qū)變體；和(d)選擇包含與包含天然igg的fc區(qū)的參照抗體相比能夠促進從血漿去除抗原的fc區(qū)變體的抗體；和[53]用于生產(chǎn)包含fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體的方法，其中所述方法包括以這樣的方式置換氨基酸：得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體包括根據(jù)eu編號在位置434處的ala；在位置438處的glu，arg，ser，或lys；和在位置440處的glu，asp，或gln。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b涉及，例如，但不限于：[b1][33]至[43]中任一項所述的fc區(qū)變體或[44]或[45]所述的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于增加在血漿中的保留；[b2][33]至[43]中任一項所述的fc區(qū)變體或[44]或[45]所述的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于與天然igg的fc區(qū)相比在中性ph條件下不顯著增加對抗藥物抗體(ada)的結(jié)合活性；[b3][33]至[43]中任一項所述的fc區(qū)變體或[44]或[45]所述的抗體用于增加在血漿中的保留的用途；[b4][33]至[43]中任一項所述的fc區(qū)變體或[44]或[45]所述的抗體用于與天然igg的fc區(qū)相比在中性ph條件下不顯著增加對抗藥物抗體(ada)的結(jié)合活性的用途；和[b5]fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體，其通過[51]，[52]，和[53]中任一項所述的方法獲得。根據(jù)各種實施方案，公開內(nèi)容b包括上述[33]至[53]和[b1]至[b5]中任一項所述的一種或多種要素的組合(部分或整體)，只要該組合與本領(lǐng)域中的普通技術(shù)知識不矛盾即可。例如，在一些實施方案中，公開內(nèi)容b包括包含fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體，其中所述fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括：(a)根據(jù)eu編號，在位置434處的ala；在位置438處的glu，arg，ser，或lys；和在位置440處的glu，asp，或gln；(b)根據(jù)eu編號，在位置434處的ala；在位置438處的arg或lys；和在位置440處的glu或asp；(c)根據(jù)eu編號，在位置428處的ile或leu；在位置434處的ala；在位置436處的ile，leu，val，thr，或phe；在位置438處的glu，arg，ser，或lys；和在位置440處的glu，asp，或gln；(d)根據(jù)eu編號，在位置428處的ile或leu；在位置434處的ala；在位置436處的ile，leu，val，thr，或phe；在位置438處的arg或lys；和在位置440處的glu或asp；(e)根據(jù)eu編號，在位置428處的leu；在位置434處的ala；在位置436處的val或thr；在位置438處的glu，arg，ser，或lys；和在位置440處的glu，asp，或gln；或(f)根據(jù)eu編號，在位置428處的leu；在位置434處的ala；在位置436處的val或thr；在位置438處的arg或lys；和在位置440處的glu或asp。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及，例如，但不限于：[54]結(jié)合人il-8的分離的抗-il-8抗體，其以下述(a)至(f)中至少一種包含至少一個氨基酸置換，并且以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8：(a)hvr-h1，其包含seqidno：67的氨基酸序列；(b)hvr-h2，其包含seqidno：68的氨基酸序列；(c)hvr-h3，其包含seqidno：69的氨基酸序列；(d)hvr-l1，其包含seqidno：70的氨基酸序列；(e)hvr-l2，其包含seqidno：71的氨基酸序列；和(f)hvr-l3，其包含seqidno：72的氨基酸序列；[55][54]所述的抗-il-8抗體，其包含seqidno：68的氨基酸序列的位置9處的酪氨酸，seqidno：68的氨基酸序列的位置11處的精氨酸，和seqidno：69的氨基酸序列的位置3處的酪氨酸的氨基酸置換；[56][54]或[55]所述的抗-il-8抗體，其包含seqidno：68的氨基酸序列的位置6處的丙氨酸和seqidno：68的氨基酸序列的位置8處的甘氨酸的氨基酸置換；[57][54]至[56]中任一項所述的抗-il-8抗體，其包含seqidno：71的氨基酸序列的位置1處的天冬酰胺，seqidno：71的氨基酸序列的位置5處的亮氨酸，和seqidno：72的氨基酸序列的位置1處的谷氨酰胺的氨基酸置換；[58][54]至[57]任一項中所述的抗-il-8抗體，其包括(a)包含seqidno：67的氨基酸序列的hvr-h1，(b)包含seqidno：73的氨基酸序列的hvr-h2，和(c)包含seqidno：74的氨基酸序列的hvr-h3；[59][54]至[58]任一項中所述的抗-il-8抗體，其包括(a)包含seqidno：70的氨基酸序列的hvr-l1，(b)包含seqidno：75的氨基酸序列的hvr-l2，和(c)包含seqidno：76的氨基酸序列的hvr-l3；[60][54]至[59]任一項中所述的抗-il-8抗體，其包括seqidno：78的重鏈可變區(qū)和seqidno：79的輕鏈可變區(qū)；[61][54]至[60]任一項中所述的抗-il-8抗體，其包含選自以下(a)至(f)的性質(zhì)中的至少一個性質(zhì)的fc區(qū)：(a)在酸性ph相對于天然fc區(qū)對于fcrn的結(jié)合親和力增加的fc區(qū)對fcrn的結(jié)合親和力；(b)相對于天然fc區(qū)對于預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)對于預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力；(c)相對于天然fc區(qū)的血漿半衰期增加的fc區(qū)的血漿半衰期；(d)相對于天然fc區(qū)的血漿清除降低的fc區(qū)的血漿清除；和(e)相對于天然fc區(qū)對于效應(yīng)受體的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)對于效應(yīng)受體的結(jié)合親和力；和(f)增加的對胞外基質(zhì)的結(jié)合。[62][61]所述的抗-il-8抗體，其中fc區(qū)在選自由以下組成的組的一個或多個位置包含一個或多個氨基酸置換：根據(jù)eu編號，位置235，236，239，327，330，331，428，434，436，438和440；[63][62]所述的抗-il-8抗體，其包含含有選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸置換的fc區(qū)：l235r，g236r，s239k，a327g，a330s，p331s，m428l，n434a，y436t，q438r和s440e；[64][63]所述的抗-il-8抗體，其中所述fc區(qū)包含l235r，g236r，s239k，m428l，n434a，y436t，q438r和s440e的氨基酸置換；[65][63]所述的抗-il-8抗體，其中所述fc區(qū)包含l235r，g236r，a327g，a330s，p331s，m428l，n434a，y436t，q438r和s440e的氨基酸置換；[66]抗-il-8抗體，其包含含有seqidno：81的氨基酸序列的重鏈和含有seqidno：82的氨基酸序列的輕鏈；[67]抗-il-8抗體，其包含含有seqidno：80的氨基酸序列的重鏈和含有seqidno：82的氨基酸序列的輕鏈；[68]分離的核酸，其編碼[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[69]載體，其包含[68]所述的核酸；[70]宿主細(xì)胞，其包含[69]所述的載體；[71]用于生產(chǎn)抗-il-8抗體的方法，其包括培養(yǎng)[70]所述的宿主；[72]用于生產(chǎn)[71]所述的抗-il-8抗體的方法，其包括從培養(yǎng)上清分離所述抗體；[73]藥物組合物，其包含[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，和藥用載體；[74][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于藥物組合物；[75][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于治療存在過量il-8的病癥；[76][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物用于存在過量il-8的病癥；[77]用于治療患有存在過量il-8的病癥的患者的方法，其包括向個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[78]用于促進從個體中去除il-8的方法，其包括向個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[79]藥物組合物，其包括[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其中所述抗體結(jié)合il-8和結(jié)合胞外基質(zhì)；以及[80]用于生產(chǎn)包含具有ph-依賴性il-8-結(jié)合活性的可變區(qū)的抗-il-8抗體的方法，其中所述方法包括：(a)評價抗-il-8抗體與胞外基質(zhì)的結(jié)合,(b)選擇與胞外基質(zhì)具有強烈結(jié)合的抗-il-8抗體,(c)培養(yǎng)包含含有編碼所述抗體的核酸的載體的宿主，和(d)從培養(yǎng)溶液分離抗體。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容c涉及：[c1][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于抑制具有生物活性的il-8的積累；[c2][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體用于抑制具有生物活性的il-8的積累的用途；[c3][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于抑制血管生成；[c4][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體用于抑制血管生成的用途；[c5][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于抑制中性粒細(xì)胞遷移的促進；[c6][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體用于抑制中性粒細(xì)胞遷移的促進的用途；[c7][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于抑制具有生物活性的il-8的積累；[c8]用于抑制具有生物活性的il-8的積累的方法，其中所述方法包括向個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c9]用于抑制具有生物活性的il-8的積累的藥物組合物，其包括[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c10][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于抑制血管生成；[c11]抑制個體中血管生成的方法，其中所述方法包括向所述個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c12]用于抑制血管生成的藥物組合物，其包括[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c13][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于抑制對中性粒細(xì)胞遷移的促進；[c14]用于抑制個體中對中性粒細(xì)胞遷移的促進的方法，其中所述方法包括向所述個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c15]藥物組合物，其用于抑制對中性粒細(xì)胞遷移的促進，所述藥物組合物包含[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c16][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于治療存在過量il-8的病癥；[c17][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于治療存在過量il-8的病癥；[c18][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體用于治療存在過量il-8的病癥的用途；[c19]治療個體中存在過量il-8的病癥的方法，其中所述方法包括向所述個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c20]用于治療存在過量il-8的病癥的藥物組合物，其包含[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；[c21][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體，其用于促進il-8的去除；[c22][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于促進il-8的去除；[c23][54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體用于促進il-8的去除的用途；[c24]用于促進個體中il-8的去除的方法，其中所述方法包括向所述個體施用[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體；和[c25]用于促進il-8的去除的藥物組合物，其包含[54]至[67]任一項中所述的抗-il-8抗體。[c26]抗-il-8抗體，其包含在選自由以下組成的組的一個或多個位置處包含一個或多個氨基酸置換的fc區(qū)：根據(jù)eu編號位置235，236，239，327，330，331，428，434，436，438和440。[c27][c26]所述的抗-il-8抗體，其包含具有選自以下(a)至(f)的性質(zhì)的至少一種性質(zhì)的fc區(qū)：(a)相對于天然fc區(qū)對于fcrn在酸性ph的結(jié)合親和力，增加的fc區(qū)對于fcrn的結(jié)合親和力；(b)相對于天然fc區(qū)對于預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力，降低的fc區(qū)對于預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力；(c)相對于天然fc區(qū)的血漿半衰期，增加的fc區(qū)的血漿半衰期；(d)相對于天然fc區(qū)的血漿清除，降低的fc區(qū)的血漿清除；(e)相對于天然fc區(qū)對于效應(yīng)受體的結(jié)合親和力，降低的fc區(qū)對于效應(yīng)受體的結(jié)合親和力；和(f)增加的對胞外基質(zhì)的結(jié)合。[c28][c26]或[c27]所述的抗-il-8抗體，其包含含有選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸置換的fc區(qū)：根據(jù)eu編號，l235r，g236r，s239k，a327g，a330s，p331s，m428l，n434a，y436t，q438r和s440e。[c29][c28]所述的抗-il-8抗體，其包含含有選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸置換的fc區(qū)：根據(jù)eu編號(a)l235r，g236r，s239k，m428l，n434a，y436t，q438r和s440e；或(b)l235r，g236r，a327g，a330s，p331s，m428l，n434a，y436t，q438r和s440e。[c30][c26]所述的抗-il-8抗體，其包含含有seqidno：81的氨基酸序列的重鏈和含有seqidno：82的氨基酸序列的輕鏈。[c31][c26]所述的抗-il-8抗體，其包含含有seqidno：80的氨基酸序列的重鏈和含有seqidno：82的氨基酸序列的輕鏈。[c32]分離的核酸，其編碼[c26]至[c31]任一項中所述的抗-il-8抗體。[c33]載體，其包含[c32]所述的核酸。[c34]宿主細(xì)胞，其包含[c33]所述的載體。[c35]用于生產(chǎn)抗-il-8抗體的方法，其包括培養(yǎng)[c34]所述的宿主細(xì)胞。[c36]用于生產(chǎn)[c26]至[c31]中任一項所述的抗-il-8抗體的方法，其還包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離所述抗體。[c37]藥物組合物，其包含[c26]至[c31]任一項中所述的抗-il-8抗體和藥用載體。[c38]用于治療具有存在過量il-8的病癥的患者的方法，所述方法包括向所述個體施用[c26]至[c31]任一項中所述的抗-il-8抗體。[c39]用于促進從個體中去除il-8的方法，所述方法包括向所述個體施用[c26]至[c31]任一項中所述的抗-il-8抗體。根據(jù)各種實施方案，公開內(nèi)容c包括上述[54]至[80]和[c1]至[c39]任一項中所述的一個或多個要素的組合(部分或整體)，只要該組合與本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識在技術(shù)上不矛盾即可。附圖簡述[圖1]圖1顯示用以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體并且其恒定區(qū)是天然igg1的恒定區(qū)的結(jié)合人il-6受體的抗體(低_pi-igg1)，或已經(jīng)提高了抗體中的可變區(qū)的pi的抗體(高_pi-igg1)施用的人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中人il-6受體的血漿濃度的改變。[圖2]圖2表明用以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體并且被賦予在中性ph條件下結(jié)合fcrn的結(jié)合人il-6受體的抗體(低_pi-f939)，和已經(jīng)提高了抗體中的可變區(qū)的pi的抗體(中_pi-f939，高_pi-f939)分別施用的人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中人il-6受體的血漿濃度的改變。[圖3]圖3顯示用以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體并且其在中性ph條件下的fcγr結(jié)合增加的結(jié)合人il-6受體的抗體(低_pi-f1180)，和已經(jīng)提高了抗體中的可變區(qū)的pi的抗體(中_pi-f1180，高_pi-f1180)分別施用的人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中人il-6受體的血漿濃度的改變。[圖4]圖4顯示其血漿中可溶性人il-6受體濃度保持在穩(wěn)定狀態(tài)的，用以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體并且其恒定區(qū)是天然igg1的恒定區(qū)的結(jié)合人il-6受體的抗體(低_pi-igg1)，包含其中抗體中的fc區(qū)在中性ph條件下具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體的抗體(低_pi-f11)，和已經(jīng)提高了的這些抗體中的可變區(qū)的pi的抗體(高_pi-igg1，高_pi-f11)分別施用的人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中人il-6受體的血漿濃度的改變。[圖5]圖5顯示三種類型的以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體的具有不同pi的抗體(低_pi-igg1，中_pi-igg1和高_pi-igg1)和兩種類型的不以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體的具有不同pi的抗體(低_pi(nph)-igg1和高_pi(nph)-igg1)中的每種的胞外基質(zhì)結(jié)合的程度。"nph"意為在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)ph非依賴性的。[圖6]圖6顯示包含其各自pi通過修飾以ph-依賴性的方式結(jié)合ige的ab1h-p600抗體的恒定區(qū)中的一個氨基酸殘基而提高的fc區(qū)變體的抗體的可溶性人fcγriib結(jié)合(通過biacore(注冊商標(biāo))測量)程度的相對值，設(shè)定ab1h-p600的值為1.00。[圖7]圖7顯示包含其各自的pi通過修飾ab1h-p600的恒定區(qū)中的一個氨基酸殘基而提高的fc區(qū)變體的抗體攝入表達hfcγriib的細(xì)胞系的細(xì)胞的速率的相對值，各自以設(shè)置為1.00的ab1h-p600的值評價。[圖8]圖8顯示fv4-igg1(其具有天然人igg1的fc區(qū))對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖9]圖9顯示fv4-yte(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖10]圖10顯示fv4-ls(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖11]圖11顯示fv4-n434h(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖12]圖12顯示fv4-f1847m(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖13]圖13顯示fv4-f1848m(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖14]圖14顯示fv4-f1886m(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖15]圖15顯示fv4-f1889m(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖16]圖16顯示fv4-f1927m(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖17]圖17顯示fv4-f1168m(其包含具有增加的fcrn結(jié)合的fc區(qū)變體)對每個ra患者的血清中類風(fēng)濕因子的結(jié)合程度。[圖18]圖18顯示fv4-igg1(其具有天然人igg1的fc區(qū)，并且每種抗體包含其中fc區(qū)具有對每種fcrn具有增加的結(jié)合的fc區(qū)變體的新fc區(qū)變體)對ra患者的血清中的類風(fēng)濕因子的結(jié)合的平均值。[圖19]圖19顯示用ohb-igg1(其是抗-人ige抗體并且具有天然人igg1的fc區(qū)，并且每個抗體包含新fc區(qū)變體(其中每個fc區(qū)包含具有增加的對fcrn的結(jié)合的fc區(qū)變體))(ohb-ls，ohb-n434a，ohb-f1847m，ohb-f1848m，ohb-f1886m，ohb-f1889m和ohb-f1927m)施用時，食蟹猴中每種抗-人ige抗體的血漿濃度的改變。[圖20]圖20顯示當(dāng)用fv4-igg1(其是抗-人il-6受體抗體并且具有天然人igg1的fc區(qū))，或fv4-f1718(其在酸性ph條件具有增加的抗體對fcrn結(jié)合)施用時，人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中抗-人il-6受體抗體的血漿濃度的改變。[圖21]圖21顯示對于在ph7.4和ph5.8用biacore測量的h998/l63和hr9的il-8結(jié)合獲得的傳感圖。[圖22]圖22顯示當(dāng)h998/l63或h89/l118以2mg/kg(在與人il-8的混合物中)施用給小鼠時，小鼠血漿中人il-8濃度的改變。[圖23]圖23顯示當(dāng)h89/l118以2mg/kg或8mg/kg(在與人il-8的混合物中)施用于小鼠時，小鼠血漿中人il-8濃度的改變。[圖24]圖24顯示當(dāng)h89/l118或h553/l118以2mg/kg或8mg/kg(在與人il-8的混合物中)施用于小鼠時，小鼠血漿中人il-8濃度的改變。[圖25a]圖25a顯示在保存在血漿中之前抗體hr9，h89/l118或h553/l118的抗體濃度-依賴性化學(xué)發(fā)光的相對值的改變。[圖25b]圖25b顯示在血漿中保存一周之后抗體hr9，h89/l118或h553/l118的抗體濃度-依賴性化學(xué)發(fā)光的相對值的改變。[圖25c]圖25c顯示在血漿中保存兩周后抗體hr9，h89/l118或h553/l118的抗體濃度-依賴性化學(xué)發(fā)光的相對值的改變。[圖26]圖26顯示預(yù)測的對于每種抗-il-8抗體(hws4，hr9，h89/l118，h496/l118或h553/l118)ada出現(xiàn)的頻率和預(yù)測的對于其他預(yù)先存在的治療性抗體的ada出現(xiàn)的頻率，通過epimatrix預(yù)測。[圖27]圖27顯示預(yù)測的對于每種抗-il-8抗體(h496/l118，h496v1/l118，h496v2/l118，h496v3/l118，h1004/l118或h1004/l395)ada出現(xiàn)的頻率和預(yù)測的對于其他預(yù)先存在的治療性抗體ada出現(xiàn)的頻率，通過epimatrix預(yù)測。[圖28a]圖28a顯示在保存在血漿中之前抗體hr9，h89/l118或h1009/l395-f1886s的抗體濃度-依賴性化學(xué)發(fā)光的相對值的改變。[圖28b]圖28b顯示在血漿中保存一周后抗體hr9，h89/l118或h1009/l395-f1886s的抗體濃度-依賴性化學(xué)發(fā)光的相對值的改變。[圖28c]圖28c顯示在血漿中保存兩周后抗體hr9，h89/l118或h1009/l395-f1886s的抗體濃度-依賴性化學(xué)發(fā)光的相對值的改變。[圖29]圖29顯示當(dāng)向小鼠施用h1009/l395，h553/l118和h998/l63中的每種(在與人il-8的混合物中)時，小鼠血漿中人il-8濃度的改變。[圖30]圖30顯示當(dāng)將hr9，h89/l118或h1009/l395單獨加入至胞外基質(zhì)，和當(dāng)將它們以與人il-8的混合物加入時的胞外基質(zhì)結(jié)合程度。[圖31]圖31顯示當(dāng)將具有h1009/l395的可變區(qū)和不結(jié)合fcrn的fc區(qū)的抗體(f1942m)單獨或以與人il-8的混合物施用于人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠時，小鼠血漿抗體濃度的改變。[圖32]圖32顯示預(yù)測的對于h1009/l395和h1004/l395ada出現(xiàn)的頻率和預(yù)測的對于其他預(yù)先存在的治療性抗體ada出現(xiàn)的頻率，通過epimatrix預(yù)測。[圖33]圖33顯示當(dāng)施用以h89/l118-igg1(其具有h89/l118的可變區(qū)和天然人igg1的fc區(qū)，和每種包含具有增加的對fcrn的結(jié)合的fc區(qū)變體的抗體(h89/l118-f1168m，h89/l118-f1847m，h89/l118-f1848m，h89/l118-f1886m，h89/l118-f1889m和h89/l118-f1927m)時，食蟹猴血漿中各個抗-人il-8抗體的濃度的改變。[圖34]圖34顯示具有h1009/l395的可變區(qū)并且其fc區(qū)對于每種fcγr是變體(f1886m，f1886s，或f1974m)的抗體的結(jié)合。[圖35]圖35顯示當(dāng)抗-il-8抗體以與人il-8的混合物施用于人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠時，小鼠血漿中人il-8濃度的改變。在該情況下，抗-il-8抗體是包含h1009/l395的可變區(qū)和天然人igg1的fc區(qū)的h1009/l395-igg1(2mg/kg)，或包含h1009/l395的可變區(qū)和修飾的fc區(qū)的h1009/l395-f1886s(2，5或10mg/kg)。[圖36]圖36顯示當(dāng)施用以hr9-igg1或h89/l118-igg1(二者都包含天然人igg1的fc區(qū))，或h1009/l395-f1886s或h1009/l395-f1974m(二者都包含修飾的fc區(qū))時，食蟹猴血漿中抗體濃度的改變。[圖37]圖37顯示就抗體可變區(qū)修飾而言，一些抗-ige抗體在c57bl6j小鼠中的ige血漿濃度時間曲線。[圖38a]圖38(圖38a-38d)顯示選擇的25個[二十五個]ph-依賴性和/或鈣-依賴性抗原結(jié)合克隆的octet傳感圖。[圖38b]圖38b是圖38a的繼續(xù)。[圖38c]圖38c是圖38b的繼續(xù)。[圖38d]圖38d是圖38c的繼續(xù)。[圖39]圖39顯示就抗體可變區(qū)修飾而言，一些抗-c5雙特異性抗體在c57bl6j小鼠中的c5血漿濃度時間曲線。[圖40]圖40顯示就抗體可變區(qū)修飾而言，一些抗-ige抗體在c57bl6j小鼠中的ige血漿濃度時間曲線。具體實施方案詳細(xì)描述公開內(nèi)容a，b或c的非限制性實施方案在下文中描述。描述下文實施例中所述的所有實施方案，意在于"詳述"部分中也正確理解，不受可能在希望本專利申請獲得授權(quán)的國家中被試圖狹義地解釋實施例中所述的內(nèi)容的任何專利實踐、條例、指南等限制。公開內(nèi)容a或公開內(nèi)容b在一些實施方案中，公開內(nèi)容a涉及包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，其中等電點(pi)通過修飾可以暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基而提高(本文中，在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)的也稱為"具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體"；并且抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域也稱為"具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域")。本發(fā)明部分基于本發(fā)明人的出人意料的發(fā)現(xiàn)：從血漿去除抗原可以用其等電點(pi)通過修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基而提高的離子濃度-依賴性抗體來促進(例如，當(dāng)體內(nèi)施用抗體時)；并且抗體對胞外基質(zhì)的結(jié)合可以隨具有增加的(升高的)pi的離子濃度-依賴性抗體而增加。本發(fā)明還部分基于本發(fā)明人的出人意料的發(fā)現(xiàn)：該有益效果通過組合以下兩種完全不同理念帶來：離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或離子濃度-依賴性抗體；和其pi通過修飾可能暴露在表面上的至少一個氨基酸殘基而提高的抗體(本文中，在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)的也稱為"具有提高的pi的抗體"；并且其pi通過修飾可能暴露在表面上的至少一個氨基酸殘基減小(降低的)抗體公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)也稱為"具有降低的pi的抗體")。本發(fā)明因此歸類為一類開拓性研究，其可能在公開內(nèi)容a屬于的領(lǐng)域(例如，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域)引領(lǐng)顯著的技術(shù)革新。通常，例如，包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且其pi通過修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基而提高，其進一步修飾從而抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗體，也包括在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)(本文中，所述抗體在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)也稱為"具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體")。通常，例如，含有離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體(其可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基具有與修飾前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)，或參考或母體抗體(例如，修飾前的抗體，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體等))中的相應(yīng)位置的至少一個氨基酸殘基不同的電荷，并且其凈抗體pi提高)也包括在本文所述的公開內(nèi)容a中(所述抗體在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)也稱為"具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體)。通常，例如，含有離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體(其pi通過修飾修飾前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體，或參考或母體抗體(例如，修飾前的抗體，或文庫構(gòu)建前或期間的抗體等))中可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基而提高)也包括在本文所述的公開內(nèi)容a中(所述抗體在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)也稱為"具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體")。通常，例如，含有離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體(其中修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基來提高抗體的pi)也包括在本文所述的公開內(nèi)容a(所述抗體在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)也稱為"具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體")。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"氨基酸"不僅包括天然氨基酸，而且也包括非天然氨基酸。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，氨基酸或氨基酸殘基可以由單字母(例如，a)或三字母編碼(例如，ala)，或二者(例如，ala(a))表示。在公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)使用時，"氨基酸的修飾"，"氨基酸殘基的修飾"，或相當(dāng)?shù)男g(shù)語可以理解為，不限于用分子化學(xué)修飾抗體氨基酸序列中一個或多個(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多于10個)特定氨基酸(殘基)或在抗體氨基酸序列中添加、缺失、置換或插入一個或多個(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或多于10個)氨基酸。可以對編碼氨基酸序列的核酸，例如，通過位點導(dǎo)向的誘變(kunkel等人，proc.natl.acad.sci.usa82：488-492(1985))或重疊延伸pcr；經(jīng)由抗體的親和力成熟，或通過使用抗體重鏈或輕鏈的鏈改組(shuffling)；或通過使用噬菌體展示文庫的基于抗原淘選的選擇(smith等人，methodsenzymol.217：228-257(1993))進行氨基酸添加，缺失，置換，或插入；并且這些可以單獨進行或以適當(dāng)?shù)慕M合進行。所述氨基酸修飾優(yōu)選，通過用不同氨基酸(分別)置換抗體氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基進行氨基酸添加，缺失，置換，或插入，并且通過人源化或嵌合修飾氨基酸序列可以通過本領(lǐng)域中已知的方法進行。氨基酸(殘基)的改變或修飾，如氨基酸添加，缺失，置換，或插入，還可以在要用于制備對于公開內(nèi)容a或b的抗體的重組抗體的抗體可變區(qū)或抗體恒定區(qū)上進行。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)的一個實施方案中，氨基酸(殘基)的置換是指用不同氨基酸(殘基)置換，并且可以設(shè)計為修飾，例如，如(a)至(c)中各項的事項：(a)折疊或螺旋構(gòu)象區(qū)域中的多肽骨架結(jié)構(gòu)；(b)靶位點的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈的大小?；诮Y(jié)構(gòu)中側(cè)鏈的性質(zhì)將氨基酸殘基分類為例如以下組：(1)疏水的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，和ile；(2)中性的，親水的：cys，ser，thr，asn，和gln；(3)酸性的：asp和glu；(4)堿性的：his，lys，和arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly和pro；以及(6)芳族的：trp，tyr，和phe。每個組內(nèi)氨基酸殘基的置換稱為保守置換，而不同組之間的氨基酸殘基置換稱為非保守置換。氨基酸殘基的置換可以是保守置換，非保守置換，或其組合。多種已知的適當(dāng)方法可以用不同于天然氨基酸的那些用于置換氨基酸(wang等人，annu.rev.biophys.biomol.struct.35：225-249(2006)；forster等人，proc.natl.acad.sci.usa100(11)：6353-6357(2003))?？赡苁褂?，例如，含有trna的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，其中非天然氨基酸與uag密碼子(琥珀密碼子)(其是終止密碼子)互補的琥珀抑制trna連接(cloverdirect(proteinexpress))。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，要理解，"抗原"的結(jié)構(gòu)不限于具體結(jié)構(gòu)，只要抗原包括結(jié)合抗體的表位即可。抗原可以是無機物質(zhì)或有機物質(zhì)?？乖梢允侨魏闻潴w，包括各種細(xì)胞因子，例如，白介素，趨化因子，和細(xì)胞生長因子。備選地，通常，例如，以可溶形式存在或修飾為在生物液體如血漿中為可溶形式的受體也可以用作抗原。所述可溶性受體的非限制性實例包括mullberg等人，j.immunol.152(10)：4958-4968(1994)中所述的可溶性il-6受體。此外，抗原可以是單價的(例如，可溶性il-6受體)或多價的(例如，ige)。在一個實施方案中，可以由公開內(nèi)容a和b的抗體結(jié)合的抗原優(yōu)選是存在于受試者的生物液體(例如，wo2013/125667中所述的生物液體，優(yōu)選血漿，細(xì)胞間液，淋巴液，腹水，或胸膜液)(在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，要施用(施加)以抗體的受試者，其可以實際上是任何動物，例如，人、小鼠等)中的可溶性抗原；然而，抗原還可以是膜抗原。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"延長靶分子在血漿中的半衰期"或"縮短靶分子在血漿中的半衰期"(所述靶分子可以是抗原或抗體)，或其相當(dāng)?shù)男g(shù)語還可以使用除了血漿中的半衰期的參數(shù)(t1/2)之外的任何其他參數(shù)更具體地表示，如在血漿中的平均保留時間，血漿中的清除率(cl)，和濃度曲線下面積(auc)(藥代動力學(xué)：enshuniyorurikai(通過實踐理解)nanzando)。這些參數(shù)可以，例如，通過根據(jù)體內(nèi)動力學(xué)分析軟件winnonlin(pharsight)所附的方案進行非房室模型分析(noncompartmentalanalysis)進行具體評估。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，這些參數(shù)通常彼此相關(guān)。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"表位"是指抗原中的抗原決定簇并且意為抗原上抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的位點。因此，表位可以，例如，基于其結(jié)構(gòu)限定。備選地，表位可以由識別表位的抗體的抗原結(jié)合活性限定。當(dāng)抗原是肽或多肽時，表位可以由構(gòu)成表位的氨基酸殘基具體化。備選地，當(dāng)表位是糖鏈時，表位可以基于其具體糖鏈結(jié)構(gòu)具體化。公開內(nèi)容a和b的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合抗原上的單個表位或不同表位。線性表位可以是一級氨基酸序列。所述線性表位典型含有至少三個并且通常含有至少五個，例如，8至10個氨基酸或6至20個氨基酸作為獨特序列。在構(gòu)象表位中，通常構(gòu)成表位的氨基酸不作為一級序列連續(xù)存在。抗體識別肽或蛋白的三維結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象表位。確定表位的構(gòu)象的方法包括但不限于，x射線晶體學(xué)，二維核磁共振，位點特異性旋轉(zhuǎn)標(biāo)記和電子順磁共振(epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology(1996)，vol.66，morris(編輯))。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"抗體"不特別限制并且以最廣泛的意義使用，只要其可以結(jié)合靶抗原即可，抗體的非限制性實例廣泛地包括已知常見抗體(例如，天然免疫球蛋白(縮寫為"ig"))，以及源自其的分子和變體，例如，fab，fab'，f(ab')2，雙抗體(diabodies)，scfv(holliger等人，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993)；ep404,097；wo93/11161；peer等人，naturenanotechnology2：751-760(2007))，低分子量抗體(minibodies)(orita等人，blood105：562-566(2005))，支架蛋白，單臂抗體(包括wo2005/063816中所述的單臂抗體的所有實施方案)，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體：對兩個不同表位具有特異性的抗體，包括識別不同抗原的抗體和識別相同抗原上不同表位的抗體)。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"雙特異性抗體"不限于但可以制備為，例如，具有wo2005/035756中所述的常見l鏈的抗體分子，或通過wo2008/119353中所述的方法制備，其中具有igg4-樣恒定區(qū)的兩種一般類型的抗體混合，引起兩種類型的所述抗體之間的交換反應(yīng)(對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言稱為"fab-臂交換"方法)。在一個備選實施方案中，它們可以是具有其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接在一起成為單鏈(例如，sc(fv)2)的結(jié)構(gòu)抗體。備選地，它們可以是由將fc區(qū)(缺少ch1結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū))與scfv(或sc(fv)2)(其中重鏈可變區(qū)(vh)連接于輕鏈可變區(qū)(vl))連接導(dǎo)致的抗體-樣分子(例如，scfv-fc)。由scfv-fc組成的多特異性抗體具有(scfv)2-fc結(jié)構(gòu)，其中第一和第二多肽分別是vh1-接頭-vl1-fc和vh2-接頭-vl2-fc。備選地，它們可以是其中單結(jié)構(gòu)域抗體連接于fc區(qū)的抗體-樣分子(marvin等人，curr.opin.drugdiscov.devel.9(2)：184-193(2006))，fc融合蛋白(例如，免疫粘附素)(us2013/0171138)，其功能性片段，與其功能相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)，和其糖鏈修飾的變體。本文中，天然igg(例如天然igg1)是指含有與天然存在的igg(例如天然igg1)相同的氨基酸序列的多肽并且屬于基本上由免疫球蛋白γ基因編碼的抗體類型。天然igg可以是其自發(fā)突變體等。通常，在抗體具有基本上與天然igg相同或類似的結(jié)構(gòu)時，四條鏈(兩條重鏈多肽和兩條輕鏈多肽)的y-形結(jié)構(gòu)可以是基本結(jié)構(gòu)。通常，重鏈和輕鏈可以通過二硫鍵(ss鍵)連接并且形成異源二聚體。所述異源二聚體可以通過二硫鍵連接在一起并且形成y-形異源四聚體。兩條重鏈或輕鏈可以彼此相同或不同。例如，igg抗體可以由木瓜蛋白酶裂解為兩個fab單位(區(qū))和單個fc單位(區(qū))，所述木瓜蛋白酶裂解鉸鏈區(qū)(在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)也稱為"鉸鏈")，其中重鏈fab區(qū)連接于fc區(qū)。通常，fab區(qū)含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因為吞噬細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有能夠結(jié)合fc區(qū)的受體(fc受體)，并且可以經(jīng)由fc受體識別結(jié)合抗原的抗體并且吞噬抗原(調(diào)理作用)。同時，fc區(qū)參與免疫反應(yīng)如adcc或cdc的介導(dǎo)，并且具有在抗體結(jié)合抗原后誘導(dǎo)反應(yīng)的效應(yīng)子功能。已知抗體效應(yīng)子功能根據(jù)免疫球蛋白的類型(同種型)改變。igg類型的fc區(qū)將表明，例如，橫跨位置226的半胱氨酸或位置230的脯氨酸(eu編號)到c末端的區(qū)域；然而，fc區(qū)不限于此。fc區(qū)可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^用蛋白酶如胃蛋白酶部分消化單克隆igg1，igg2，igg3，或igg4抗體等，接著從蛋白a或蛋白g柱洗脫吸附的級分而適當(dāng)?shù)孬@得。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，抗體可變區(qū)(一個或多個cdr和/或一個或多個fr)中氨基酸殘基的位置根據(jù)kabat顯示，而恒定區(qū)或fc區(qū)中氨基酸殘基的位置基于kabat的氨基酸位置根據(jù)eu編號顯示(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstituteofhealth，bethesda，md.，1987和1991)。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"文庫"可以指分子(群體)如具有序列變異的多種抗體，其中其各自的序列可以彼此相同或不同；多種含有所述抗體的融合多肽；或編碼這些氨基酸序列的核酸或寡核苷酸，如wo2013/125667(例如，第0121-0125段)中詳述的。文庫可以，例如，含有至少104個抗體分子，更優(yōu)選，至少105個抗體分子，甚至更優(yōu)選，至少106個抗體分子，特別優(yōu)選，至少107個抗體分子或更多。文庫可以是噬菌體文庫。術(shù)語"主要由…組成"意為在文庫中具有不同序列的很多獨立的克隆中占一定部分的可以具有不同抗原結(jié)合活性的抗體。在一個實施方案中，基于來自用特定抗原免疫的動物的淋巴細(xì)胞，感染的患者，由于免疫在血液中具有升高的抗體低度的人，或含有癌癥或自身免疫病的患者的抗體基因構(gòu)建的免疫文庫可以適當(dāng)?shù)赜米麟S機可變區(qū)文庫。在一個備選實施方案中，含有未免疫(naive)序列(在組庫中沒有偏向的抗體序列)的未免疫文庫(其從源自健康人的淋巴細(xì)胞的抗體基因構(gòu)建)也可以適當(dāng)?shù)赜米麟S機化的可變區(qū)文庫(gejima等人，人抗體11：121-129(2002))；cardoso等人，scand.j.immunol.51：337-344(2000))。含有未免疫序列的氨基酸序列可以指從所述未免疫文庫獲得的那些。在一個備選實施方案中，其中來自基因組dna的v基因或重構(gòu)建的功能性v基因用一組含有編碼適當(dāng)長度的密碼子組的序列合成的寡核苷酸置換的cdr序列的合成文庫還可以適當(dāng)?shù)赜米麟S機的可變區(qū)文庫。在該情況下，還可能僅置換重鏈cdr3序列，因為在cdr3基因中觀察到序列改變。在抗體可變區(qū)中產(chǎn)生氨基酸多樣性的標(biāo)準(zhǔn)途徑可以是增加可能暴露在抗體表面上的位置處的氨基酸殘基的改變。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a或b的抗體，例如，具有與天然ig抗體的結(jié)構(gòu)基本上相同或相似的結(jié)構(gòu)的情況下，它們通常具有可變區(qū)("v區(qū)")[重鏈可變區(qū)("vh區(qū)")和輕鏈可變區(qū)("vl區(qū)")]以及恒定區(qū)("c區(qū)")["重鏈恒定區(qū)("ch區(qū)")和輕鏈恒定區(qū)("cl區(qū)")]。ch區(qū)進一步分為三個：ch1至ch3。通常，重鏈的fab區(qū)含有vh區(qū)和ch1，并且通常重鏈的fc區(qū)含有ch2和ch3。通常，鉸鏈區(qū)位于ch1和ch2之間。此外，可變區(qū)通常具有互補決定區(qū)("cdrs")和框架區(qū)("frs")。通常，vh區(qū)和vl區(qū)各自具有三個cdrs(cdr1，cdr2，和cdr3)和四個frs(fr1，fr2，fr3，和fr4)。通常，重鏈和輕鏈的可變區(qū)中的六個cdr相互作用并且形成抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另一方面，在僅存在一個單個cdr的情況下，在已知與存在六個cdr的情況相比抗原結(jié)合親和力更低的同時，其具有識別和結(jié)合抗原的能力。ig抗體基于其恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)差異分類為多種類型(同種型)。在很多哺乳動物中，它們基于恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)差異分類為五個免疫球蛋白類型：igg，iga，igm，igd，和ige。此外，在人的情形中，igg具有四種類型：igg1，igg2，igg3，和igg4；并且iga具有兩種亞類：iga1和iga2。重鏈根據(jù)恒定區(qū)的差異分類為γ鏈，μ鏈，α鏈，δ鏈，和ε鏈，并且基于這些差異，存在五種免疫球蛋白類型(同種型)：igg，igm，iga，igd，和ige。另一方面，存在兩種類型的輕鏈：λ鏈和κ鏈，并且所有免疫球蛋白具有這兩種之一。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體具有重鏈，例如，所述重鏈可以是γ鏈，μ鏈，α鏈，δ鏈，和ε鏈中的任一種，或可以源自它們中的任一種，并且其中公開內(nèi)容a或b的抗體具有輕鏈，例如，所述輕鏈可以是κ鏈或λ鏈，或可以源自它們中的任一種。此外，在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，所述抗體可以是任一同種型的(例如，igg，igm，iga，igd，或ige)和任意亞類的(例如，人igg1，igg2，igg3，igg4，iga1，和iga2；小鼠igg1，igg2a，igg2b，和igg3)，或可以源自它們中的任一種，但不限于其。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，"抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域"可以具有任意結(jié)構(gòu)，只要其結(jié)合研究的抗原即可。所述結(jié)構(gòu)域可以包括，例如，抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)(例如，1至6個cdrs)；約35個氨基酸的稱為a結(jié)構(gòu)域的模塊，其包含在avimer(體內(nèi)存在的細(xì)胞膜蛋白)中(wo2004/044011和wo2005/040229)；結(jié)合表達在細(xì)胞膜上的糖蛋白纖連蛋白(fibronectin)中的蛋白的含有10fn3結(jié)構(gòu)域的adnectin(wo2002/032925)；affibody，其具有支架igg-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(構(gòu)成蛋白a的58個氨基酸的三螺旋束)(wo1995/001937)；設(shè)計的錨蛋白(ankyrin)重復(fù)蛋白(darpins)，其是暴露在錨蛋白重復(fù)(ar)的分子表面上的區(qū)域，所述錨蛋白重復(fù)具有這樣的結(jié)構(gòu)：其中具有含有33個氨基酸殘基轉(zhuǎn)角(turn)，兩個反平行螺旋，和環(huán)的亞單位重復(fù)堆疊(wo2002/020565)；anticalins等，其是支持分子如中性粒細(xì)胞明膠酶-相關(guān)脂籠蛋白(ngal)中高度保守的八條反平行鏈的中央扭曲的桶結(jié)構(gòu)的一側(cè)的四環(huán)區(qū)域(wo2003/029462)；和通過由可變淋巴細(xì)胞受體(vlr)(其不具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)并且用于無頜脊椎動物如七鰓鰻和盲鰻中的獲得性免疫的系統(tǒng))的富亮氨酸重復(fù)(lrr)模塊的堆疊重復(fù)形成的馬蹄形結(jié)構(gòu)內(nèi)部的平行片結(jié)構(gòu)形成的凹形區(qū)域(wo2008/016854)。公開內(nèi)容a或b的優(yōu)選的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括具有igg抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的那些，并且更具體地是，scfv，單鏈抗體，fv，scfv2(單鏈fv2)，fab，和f(ab')2。在公開內(nèi)容a的一個實施方案中，"離子濃度"不特別受限，并且指氫離子濃度(ph)或金屬離子濃度。本文中，"金屬離子"可以是除氫之外的第i族元素中的離子中的任一種，如堿金屬和銅族元素，第ii族元素如堿土金屬和鋅族元素，除硼之外的第iii族元素，除碳和硅之外的第iv族元素，第viii族元素如鐵族和鉑族元素，屬于第v，vi，和vii族的亞族a的元素，和金屬元素如銻，鉍，和釙。金屬原子具有釋放價電子成為陽離子的性質(zhì)。這稱為離子化傾向。具有強的離子化傾向的金屬認(rèn)為是有化學(xué)活性的。在公開內(nèi)容a的一個實施方案中，優(yōu)選的金屬離子可以是鈣離子，如wo2012/073992和wo2013/125667中詳述的。在公開內(nèi)容a的一個實施方案中，"一個或多個離子濃度條件"可以是集中于離子濃度-依賴性抗體的生物行為在低離子濃度和高離子濃度之間的差異的條件。此外，"抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變"可能意為，公開內(nèi)容a或b的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或離子濃度-依賴性抗體的抗原結(jié)合活性在低離子濃度和高離子濃度之間改變。所述情況包括，例如，在高離子濃度比在低離子濃度具有更高(更強)的或更低(更弱)的抗原結(jié)合活性的那些，但不限于其。在公開內(nèi)容a的一個實施方案中，離子濃度可以是氫離子濃度(ph)或鈣離子濃度，在離子濃度是氫離子濃度(ph)的情況下，離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域還可以稱為"ph-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域"；并且在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，其也可以稱為"鈣離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域"。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，離子濃度-依賴性抗體，具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體可以獲自主要由序列不同(具有可變性)并且其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有至少一個引起抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的氨基酸殘基的抗體組成的文庫?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以優(yōu)選位于輕鏈可變區(qū)(其可以被修飾)和/或重鏈可變區(qū)(其可以被修飾)內(nèi)。此外，為了構(gòu)建文庫，所述輕鏈或重鏈可變區(qū)可以與構(gòu)建為隨機可變區(qū)序列文庫的重鏈或輕鏈可變區(qū)組合。在離子濃度是氫或鈣離子濃度的情況下，文庫的非限制性實例包括，例如，其中構(gòu)建為隨機可變區(qū)序列文庫的重鏈可變區(qū)與其中種系序列如seqidno：1(vk1)，seqidno：2(vk2)，seqidno：3(vk3)，或seqidno：4(vk4)中的一個或多個氨基酸殘基用至少一個能夠根據(jù)離子濃度改變抗原結(jié)合活性的氨基酸殘基置換的輕鏈可變區(qū)序列組合的文庫。此外，在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，文庫包括，例如，其中seqidno：5(6rl#9-igg1)或seqidno：6(6kc4-1#85-igg1)的重鏈可變區(qū)序列與構(gòu)建為隨機可變區(qū)序列文庫的輕鏈可變區(qū)或具有種系序列的輕鏈可變區(qū)組合的那些。在一個實施方案中，在離子濃度是鈣離子濃度，高鈣離子濃度不特別限于具體值；然而，濃度可以在100μm至10mm之間，在200μm至5mm之間，在400μm至3mm之間，在200μm至2mm之間，或在400μm至1mm之間選擇。在500μm至2.5mm(其接近鈣離子體內(nèi)血漿(血液)濃度)之間選擇的濃度，也可以是優(yōu)選的。低鈣離子濃度不特別限于具體值；然而，濃度可以在0.1μm至30μm之間，在0.2μm至20μm之間，在0.5μm至10μm之間，或在1μm至5μm之間，或在2μm至4μm之間選擇。在之間1μm至5μm(其接近在早期內(nèi)體中的體內(nèi)鈣離子濃度)選擇的濃度，也可以是優(yōu)選的?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有所述結(jié)構(gòu)域的抗體的抗原結(jié)合活性是否根據(jù)金屬離子濃度(例如，鈣離子濃度)條件改變可以容易地通過已知方法確定，例如，通過本文在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)所述的方法，或wo2012/073992中所述的方法確定。例如，可以在低和高鈣離子濃度測量抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有所述結(jié)構(gòu)域的抗體的抗原結(jié)合活性并比較。在該情況下，除了鈣離子濃度以外的條件可以優(yōu)選相同。此外，在抗原結(jié)合活性的確定中除了鈣離子濃度以外的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇?？乖Y(jié)合活性可以，例如，在37℃在hepes緩沖液的條件下，或使用biacore(gehealthcare)等確定。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，優(yōu)選離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，離子濃度-依賴性抗體，具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的抗原結(jié)合活性在高鈣離子濃度條件下比在低鈣離子濃度條件下更高。在該情況下，在低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性和在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性之間的比率不受限；然而，在低鈣離子濃度條件下對于抗原的kd(解離常數(shù))與在高鈣離子濃度條件下的kd的比值，即，kd(3μmca)/kd(2mmca)，可以優(yōu)選是2或更多，更優(yōu)選10或更多，并且還更優(yōu)選40或更多。kd(3μmca)/kd(2mmca)值的上限不受限，并且可以是任意值如400，1000，或10000。在抗原是可溶性抗原的情況下，解離常數(shù)(kd)可以用作抗原結(jié)合活性的值。同時，在抗原是膜抗原的情況下，可以使用表觀解離常數(shù)(kd)。解離常數(shù)(kd)和表觀解離常數(shù)(kd)可以通過已知方法，例如，通過biacore(gehealthcare)，scatchard曲線，或流式細(xì)胞儀確定。備選地，例如，解離速率常數(shù)(kd)也可以用作表示結(jié)合活性比的另一指標(biāo)。在使用解離速率常數(shù)(kd)替代解離常數(shù)(kd)作為表示抗原結(jié)合活性比的指標(biāo)時，低-鈣-離子-濃度-條件解離速率常數(shù)(kd)與高-鈣-離子-濃度-條件解離速率常數(shù)(kd)的比值，即，kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)，可以優(yōu)選為2或更多，更優(yōu)選5或更多，還更優(yōu)選10或更多，并且另外更優(yōu)選30或更多。kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)值的上限不受限，并且可以是任意值如50，100，或200。在抗原是可溶性抗原的情況下，解離速率常數(shù)(kd)可以用作抗原結(jié)合活性的值。同時，在抗原是膜抗原的情況下，可以使用表觀解離速率常數(shù)(kd)。解離速率常數(shù)(kd)和表觀解離速率常數(shù)(kd)可以通過已知方法，例如，通過biacore(gehealthcare)或流式細(xì)胞儀確定。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生或篩選其抗原結(jié)合活性在高鈣離子濃度條件比在低鈣離子濃度條件更高的鈣離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子濃度-依賴性抗體，或其文庫的方法不受限。所述方法包括，例如，wo2012/073992(例如，第0200-0213段)中所述的那些。所述方法可以包括，例如：(a)確定抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在低鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性；(b)確定抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性；和(c)選擇其抗原結(jié)合活性在低鈣離子濃度條件低于在高鈣離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)在高鈣離子濃度條件下將抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫接觸；(b)在低鈣離子濃度條件下孵育步驟(a)中結(jié)合于抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(c)分離步驟(b)中解離的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，方法可以包括，例如：(a)在低鈣離子濃度條件下將抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫接觸；(b)選擇步驟(a)中不結(jié)合抗原或具有低抗原結(jié)合能力的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；(c)使步驟(b)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在高鈣離子濃度條件下與抗原結(jié)合；和(d)分離在步驟(c)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫與固定抗原的柱在高鈣離子濃度條件下接觸；(b)在低鈣離子濃度條件下從所述柱洗脫步驟(a)中結(jié)合于柱的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(c)分離步驟(b)中洗脫的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)在低鈣離子濃度條件下使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫通過固定抗原的柱以收集不結(jié)合柱而洗脫的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；(b)使步驟(a)中收集的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在高鈣離子濃度條件下結(jié)合抗原；和(c)分離步驟(b)中結(jié)合抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)在高鈣離子濃度條件下將抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫接觸；(b)獲得在步驟(a)中與所述抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；(c)在低鈣離子濃度下孵育在步驟(b)中獲得的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(d)分離其在步驟(c)中的抗原結(jié)合活性弱于步驟(b)中選擇的標(biāo)準(zhǔn)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。這些不同篩選方法的每個步驟可以重復(fù)數(shù)次，或可以將步驟適當(dāng)組合，獲得最合適的分子。對低和高鈣離子濃度條件可以適當(dāng)選擇上述條件。所需鈣離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子濃度-依賴性抗體可以由此獲得。在公開內(nèi)容a的情況下，在一個實施方案中，作為起始材料的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可以是，例如，由于修飾至少一個能夠暴露在其表面上的氨基酸殘基的電荷得到的具有提高的pi的修飾的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。在一個備選實施方案中，在將改變離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的氨基酸引入序列的情況下，可以將它們與至少一個可能暴露在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的表面的氨基酸殘基的電荷修飾一起引入從而提高pi。備選地，在本發(fā)明a的情況下，例如，可能使用預(yù)先存在的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，預(yù)先存在的文庫(噬菌體文庫等)；從通過免疫動物獲得的雜交瘤或從免疫的動物的b細(xì)胞，或其文庫制備抗體；或通過引入能夠螯合其中的鈣的天然或非天然氨基酸突變獲得的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抗體，或文庫(下文所述)(例如，具有增加的可螯合鈣的氨基酸的含量的文庫，或在特定位點引入可螯合鈣的氨基酸的文庫)。在在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，對于改變具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的氨基酸類型沒有限制，只要它們能夠形成鈣-結(jié)合基序即可。例如，鈣-結(jié)合基序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，springer等人(cells102：275-277(2000))；kawasaki等人(proteinprof.2：305-490(1995))；moncrief等人(j.mol.evol.30：522-562(1990))；chauvaux等人(biochem.j.265：261-265(1990))；bairoch等人(febslett.269：454-456(1990))；davis(newbiol.2：410-419(1990))；schaefer等人(genomics25：638-643(1995))；economou等人(emboj.9：349-354(1990))；wurzburg等人(結(jié)構(gòu).14(6)：1049-1058(2006))。因此，在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有任意鈣-結(jié)合基序如c-型凝集素的鈣-結(jié)合基序，例如，asgpr，cd23，mbr，或dc-sign的情況下，結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合活性能夠根據(jù)鈣離子濃度條件改變。所述鈣-結(jié)合基序可以包括(除了上述那些之外)例如，seqidno：7中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包括的鈣-結(jié)合基序(其對應(yīng)于"vk5-2")。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，具有金屬螯合活性的氨基酸可以用作改變具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的氨基酸。例如，任意氨基酸可以適當(dāng)?shù)赜米骶哂薪饘衮匣钚缘陌被幔灰鼈兡軌蛐纬赦}-結(jié)合基序即可。具體而言，所述氨基酸包括具有供電子性質(zhì)的那些。氨基酸優(yōu)選包括，但不限于，ser(s)，thr(t)，asn(n)，gln(q)，asp(d)，和glu(e)。所述具有金屬螯合活性的氨基酸在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的位置不受限于具體位置。在一個實施方案中，所述氨基酸可以位于可以形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)中的任意位置。引起抗體的抗原結(jié)合活性的鈣離子濃度-依賴性改變的至少一個氨基酸殘基可以包含在，例如，重鏈和/或輕鏈的cdr(cdr1，cdr2和cdr3中的一個或多個)和/或fr(fr1，fr2，fr3，和fr4中的一個或多個)中。一個或多個氨基酸殘基可以置于，例如，根據(jù)kabat編號在重鏈cdr3中的位置95，96，100a，和101中的一個或多個處；根據(jù)kabat編號在輕鏈cdr1中的位置30，31和32的一個或多個處；根據(jù)kabat編號在輕鏈cdr2中的位置50處；和/或根據(jù)kabat編號在輕鏈cdr3中的位置92處。那些氨基酸殘基可以單獨或組合放置。已知肌鈣蛋白c，鈣調(diào)蛋白，小清蛋白，肌球蛋白輕鏈等具有多個鈣-結(jié)合位點并且猜測在分子進化中源自共同來源，并且在一個實施方案中，輕鏈cdr1，cdr2，和cdr3中的一個或多個可以設(shè)計為含有其結(jié)合基序。為了上述目的，可以適當(dāng)使用例如，鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)域；鈣調(diào)蛋白中含有的ef手；蛋白激酶c中含有的c2結(jié)構(gòu)域；凝血蛋白因子ix中含有的gla結(jié)構(gòu)域；脫唾液酸糖蛋白受體或甘露糖-結(jié)合受體的c-型凝集素；ldl受體中含有的a結(jié)構(gòu)域；膜聯(lián)蛋白(annexin)；凝血酶敏感蛋白3型結(jié)構(gòu)域；和egf-樣結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，在離子濃度是氫離子濃度(ph)的情況下，質(zhì)子，即，氫原子的核的濃度條件，與氫指數(shù)的條件(ph)同義地使用。在水溶液中氫離子活性量用ah+表示的情況下，ph定義為-log10ah+。在水溶液的離子強度低(例如，低于10-3)的情況下，ah+幾乎等于氫離子強度。例如，在25℃和1個大氣壓下水的離子積是kw＝ah+*aoh＝10-14；因此，對于純水，ah+＝aoh＝10-7。在此情況下，ph＝7是中性的，并且ph小于7的水溶液是酸性的，并且ph大于7的水溶液是堿性的。因此，氫離子濃度條件可以是集中于對于氫離子濃度條件或ph條件，在高氫離子濃度(酸性ph范圍)和在低氫離子濃度(中性ph范圍)下ph-依賴性抗體的生物行為的差異的條件。例如，在公開內(nèi)容a的情況下，"在高氫離子濃度(酸性ph范圍)條件下的抗原結(jié)合活性低于在低氫離子濃度(中性ph范圍)條件下的抗原結(jié)合活性"可以意為，離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，離子濃度-依賴性抗體，具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的抗原結(jié)合活性在選自ph4.0至ph6.5，優(yōu)選ph4.5至ph6.5，更優(yōu)選ph5.0至ph6.5，并且還更優(yōu)選ph5.5至ph6.5的ph，比選自ph6.7至ph10.0，優(yōu)選ph6.7至ph9.5，更優(yōu)選ph7.0至ph9.0，并且還更優(yōu)選ph7.0至ph8.0的ph弱。優(yōu)選地，上述表達可以意為，在早期內(nèi)體體內(nèi)ph的抗原結(jié)合活性弱于血漿ph體內(nèi)的抗原結(jié)合活性；并且具體意為，抗體，例如，在ph5.8的抗原結(jié)合活性弱于在例如，ph7.4的抗原結(jié)合活性。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有所述結(jié)構(gòu)域的抗體的抗原結(jié)合活性是否根據(jù)氫離子濃度條件改變可以容易地通過已知方法，例如，通過本文公開內(nèi)容a的情況下所述的，或wo2009/125825中所述的測定方法評估。例如，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或含有所述結(jié)構(gòu)域的抗體對研究的抗原的抗原結(jié)合活性可以在低和高氫離子濃度測量和比較。在該情況下，優(yōu)選除了氫離子濃度之外的條件相同。在確定抗原結(jié)合活性的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)剡x擇除了氫離子濃度之外的條件，并且例如，測量可以在hepes緩沖液的條件下在37℃，或使用biacore(gehealthcare)等進行。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，除非在上下文中具體另外指出，"中性ph范圍"(也稱為"低氫離子濃度"，"高ph"，"中性ph條件"，或"中性ph")不特別限制于具體值；然而，其可以優(yōu)選選自ph6.7至ph10.0，ph6.7至ph9.5，ph7.0至ph9.0，或ph7.0至ph8.0。中性ph范圍可以優(yōu)選為ph7.4，其接近血漿(血液)中的體內(nèi)ph，但為了方便測量，例如，可以使用ph7.0。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，除非上下文另外特別指出，"酸性ph范圍"(也稱為"高氫離子濃度"，"低ph"，"酸性ph條件"，或"酸性ph")不特別限制為具體值；然而，其可以優(yōu)選選自ph4.0至ph6.5，ph4.5至ph6.5，ph5.0至ph6.5，或ph5.5至ph6.5。酸性ph范圍可以優(yōu)選是ph5.8，其接近于早期內(nèi)體的體內(nèi)氫離子濃度，但為了方便，例如，可以使用ph6.0。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，在離子濃度是氫離子濃度的情況下，優(yōu)選的是，離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，離子濃度-依賴性抗體，具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的抗原結(jié)合活性在中性ph條件下比在酸性ph條件下更高。在該情況下，在中性ph條件下的抗原結(jié)合活性與在酸性ph條件下的抗原結(jié)合活性的比率不受限；然而，對于抗原在酸性ph條件下的解離常數(shù)(kd)與在中性ph條件下的kd的比值，即，kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)，(例如，kd(ph5.8)/kd(ph7.4))可以是2或更多；10或更多；或40或更多。kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)值的上限不受限，并且可以是任意值如400，1000，或10000。在一個備選實施方案中，還可能使用，例如，解離速率常數(shù)(kd)作為指標(biāo)來表示上述結(jié)合活性比。在使用解離速率常數(shù)(kd)替代解離常數(shù)(kd)作為指標(biāo)來表示結(jié)合活性比的情況下，對于抗原在高氫離子濃度條件下與在低氫離子濃度條件下的解離速率常數(shù)(kd)的比值，即，kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)可以是2或更多，5或更多，10或更多，或30或更多。kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)值的上限不受限，并且可以是任意值如50，100，或200。在抗原是可溶性抗原的情況下，抗原結(jié)合活性的值可以由解離速率常數(shù)(kd)表示，而在抗原是膜抗原的情況下，所述值可以由表觀解離速率常數(shù)(表觀kd)表示。解離速率常數(shù)(kd)和表觀解離速率常數(shù)(表觀kd)可以通過已知方法確定，例如，通過使用biacore(gehealthcare)或流式細(xì)胞儀確定。在一個實施方案中，用于產(chǎn)生或篩選其抗原結(jié)合活性在中性ph條件下比在酸性ph條件下更高的ph-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ph-依賴性抗體，或其文庫的方法不受限。所述方法包括，例如，wo2009/125825(例如，第0158-0190段)中所述的那些。所述方法可以包括，例如：(a)確定抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在酸性ph條件下的抗原結(jié)合活性；(b)確定抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在中性ph條件下的抗原結(jié)合活性；和(c)選擇其抗原結(jié)合活性在酸性ph條件下低于在中性ph條件的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)將抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫在中性ph條件下接觸；(b)在酸性ph條件下孵育步驟(a)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(c)分離步驟(b)中解離的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)將抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫在酸性ph條件下接觸；(b)選擇步驟(a)中不結(jié)合抗原或具有低抗原結(jié)合能力的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；(c)在中性ph條件下使抗原結(jié)合步驟(b)中選擇的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(d)分離步驟(c)中與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫與固定抗原的柱在中性ph條件下接觸；(b)在酸性ph條件下從柱上洗脫步驟(a)中結(jié)合于柱的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(c)分離步驟(b)中洗脫的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫在酸性ph條件下通過固定抗原的柱以收集不結(jié)合柱的洗脫的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；(b)使步驟(a)中收集抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體在中性ph條件下結(jié)合抗原；和(c)分離步驟(b)中結(jié)合于抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a)將抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫在中性ph條件下接觸；(b)獲得步驟(a)中結(jié)合于抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；(c)在酸性ph條件下孵育步驟(b)中獲得的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體；和(d)分離其抗原結(jié)合活性在步驟(c)中比步驟(b)中選擇的標(biāo)準(zhǔn)弱的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。這些不同篩選方法的每個步驟可以重復(fù)數(shù)次，或可以將步驟組合。對于酸性和中性ph條件，可以適當(dāng)選擇上述條件?？梢杂纱双@得所需ph-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ph-依賴性抗體。在公開內(nèi)容a的情況下，在一個實施方案中，作為起始材料的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可以是，例如，由于修飾至少一個能夠暴露在其表面上的氨基酸殘基的電荷導(dǎo)致具有提高的pi的修飾的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體。在一個備選實施方案中，在將改變離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的氨基酸引入序列中的情況下，它們可以與至少一個能夠暴露在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的表面上的氨基酸殘基的電荷修飾一起引入從而提高pi。備選地，在本發(fā)明a的情況下，例如，可能使用預(yù)先存在的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，預(yù)先存在的文庫(噬菌體文庫等)；從通過免疫動物獲得的雜交瘤或從免疫的動物的b細(xì)胞，或其文庫制備的抗體；或通過向其中引入具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的天然或非天然氨基酸突變(下文描述)獲得的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抗體，或文庫(例如，具有增加的具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的天然或非天然氨基酸突變的文庫，或在特定位點引入具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的天然或非天然氨基酸突變的文庫)。所述優(yōu)選的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以具有，例如，其中至少一個氨基酸殘基被具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的氨基酸置換和/或其用具有4.0-8.0的側(cè)鏈的氨基酸插入的氨基酸序列，如wo2009/125825中所述。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，引入具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的氨基酸突變的位點不受限，并且突變可以引入至任意位點，只要與置換或插入前相比，抗原結(jié)合活性在酸性ph范圍比在中性ph范圍更弱(kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)值增加或kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)值增加)。在抗體具有可變區(qū)或一個或多個cdr的情況下，所述位點可以在所述可變區(qū)或一個或多個cdr內(nèi)。置換或插入的氨基酸數(shù)量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定；并且所述數(shù)量可以是一個或多個。此外，可能缺失、添加、插入、和/或置換、或修飾其他氨基酸(除了上述置換或插入之外)。用具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的氨基酸置換或插入具有4.0-8.0的側(cè)鏈pka的氨基酸可以通過掃描方法以隨機方式進行，如組氨酸掃描，其中在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的丙氨酸掃描中使用組氨酸替代丙氨酸，和/或與突變前相比其kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)值或kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)值增加的抗體可以選自用這些氨基酸的隨機置換或隨機插入突變這些氨基酸得到的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，或其文庫。此外，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體可以優(yōu)選其抗原結(jié)合活性在這些突變之前和之后在中性ph范圍下不顯著降低，基本上不降低，基本相同，或增加的那些；并且換句話說，其活性可以保持在至少10％或更高，優(yōu)選50％或更高，還更優(yōu)選80％或更高，并且另外更優(yōu)選90％或更高，或甚至更高的那些。在由于用具有4.0-8.0的pka的氨基酸置換或插入具有4.0-8.0的pka的氨基酸導(dǎo)致抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的結(jié)合活性減小的情況下，結(jié)合活性可以通過例如，在除上述置換或插入位點之外的位點置換，缺失，添加，插入一個或多個氨基酸來恢復(fù)或增加。在一個備選實施方案中，側(cè)鏈pka為4.0-8.0的氨基酸可以置于可以形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)內(nèi)的任意位置。至少一個側(cè)鏈pka為4.0-8.0的氨基酸殘基可以位于，例如，重鏈和/或輕鏈的cdr(cdr1，cdr2和cdr3中的一個或多個)和/或fr(fr1，fr2，fr3和fr4中的一個或多個)中。所述氨基酸殘基包括，但不限于，根據(jù)kabat編號在輕鏈可變區(qū)cdr1中位置24，27，28，31，32和34的一個或多個處的氨基酸殘基；根據(jù)kabat編號在輕鏈可變區(qū)cdr2的位置50，51，52，53，54，55和56中的一個或多個處的氨基酸殘基；和/或根據(jù)kabat編號在輕鏈可變區(qū)cdr3的位置89，90，91，92，93，94和95a的一個或多個處的氨基酸殘基。那些氨基酸殘基可以單獨或組合包含在其中，只要抗體的抗原結(jié)合活性根據(jù)氫離子濃度條件改變即可。在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)的一個實施方案中，任意氨基酸殘基可以適當(dāng)用作抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的抗原結(jié)合活性根據(jù)氫離子濃度條件改變的氨基酸殘基。具體而言，所述氨基酸殘基可以包括側(cè)鏈pka為4.0-8.0的那些。所述具有供電子性質(zhì)的氨基酸可以包括，例如，天然氨基酸如his(h)和glu(e)，以及非天然氨基酸如組氨酸類似物(us2009/0035836)，m-no2-tyr(pka7.45)，3,5-br2-tyr(pka7.21)，和3,5-i2-tyr(pka7.38)(heyl等人，bioorg.med.chem.11(17)：3761-3768(2003))。氨基酸殘基可以優(yōu)選包括，例如，側(cè)鏈pka為6.0-7.0的氨基酸，特別是his(h)。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，除非另有說明并且除非在上下文存在不一致，要理解，等電點(pi)可以是理論或?qū)嶒灤_定的等電點，并且其也稱為"pi"。pi值可以實驗確定，例如，通過等電聚焦電泳確定。同時，理論pi值可以使用基因和氨基酸序列分析軟件(genetyx，etc.)計算。在一個實施方案中，與修飾前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)或參照抗體(例如，抗體修飾前，或文庫構(gòu)建前或期間的抗體))相比，具有提高的pi的抗體或公開內(nèi)容a的抗體的pi是否增加可以通過使用血漿(例如，來自小鼠、大鼠、兔、狗、猴、或人)進行(除了或替代上述方法)抗體藥代動力學(xué)測試，與諸如biacore，細(xì)胞增殖測定，elisa，酶免疫測定(eia)，放射免疫測定(ria)，或熒光免疫測定的方法組合進行確定。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，"能夠暴露在表面上的氨基酸殘基"通常可以指位于構(gòu)成抗體的多肽的表面上的氨基酸殘基。"位于多肽的表面上的氨基酸殘基"可能指其側(cè)鏈可能與溶劑分子(其通?？梢灾饕撬肿?接觸的氨基酸殘基。然而，側(cè)鏈不必需完全與溶劑分子接觸，并且甚至當(dāng)側(cè)鏈的一部分與溶劑分子接觸時，氨基酸殘基定義為"位于表面上的氨基酸"。位于多肽的表面上的氨基酸殘基還可以包括臨近抗體表面的氨基酸殘基并且由此可能具有來自其側(cè)鏈，甚至部分與溶劑分子接觸的其他一個或多個氨基酸殘基的共用電荷影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過例如使用可商購軟件進行同源性建模制備多肽或抗體的同源性模型。備選地，可能使用方法如x-射線晶體學(xué)。可能暴露在表面上的氨基酸殘基可以例如使用計算機軟件如insightii程序(accelrys)從抗體的三維模型整合來確定。表面-暴露的位點可以使用
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的算法確定(例如，lee和richards(j.mol.biol.55：379-400(1971))；connolly(j.appl.cryst.16：548-558(1983))。可暴露在表面的位點可以使用適于蛋白建模的軟件和獲自抗體的三維結(jié)構(gòu)信息確定。用于此目的可獲得的軟件包括，例如，sybylbiopolymermodule軟件(triposassociates)。當(dāng)算法需要用戶輸入尺寸參數(shù)時，計算中使用的探針的“大小”可以設(shè)為半徑約1.4埃(a)或更少。此外，用于使用用于個人電腦的軟件確定表面-暴露的區(qū)域和面積的方法由pacios(pacios，comput.chem18(4)：377-386(1994)；j.mol.model.1：46-53(1995))描述?；谏鲜鏊鲂畔ⅲ梢赃x擇位于構(gòu)成抗體的多肽表面上的適當(dāng)氨基酸殘基。增加蛋白的pi的方法是，例如，減少在中性ph條件下具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)和/或增加具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸(例如，精氨酸，賴氨酸和組氨酸)的數(shù)量。具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸殘基在充分高于其側(cè)鏈pka的ph條件下具有表示為-1的負(fù)電荷，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的理論。例如，天冬氨酸的側(cè)鏈的理論pka是3.9，并且側(cè)鏈在中性ph條件(例如，在ph7.0的溶液中)具有表示為-1的負(fù)電荷。相反，具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸殘基在充分低于其側(cè)鏈pka的ph條件下具有表示為+1的正電荷。例如，精氨酸的側(cè)鏈的理論pka是12.5，并且側(cè)鏈在中性ph條件(例如，在ph7.0的溶液中)下具有表示為+1的正電荷。已知在中性ph條件(例如，在ph7.0的溶液中)其側(cè)鏈不帶電荷的氨基酸殘基包括15種類型的天然氨基酸，即，丙氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，色氨酸，和酪氨酸。通常，要理解用于改變pi的氨基酸可以是非天然氨基酸。綜上，作為用于在中性ph條件(例如，在ph7.0的溶液中)下增加蛋白的pi的方法，例如，對于蛋白氨基酸序列中的天冬氨酸(殘基)或谷氨酸(殘基)(其側(cè)鏈具有-1的負(fù)電荷)可以通過用不帶電側(cè)鏈置換氨基酸(殘基)賦予研究的蛋白+1的電荷改變。此外，例如，對于側(cè)鏈不帶電的氨基酸(殘基)，可以通過置換精氨酸或賴氨酸(其側(cè)鏈具有+1的正電荷)賦予蛋白+1的電荷改變。此外，對于天冬氨酸或谷氨酸(其側(cè)鏈具有-1的負(fù)電荷)，可以通過置換精氨酸或賴氨酸(其側(cè)鏈具有+1的正電荷)每次賦予蛋白+2的電荷改變。備選地，為了增加蛋白的pi，將具有不帶電側(cè)鏈的氨基酸和/或具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸添加或插入到蛋白的氨基酸序列中，或可以缺失存在于蛋白的氨基酸序列中的不帶電荷的側(cè)鏈的氨基酸和/或帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸。要理解，例如，除了源自其側(cè)鏈的電荷之外，蛋白的n-末端和c-末端氨基酸殘基具有源自主鏈的電荷(n-末端的氨基的nh3+和c-末端的羧基的coo-)。因此，蛋白的pi也可以向源自主鏈的官能團進行一些添加，缺失，置換，或插入來增加。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，改變蛋白的凈電荷或pi(通過修飾氨基酸序列中的一個或多個氨基酸(殘基)獲得(致力于氨基酸(殘基)的電荷的存在或規(guī)模))的效果，不僅僅(或基本上)取決于構(gòu)成抗體的氨基酸序列本身或靶抗原的類型，而且依賴于添加、缺失、置換或插入的氨基酸殘基的類型和數(shù)量。通過可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基上的修飾來修飾以具有提高的pi的抗體("具有提高的pi的抗體"或"pi-提高的抗體")可以更快速地攝取入細(xì)胞或能夠促進從血漿去除抗原，如例如，wo2007/114319，wo2009/041643，wo2014/145159，或wo2012/016227中所述或提示的。多種抗體同種型中，例如，igg抗體具有足夠大的分子量，并且其主要代謝通路不是通過腎排泄。已知igg抗體(其具有fc區(qū)作為分子的一部分)通過經(jīng)由fcrn的營救通路再循環(huán)，并且因此具有長的體內(nèi)半衰期。認(rèn)為igg抗體主要經(jīng)由內(nèi)皮細(xì)胞中的代謝通路代謝(he等人，j.immunol.160(2)：1029-1035(1998))。具體而言，據(jù)信，當(dāng)非特異性攝入內(nèi)皮細(xì)胞中時，igg抗體通過結(jié)合fcrn再循環(huán)，而不能結(jié)合的igg抗體被代謝。當(dāng)其fc區(qū)被修飾從而其fcrn-結(jié)合活性降低時，igg抗體的血漿半衰期可以縮短。另一方面，已經(jīng)表明，具有提高的pi的抗體的血漿半衰期以高度相關(guān)的方式取決于pi，如例如，wo2007/114319和wo2009/041643中所述。具體而言，上述文獻中所述的pi-提高的抗體的血漿半衰期在不修飾構(gòu)成fc的氨基酸序列(其可能潛在地導(dǎo)致免疫原性的獲得)的情況下降低，并且該結(jié)果提示，提高pi的技術(shù)可廣泛應(yīng)用，甚至用于其主要代謝途徑是腎排泄的任何類型的抗體分子，如scfv，fab，或fc融合蛋白。生物液(例如，血漿)中的ph濃度是中性ph范圍。不受特定理論限制，據(jù)信，在生物液中，pi-提高的抗體的凈正電荷由于pi提高而增加，并且因此與其pi未提高的抗體相比，抗體通過理化coulomb相互作用更強烈吸附于其凈電荷是負(fù)的內(nèi)皮細(xì)胞表面；通過非特異性結(jié)合，抗體與其結(jié)合并且攝入細(xì)胞，這導(dǎo)致血漿中抗體半衰期的縮短或從血漿去除抗原的增強。此外，提高抗體的pi增強抗體(或抗原/抗體復(fù)合物)攝入細(xì)胞和/或細(xì)胞內(nèi)滲透性，這被認(rèn)為導(dǎo)致降低血漿中的抗體濃度，降低抗體生物利用度，和/或縮短血漿中的抗體半衰期；并且這些現(xiàn)象預(yù)期常在體內(nèi)發(fā)生，不論細(xì)胞類型、組織類型、器官類型等。此外，在抗體與抗原形成復(fù)合物并且攝入細(xì)胞的情況下，不僅抗體的pi而且抗原的pi可能對向細(xì)胞中攝入的減少或增加有影響。在一個實施方案中，產(chǎn)生或篩選具有提高的pi的抗體的方法可以包括，例如，wo2007/114319(例如，第0060-0087段)，wo2009/041643(例如，第0115-段)，wo2014/145159，和wo2012/016227中描述的那些。所述方法可以包括，例如：(a)修飾編碼包含可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基的抗體的核酸，從而一個或多個氨基酸殘基的電荷被修飾，從而提高抗體的pi；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞從而表達核酸；和(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a')修飾編碼包含可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基的抗體的核酸，從而一個或多個氨基酸殘基電荷被修飾；(b')培養(yǎng)宿主細(xì)胞從而表達核酸；(c')從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集抗體；和(d')(任選地確認(rèn)或測量和)選擇與修飾前的抗體相比pi增加的抗體。這里，作為起始材料的抗體或修飾前的抗體或參照抗體可以是，例如，離子濃度-依賴性抗體。備選地，當(dāng)修飾一個或多個氨基酸殘基時，改變離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的一個或多個氨基酸也可以包括在序列中。備選地，所述方法可以簡單地是包括培養(yǎng)在步驟(b)或(b')中獲得的宿主細(xì)胞和從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集抗體的方法。在一個備選實施方案中，所述方法可以是，例如，產(chǎn)生包含第一多肽和第二多肽，和任選地第三多肽和第四多肽的多特異性抗體的方法，所述方法包括：(a)修飾編碼第一多肽和/或第二多肽，和任選地第三多肽和/或第四多肽的核酸，其中任意一個或多個包含至少一個可能暴露在多肽表面的氨基酸殘基，從而一個或多個氨基酸殘基的電荷被修飾，而提高抗體的pi；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞從而表達核酸；和(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集多特異性抗體。備選地，所述方法可以包括，例如：(a')修飾編碼第一多肽和/或第二多肽，以及任選地第三多肽和/或第四多肽的核酸，其中任意一個或多個包含至少一個可能暴露在多肽表面的氨基酸殘基，從而一個或多個氨基酸殘基的電荷得到改變；(b')培養(yǎng)宿主細(xì)胞從而表達核酸；(c')從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集多特異性抗體；和(d')(任選地確認(rèn)和)選擇其pi與修飾前的抗體相比提高的抗體。本文中，作為起始材料的抗體或修飾前的抗體或參照抗體可以是，例如，離子濃度-依賴性抗體。備選地，當(dāng)修飾一個或多個氨基酸殘基時，改變離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的氨基酸也可以包在序列中。備選地，所述方法可以簡單地包括培養(yǎng)步驟(b)或(b')中獲得的宿主細(xì)胞和從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集抗體的方法。在該情況下，其核酸被修飾的多肽可以優(yōu)選是第一多肽的同源多聚物，第二多肽的同源多聚物，或第一和第二多肽的異源多聚物(和任選地，第三多肽的同源多聚物，第四多肽的同源多聚物，或第三和第四多肽的異源多聚物)。在一個備選實施方案中，所述方法可以，例如，是產(chǎn)生在血漿中具有縮短的半衰期的人源化或人抗體的方法，其包括：在包含一個或多個選自由一個或多個人源的cdr，一個或多個源自人之外的動物的cdr，和一個或多個合成的cdr；一個或多個人源的fr；和人恒定區(qū)組成的組的cdr的抗體中，(i)將可能暴露在至少一個選自由一個或多個cdr，一個或多個fr，和恒定區(qū)組成的組的區(qū)域的表面上的至少一個氨基酸殘基修飾為與修飾前在相應(yīng)位置處存在的一個或多個氨基酸殘基具有不同電荷的一個或多個氨基酸殘基，從而抗體的pi提高。備選地，所述方法可以包括，例如，在包含選自由一個或多個人源的cdr，一個或多個源自人之外的動物的cdr，和一個或多個合成的cdr；一個或多個人源的fr；和人恒定區(qū)組成的組的一個或多個cdr的抗體中，(i')將可能暴露在至少一個選自由一個或多個cdr，一個或多個fr，和恒定區(qū)組成的組的區(qū)域的表面的至少一個氨基酸殘基修飾為與修飾前在相應(yīng)位置處存在的一個或多個氨基酸殘基具有不同電荷的一個或多個氨基酸殘基；和(ii')(任選地確認(rèn))選擇與修飾前的抗體相比，其pi提高的抗體。這里，作為起始材料的抗體或修飾前的抗體或參照抗體可以是，例如，離子濃度-依賴性抗體。備選地，當(dāng)修飾一個或多個氨基酸殘基時，一個或多個改變離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性的氨基酸也可以包括在序列中。備選地，例如，可能使用預(yù)先存在的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體，預(yù)先存在的文庫(噬菌體文庫等)；從通過免疫動物獲得的雜交瘤或從免疫的動物的b細(xì)胞制備的抗體，或其文庫；或通過根據(jù)例如上述實施方案中的任一個在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抗體，或其文庫中修飾可能暴露在表面上的至少一個氨基酸殘基制備的具有提高的pi的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體或其文庫。在公開內(nèi)容a的抗體的一個實施方案中，與修飾或改變前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)，或參考或母體抗體(例如，抗體修飾前的，或文庫構(gòu)建前或構(gòu)建期間的抗體))相比，pi值可以優(yōu)選增加，例如，至少0.01，0.03，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，或更多，或至少0.6，0.7，0.8，0.9，或更多，并且顯著縮短在血漿中的抗體半衰期，pi值可以增加，例如，至少1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，或更多，或至少1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，或更多，或3.0或更多。根據(jù)目的，考慮藥理作用和毒性，以及例如，抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域數(shù)量或抗原的pi之間的平衡，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)常規(guī)確定公開內(nèi)容a的抗體的最佳pi值。不受特定理論限制，據(jù)信，在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體是有益的，因為除了在血漿和細(xì)胞內(nèi)體之間穿梭以及由于離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在以單個抗體分子與多個抗原重復(fù)結(jié)合的特征，抗體的凈正電荷由于pi的增加而增加，并且這使得能夠?qū)崿F(xiàn)抗體的快速細(xì)胞攝取。這些特性會縮短在血漿中的抗體半衰期，增加抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合活性，或增強從血漿去除抗原。技術(shù)人員可以決定最佳pi值以利用這些特性。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，當(dāng)與修飾或改變至少一個氨基酸殘基以提高pi的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)，或參考或母體抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體)，其可以是離子濃度-依賴性抗體)相比，公開內(nèi)容a的具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體可以優(yōu)選增強從血漿去除抗原，例如，至少1.1-倍，1.25-倍，1.5-倍，1.75-倍，2-倍，2.25-倍，2.5-倍，2.75-倍，3-倍，3.25-倍，3.5-倍，3.75-倍，4-倍，4.25-倍，4.5-倍，4.75-倍，5-倍，5.5-倍，6-倍，6.5-倍，7-倍，7.5-倍，8-倍，8.5-倍，9-倍，9.5-倍，或10-倍或更多(當(dāng)抗體體內(nèi)施用時)，或其胞外基質(zhì)結(jié)合活性可以優(yōu)選增加，例如，至少1.1-倍，1.25-倍，1.5-倍，1.75-倍，2-倍，2.25-倍，2.5-倍，2.75-倍，3-倍，3.25-倍，3.5-倍，3.75-倍，4-倍，4.25-倍，4.5-倍，4.75-倍，或5-倍或更多。在公開內(nèi)容a的情況下的一個實施方案中，當(dāng)與引入離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)，或參考或母體抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建前或期間的抗體)，其可以是具有提高的pi的抗體)相比時，公開內(nèi)容a的具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體可以優(yōu)選增強從血漿去除抗原，例如，至少1.1-倍，1.25-倍，1.5-倍，1.75-倍，2-倍，2.25-倍，2.5-倍，2.75-倍，3-倍，3.25-倍，3.5-倍，3.75-倍，4-倍，4.25-倍，4.5-倍，4.75-倍，5-倍，5.5-倍，6-倍，6.5-倍，7-倍，7.5-倍，8-倍，8.5-倍，9-倍，9.5-倍，或10-倍或更多(當(dāng)抗體體內(nèi)施用時)，或其胞外基質(zhì)結(jié)合活性可以優(yōu)選增加，例如，至少1.1-倍，1.25-倍，1.5-倍，1.75-倍，2-倍，2.25-倍，2.5-倍，2.75-倍，3-倍，3.25-倍，3.5-倍，3.75-倍，4-倍，4.25-倍，4.5-倍，4.75-倍，或5-倍或更多。在一個實施方案中，用于評估與修飾或改變前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，其可以是天然igg抗體)，或參考或母體抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體)，其可以是具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體或抗體)相比，公開內(nèi)容a的抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合活性是否增加的測定方法不受限制。例如，測定可以使用elisa系統(tǒng)進行，其檢測抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合，其中將抗體加入固定有胞外基質(zhì)的板中，并且將針對該抗體的標(biāo)記的抗體加入其中。備選地，如本文中實施例1至4和wo2012/093704中所述的，還可能使用電化學(xué)發(fā)光(ecl)，其使得能夠高靈敏度檢測胞外基質(zhì)結(jié)合能力。該方法可以，例如，使用ecl系統(tǒng)進行，其中將抗體和釕抗體的混合物加入固定有胞外基質(zhì)的平板中，并且基于釕的電化學(xué)發(fā)光測量抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合。要加入的抗體的濃度可以適當(dāng)設(shè)置；加入的濃度可以高，從而增加檢測胞外基質(zhì)結(jié)合的靈敏度。所述胞外基質(zhì)可以源自動物或植物，只要它們含有糖蛋白如膠原蛋白，蛋白聚糖，纖連蛋白，層粘連蛋白，巢蛋白，纖維蛋白，和基底膜蛋白多糖(perlecan)；并且動物源的胞外基質(zhì)可以是優(yōu)選的。例如，可能使用源自動物如人，小鼠，大鼠，猴，兔，或狗的胞外基質(zhì)。例如，人源的天然胞外基質(zhì)可以用作抗體在人血漿中的藥代動力學(xué)的指標(biāo)。評估抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合的條件可優(yōu)選為約ph7.4的中性ph范圍，其是生理條件；然而，條件不必須是中性范圍，并且結(jié)合也可以在酸性ph范圍(例如，約ph6.0)評估。備選地，當(dāng)評估抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合時，測定可以在抗體結(jié)合的抗原分子的共存下，并且通過評估抗原-抗體復(fù)合物對胞外基質(zhì)的結(jié)合活性進行。在一個實施方案中，與修飾或改變至少一個氨基酸殘基以提高pi之前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)或參照抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體))相比，公開內(nèi)容a的抗體(基本上)可以保留抗原結(jié)合活性。在該情況下，"以(基本上)保留抗原結(jié)合活性"可能意為與修飾或改變前的抗體的結(jié)合活性相比，具有至少50％或更多，優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選70％或75％或更多，并且還更優(yōu)選80％，85％，90％，或95％或更多的活性。備選地，公開內(nèi)容a的抗體僅需要保留結(jié)合活性至允許它們在結(jié)合抗原時保留其功能的程度；因此，在37℃在生理條件下確定的親和力可以是，例如，100nm或更少，優(yōu)選50nm或更少，更優(yōu)選10nm或更少，并且還更優(yōu)選1nm或更少。在公開內(nèi)容a的一個實施方案中，"修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基"的語句或相當(dāng)?shù)恼Z句可以意為，在可能暴露在抗體表面的至少一個氨基酸殘基上進行添加，缺失，置換和插入中的一種或多種。所述修飾可以優(yōu)選包括置換至少一個氨基酸殘基。氨基酸殘基的置換可能包括，例如，在目標(biāo)抗體的氨基酸序列中，將其側(cè)鏈不帶電的氨基酸殘基置換為具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸殘基，將具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸殘基置換為其側(cè)鏈不帶電的氨基酸殘基，和將具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸殘基置換為具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸殘基，其可以單獨或以適當(dāng)?shù)慕M合進行。氨基酸殘基的插入或添加可以包括，例如，在目標(biāo)抗體的氨基酸序列中，插入或添加其側(cè)鏈不帶電的氨基酸和/或插入或添加具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸，其可以單獨或以適當(dāng)?shù)慕M合進行。氨基酸殘基的缺失可以包括，例如，在目標(biāo)抗體的氨基酸序列中，缺失其側(cè)鏈不帶電的氨基酸殘基和/或缺失具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸殘基，其可以單獨或以適當(dāng)?shù)慕M合進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)亟M合目標(biāo)抗體的氨基酸序列中的這些添加，缺失，置換和插入中的一種或多種。引起氨基酸殘基的局部電荷的降低的修飾也是可接受的，因為僅公開內(nèi)容a的抗體凈pi必需增加。例如，如果需要，可以將其pi提高(太多)的抗體修飾以降低pi(稍微)。還可以接受的是，為了其他目的(例如，增加抗體穩(wěn)定性或降低免疫原性)同時或不同時進行至少一個氨基酸殘基的修飾而造成的氨基酸殘基的局部電荷減少。所述抗體包括來自構(gòu)建用于特定目的文庫的抗體。在一個實施方案中，在用于修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基的氨基酸(殘基)中，天然氨基酸如下：具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸可以是glu(e)或asp(d)；其側(cè)鏈不帶電的氨基酸可以是ala(a)，asn(n)，cys(c)，gln(q)，gly(g)，his(h)，ile(i)，leu(l)，met(m)，phe(f)，pro(p)，ser(s)，thr(t)，trp(w)，tyr(y)，或val(v)；并且具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸可以是his(h)，lys(k)，或arg(r)。如實施例1至4中詳述的，在中性ph(例如，ph7.0)溶液中，賴氨酸和精氨酸在作為抗體中的殘基存在時幾乎100％具有正電荷，而組氨酸當(dāng)作為抗體中的殘基存在時，僅約9％具有正電荷，其余的主要部分被認(rèn)為不具有任何電荷。因此，lys(k)或arg(r)優(yōu)選選擇作為具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體優(yōu)選具有可變區(qū)和/或恒定區(qū)。此外，可變區(qū)可以優(yōu)選具有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，和/或可以優(yōu)選具有一個或多個cdr(例如，cdr1，cdr2和cdr3中的一個或多個)和/或一個或多個fr(例如，fr1，fr2，fr3和fr4中的一個或多個)。恒定區(qū)可以優(yōu)選具有重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)，并且就序列和類型而言，其可以是，例如，igg-型恒定區(qū)(優(yōu)選，人igg1，人igg2，人igg3，或人igg4-型恒定區(qū)，人κ鏈恒定區(qū)，和人λ鏈恒定區(qū))?？赡苁褂眠@些恒定區(qū)的修飾的變體。在一個實施方案中，可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基的修飾可以是單個氨基酸的修飾或多個氨基酸的修飾的組合。優(yōu)選的方法可以是在氨基酸可能暴露在抗體表面的位點引入多個氨基酸置換的組合。此外，不受限制，所述多個氨基酸置換優(yōu)選引入在三維上彼此接近的位置。當(dāng)具有帶正電的側(cè)鏈的氨基酸(例如，lys(k)或arg(r))置換為可能暴露在抗體分子的表面的氨基酸(其優(yōu)選，但不限于，具有帶負(fù)電的側(cè)鏈的氨基酸(例如，glu(e)或asp(d))時；或當(dāng)使用帶正電的預(yù)先存在的氨基酸(例如，lys(k)或arg(r))時，例如，三維上接近氨基酸的一個或多個氨基酸(其可以包括根據(jù)情況嵌入抗體分子內(nèi)的氨基酸)還可以用帶正電的氨基酸置換，從而相應(yīng)產(chǎn)生在三維臨近位置局部正電荷的密集狀態(tài)。本文中，"三維接近的位置"的定義不特別受限；但其可以意為其中一個或多個氨基酸置換引入，例如，20a內(nèi)，優(yōu)選15a內(nèi)，并且更優(yōu)選10a內(nèi)的狀態(tài)。目的氨基酸置換位點是否暴露在抗體分子的表面或氨基酸置換位點是否接近其他氨基酸置換位點或上述預(yù)先存在的氨基酸可以通過已知方法如x-射線晶體學(xué)評估。除了上述的那些，在三維上彼此接近的位點給予多個正電荷的方法可以包括使用原始在天然igg恒定區(qū)具有正電荷的氨基酸的那些。所述氨基酸包括，例如：位置255，292，301，344，355，和416處的精氨酸，根據(jù)eu編號；和位置121，133，147，205，210，213，214，218，222，246，248，274，288，290，317，320，322，326，334，338，340，360，370，392，409，414，和439處的賴氨酸，根據(jù)eu編號?？赏ㄟ^在三維上接近這些帶正電的氨基酸的位點用帶正電的氨基酸置換在三維上接近的位置給予多個正電荷。在公開內(nèi)容a的抗體具有可變區(qū)(其可以被修飾)的情況下，未被抗原結(jié)合遮蓋(即，仍然可以暴露在表面上)的氨基酸殘基可以被修飾，和/或氨基酸修飾可以不引入在被抗原結(jié)合遮蓋的位點或可以進行(基本上)不抑制抗原結(jié)合的氨基酸修飾。在存在于離子濃度-依賴性結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的可能暴露在抗體分子的表面的氨基酸殘基被修飾的情況下，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸可以以這種方式修飾：修飾(基本上)不降低可能根據(jù)離子濃度條件而改變抗體的抗原結(jié)合活性的氨基酸殘基(例如，鈣-結(jié)合基序，或組氨酸插入位點和/或組氨酸置換的位點中的那些)的結(jié)合活性，或氨基酸殘基可以在不同于根據(jù)離子濃度條件而改變抗體的抗原結(jié)合活性的氨基酸殘基的位點修飾。另一方面，當(dāng)存在于離子濃度-依賴性結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的可能暴露在抗體分子的表面上的氨基酸殘基已經(jīng)被修飾時，可能根據(jù)離子濃度條件而改變抗體的抗原結(jié)合活性的氨基酸殘基的類型或位置可以這樣選擇，使得抗體的pi不降低至低于可接受水平。在抗體的pi降低至低于可接受水平的情況下，整個抗體的pi可以通過修飾可能暴露在抗體分子的表面上的至少一個氨基酸殘基而提高。不受限制，具有高pi的fr序列可以優(yōu)選選自人種系fr序列或與其相當(dāng)?shù)膮^(qū)域的序列，其氨基酸在一些情況下可以被修飾。在公開內(nèi)容a的抗體具有包含fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其可以是針對下述fcγr同種型和同種異型中的任一種的結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和/或fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)(其可以被修飾)的情況下，如果需要，用于修飾可能暴露在恒定區(qū)表面的至少一個氨基酸殘基的位點可以是除了fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的那些和/或fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的那些之外的氨基酸殘基。備選地，在修飾位點選自fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基時，其可以優(yōu)選選擇(基本上)不影響對fcγr和/或fcrn的結(jié)合活性或結(jié)合親和力的位點，或如果它們會影響，選擇生物或藥理學(xué)上可接受的位點。在一個實施方案中，修飾以產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體(其pi通過修飾可能暴露在可變區(qū)表面(其可以被修飾)至少一個氨基酸殘基而提高)的至少一個氨基酸殘基的位點不受限；然而，所述位點可以選自由以下組成的組，根據(jù)kabat編號：(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，5，8，10，12，13，15，16，18，19，23，25，26，39，41，42，43，44，46，68，71，72，73，75，76，77，81，82，82a，82b，83，84，85，86，105，108，110，和112；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，7，8，9，11，12，16，17，18，20，22，37，38，39，41，42，43，45，46，49，57，60，63，65，66，68，69，70，74，76，77，79，80，81，85，100，103，105，106，107，和108；和(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56，其中每個位置處的氨基酸在修飾后可以就側(cè)鏈電荷而言選自上述的任意氨基酸，如lys(k)，arg(r)，gln(q)，gly(g)，ser(s)，或asn(n)，但不限于其。在一些實施方案中，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或多于10個上述氨基酸位置被修飾。在一些實施方案中，1-20，1-15，1-10，或1-5個上述氨基酸位置被修飾。在一個實施方案中，在要修飾的位置中，以下位置可以與它們本身可能對提高抗體的pi具有足夠效果的其他位置組合用于輔助公開內(nèi)容a的抗體的pi增加。所述用于輔助pi增加的位置可以是，例如，對于輕鏈可變區(qū)，選自由位置27，52，56，65，和69(根據(jù)kabat編號)組成的組。此外，在cdr和/或fr中修飾的至少一個氨基酸殘基的位點不受限；然而，所述位點可以選自由以下組成的組：(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置8，10，12，13，15，16，18，23，39，41，43，44，77，82，82a，82b，83，84，85，和105；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置16，18，37，41，42，45，65，69，74，76，77，79，和107；和(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56。在一些實施方案中，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或多于10個上述氨基酸位置被修飾。在一些實施方案中，1-20，1-15，1-10，或1-5個上述氨基酸位置被修飾。在至少一個氨基酸殘基的修飾位點選自，例如，包含上述組的組的情況下，重鏈可變區(qū)中修飾后的氨基酸類型是，例如：(a)對于位置8是8k，8r，8q，8g，8s，或8n；(b)對于位置13是13k，13r，13q，13g，13s，或13n；(c)對于位置15是15k，15r，15q，15g，15s，或15n；(d)對于位置16是16k，16r，16q，16g，16s，或16n；(e)對于位置18是18k，18r，18q，18g，18s，或18n；(f)對于位置39是39k，39r，39q，39g，39s，或39n；(g)對于位置41是41k，41r，41q，41g，41s，或41n；(h)對于位置43是43k，43r，43q，43g，43s，或43n；(i)對于位置44是44k，44r，44q，44g，44s，或44n；(j)對于位置63是63k，63r，63q，63g，63s，或63n；(k)對于位置64是64k，64r，64q，64g，64s，或64n；(l)對于位置77是77k，77r，77q，77g，77s，或77n；(m)對于位置82是82k，82r，82q，82g，82s，或82n；(n)對于位置82a是82ak，82ar，82aq，82ag，82as，或82an；(o)對于位置82b是82bk，82br，82bq，82bg，82bs，或82bn；(p)對于位置83是83k，83r，83q，83g，83s，或83n；(q)對于位置84是84k，84r，84q，84g，84s，或84n；(r)對于位置85是85k，85r，85q，85g，85s，或85n；或(s)對于位置105是105k，105r，105q，105g，105s，或105n。在一些實施方案中，上述氨基酸位置的任意組合中的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或多于10個被修飾。在一些實施方案中，上述氨基酸位置的任意組合中的1-20，1-15，1-10，或1-5個被修飾。重鏈可變區(qū)中的修飾的氨基酸位置的組合的非限制性實例是，例如：選自由16，43，64，和105組成的組的位置的任意兩個或更多個位置；選自由以下組成的組的任意兩個或更多個位置(根據(jù)kabat編號)：位置77，82a，和82b；位置77和85；位置41和44；位置82a和82b；位置82和82b；位置82b和83；或位置63和64，其中修飾后每個位置的氨基酸就側(cè)鏈電荷而言可以選自上述任意氨基酸，如lys(k)，arg(r)，gln(q)，gly(g)，ser(s)，或asn(n)，但不限于其。具體組合可以是，例如，16q/43r/64k/105q；77r/82an/82br；77r/82ag/82br；77r/82as/82br；77r/85g；41r/44r；82an/82br；82ag/82br；82as/82br；82k/82br；82br/83r；77r/85r；或63r/64k。同樣，輕鏈可變區(qū)中修飾后的氨基酸類型是，例如：(a)對于位置16是16k，16r，16q，16g，16s，或16n；(b)對于位置18是18k，18r，18q，18g，18s，或18n；(c)對于位置24是24k，24r，24q，24g，24s，或24n；(d)對于位置25是25k，25r，25q，25g，25s，或25n；(e)對于位置26是26k，26r，26q，26g，26s，或26n；(f)對于位置27是27k，27r，27q，27g，27s，或27n；(g)對于位置37是37k，37r，37q，37g，37s，或37n；(h)對于位置41是41k，41r，41q，41g，41s，或41n；(i)對于位置42是42k，42r，42q，42g，42s，或42n；(j)對于位置45是45k，45r，45q，45g，45s，或45n；(k)對于位置52是52k，52r，52q，52g，52s，或52n；(l)對于位置53是53k，53r，53q，53g，53s，或53n；(m)對于位置54是54k，54r，54q，54g，54s，或54n；(n)對于位置55是55k，55r，55q，55g，55s，或55n；(o)對于位置56是56k，56r，56q，56g，56s，或56n；(p)對于位置65是65k，65r，65q，65g，65s，或65n；(q)對于位置69是69k，69r，69q，69g，69s，或69n；(r)對于位置74是74k，74r，74q，74g，74s，或74n；(s)對于位置76是76k，76r，76q，76g，76s，或76n；(t)對于位置77是77k，77r，77q，77g，77s，或77n；(u)對于位置79是79k，79r，79q，79g，79s，或79n；和(v)對于位置107是107k，107r，107q，107g，107s，或107n。在一些實施方案中，上述氨基酸位置的任意組合中的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或多于10個被修飾。在一些實施方案中，上述氨基酸位置的任意組合中1-20，1-15，1-10，或1-5個被修飾。輕鏈可變區(qū)中的修飾的氨基酸位置的組合的非限制性實例是，例如：位置24和27；位置25和26；位置41和42；位置42和76；位置52和56；位置65和79；位置74和77；位置76和79；選自由16，24，和27組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，和37組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由25，26，和37組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由41，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由41，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，41，和42組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，52，和56組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，65，和69組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由25，26，52，和56組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由25，26，65，和69組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由25，26，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，41，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，41，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由52，56，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由52，56，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由65，69，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由65，69，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由18，24，45，79，和107組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，52，56，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，52，56，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，65，69，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由27，65，69，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由41，52，56，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由41，52，56，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由41，65，69，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由41，65，69，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，41，42，65，和69組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，52，56，65，和69組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，65，69，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，65，69，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，41，42，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，52，56，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，41，42，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，52，56，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由24，27，74，76，77，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；選自由52，56，65，69，74，和77組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置；或選自由52，56，65，69，76，和79組成的組的位置處的任意兩個或更多個位置(根據(jù)kabat編號)，其中每個位置在修飾后的氨基酸就側(cè)鏈電荷而言可以選自任意上述氨基酸，如lys(k)，arg(r)，gln(q)，gly(g)，ser(s)，或asn(n)，但不限于其。具體組合可以是，例如，24r/27q；24r/27r；24k/27k；25r/26r；25k/26k；41r/42k；42k/76r；52r/56r；65r/79k；74k/77r；76r/79k；16k/24r/27r；24r/27r/37r；25r/26r/37r；27r/76r/79k；41r/74k/77r；41r/76r/79k；24r/27r/41r/42k；24r/27r/52r/56r；24r/27r/52k/56k；24r/27r/65r/69r；24r/27r/74k/77r；24r/27r/76r/79k；25r/26r/52r/56r；25r/26r/52k/56k；25r/26r/65r/69r；25r/26r/76r/79k；27r/41r/74k/77r；27r/41r/76r/79k；52r/56r/74k/77r；52r/56r/76r/79k；65r/69r/76r/79k；65r/69r/74k/77r；18r/24r/45k/79q/107k；27r/52r/56r/74k/77r；27r/52r/56r/76r/79k；27r/65r/69r/74k/77r；27r/65r/69r/76r/79k；41r/52r/56r/74k/77r；41r/52r/56r/76r/79k；41r/65r/69r/74k/77r；41r/65r/69r/76r/79k；24r/27r/41r/42k/65r/69r；24r/27r/52r/56r/65r/69r；24r/27r/65r/69r/74k/77r；24r/27r/65r/69r/76r/79k；24r/27r/41r/42k/74k/77r；24r/27r/52r/56r/74k/77r；24r/27r/41r/42k/76r/79k；24r/27r/52r/56r/76r/79k；24r/27r/74k/76r/77r/79k；52r/56r/65r/69r/74k/77r；或52r/56r/65r/69r/76r/79k。在wo2007/114319或wo2009/041643中，已經(jīng)基于理論證據(jù)、同源性建?；?qū)嶒灱夹g(shù)解釋或證明了，通過修飾可變區(qū)中的一些氨基酸殘基提高pi的效果不是僅僅(或基本上)依賴于構(gòu)成抗體的氨基酸序列本身或靶抗原的類型，而是其依賴于置換的氨基酸殘基的類型和數(shù)量。還證明了，甚至在修飾一些氨基酸之后，對于幾種類型的抗原的抗原結(jié)合活性(基本上)被保持，或至少本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期以高的可能性保持。例如，wo2009/041643特別顯示，在如seqidno：8所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3)抗體的重鏈fr中，優(yōu)選的可能暴露在表面的氨基酸殘基的修飾位點根據(jù)kabat編號是位置1，3，5，8，10，12，13，15，16，19，23，25，26，39，42，43，44，46，69，72，73，74，76，77，82，85，87，89，90，107，110，112，和114。其還報道了，根據(jù)kabat編號在位置97的氨基酸殘基是優(yōu)選的，因為其暴露在幾乎所有抗體的表面。wo2009/041643還顯示，抗體的重鏈cdr中的位置52，54，62，63，65，和66的氨基酸殘基是優(yōu)選的。其還表明，如seqidno：9中所示的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的輕鏈fr中根據(jù)kabat編號在位置1，3，7，8，9，11，12，16，17，18，20，22，43，44，45，46，48，49，50，54，62，65，68，70，71，73，74，75，79，81，82，84，85，86，90，105，108，110，111，和112的氨基酸殘基是優(yōu)選的。其還表明，該抗體的輕鏈cdr中的位置24，27，33，55，59的氨基酸殘基是優(yōu)選的。此外，wo2009/041643具體表明，seqidno：10中所示的抗-人il-6受體抗體的重鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置31，64，和65的氨基酸殘基是優(yōu)選的位點，其允許修飾可能暴露在表面上的氨基酸殘基同時保持抗原結(jié)合活性。其還表明，如seqidno：11中所示的抗-人il-6受體抗體的輕鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置24，27，53，和55的氨基酸殘基是優(yōu)選的。其還具體表明，seqidno：12中所示的抗-人il-6受體抗體的重鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置31的氨基酸殘基是優(yōu)選的位點，該位點允許修飾可能暴露在表面上的氨基酸殘基，同時保持抗原結(jié)合活性。其還表明，seqidno：13中所示的抗-人il-6受體抗體的輕鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置24，53，54，和55的氨基酸殘基是優(yōu)選的。wo2009/041643還表明，seqidno：14所示的抗-人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的重鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置61，62，64，和65的氨基酸殘基是優(yōu)選的位點，其允許修飾可能暴露在表面的氨基酸殘基，同時保持抗原結(jié)合活性。還表明，seqidno：15中所示的抗-人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體的輕鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置24和27的氨基酸殘基是優(yōu)選的。還表明，seqidno：16中所示的抗-人il-31受體抗體的重鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置61，62，64，和65的氨基酸殘基是優(yōu)選的位點，其允許修飾可能暴露在表面的氨基酸殘基，同時保持抗原結(jié)合活性。wo2009/041643還表明，seqidno：17中所示的抗-人il-31受體抗體的輕鏈cdr中根據(jù)kabat編號位置24和54的氨基酸殘基是優(yōu)選的。類似地，wo2007/114319報道了抗體ha69-pf，ha69-p18，ha69-n97r，hb26-f123e4，hb26-p15，和hb26-pf，它們通過修飾可能暴露在表面上的一個或多個氨基酸殘基的電荷產(chǎn)生，顯示pi的改變(如通過等電聚焦證明的)，并且具有與修飾或改變前的抗體相比相當(dāng)?shù)膶σ蜃觟xa或因子x(其是它們的抗原)的結(jié)合活性。其還報道了，當(dāng)這些抗體施用給小鼠時，每種抗體的pi顯示與其在血漿中的清除率(cl)，在血漿中的保留，和在血漿中的半衰期(t1/2)的高度相關(guān)性。wo2007/114319還表明，作為用于可能暴露在表面的氨基酸殘基的修飾的位點，可變區(qū)中位置10，12，23，39，43，97，和105的氨基酸殘基是優(yōu)選的。在備選的或另一個實施方案中，例如，使用已知方法如x-射線晶體學(xué)或通過從抗體恒定區(qū)(其優(yōu)選為人恒定區(qū)，更優(yōu)選人ig-型恒定區(qū)，并且還更優(yōu)選人igg-型恒定區(qū)，但不限于其中)同源建模構(gòu)建的同源性模型，可以鑒別可能暴露在抗體恒定區(qū)表面的氨基酸殘基以確定用于產(chǎn)生公開內(nèi)容a的其pi提高的抗體的至少一個氨基酸殘基的修飾位點。可能暴露在恒定區(qū)的表面的至少一個氨基酸殘基的修飾位點不受限；然而，位點可能優(yōu)選選自由以下組成的組：根據(jù)eu編號，位置196，253，254，256，257，258，278，280，281，282，285，286，306，307，308，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，388，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和位置443，并且可以優(yōu)選選自由以下組成的組：位置254，258，281，282，285，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，418，419，421，433，434，和443，并且還可以優(yōu)選選自由以下組成的組：位置282，309，311，315，342，343，384，399，401，402，和413，其每個位置的氨基酸在修飾后就側(cè)鏈電荷而言可以選自上述氨基酸，如lys(k)，arg(r)，gln(q)，或asn(n)，但不限于其。當(dāng)例如從包含上述組的組選擇至少一個氨基酸殘基的修飾位點時，例如，修飾后在每個位點的氨基酸類型可以如下：位置254的254k，254r，254q，或254n；位置258的258k，258r，258q，或258n；位置281的281k，281r，281q，或281n；位置282的282k，282r，282q，或282n；位置285的285k，285r，285q，或285n；位置309的309k，309r，309q，或309n；位置311的311k，311r，311q，或311n；位置315的315k，315r，315q，或315n；位置327的327k，327r，327q，或327n；位置330的330k，330r，330q，或330n；位置342的342k，342r，342q，或342n；位置311的343k，343r，343q，或343n；位置345的345k，345r，345q，或345n；位置356的356k，356r，356q，或356n；位置358的358k，358r，358q，或358n；位置359的359k，359r，359q，或359n；位置361的361k，361r，361q，或361n；位置362的362k，362r，362q，或362n；位置384的384k，384r，384q，或384n；位置385的385k，385r，385q，或385n；位置386的386k，386r，386q，或386n；位置387的387k，387r，387q，或387n；位置389的389k，389r，389q，或389n；位置399的399k，399r，399q，或399n；位置400的400k，400r，400q，或400n；位置401的401k，401r，401q，或401n；位置402的402k，402r，402q，或402n；位置413的413k，413r，413q，或413n；位置418的418k，418r，418q，或418n；位置419的419k，419r，419q，或419n；位置421的421k，421r，421q，或421n；位置433的433k，433r，433q，或433n；位置434的434k，434r，434q，或434n；和位置443的443k，443r，443q，或443n。在一個備選實施方案中，修飾后的至少一個氨基酸殘基的修飾位點和氨基酸類型可以包括345r或345k，和/或430r，430k，430g，或435t(根據(jù)eu編號)。在公開內(nèi)容a的抗體的一個實施方案中，抗體的凈pi可以通過修飾如上文所述的可能暴露在可變區(qū)(其可以被修飾)表面的至少一個氨基酸殘基和如上文所述的可能暴露在恒定區(qū)(其可以被修飾)表面的至少一個氨基酸殘基而增加。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，在公開內(nèi)容a或b的抗體是igg-型抗體或來源其的分子的情況下，抗體重鏈恒定區(qū)可以含有igg1型，igg2型，igg3型，或igg4型的恒定區(qū)。在公開內(nèi)容a或b中，重鏈恒定區(qū)可以是人重鏈恒定區(qū)，但不限于其。已知對于人igg存在多種同種異型。具體而言，據(jù)報道，在個體之間的人igg恒定區(qū)的氨基酸序列之間存在一些差異(methodsmol.biol.882：635-80(2012)；sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，nih出版no.91-3242)。實例包括人igg1恒定區(qū)(seqidno：18)，人igg2恒定區(qū)(seqidno：19)，人igg3恒定區(qū)(seqidno：20)，和人igg4恒定區(qū)(seqidno：21)。這些當(dāng)中，例如，對于人igg1，稱為g1m1,17和g1m3的同種異型是已知的。同種異型在它們的氨基酸序列方面有差異：g1m1,17在位置356具有天冬氨酸并且在位置358具有亮氨酸(根據(jù)eu編號)，而g1m3在位置356具有谷氨酸并且在位置358具有甲硫氨酸(根據(jù)eu編號)。然而，未見報道提示在報道的同種異型中存在基本抗體功能和性質(zhì)的顯著差異。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地預(yù)測，使用特定同種異型進行各種評估，并且結(jié)果不限于用于獲得實施例的同種異型并且利用任意同種異型預(yù)測具有相同的效果。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，當(dāng)稱為"人igg1"，"人igg2，"人igg3"，或"人igg4"時，同種異型不限于具體的同種異型并且可以包括所有報道的同種異型(allotype)。在公開內(nèi)容a或b的備選或另一個實施方案中，抗體的輕鏈恒定區(qū)可以包括κ鏈(igk)型或λ鏈(igl1，igl2，igl3，igl6，或igl7)型的任意恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)可以優(yōu)選是人輕鏈恒定區(qū)，但不限于其。如在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，nih出版no.91-3242中，存在關(guān)于由于人κ鏈恒定區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)的基因多態(tài)性造成的多種同種異型序列的報道。所述同種異型包括，例如，人κ鏈恒定區(qū)(seqidno：22)和人λ鏈恒定區(qū)(seqidno：23)。然而，未見報道提示在報道的同種異型中基本抗體功能和性質(zhì)存在顯著差異。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易理解，當(dāng)對本文所述的公開內(nèi)容a和b范圍內(nèi)的具體同種異型進行參考時，對任意同種異型(下文中也統(tǒng)稱為天然(人)igg(型)恒定區(qū))預(yù)期相同的效果。此外，因為天然igg抗體的fc區(qū)構(gòu)成天然igg抗體的恒定區(qū)的一部分，當(dāng)公開內(nèi)容a或b的抗體是，例如，igg型抗體或源自其的分子時，抗體可以具有包含在天然igg(igg1，igg2，igg3，或igg4型)的恒定區(qū)中的fc區(qū)(下文中也統(tǒng)稱為天然(人)igg(型)fc區(qū))。天然igg的fc區(qū)可以涉及由與源自天然存在的igg的fc區(qū)相同的氨基酸序列組成的fc區(qū)。天然人igg的fc區(qū)的具體實例可以包括上文所述的人igg1恒定區(qū)(seqidno：18)，人igg2恒定區(qū)(seqidno：19)，人igg3恒定區(qū)(seqidno：20)，或人igg4恒定區(qū)(seqidno：21)中含有的fc區(qū)(igg型的fc區(qū)可以指，例如，從根據(jù)eu編號位置226的半胱氨酸到c末端，或從根據(jù)eu編號位置230的脯氨酸至c末端)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a和b的抗體可以包括其中對天然(優(yōu)選人)igg(重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū))的恒定區(qū)或天然(優(yōu)選人)igg的fc區(qū)進行選自氨基酸置換，添加，缺失，或插入的一種或多種修飾的變體。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，wo2013/081143報道了，例如，由于憑借抗體分子中含有的至少兩個或更多個多價恒定區(qū)(其可以被修飾)或fc區(qū)(其可以被修飾)的親合力(多種表位和多個互補位之間的結(jié)合強度的總和)，能夠與多聚抗原形成多價免疫復(fù)合物(多價抗原-抗體復(fù)合物)的離子濃度-依賴性抗體和能夠通過識別單體抗原上的兩個或更多個表位形成多價免疫復(fù)合物(多價抗原-抗體復(fù)合物)的多特異性離子濃度-依賴性抗體或多互補位(multiparatopic)離子濃度-依賴性抗體能夠更強烈地結(jié)合fcγr，fcrn，補體受體，并且因此抗體更快攝入細(xì)胞。因此，當(dāng)經(jīng)由修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基而修飾以具有提高的pi時，上述離子濃度-依賴性抗體(其能夠與多聚抗原或單體抗原形成多價免疫復(fù)合物)，也可以用作公開內(nèi)容a的抗體(具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，與不能形成多價免疫復(fù)合物的具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體相比，能夠與多聚抗原或單體抗原形成多價免疫復(fù)合物的具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體可以更快速地攝入細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體結(jié)合fcrn和/或fcγr的活性可以在中性ph條件下增加并且在該情況下，能夠與多聚抗原或單體抗原形成多價免疫復(fù)合物的具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體可以甚至更快速地攝入細(xì)胞。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體可以是單臂抗體(包括wo2005/063816中所述的單臂抗體的所有實施方案)。通常，單臂抗體是缺少普通igg抗體具有的兩個fab區(qū)中的一個的抗體，并且可以(不受限制)例如，通過wo2005/063816中所述的方法產(chǎn)生。不受限制，在具有其結(jié)構(gòu)是例如，vh-ch1-鉸鏈-ch2-ch3的重鏈的igg-型抗體中，當(dāng)fab區(qū)中的一個在相對于鉸鏈更靠n末端的位點(例如，vh或ch1)裂解時，抗體將以含有多余序列的形式表達，并且當(dāng)fab區(qū)中的一個在相對于鉸鏈更靠近c末端的位點(例如，ch2)裂解時，fc區(qū)將具有不完整的形式。因此，不受限制，從抗體分子穩(wěn)定性的角度，優(yōu)選單臂抗體通過在igg抗體的兩個fab區(qū)中的一個的鉸鏈區(qū)(鉸鏈)中裂解產(chǎn)生。更優(yōu)選的是，重鏈在裂解后通過分子內(nèi)二硫鍵連接于未裂解的重鏈。wo2005/063816報道了，與fab分子相比，這樣的單臂抗體具有增加的穩(wěn)定性。具有增加的或降低的pi的抗體還可以通過制備這樣的單臂抗體產(chǎn)生。此外，當(dāng)將離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域引入是單臂抗體的具有提高的pi的抗體時，與不具有離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的pi提高的抗體相比，抗體在血漿中的半衰期可以進一步縮短，抗體的細(xì)胞攝取可以進一步增強，抗原從血漿的去除可以進一步增強，或抗體對胞外基質(zhì)的親和力可以進一步增加。不受特定理論限制，可以設(shè)想在預(yù)期單臂抗體的細(xì)胞攝取-加速效果的情況下的實施方案是，但不受限這樣的情形，其中可溶性抗原的pi低于抗體的。由抗體和抗原組成的復(fù)合物的凈pi可以通過已知方法，考慮復(fù)合物是單個分子來計算。在該情況下，可溶性抗原的pi越低，復(fù)合物的凈pi越低；并且可溶性抗原的pi越高，復(fù)合物的凈pi越高。當(dāng)普通型igg抗體分子(具有兩個fabs)結(jié)合于單個低-pi可溶性抗原與結(jié)合于兩個低-pi可溶性抗原相比時，在后一情況中的復(fù)合物的凈pi更低。當(dāng)這樣的普通型抗體轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪劭贵w時，僅一個抗原可以結(jié)合抗體的單個分子；由于結(jié)合第二抗原造成的復(fù)合物pi的降低可以由此被抑制。換句話說，據(jù)信，當(dāng)可溶性抗原的pi低于抗體的pi時，轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪劭贵w使得復(fù)合物的pi與普通抗體相比增加，并且加速攝入細(xì)胞中。此外，不受限制，當(dāng)普通igg-型抗體分子(具有兩個fabs)的fab具有比fc低的pi時，轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪劭贵w增加由單臂抗體和抗原組成的復(fù)合物的凈pi。此外，當(dāng)進行此種向單臂抗體的轉(zhuǎn)變時，從單臂抗體的穩(wěn)定性的角度優(yōu)選fabs中的一個在位于fab和fc之間的連接處的鉸鏈區(qū)中裂解。在該情況下，可以預(yù)期通過選擇會將單臂抗體的pi提高到所需程度的位點有效提高pi。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，不僅僅(或基本上)取決于抗體氨基酸序列本身和可溶性抗原的類型，抗體的pi可以增加并且附帶的抗原的細(xì)胞攝取可以通過將抗體轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪劭贵w，通過計算抗體的理論pi(fc的理論pi和fab的理論pi)和可溶性抗原的理論pi以及預(yù)測它們的理論pi值的差異上的關(guān)系來加速。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體可以是多特異性抗體，所述多特異性抗體可以是，但不受限于雙特異性抗體。多特異性抗體可以是含有第一多肽和第二多肽的多特異性抗體。這里，"含有第一多肽和第二多肽的多特異性抗體"是指結(jié)合至少兩個或更多個類型的不同抗原或同一抗原中至少兩個或更多個類型的表位的抗體。第一多肽和第二多肽優(yōu)選可以含有重鏈可變區(qū)，并且更優(yōu)選可變區(qū)含有一個或多個cdr和/或一個或多個fr。在另一個實施方案中，第一多肽和第二多肽可以優(yōu)選各自含有重鏈恒定區(qū)。在另一個實施方案中，多特異性抗體可以含有第三多肽和第四多肽，其各自含有輕鏈可變區(qū)并且優(yōu)選還有輕鏈恒定區(qū)。在該情況下，第一至第四多肽可以組裝在一起形成多特異性抗體。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a的抗體是多特異性抗體并且多特異性抗體含有重鏈恒定區(qū)的情況下，為了降低其pi，例如，可以使用以下序列：位置137處的igg2或igg4序列；位置196處的igg1，igg2，或igg4序列；位置203處的igg2或igg4序列；位置214處的igg2序列；位置217處的igg1，igg3，或igg4序列；位置233處的igg1，igg3，或igg4序列；位置268處的igg4序列；位置274處的igg2，igg3，或igg4序列；位置276處的igg1，igg2，或igg4序列；位置355處的igg4序列；位置392處的igg3序列；位置419處的igg4序列；或位置435處的igg1，igg2，或igg4序列。同時，為了增加其pi，例如，可以使用以下序列：位置137處的igg1或igg3序列；位置196處的igg3序列；位置203處的igg1或igg3序列；位置214處的igg1，igg3，或igg4序列；位置217處的igg2序列；位置233處的igg2序列；位置268處的igg1，igg2，或igg3序列；位置274處的igg1序列；位置276處的igg3序列；位置355處的igg1，igg2，或igg3序列；位置392處的igg1，igg2，或igg4序列；位置419處的igg1，igg2，或igg3序列；或位置435處的igg3序列。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a的抗體具有兩個重鏈恒定區(qū)的情況下，兩個重鏈恒定區(qū)的pi可以彼此相同或不同。所述重鏈恒定區(qū)可以是最初具有不同pi的igg1，igg2，igg3和igg4重鏈恒定區(qū)。備選地，可能在兩個重鏈恒定區(qū)之間引入pi差異。用于在恒定區(qū)中引入這種pi差異的至少一個氨基酸殘基的修飾位點可以是上述的一個或多個位置或選自，例如，由以下組成的組的一個或多個位置：wo2009/041643中所述的重鏈恒定區(qū)中的位置137，位置196，位置203，位置214，位置217，位置233，位置268，位置274，位置276，位置297，位置355，位置392，位置419，和位置435(根據(jù)eu編號)。備選地，可以修飾作為糖基化位點的位置297的氨基酸殘基以去除糖鏈，因為從重鏈恒定區(qū)去除糖鏈導(dǎo)致pi差異。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并且哺乳動物來源的單克隆抗體是優(yōu)選的。單克隆抗體包括通過雜交瘤產(chǎn)生的那些或由通過遺傳改造技術(shù)利用攜帶抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的那些。公開內(nèi)容a或b的抗體可以是，例如，抗體如嵌合抗體，人源化抗體，或通過親和力成熟產(chǎn)生的抗體，或源自它們的分子。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體可以源自，不限于任何動物物種(例如，人；或非人動物如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、猴、食蟹猴、獼猴、阿拉伯狒狒(hamadryasbaboon)、黑猩猩、山羊、綿羊、狗、豬或駱駝)，或任意鳥類；并且抗體優(yōu)選源自人、猴或小鼠。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體可以是ig-型抗體，并且可以優(yōu)選為igg-型抗體。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，fc受體(也稱為"fcr")是指可以結(jié)合免疫球蛋白(抗體)或由其衍生的分子的fc區(qū)，或fc區(qū)變體的受體蛋白。例如，在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，已知對于igg，iga，ige和igm的fc受體分別為fcγr，fcαr，fcεr和fcμr。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，fc受體還可以是，例如，fcrn(也稱為"新生fc受體")。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，"fcγr"可以指可以結(jié)合igg1，igg2，igg3，或igg4抗體或源自其的分子的fc區(qū)，或fc區(qū)變體的受體蛋白，并且可以包括基本上由fcγr基因編碼的蛋白家族的成員中的任意一個或多個或全部。在人中，所述家族包括，但不限于，fcγri(cd64)(包括同種型fcγria，fcγrib，和fcγric)；fcγrii(cd32)(包括同種型fcγriia((包括同種異型h131(類型h)和r131(類型r)))，fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)，和fcγriic)；以及fcγriii(cd16)(包括同種型fcγriiia(包括同種異型v158和f158)和fcγriiib(包括同種異型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2))，以及所有未鑒定的人fcγrs和fcγr同種型以及同種異型。此外，fcγriib1和fcγriib2已經(jīng)報道為人fcγriib(hfcγriib)的剪接變體。還存在稱為fcγriib3的剪接變體的報道(brooks等人，j.exp.med，170：1369-1385(1989))。除了上文所述的那些，hfcγriib包括所有剪接變體，如ncbi中在np_001002273.1，np_001002274.1，np_001002275.1，np_001177757.1，和np_003992.3下記錄的那些。hfcγriib還包括所有已經(jīng)報道的遺傳多態(tài)性，例如，fcγriib(li等人，arthritisrheum.48：3242-3252(2003)，kono等人，hum.mol.genet.14：2881-2892(2005)；kyogoku等人，arthritisrheum.46(5)：1242-1254(2002))，以及未來將報道的所有遺傳多態(tài)性。fcγr可以源自任意生物，并且可以包括源自人，小鼠，大鼠，兔，或猴的那些，但不限于其。小鼠fcγrs包括，但不限于，fcγri(cd64)，fcγrii(cd32)，fcγriii(cd16)和fcγriii-2(cd16-2)，以及所有未鑒定的小鼠fcγrs，和fcγr同種型以及同種異型。所述優(yōu)選的fcγr包括，例如，人fcγri(cd64)，fcγriia(cd32)，fcγriib(cd32)，fcγriiia(cd16)，或fcγriiib(cd16)。因為fcγr以膜形式在體內(nèi)存在，因此其可以在人工轉(zhuǎn)變?yōu)檫m當(dāng)?shù)目扇苄孕问胶笥糜趯嶒炏到y(tǒng)。例如，如wo2014/163101中所示，fcγri的寡核苷酸序列和氨基酸序列可以分別是nm_000566.3和np_000557.1中所示的序列；fcγriia的寡核苷酸序列和氨基酸序列可以分別是bc020823.1和aah20823.1中所示的序列。fcγriib的寡核苷酸序列和氨基酸序列可以分別是bc146678.1和aai46679.1中所示的序列；fcγriiia的寡核苷酸序列和氨基酸序列可以分別是bc033678.1和aah33678.1中所示的序列；fcγriiib的寡核苷酸序列和氨基酸序列可以分別是bc128562.1和aai28563.1中所示的序列(顯示refseq登錄號)。fcγriia具有兩個遺傳多態(tài)性，其中fcγriia的位置131的氨基酸被組氨酸(類型h)或精氨酸(類型r)替代(j.exp.med.172：19-25，1990)。在fcγri(cd64)(其包括fcγria，fcγrib，和fcγric)，和fcγriii(cd16)(其包括fcγriiia(包括同種異型v158和f158))中，結(jié)合igg的fc區(qū)的α鏈與共同γ鏈關(guān)聯(lián)，所述共同γ鏈具有傳遞細(xì)胞內(nèi)的激活信號的itam。fcγriiib(包括同種異型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)是gpi錨蛋白。同時，fcγrii(cd32)(其包括fcγriia(包括同種異型h131和r131)以及fcγriic同種型)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有itam。這些受體表達在很多免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞，和抗原呈遞細(xì)胞上。這些受體結(jié)合于igg的fc區(qū)后轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活信號促進巨噬細(xì)胞的吞噬能力，炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，肥大細(xì)胞的脫粒，和抗原-呈遞細(xì)胞的增加的功能。具有上述轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號能力的fcγr在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)也稱為激活性fcγr。同時，fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有itim，其傳遞抑制性信號。在b細(xì)胞中，fcγriib和b細(xì)胞受體(bcr)之間的交聯(lián)抑制來自bcr的激活信號，其導(dǎo)致對通過bcr的抗體產(chǎn)生的抑制。在巨噬細(xì)胞中，fcγriii和fcγriib的交聯(lián)抑制吞噬能力和產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的能力。在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)上文所述的抑制性信號的能力的fcγr也稱為抑制性fcγ受體。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，與修飾前的抗體或fc區(qū)(變體)相比，抗體或fc區(qū)(變體)對各種fcγr的結(jié)合活性增加，還是(基本上)保持，還是降低可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法評估。所述方法不特別限制并且可以使用本實施例中所述的那些，并且可以使用例如，基于表面等離子共振(spr)現(xiàn)象的biacore(proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11)，4005-4010)。備選地，例如，elisa和熒光激活的細(xì)胞分選(facs)以及alpha篩選(放大的發(fā)光鄰近均相測定(amplifiedluminescentproximityhomogeneousassay))。在這些測定中，人fcγr的胞外結(jié)構(gòu)域可以用作可溶性抗原(例如，wo2013/047752)。對于用于測量抗體或fc區(qū)(變體)中含有的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和fcγr之間的結(jié)合活性的ph條件，可以適當(dāng)使用酸性或中性ph條件。對于測量條件中使用的溫度，可以例如，在10℃至50℃之間的任意評估fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和fcγr之間的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)。確定人fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與fcγr的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)的優(yōu)選的溫度是，例如，15℃至40℃。更優(yōu)選，為了確定fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與fcγr之間的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)，可以使用20℃至35℃的任意溫度，例如，如20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，和35℃中的任一個。所述溫度的非限制性實例是25℃。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a或b的抗體具有恒定區(qū)(其可以被修飾)的情況下，恒定區(qū)可以具有fc區(qū)或fc區(qū)變體(優(yōu)選，人fc區(qū)或人fc區(qū)變體)，并且優(yōu)選在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)具有fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a的抗體具有fcγr-結(jié)合活性的情況下，其可以具有fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選人fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特別限制，只要抗體在酸性ph和/或中性ph對fcγr具有結(jié)合活性或親和力，并且其可以是具有直接或間接結(jié)合fcγr的活性的結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a的抗體具有fcγr-結(jié)合活性的情況下，優(yōu)選的是，與含有天然igg恒定區(qū)的參照抗體相比，抗體的fcγr-結(jié)合活性在中性ph條件下增加。從比較二者的fcγr-結(jié)合活性的角度，優(yōu)選的是，不限于，公開內(nèi)容a的抗體和含有天然igg恒定區(qū)的參照抗體在除了優(yōu)選，公開內(nèi)容a的在一個或多個氨基酸殘基處修飾的抗體的恒定區(qū)之外的區(qū)域(例如，可變區(qū))具有相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a的抗體在中性ph條件(例如，ph7.4)下具有fcγr-結(jié)合活性或增加的fcγr-結(jié)合活性的情況下，不受理論限制，認(rèn)為抗體具有如下性質(zhì)的組合：在血漿和細(xì)胞內(nèi)體之間穿梭和通過具有離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為單個抗體分子重復(fù)結(jié)合多個抗原的性質(zhì)；通過在整體抗體中具有提高的pi和增加的正電荷而快速攝入細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)；和通過在中性ph條件下具有增加的fcγr-結(jié)合活性而快速攝入細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)。由此，抗體在血漿中的半衰期可以進一步縮短，或抗體對胞外基質(zhì)的結(jié)合活性可以進一步增加，或抗原從血漿的去除可以進一步促進；因此公開內(nèi)容a的抗體是有益的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定用于抗體的最佳pi值來利用這些性質(zhì)。在一個實施方案中，其fcγr-結(jié)合活性比其中根據(jù)eu編號在位置297處連接的糖鏈?zhǔn)呛瑤r藻糖糖鏈的天然人igg的fc區(qū)或恒定區(qū)高的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過修飾天然人igg的fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基產(chǎn)生(參見wo2013/047752)。此外，與fcγr結(jié)合的任何結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域可以用作fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在該情況下，可以在不需要引入氨基酸修飾的情況下產(chǎn)生fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且備選地，其對fcγr的親和力可以通過引入額外修飾增加。所述fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括schlapschly等人(proteineng.des.sel.22(3)：175-188(2009)，behar等人(proteineng.des.sel.21(1)：1-10(2008))，和kipriyanov等人，jimmunol.169(1)：137-144(2002)中描述的結(jié)合fcγriiia的fab片段抗體，駱駝源的單結(jié)構(gòu)域抗體，和單鏈fv抗體，以及bonetto等人，fasebj.23(2)：575-585(2008)中所述的結(jié)合fcγri的環(huán)肽?？梢允褂蒙衔乃龅姆椒ㄟm當(dāng)評估fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fcγr-結(jié)合活性是否比在根據(jù)eu編號在位置297處連接的糖鏈?zhǔn)呛瑤r藻糖糖鏈的天然人igg的fc區(qū)或恒定區(qū)高。在公開內(nèi)容a的一個實施方案中，起始fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括，例如，(人)iggfc區(qū)或(人)igg恒定區(qū)。只要起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的變體能夠在中性ph范圍結(jié)合人fcγr，任意fc區(qū)或恒定區(qū)可以用作起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)。通過進一步修飾其一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)從fc區(qū)或恒定區(qū)修飾的起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)進一步獲得的fc區(qū)或恒定區(qū)還可以適當(dāng)用作公開內(nèi)容a的fc區(qū)或恒定區(qū)。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)可以指多肽本身，含有起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的組合物，或編碼起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的氨基酸序列。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)可以包括通過重組技術(shù)產(chǎn)生的已知fc區(qū)或已知恒定區(qū)。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的來源不受限，并且其可以獲自非人動物的任意生物或人。此外，起始fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以獲自食蟹猴，狨，獼猴，黑猩猩，或人。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)可以優(yōu)選獲自人igg1；然而，其不限于特定igg類型。這意為人igg1，igg2，igg3，或igg4的fc區(qū)可以用作適當(dāng)?shù)钠鹗糵cγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且其還意為，在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，源自任意生物的igg型或亞類的fc區(qū)或恒定區(qū)可以優(yōu)選用作起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)。天然igg變體或修飾的形式的實例在公知文獻如strohl，curr.opin.biotechnol.20(6)：685-691(2009)；presta，curr.opin.immunol.20(4)：460-470(2008)；davis等人，proteineng.des.sel.23(4)：195-202(2010)；wo2009/086320，wo2008/092117；wo2007/041635；和wo2006/105338中描述，但不限于此。在一個實施方案中，起始fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，起始fc區(qū)，或起始恒定區(qū)的氨基酸殘基可以含有，例如，一種或多種突變：例如，用不同于起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)中的那些的氨基酸殘基置換；將一個或多個氨基酸殘基插入起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)中的氨基酸殘基中；或從起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的那些中缺失一個或多個氨基酸殘基。修飾后的fc區(qū)或恒定區(qū)的氨基酸序列優(yōu)選是含有可能不是天然存在的fc區(qū)或恒定區(qū)的至少一部分的氨基酸序列。所述變體必需與起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)具有小于100％的序列同一性或相似性。例如，變體與起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的氨基酸序列具有約75％至小于100％，更優(yōu)選約80％至小于100％，甚至更優(yōu)選約85％至小于100％，還更優(yōu)選約90％至小于100％，并且也更優(yōu)選約95％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性。在非限制性實例中，在公開內(nèi)容a的修飾的fc區(qū)或恒定區(qū)和起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)之間有至少一個氨基酸不同。在一個實施方案中，在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍具有fcγr-結(jié)合活性的fc區(qū)或恒定區(qū)(可以包含在公開內(nèi)容a的抗體中)可以通過任意方法獲得。具體而言，在中性ph范圍具有fcγr-結(jié)合活性的fc區(qū)或恒定區(qū)變體可以通過修飾可以用作起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的人igg抗體的氨基酸獲得。適于修飾的igg抗體fc區(qū)或igg抗體恒定區(qū)可以包括，例如，人igg(igg1，igg2，igg3，或igg4，或其變體)的fc區(qū)或恒定區(qū)，和由其自發(fā)產(chǎn)生的突變體。對于人igg1，人igg2，人igg3，或人igg4抗體的fc區(qū)或恒定區(qū)，很多由于遺傳多態(tài)性導(dǎo)致的同種異型序列在"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"，nih出版no.91-3242中描述，并且它們中的任一種可以用于公開內(nèi)容a。尤其是，對于人igg1序列，根據(jù)eu編號位置356至358的氨基酸序列可以是del或eem。在公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)的另一個實施方案中，其他氨基酸的修飾不受限，只要變體在中性ph范圍具有fcγr-結(jié)合活性即可。所述修飾的一個或多個氨基酸位置在例如wo2007/024249，wo2007/021841，wo2006/031370，wo2000/042072，wo2004/029207，wo2004/099249，wo2006/105338，wo2007/041635，wo2008/092117，wo2005/070963，wo2006/020114，wo2006/116260，wo2006/023403，wo2013/047752，wo2006/019447，wo2012/115241，wo2013/125667，wo2014/030728，wo2014/163101，wo2013/118858，和wo2014/030750中報道。為了增加在中性ph范圍內(nèi)的fcγr-結(jié)合活性在恒定區(qū)或fc區(qū)中的氨基酸修飾的位點可以包括，例如，選自由以下組成的組的位置的一個或多個位置：人igg抗體的fc區(qū)或恒定區(qū)中221，222，223，224，225，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，243，244，245，246，247，249，250，251，254，255，256，258，260，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，278，279，280，281，282，283，284，285，286，288，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，311，313，315，317，318，320，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，339，376，377，378，379，380，382，385，392，396，421，427，428，429，434，436，和440(根據(jù)eu編號)，如wo2013/047752中所示。所述氨基酸殘基的修飾可以增加igg抗體的fc區(qū)或恒定區(qū)在中性ph條件下對fcγr的結(jié)合。wo2013/047752描述了，作為igg-型恒定區(qū)或fc區(qū)中的優(yōu)選的修飾，例如，一個或多個氨基酸殘基的修飾選自由以下組成的組：位置221的氨基酸修飾為lys或tyr；位置222的氨基酸修飾為phe，trp，glu，和tyr中的任一個；位置223的氨基酸修飾為phe，trp，glu，和lys中的任一個；位置224的氨基酸修飾為phe，trp，glu，和tyr中的任一個；位置225的氨基酸修飾為glu，lys，和trp中的任一個；位置227的氨基酸修飾為glu，gly，lys，和tyr中的任一個；位置228的氨基酸修飾為glu，gly，lys，和tyr中的任一個；位置230的氨基酸修飾為ala，glu，gly，和tyr中的任一個；位置231的氨基酸修飾為glu，gly，lys，pro，和tyr中的任一個；位置232的氨基酸修飾為glu，gly，lys，和tyr中的任一個；位置233的氨基酸修飾為ala，asp，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置234的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置235的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置236的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置237的氨基酸修飾為asp，glu，phe，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置238的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置239的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置240的氨基酸修飾為ala，ile，met，和thr中的任一個；位置241的氨基酸修飾為asp，glu，leu，arg，trp，和tyr中的任一個；位置243的氨基酸修飾為glu，leu，gln，arg，trp，和tyr中的任一個；位置244的氨基酸修飾為his；位置245的氨基酸修飾為ala；位置246的氨基酸修飾為asp，glu，his，和tyr中的任一個；位置247的氨基酸修飾為ala，phe，gly，his，ile，leu，met，thr，val，和tyr中的任一個；位置249的氨基酸修飾為glu，his，gln，和tyr中的任一個；位置250的氨基酸修飾為glu或gln；位置251的氨基酸修飾為phe；位置254的氨基酸修飾為phe，met，和tyr中的任一個；位置255的氨基酸修飾為glu，leu，和tyr中的任一個；位置256的氨基酸修飾為ala，met，和pro中的任一個；位置258的氨基酸修飾為asp，glu，his，ser，和tyr中的任一個；位置260的氨基酸修飾為asp，glu，his，和tyr中的任一個；位置262的氨基酸修飾為ala，glu，phe，ile，和thr中的任一個；位置263的氨基酸修飾為ala，ile，met，和thr中的任一個；位置264的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，trp，和tyr中的任一個；位置265的氨基酸修飾為ala，leu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置266的氨基酸修飾為ala，ile，met，和thr中的任一個；位置267的氨基酸修飾為asp，glu，phe，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置268的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，ile，lys，leu，met，pro，gln，arg，thr，val，和trp中的任一個；位置269的氨基酸修飾為phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置270的氨基酸修飾為glu，phe，gly，his，ile，leu，met，pro，gln，arg，ser，thr，trp，和tyr中的任一個；位置271的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置272的氨基酸修飾為asp，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置273的氨基酸修飾為phe或ile；位置274的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，leu，met，asn，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置275的氨基酸修飾為leu或trp；位置276的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，leu，met，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置278的氨基酸修飾為asp，glu，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，和trp中的任一個；位置279的氨基酸修飾為ala；位置280的氨基酸修飾為ala，gly，his，lys，leu，pro，gln，trp，和tyr中的任一個；位置281的氨基酸修飾為asp，lys，pro，和tyr中的任一個；位置282的氨基酸修飾為glu，gly，lys，pro，和tyr中的任一個；位置283的氨基酸修飾為ala，gly，his，ile，lys，leu，met，pro，arg，和tyr中的任一個；位置284的氨基酸修飾為asp，glu，leu，asn，thr，和tyr中的任一個；位置285的氨基酸修飾為asp，glu，lys，gln，trp，和tyr中的任一個；位置286的氨基酸修飾為glu，gly，pro，和tyr中的任一個；位置288的氨基酸修飾為asn，asp，glu，和tyr中的任一個；位置290的氨基酸修飾為asp，gly，his，leu，asn，ser，thr，trp，和tyr中的任一個；位置291的氨基酸修飾為asp，glu，gly，his，ile，gln，和thr中的任一個；位置292的氨基酸修飾為ala，asp，glu，pro，thr，和tyr中的任一個；位置293的氨基酸修飾為phe，gly，his，ile，leu，met，asn，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置294的氨基酸修飾為phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置295的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，met，asn，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置296的氨基酸修飾為ala，asp，glu，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，gln，arg，ser，thr，和val中的任一個；位置297的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置298的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，his，ile，lys，met，asn，gln，arg，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置299的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，val，trp，和tyr中的任一個；位置300的氨基酸修飾為ala，asp，glu，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，和trp中的任一個；位置301的氨基酸修飾為asp，glu，his，和tyr中的任一個；位置302的氨基酸修飾為ile；位置303的氨基酸修飾為asp，gly，和tyr中的任一個；位置304的氨基酸修飾為asp，his，leu，asn，和thr中的任一個；位置305的氨基酸修飾為glu，ile，thr，和tyr中的任一個；位置311的氨基酸修飾為ala，asp，asn，thr，val，和tyr中的任一個；位置313的氨基酸修飾為phe；位置315的氨基酸修飾為leu；位置317的氨基酸修飾為glu或gln；位置318的氨基酸修飾為his，leu，asn，pro，gln，arg，thr，val，和tyr中的任一個；位置320的氨基酸修飾為asp，phe，gly，his，ile，leu，asn，pro，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置322的氨基酸修飾為ala，asp，phe，gly，his，ile，pro，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置323的氨基酸修飾為ile；位置324的氨基酸修飾為asp，phe，gly，his，ile，leu，met，pro，arg，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置325的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置326的氨基酸修飾為ala，asp，glu，gly，ile，leu，met，asn，pro，gln，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置327的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，arg，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置328的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置329的氨基酸修飾為asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置330的氨基酸修飾為cys，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置331的氨基酸修飾為asp，phe，his，ile，leu，met，gln，arg，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置332的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；位置333的氨基酸修飾為ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，leu，met，pro，ser，thr，val，和tyr中的任一個；位置334的氨基酸修飾為ala，glu，phe，ile，leu，pro，和thr中的任一個；位置335的氨基酸修飾為asp，phe，gly，his，ile，leu，met，asn，pro，arg，ser，val，trp，和tyr中的任一個；位置336的氨基酸修飾為glu，lys，和tyr中的任一個；位置337的氨基酸修飾為glu，his，和asn中的任一個；位置339的氨基酸修飾為asp，phe，gly，ile，lys，met，asn，gln，arg，ser，和thr中的任一個；位置376的氨基酸修飾為ala或val；位置377的氨基酸修飾為gly或lys；位置378的氨基酸修飾為asp；位置379的氨基酸修飾為asn；位置380的氨基酸修飾為ala，asn，和ser中的任一個；位置382的氨基酸修飾為ala或ile；位置385的氨基酸修飾為glu；位置392的氨基酸修飾為thr；位置396的氨基酸修飾為leu；位置421的氨基酸修飾為lys；位置427的氨基酸修飾為asn；位置428的氨基酸修飾為phe或leu；位置429的氨基酸修飾為met；位置434的氨基酸修飾為trp；位置436的氨基酸修飾為ile；和位置440的氨基酸修飾為gly，his，ile，leu，和tyr中的任一個(根據(jù)eu編號)。要修飾的氨基酸數(shù)量不特別限制，并且可能修飾僅一個位置的氨基酸或兩個或更多個位置的氨基酸。在兩個或更多個位置處的氨基酸修飾的組合顯示在wo2013/047752的表5中。這些氨基酸殘基的修飾還可以適當(dāng)引入公開內(nèi)容a的抗體中。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體(的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)對(人)fcγr，如fcγri，fcγriia，fcγriib，fcγriiia和fcγriiib中的任意一個或多個的結(jié)合活性，可以比天然igg或含有起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的參照抗體(的fc區(qū)或恒定區(qū))的結(jié)合活性高。例如，公開內(nèi)容a的抗體(的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的fcγr-結(jié)合活性，與參照抗體的fcγr-結(jié)合活性相比，可以是55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，100％或更多，105％或更多，優(yōu)選110％或更多，115％或更多，120％或更多，125％或更多，特別優(yōu)選130％或更多，135％或更多，140％或更多，145％或更多，150％或更多，155％或更多，160％或更多，165％或更多，170％或更多，175％或更多，180％或更多，185％或更多，190％或更多，或195％或更多，或是參照抗體的fcγr-結(jié)合活性的2-倍或更多，2.5-倍或更多，3-倍或更多，3.5-倍或更多，4-倍或更多，4.5-倍或更多，5-倍或更多，7.5-倍或更多，10-倍或更多，20-倍或更多，30-倍或更多，40-倍或更多，50-倍或更多，60-倍或更多，70-倍或更多，80-倍或更多，90-倍或更多，或100-倍或更多。在另一個實施方案中，對抑制性fcγr(fcγriib-1和/或fcγriib-2)的結(jié)合活性的提高水平(在中性ph范圍內(nèi))可以大于對激活性fcγr(fcγria：fcγrib；fcγric；fcγriiia(包括同種異型v158)；fcγriiia(包括同種異型f158)；fcγriiib(包括同種異型fcγriiib-na1)；fcγriiib(包括同種異型fcγriiib-na2)；fcγriia(包括同種異型h131)；或fcγriia(包括同種異型r131))的結(jié)合活性的提高水平。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體可以具有對fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)的結(jié)合活性。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的優(yōu)選的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包括，例如，其對具體fcγr的結(jié)合活性大于對其他fcγr的結(jié)合活性的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(具有選擇性fcγr-結(jié)合活性的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。在使用抗體(或fc區(qū)作為fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的情況下，單個抗體分子可以僅結(jié)合單個fcγr分子。因此，結(jié)合抑制性fcγr的狀態(tài)下的單個抗體分子不能結(jié)合其他激活性fcγr，并且結(jié)合激活性fcγr的狀態(tài)下的單個抗體分子不能結(jié)合其他激活性fcγr或抑制性fcγr。如上文所述的，激活性fcγr優(yōu)選包括，例如，fcγri(cd64)如fcγria，fcγrib，或fcγric；和fcγriii(cd16)如fcγriiia(如同種異型v158或f158)或fcγriiib(如同種異型fcγriiib-na1或fcγriiib-na2)。同時，抑制性fcγr優(yōu)選包括，例如，fcγriib(如fcγriib-1或fcγriib-2)。在一個實施方案中，對抑制性fcγr比對激活性fcγr具有更高結(jié)合活性的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用作包含在公開內(nèi)容a的抗體中的選擇性fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述選擇性fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括，例如，對fcγriib(如fcγriib-1和/或fcγriib-2)比對選自由以下組成的組的激活性fcγr中的任意一個或多個具有更高結(jié)合活性的fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域：fcγri(cd64)如fcγria，fcγrib，或fcγric；fcγriii(cd16)如fcγriiia(如同種異型v158或f158)或fcγriiib(如fcγriiib-na1或fcγriiib-na2)；fcγrii(cd32)如fcγriia(包括同種異型h131或r131)；和fcγriic。此外，fcγr-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是否具有選擇性結(jié)合活性可以通過比較由上述方法確定的與每個fcγr的結(jié)合活性來評估，例如，通過比較通過用對激活性fcγr的kd值除以對抑制性fcγr的kd值獲得的值(比)，更具體通過比較以下等式1中所示的fcγr選擇性指數(shù)：[等式1]fcγr選擇性指數(shù)＝對激活性fcγr的kd值/對抑制性fcγr的kd值在等式1中，對于激活性fcγr的kd值是指對于以下中的一種或多種的kd值：fcγria；fcγrib；fcγric；fcγriiia(包括同種異型v158和/或f158)；fcγriiib(包括fcγriiib-na1和/或fcγriiib-na2)；fcγriia(包括同種異型h131和/或r131)；和fcγriic；并且對于抑制性fcγr的kd值是指對于fcγriib-1和/或fcγriib-2的kd值。用于確定kd值的激活性fcγr和抑制性fcγr可以以任意組合選擇。例如，可能使用用對于fcγriia(包括同種異型h131)的kd值除以對于fcγriib-1和/或fcγriib-2的kd值確定的值(比)，不限于此。fcγr選擇性指數(shù)可以是，例如：1.2或更高，1.3或更高，1.4或更高，1.5或更高，1.6或更高，1.7或更高，1.8或更高，1.9或更高，2或更高，3或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，15或更高，20或更高，25或更高，30或更高，35或更高，40或更高，45或更高，50或更高，55或更高，60或更高，65或更高，70或更高，75或更高，80或更高，85或更高，90或更高，95或更高，100或更高，110或更高，120或更高，130或更高，140或更高，150或更高，160或更高，170或更高，180或更高，190或更高，200或更高，210或更高，220或更高，230或更高，240或更高，250或更高，260或更高，270或更高，280或更高，290或更高，300或更高，310或更高，320或更高，330或更高，340或更高，350或更高，360或更高，370或更高，380或更高，390或更高，400或更高，410或更高，420或更高，430或更高，440或更高，450或更高，460或更高，470或更高，480或更高，490或更高，500或更高，520或更高，540或更高，560或更高，580或更高，600或更高，620或更高，640或更高，660或更高，680或更高，700或更高，720或更高，740或更高，760或更高，780或更高，800或更高，820或更高，840或更高，860或更高，880或更高，900或更高，920或更高，940或更高，960或更高，980或更高，1000或更高，1500或更高，2000或更高，2500或更高，3000或更高，3500或更高，4000或更高，4500或更高，5000或更高，5500或更高，6000或更高，6500或更高，7000或更高，7500或更高，8000或更高，8500或更高，9000或更高，9500或更高，10000或更高，或100000或更高；單其不限于此。在一個實施方案中，人igg(igg1，igg2，igg3，或igg4)根據(jù)eu編號在位置238或328的氨基酸分別是asp或glu的fc區(qū)變體或恒定區(qū)變體(含有其的抗體)，可以優(yōu)選用作含有fc區(qū)變體或恒定區(qū)變體的公開內(nèi)容a的抗體，因為如在wo2013/125667，wo2012/115241，和wo2013/047752中具體描述的，其對fcγriib-1和/或fcγriib-2比對fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia(包括同種異型v158)，fcγriiia(包括同種異型f158)，fcγriiib(包括同種異型fcγriiib-na1)，fcγriiib(包括同種異型fcγriiib-na2)，fcγriia(包括同種異型h131)，fcγriia(包括同種異型r131)，和/或fcγriic具有更高的結(jié)合活性。在該實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體對所有激活性fcγrs(本文中，其選自由以下組成的組：fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib，fcγriia)和fcγriib都具有結(jié)合活性，并且與含有天然igg恒定區(qū)或天然iggfc區(qū)的參照抗體相比，它們的fcγriib-結(jié)合活性被保持或增加，和/或它們對所有激活性fcγr的結(jié)合活性降低。在一個實施方案中，對于含有fc區(qū)變體或恒定區(qū)變體的公開內(nèi)容a的抗體，與具有天然igg的恒定區(qū)或fc區(qū)的參照抗體相比，它們對fcγriib的結(jié)合活性可以保持或增加，并且它們對fcγriia(類型h)和fcγriia(類型r)的結(jié)合活性可以降低。所述抗體可以具有增加的相對于fcγriia的對fcγriib的結(jié)合選擇性。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，"對所有激活性fcγr的結(jié)合活性降低"的程度可以是，但不限于，99％或更少，98％或更少，97％或更少，96％或更少，95％或更少，94％或更少，93％或更少，92％或更少，91％或更少，90％或更少，88％或更少，86％或更少，84％或更少，82％或更少，80％或更少，78％或更少，76％或更少，74％或更少，72％或更少，70％或更少，68％或更少，66％或更少，64％或更少，62％或更少，60％或更少，58％或更少，56％或更少，54％或更少，52％或更少，50％或更少，45％或更少，40％或更少，35％或更少，30％或更少，25％或更少，20％或更少，15％或更少，10％或更少，5％或更少，4％或更少，3％或更少，2％或更少，1％或更少，0.5％或更少，0.4％或更少，0.3％或更少，0.2％或更少，0.1％或更少，0.05％或更少，0.01％或更少，或0.005％或更少。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，"fcγriib-結(jié)合活性被保持或增加的"程度，"對fcγriib的結(jié)合活性被保持或增加的"程度，或"對fcγriib保持的或增加的結(jié)合活性"的程度可以是，但不限于，55％或更高，60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，87％或更高，88％或更高，89％或更高，90％或更高，91％或更高，92％或更高，93％或更高，94％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，100％或更高，101％或更高，102％或更高，103％或更高，104％或更高，105％或更高，106％或更高，107％或更高，108％或更高，109％或更高，110％或更高，112％或更高，114％或更高，116％或更高，118％或更高，120％或更高，122％或更高，124％或更高，126％或更高，128％或更高，130％或更高，132％或更高，134％或更高，136％或更高，138％或更高，140％或更高，142％或更高，144％或更高，146％或更高，148％或更高，150％或更高，155％或更高，160％或更高，165％或更高，170％或更高，175％或更高，180％或更高，185％或更高，190％或更高，195％或更高，2-倍或更高，3-倍或更高，4-倍或更高，5-倍或更高，6-倍或更高，7-倍或更高，8-倍或更高，9-倍或更高，10-倍或更高，20-倍或更高，30-倍或更高，40-倍或更高，50-倍或更高，60-倍或更高，70-倍或更高，80-倍或更高，90-倍或更高，100-倍或更高，200-倍或更高，300-倍或更高，400-倍或更高，500-倍或更高，600-倍或更高，700-倍或更高，800-倍或更高，900-倍或更高，1000-倍或更高，10000-倍或更高，或100000-倍或更高。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，"對fcγriia(類型h)和fcγriia(類型r)的結(jié)合活性降低的"或"對fcγriia(類型h)和fcγriia(類型r)的結(jié)合活性降低的"程度可以是，但不限于，99％或更少，98％或更少，97％或更少，96％或更少，95％或更少，94％或更少，93％或更少，92％或更少，91％或更少，90％或更少，88％或更少，86％或更少，84％或更少，82％或更少，80％或更少，78％或更少，76％或更少，74％或更少，72％或更少，70％或更少，68％或更少，66％或更少，64％或更少，62％或更少，60％或更少，58％或更少，56％或更少，54％或更少，52％或更少，50％或更少，45％或更少，40％或更少，35％或更少，30％或更少，25％或更少，20％或更少，15％或更少，10％或更少，5％或更少，4％或更少，3％或更少，2％或更少，1％或更少，0.5％或更少，0.4％或更少，0.3％或更少，0.2％或更少，0.1％或更少，0.05％或更少，0.01％或更少，或0.005％或更少。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，增加的相對于fcγriia(類型r)的對fcγriib的結(jié)合選擇性的修飾可以是優(yōu)選的，并且增加的相對于fcγriia(類型h)的對fcγriib的結(jié)合選擇性的修飾可以是更優(yōu)選的，并且如在wo2013/047752中報道的，對于此種修飾的優(yōu)選的氨基酸置換可以包括，例如，根據(jù)eu編號：(a)通過在位置237用trp置換gly進行的修飾；(b)通過在位置237用phe置換gly進行的修飾；(c)通過在位置238用phe置換pro進行的修飾；(d)通過在位置325用met置換asn進行的修飾；(e)通過在位置267用ile置換ser進行的修飾；(f)通過在位置328用asp置換leu進行的修飾；(g)通過在位置267用val置換ser進行的修飾；(h)通過在位置328用trp置換leu進行的修飾；(i)通過在位置267用gln置換ser進行的修飾；(j)通過在位置267用met置換ser進行的修飾；(k)通過在位置236用asp置換gly進行的修飾；(l)通過在位置327用asn置換ala進行的修飾；(m)通過在位置325用ser置換asn進行的修飾；(n)通過在位置235用tyr置換leu進行的修飾；(o)通過在位置266用met置換val進行的修飾；(p)通過在位置328用tyr置換leu進行的修飾；(q)通過在位置235用trp置換leu進行的修飾；(r)通過在位置235用phe置換leu進行的修飾；(s)通過在位置239用gly置換ser進行的修飾；(t)通過在位置327用glu置換ala進行的修飾；(u)通過在位置327用gly置換ala進行的修飾；(v)通過在位置238用leu置換pro進行的修飾；(w)通過在位置239用leu置換ser進行的修飾；(x)通過在位置328用thr置換leu進行的修飾；(y)通過在位置328用ser置換leu進行的修飾；(z)通過在位置328用met置換leu進行的修飾；(aa)通過在位置331用trp置換pro進行的修飾；(ab)通過在位置331用tyr置換pro進行的修飾；(ac)通過在位置331用phe置換pro進行的修飾；(ad)通過在位置327用asp置換ala進行的修飾；(ae)通過在位置328用phe置換leu進行的修飾；(af)通過在位置271用leu置換pro進行的修飾；(ag)通過在位置267用glu置換ser進行的修飾；(ah)通過在位置328用ala置換leu進行的修飾；(ai)通過在位置328用ile置換leu進行的修飾；(aj)通過在位置328用gln置換leu進行的修飾；(ak)通過在位置328用val置換leu進行的修飾；(al)通過在位置326用trp置換lys進行的修飾；(am)通過在位置334用arg置換lys進行的修飾；(an)通過在位置268用gly置換his進行的修飾；(ao)通過在位置268用asn置換his進行的修飾；(ap)通過在位置324用val置換ser進行的修飾；(aq)通過在位置266用leu置換val進行的修飾；(ar)通過在位置271用gly置換pro進行的修飾；(as)通過在位置332用phe置換ile進行的修飾；(at)通過在位置324用ile置換ser進行的修飾；(au)通過在位置333用pro置換glu進行的修飾；(av)通過在位置300用asp置換tyr進行的修飾；(aw)通過在位置337用asp置換ser進行的修飾；(ax)通過在位置300用gln置換tyr進行的修飾；(ay)通過在位置335用asp置換thr進行的修飾；(az)通過在位置239用asn置換ser進行的修飾；(ba)通過在位置326用leu置換lys進行的修飾；(bb)通過在位置326用ile置換lys進行的修飾；(bc)通過在位置239用glu置換ser進行的修飾；(bd)通過在位置326用phe置換lys進行的修飾；(be)通過在位置326用val置換lys進行的修飾；(bf)通過在位置326用tyr置換lys進行的修飾；(bg)通過在位置267用asp置換ser進行的修飾；(bh)通過在位置326用pro置換lys進行的修飾；(bi)通過在位置326用his置換lys進行的修飾；(bj)通過在位置334用ala置換lys進行的修飾；(bk)通過在位置334用trp置換lys進行的修飾；(bl)通過在位置268用gln置換his進行的修飾；(bm)通過在位置326用gln置換lys進行的修飾；(bn)通過在位置326用glu置換lys進行的修飾；(bo)通過在位置326用met置換lys進行的修飾；(bp)通過在位置266用ile置換val進行的修飾；(bq)通過在位置334用glu置換lys進行的修飾；(br)通過在位置300用glu置換tyr進行的修飾；(bs)通過在位置334用met置換lys進行的修飾；(bt)通過在位置334用val置換lys進行的修飾；(bu)通過在位置334用thr置換lys進行的修飾；(bv)通過在位置334用ser置換lys進行的修飾；(bw)通過在位置334用his置換lys進行的修飾；(bx)通過在位置334用phe置換lys進行的修飾；(by)通過在位置334用gln置換lys進行的修飾；(bz)通過在位置334用pro置換lys進行的修飾；(ca)通過在位置334用tyr置換lys進行的修飾；(cb)通過在位置334用ile置換lys進行的修飾；(cc)通過在位置295用leu置換gln進行的修飾；(cd)通過在位置334用leu置換lys進行的修飾；(ce)通過在位置334用asn置換lys進行的修飾；(cf)通過在位置268用ala置換his進行的修飾；(cg)通過在位置239用asp置換ser進行的修飾；(ch)通過在位置267用ala置換ser進行的修飾；(ci)通過在位置234用trp置換leu進行的修飾；(cj)通過在位置234用tyr置換leu進行的修飾；(ck)通過在位置237用ala置換gly進行的修飾；(cl)通過在位置237用asp置換gly進行的修飾；(cm)通過在位置237用glu置換gly進行的修飾；(cn)通過在位置237用leu置換gly進行的修飾；(co)通過在位置237用met置換gly進行的修飾；(cp)通過在位置237用tyr置換gly進行的修飾；(cq)通過在位置330用lys置換ala進行的修飾；(cr)通過在位置330用arg置換ala進行的修飾；(cs)通過在位置233用asp置換glu進行的修飾；(ct)通過在位置268用asp置換his進行的修飾；(cu)通過在位置268用glu置換his進行的修飾；(cv)通過在位置326用asp置換lys進行的修飾；(cw)通過在位置326用ser置換lys進行的修飾；(cx)通過在位置326用thr置換lys進行的修飾；(cy)通過在位置323用ile置換val進行的修飾；(cz)通過在位置323用leu置換val進行的修飾；(da)通過在位置323用met置換val進行的修飾；(db)通過在位置296用asp置換tyr進行的修飾；(dc)通過在位置326用ala置換lys進行的修飾；(dd)通過在位置326用asn置換lys進行的修飾；和(de)通過在位置330用met置換ala進行的修飾。上述修飾可以單獨在單個位置或組合在兩個或更多個位置。備選地，所述優(yōu)選的修飾可以包括，例如，wo2013/047752的表14至15，17至24，和26至28中所示的那些，例如，人恒定區(qū)或人fc區(qū)的變體，其中在人igg(igg1，igg2，igg3，或igg4)中，根據(jù)eu編號位置238的氨基酸是asp并且根據(jù)eu編號位置271的氨基酸是gly；此外，根據(jù)eu編號位置233，234，237，264，265，266，267，268，269，272，296，326，327，330，331，332，333，和396處的一個或多個可以被置換。在該情況下，變體可以包括，但不限于，含有以下中的一種或多種的人恒定區(qū)或人fc區(qū)的變體：位置233處asp，位置234處tyr，位置237處asp，位置264處ile，位置265處glu，位置266處phe，met，和leu中的任一個，位置267處ala，glu，gly，和gln中的任一個，位置268處asp或glu，位置269處asp，位置272處asp，phe，ile，met，asn，和gln中的任一個，位置296處asp，位置326處ala或asp，位置327處gly，位置330處lys或arg，位置331處ser，位置332處thr，位置333處thr，lys，和arg中的任一個，以及位置396處asp，glu，phe，ile，lys，leu，met，gln，arg，和tyr中的任一個(根據(jù)eu編號)。在一個備選實施方案中，含有fc區(qū)變體或恒定區(qū)變體的公開內(nèi)容a的抗體可以具有與含有天然igg的恒定區(qū)或fc區(qū)的參照抗體相比保持的或增加的對fcγriib的結(jié)合活性和降低的對fcγriia(類型h)和fcγriia(類型r)的結(jié)合活性。此種變體的氨基酸置換的優(yōu)選的位點可以是如wo2014/030728中報道的，例如，根據(jù)eu編號位置238處的氨基酸和選自由以下組成的組的位置的至少一個氨基酸：位置233，234，235，237，264，265，266，267，268，269，271，272，274，296，326，327，330，331，332，333，334，355，356，358，396，409，和419(根據(jù)eu編號)。更優(yōu)選，所述變體可以根據(jù)eu編號在位置238處具有asp，并且具有選自以下的組的氨基酸中的至少一個氨基酸：位置233處asp，位置234處tyr，位置235處phe，位置237處asp，位置264處ile，位置265處glu，位置266處phe，leu，或met，位置267處ala，glu，gly，或gln，位置268處asp，gln，或glu，位置269處asp，位置271處gly，位置272處asp，phe，ile，met，asn，pro，或gln，位置274處gln，位置296處asp或phe，位置326處ala或asp，位置327處gly，位置330處lys，arg，或ser，位置331處ser，位置332處lys，arg，ser，或thr，位置333處lys，arg，ser，或thr，位置334處arg，ser，或thr，位置355處ala或gln，位置356處glu，位置358處met，位置396處ala，asp，glu，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，gln，arg，ser，thr，val，trp，或tyr，位置409處arg，和位置419處glu(根據(jù)eu編號)。在一個備選實施方案中，與含有天然igg的恒定區(qū)或fc區(qū)的參照抗體相比，含有fc區(qū)變體或恒定區(qū)變體的公開內(nèi)容a的抗體可以具有保持的對fcγriib的結(jié)合活性和降低的對所有激活性fcγrs，fcγriia(類型r)的結(jié)合活性。對于此種變體的氨基酸置換的優(yōu)選的位點可以是如wo2014/163101中報道的，例如，除了根據(jù)eu編號)位置238處的氨基酸之外，選自根據(jù)eu編號位置235，237，241，268，295，296，298，323，324，和330的位置的至少一個氨基酸。更優(yōu)選，所述變體可以根據(jù)eu編號在位置238處具有asp，和選自以下的組的氨基酸中的至少一個氨基酸：位置235處phe；位置237處gln或asp；位置241處met或leu；位置268處pro；位置295處met或val；位置296處glu，his，asn，或asp；位置298處ala或met；位置323處ile；位置324處asn或his；和位置330處his或tyr(根據(jù)eu編號)。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，"保持的對fcγriib的結(jié)合活性"的水平可以是，但不限于，55％或更高，60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，81％或更高，82％或更高，83％或更高，84％或更高，85％或更高，86％或更高，87％或更高，88％或更高，89％或更高，90％或更高，91％或更高，92％或更高，93％或更高，94％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，100％或更高，101％或更高，102％或更高，103％或更高，104％或更高，105％或更高，106％或更高，107％或更高，108％或更高，109％或更高，110％或更高，120％或更高，130％或更高，140％或更高，150％或更高，175％或更高，或2-倍或更高。在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，前述"降低的對所有激活性fcγrs，尤其是fcγriia(類型r)的結(jié)合活性"的水平可以是，但不限于，74％或更少，72％或更少，70％或更少，68％或更少，66％或更少，64％或更少，62％或更少，60％或更少，58％或更少，56％或更少，54％或更少，52％或更少，50％或更少，45％或更少，40％或更少，35％或更少，30％或更少，25％或更少，20％或更少，15％或更少，10％或更少，5％或更少，4％或更少，3％或更少，2％或更少，1％或更少，0.5％或更少，0.4％或更少，0.3％或更少，0.2％或更少，0.1％或更少，0.05％或更少，0.01％或更少，或0.005％或更少。wo2014/030750還報道了小鼠恒定區(qū)和fc區(qū)的變體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體可以包含此種變體。本文所述的公開內(nèi)容a和b范圍內(nèi)，不像屬于免疫球蛋白超家族的fcγr，"fcrn"，尤其是人fcrn，與i型主要組織相容性復(fù)合物(mhc)的多肽結(jié)構(gòu)上類似，并且呈現(xiàn)與i型mhc分子22％至29％的序列同一性(ghetie等人，immunol.today18(12)，592-598(1997))。fcrn表達為異源二聚體，其由與跨膜α或重鏈復(fù)合的可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)組成。如mhc一樣，fcrn的α鏈含有三個胞外結(jié)構(gòu)域(α1，α2，和α3)，并且其短的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍走B接到細(xì)胞表面。α1和α2結(jié)構(gòu)域與抗體fc區(qū)的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用(raghavan等人，immunity1：303-315(1994))。fcrn在哺乳動物的母體胎盤和卵黃囊中表達，并且參與母親到胎兒的igg轉(zhuǎn)移。此外，在新生嚙齒類動物表達fcrn的小腸中，fcrn參與成熟igg從攝取的初乳或乳汁跨刷狀緣上皮的轉(zhuǎn)移。fcrn在各種物種的多種其他組織和內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)中表達。fcrn還在成人血管內(nèi)皮、肌肉血管系統(tǒng)、和肝竇狀隙毛細(xì)管中表達。認(rèn)為fcrn通過結(jié)合igg并將igg再循環(huán)到血清中而在血漿igg濃度的保持中發(fā)揮作用。通常，fcrn對igg分子的結(jié)合是嚴(yán)格ph依賴性的。在低于7.0的酸性ph范圍中觀察到最佳結(jié)合。人fcrn的寡核苷酸和氨基酸序列可以分別源自，例如，nm_004107.4和np_004098.1中所示的前體(含有信號序列)，(括號中顯示refseq登錄號)。該前體與與人β2-微球蛋白在體內(nèi)形成復(fù)合物。因此，通過使用已知重組表達技術(shù)，可以制備能夠與人β2-微球蛋白形成復(fù)合物的可溶性人fcrn，以適當(dāng)用于各種實驗系統(tǒng)。所述可溶性人fcrn可以用于評估抗體或fc區(qū)變體的fcrn-結(jié)合活性。在公開內(nèi)容a或b中，fcrn不特別限制，只要其是能夠結(jié)合fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的形式即可；然而，優(yōu)選的fcrn可以是人fcrn。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，在抗體或fc區(qū)變體具有fcrn-結(jié)合活性的情況下，其可以具有"fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域"，優(yōu)選人fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特別限制，只要抗體在酸性ph和/或在中性ph對fcrn具有結(jié)合活性或親和力即可；或其可以是具有直接或間接結(jié)合fcrn的活性的結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)域包括，但不限于，igg-型免疫球蛋白的fc區(qū)，白蛋白，白蛋白結(jié)構(gòu)域3，抗-fcrn抗體，抗-fcrn肽，和抗-fcrn支架分子(其具有直接結(jié)合fcrn的活性)，和結(jié)合igg或白蛋白的分子(其具有間接結(jié)合fcrn的活性。在公開內(nèi)容a或b中，還可能使用在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍具有fcrn-結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域。如果所述結(jié)構(gòu)域最初在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍具有fcrn-結(jié)合活性，則它們可以在不進一步修飾的情況下使用。如果該結(jié)構(gòu)域在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍僅具有弱的或不具有fcrn-結(jié)合活性，抗體或fc區(qū)變體的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基可以被修飾以在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍具有fcrn-結(jié)合活性。備選地，可以修飾最初在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍具有fcrn-結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域的氨基酸以進一步增加其fcrn-結(jié)合活性。在酸性ph范圍和/或在中性ph范圍中的fcrn-結(jié)合活性可以與氨基酸修飾前和后相比較，以找到對于fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域而言感興趣的氨基酸修飾。fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以優(yōu)選是直接結(jié)合fcrn的區(qū)域。所述優(yōu)選的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括，例如，抗體的恒定區(qū)和fc區(qū)。然而，能夠結(jié)合具有fcrn-結(jié)合活性的多肽，如白蛋白和igg的區(qū)域，可以經(jīng)由白蛋白，igg間接結(jié)合fcrn。因此，fcrn-結(jié)合區(qū)可以是結(jié)合對白蛋白或igg具有結(jié)合活性的多肽的區(qū)域。不受限制，為了促進從血漿去除抗原，其fcrn-結(jié)合活性在中性ph較高的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是優(yōu)選的，同時為了改善抗體在血漿中的保留，其fcrn-結(jié)合活性在酸性ph較高的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是優(yōu)選的。例如，可以選擇其fcrn-結(jié)合活性最初在中性ph或酸性ph較高的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。備選地，可以修飾抗體或fc區(qū)變體的氨基酸以賦予在中性ph或酸性ph下的fcrn-結(jié)合活性。備選地，可以增加預(yù)先存在的在中性ph或酸性ph下的fcrn-結(jié)合活性。在本文所述的公開內(nèi)容a和b范圍內(nèi)，與修飾前的抗體或fc區(qū)(變體)相比，抗體或fc區(qū)(變體)的fcrn-結(jié)合活性增加，(基本上)保持，還是降低可以通過已知方法評估，如本文實施例中所述的那些，并且例如，biacore，scatchard曲線和流式細(xì)胞儀(參見wo2013/046722)。在這些測定中人fcrn的胞外結(jié)構(gòu)域可以用作可溶性抗原。在抗體或fc區(qū)(變體)的fcrn-結(jié)合活性的測量中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇條件(除了ph以外)。測定可以，例如，在mes緩沖液和37℃的條件下進行，如wo2009/125825中所述的?？梢岳?，通過在固定有抗體的芯片上加載fcrn作為分析物，評估抗體或fc區(qū)(變體)的fcrn-結(jié)合活性?？贵w或fc區(qū)(變體)的fcrn-結(jié)合活性可以基于解離常數(shù)(kd)，表觀解離常數(shù)(表觀kd)，解離速率(kd)，表觀解離(表觀kd)評估。對于用于測量fcrn和包含在抗體或fc區(qū)(變體)中的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合活性的ph條件，可以適當(dāng)使用酸性ph條件或中性ph條件。對于測量fcrn和fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)的溫度條件，可以使用10℃至50℃之間的任意溫度。為了確定fcrn和人fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)，可以優(yōu)選使用15℃至40℃之間的溫度。更優(yōu)選，可以使用20℃至35℃之間的任意溫度如20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，和35℃中的任一個。該溫度的非限制性實例可以是25℃。在一個實施方案中，在公開內(nèi)容a或b的抗體具有fcrn-結(jié)合活性的情況下，它們可以具有fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選人fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特別限制，只要抗體在酸性ph和/或中性ph對fcrn具有結(jié)合活性或親和力，并且其可以是具有直接或間接結(jié)合fcrn的活性的結(jié)構(gòu)域。在一個具體實施方案中，可以優(yōu)選的是，與含有天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，公開內(nèi)容a或b的抗體在中性ph條件下具有例如，增加的fcrn-結(jié)合活性(參見wo2013/046722)。從比較二者的fcrn-結(jié)合活性的角度，可以優(yōu)選的是，不限于，公開內(nèi)容a或b的抗體和含有天然igg的恒定區(qū)的參照抗體在除了優(yōu)選，公開內(nèi)容a或b的抗體的在一個或多個氨基酸殘基處修飾的恒定區(qū)以外的區(qū)域(例如，可變區(qū))具有相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，在本文所述的公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)，在公開內(nèi)容a的抗體在中性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性的情況下，不受特定理論限制，公開內(nèi)容a的抗體可以具有以下性質(zhì)中的任意兩個或更多個的組合：在血漿和細(xì)胞內(nèi)體之間穿梭并且作為單個抗體分子通過具有離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域而重復(fù)結(jié)合多個抗原的性質(zhì)；通過在整個抗體中具有提高的pi和增加的正電荷而被快速攝入細(xì)胞的性質(zhì)；和通過在中性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性而被快速攝入細(xì)胞的性質(zhì)。由此，血漿中的抗體半衰期可以進一步縮短，或抗體對胞外基質(zhì)的結(jié)合活性可以進一步增加，或可以進一步促進抗原從血漿的去除。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定公開內(nèi)容a的抗體的最佳pi值以利用這些性質(zhì)。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，根據(jù)yeung等人(j.immunol.182：7663-7671(2009))，天然人igg1結(jié)合人fcrn的活性在酸性ph范圍(ph6.0)內(nèi)是kd1.7μm，而在中性ph范圍內(nèi)活性幾乎不可檢測。因此，為了增加在中性ph范圍內(nèi)的fcrn-結(jié)合活性，作為公開內(nèi)容a或b的抗體，可以優(yōu)選使用：其人fcrn-結(jié)合活性在酸性ph范圍內(nèi)是kd20μm或更強并且其人fcrn-結(jié)合活性在中性ph范圍內(nèi)與天然人igg相當(dāng)或更強的抗體或恒定區(qū)變體或fc區(qū)變體；優(yōu)選其人fcrn-結(jié)合活性在酸性ph范圍內(nèi)是kd2.0μm或更強并且其人fcrn-結(jié)合活性在中性ph范圍內(nèi)是kd40μm或更強的抗體或恒定區(qū)變體或fc區(qū)變體；并且更優(yōu)選其人fcrn-結(jié)合活性在酸性ph范圍內(nèi)是kd0.5μm或更強并且其人fcrn-結(jié)合活性在中性ph范圍內(nèi)是kd15μm或更強的抗體或恒定區(qū)變體或fc區(qū)變體。kd值通過yeung等人(j.immunol.182：7663-7671(2009)中所述的方法確定(通過將抗體固定在芯片上并且加載人fcrn作為分析物))。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，結(jié)合fcrn的任意結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域可以用作fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在該情況下，可以產(chǎn)生fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域而不需要引入氨基酸修飾，或?qū)crn的親和力可以通過引入另外的修飾增加。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，起始fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括例如，(人)igg的fc區(qū)或恒定區(qū)。只要起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的變體能夠在酸性ph范圍內(nèi)和/或在中性ph范圍內(nèi)結(jié)合fcrn，則任意fc區(qū)或恒定區(qū)可以用作起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)。或，通過進一步修飾起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)獲得的fc區(qū)或恒定區(qū)(其氨基酸殘基已經(jīng)從fc區(qū)或恒定區(qū)進行修飾)也可以適當(dāng)?shù)赜米鱢c區(qū)或恒定區(qū)。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)可以包括已知通過重組產(chǎn)生的fc區(qū)。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)可以指多肽本身，含有起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的組合物，或編碼起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的氨基酸序列，這取決于上下文。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的來源不受限，并且其可以獲自非人動物或人的任意生物。此外，起始fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以獲自食蟹猴，絨，獼猴，黑猩猩和人。起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)可以獲自人igg1，但不限于任何特定igg類型。這意為，人igg1，igg2，igg3，或igg4的fc區(qū)可以用作適當(dāng)?shù)钠鹗糵crn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且源自任意生物的igg類型或亞類的fc區(qū)或恒定區(qū)可以用作起始fc區(qū)或作為起始恒定區(qū)。天然igg變體或修飾的形式的實例在，例如，strohl，curr.opin.biotechnol.20(6)：685-691(2009)；presta，curr.opin.immunol.20(4)：460-470(2008)；davis等人，proteineng.des.sel.23(4)：195-202(2010)，wo2009/086320，wo2008/092117；wo2007/041635；和wo2006/105338)中描述。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，起始fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，起始fc區(qū)，或起始恒定區(qū)的氨基酸殘基可以含有，例如，一種或多種突變：例如，利用與起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)中的氨基酸殘基不同的氨基酸殘基的置換突變；將一個或多個氨基酸殘基插入起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)中的氨基酸殘基中；或從起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的氨基酸殘基中缺失一個或多個氨基酸殘基。修飾后fc區(qū)或恒定區(qū)的氨基酸序列可以優(yōu)選是含有不天然存在的fc區(qū)或恒定區(qū)的至少一部分的氨基酸序列。所述變體必需與起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)具有小于100％的序列同一性或相似性。例如，所述變體與起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的氨基酸序列具有約75％至小于100％，更優(yōu)選約80％至小于100％，甚至更優(yōu)選約85％至小于100％，還更優(yōu)選約90％至小于100％，并且另外更優(yōu)選約95％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性。在非限制性實例中，至少一個氨基酸在公開內(nèi)容a或b的修飾的fc區(qū)或恒定區(qū)和起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)之間不同。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)，在酸性ph范圍內(nèi)和/或在中性ph范圍內(nèi)具有fcrn-結(jié)合活性的fc區(qū)或恒定區(qū)可以通過任意方法獲得。具體而言，在酸性ph范圍內(nèi)和/或在中性ph范圍內(nèi)具有fcrn-結(jié)合活性的fc區(qū)或恒定區(qū)的變體可以通過修飾可以用作起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的人igg-型抗體的氨基酸獲得。適于修飾的igg-型抗體fc區(qū)或恒定區(qū)包括，例如，人igg(igg1，igg2，igg3，和igg4，和其變體)的fc區(qū)或恒定區(qū)，和自發(fā)從其產(chǎn)生的突變體也包括在iggfc區(qū)或恒定區(qū)中。對于人igg1，人igg2，人igg3，和人igg4抗體的fc區(qū)或恒定區(qū)，由于遺傳多態(tài)性造成的很多同種異型序列在"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"，nih出版no.91-3242中描述，并且它們中的任一種可以用于公開內(nèi)容a或b。尤其是，對于人igg1序列，根據(jù)eu編號位置356至358的氨基酸序列可以是del或eem。在公開內(nèi)容a或b的一個實施方案中，修飾為其他氨基酸不特別限制，只要得到的變體在酸性ph范圍內(nèi)和/或在中性ph范圍內(nèi)，并且優(yōu)選在中性ph范圍內(nèi)具有fcrn-結(jié)合活性即可。修飾氨基酸以增加在中性ph條件下的fcrn-結(jié)合活性的位點，例如，在wo2013/046722中描述。所述修飾位點包括，例如，選自由以下組成的組的一個或多個位置：人igg抗體的fc區(qū)或恒定區(qū)中的位置221至225，227，228，230，232，233至241，243至252，254至260，262至272，274，276，278至289，291至312，315至320，324，325，327至339，341，343，345，360，362，370，375至378，380，382，385至387，389，396，414，416，423，424，426至438，440，和442(根據(jù)eu編號)，如wo2013/046722中所述的。wo2013/046722還描述了，作為fc區(qū)或恒定區(qū)中的優(yōu)選的修飾的一部分，例如，選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸的修飾：位置256的氨基酸修飾為pro，位置280的氨基酸修飾為lys，位置339的氨基酸修飾為thr，位置385的氨基酸修飾為his，位置428的氨基酸修飾為leu，和位置434的氨基酸修飾為trp，tyr，phe，ala，或his(根據(jù)eu編號)。要被修飾的氨基酸的數(shù)量不特別限制，并且修飾可以在單個位置單獨地或在兩個或更多個位置進行。這些氨基酸殘基的修飾可以增強igg-型抗體的fc區(qū)或恒定區(qū)在中性ph條件下的fcrn結(jié)合。這些氨基酸殘基的修飾還可以適當(dāng)?shù)匾牍_內(nèi)容a或b的抗體中。在進一步或備選實施方案中，還可能使用適當(dāng)?shù)陌被嵝揎椢稽c用于增加在酸性ph條件下的fcrn-結(jié)合活性。在這樣的修飾位點中，允許fcrn結(jié)合的增加的一個或多個修飾位點在中性ph范圍內(nèi)也可適當(dāng)用于公開內(nèi)容a或b。所述修飾位點包括，例如，wo2011/122011，wo2013/046722，wo2013/046704，和wo2013/046722中報道的那些。允許人igg-型抗體的恒定區(qū)或fc區(qū)的所述修飾的氨基酸位點和修飾后的氨基酸類型在wo2013/046722的表1中報道。wo2013/046722還描述了，特別優(yōu)選的，恒定區(qū)或fc區(qū)中的修飾位點，例如，選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸位置的位點：位置237，238，239，248，250，252，254，255，256，257，258，265，270，286，289，297，298，303，305，307，308，309，311，312，314，315，317，325，332，334，360，376，380，382，384，385，386，387，389，424，428，433，434，和436(根據(jù)eu編號)。這些氨基酸殘基位置的修飾還可以增強fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域在中性ph范圍內(nèi)的人fcrn結(jié)合。wo2013/046722還描述了，作為igg-型恒定區(qū)或fc區(qū)中的優(yōu)選的修飾的一部分，例如，選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸殘基的修飾：(a)位置237處的氨基酸修飾為met；(b)位置238處的氨基酸修飾為ala；(c)位置239處的氨基酸修飾為lys；(d)位置248處的氨基酸修飾為ile；(e)位置250處的氨基酸修飾為ala，phe，ile，met，gln，ser，val，trp，和tyr中的任一個；(f)位置252處的氨基酸修飾為phe，trp，和tyr中的任一個；(g)位置254處的氨基酸修飾為thr；(h)位置255處的氨基酸修飾為glu；(i)位置256處的氨基酸修飾為asp，glu，和gln中的任一個；(j)位置257處的氨基酸修飾為ala，gly，ile，leu，met，asn，ser，thr，和val中的任一個；(k)位置258處的氨基酸修飾為his；(l)位置265處的氨基酸修飾為ala；(m)位置270處的氨基酸修飾為phe；(n)位置286處的氨基酸修飾為ala或glu；(o)位置289處的氨基酸修飾為his；(p)位置297處的氨基酸修飾為ala；(q)位置298處的氨基酸修飾為gly；(r)位置303處的氨基酸修飾為ala；(s)位置305處的氨基酸修飾為ala；(t)位置307處的氨基酸修飾為ala，asp，phe，gly，his，ile，lys，leu，met，asn，pro，gln，arg，ser，val，trp，和tyr中的任一個；(u)位置308處的氨基酸修飾為ala，phe，ile，leu，met，pro，gln，和thr中的任一個；(v)位置309處的氨基酸修飾為ala，asp，glu，pro，和arg中的任一個；(w)位置311處的氨基酸修飾為ala，his，和ile中的任一個；(x)位置312處的氨基酸修飾為ala或his；(y)位置314處的氨基酸修飾為lys或arg；(z)位置315處的氨基酸修飾為ala或his；(aa)位置317處的氨基酸修飾為ala；(ab)位置325處的氨基酸修飾為gly；(ac)位置332處的氨基酸修飾為val；(ad)位置334處的氨基酸修飾為leu；(ae)位置360處的氨基酸修飾為his；(af)位置376處的氨基酸修飾為ala；(ag)位置380處的氨基酸修飾為ala；(ah)位置382處的氨基酸修飾為ala；(ai)位置384處的氨基酸修飾為ala；(aj)位置385處的氨基酸修飾為asp或his；(ak)位置386處的氨基酸修飾為pro；(al)位置387處的氨基酸修飾為glu；(am)位置389處的氨基酸修飾為ala或ser；(an)位置424處的氨基酸修飾為ala；(ao)位置428處的氨基酸修飾為ala，asp，phe，gly，his，ile，lys，leu，asn，pro，gln，ser，thr，val，trp，和tyr中的任一個；(ap)位置433處的氨基酸修飾為lys；(aq)位置434處的氨基酸修飾為ala，phe，his，ser，trp，和tyr；和(ar)位置436處的氨基酸修飾為his(根據(jù)eu編號)。要被修飾的氨基酸數(shù)量不特別限制，并且修飾可以在單個位置單獨地或在兩個或更多個位置進行。在兩個或更多個位置的氨基酸修飾的組合包括，例如，wo2013/046722的表2中所示的那些。這些氨基酸殘基的修飾還可以適當(dāng)引入公開內(nèi)容a和b的抗體中。在一個實施方案中，當(dāng)與含有天然igg的fc區(qū)或恒定區(qū)的參照抗體或含有起始fc區(qū)或起始恒定區(qū)的參照抗體比較時，公開內(nèi)容a或b的抗體的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fcrn-結(jié)合活性增加。即，公開內(nèi)容a或b的fc區(qū)變體或恒定區(qū)變體，或含有所述變體的抗體的fcrn-結(jié)合活性大于參照抗體的結(jié)合活性)。這可以意為，當(dāng)與參照抗體的fcrn-結(jié)合活性比較時，公開內(nèi)容a或b的抗體的fcrn-結(jié)合活性可以是，例如：55％或更高，60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，100％或更高，105％或更高，優(yōu)選110％或更高，115％或更高，120％或更高，125％或更高，更優(yōu)選130％或更高，135％或更高，140％或更高，145％或更高，150％或更高，155％或更高，160％或更高，165％或更高，170％或更高，175％或更高，180％或更高，185％或更高，190％或更高，195％或更高，2-倍或更高，2.5-倍或更高，3-倍或更高，3.5-倍或更高，4-倍或更高，4.5-倍或更高，或5-倍或更高。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體中要修飾的氨基酸序列可以優(yōu)選含有人序列(天然人源的抗體中存在的序列)，從而當(dāng)將抗體體內(nèi)施用(優(yōu)選，入人體)時不增加抗體的免疫原性。備選地，修飾后，突變可以以這樣的方式引入到氨基酸修飾位點之外的位置：frs(fr1，fr2，fr3，和fr4)中的一個或多個用人序列置換。用人序列置換一個或多個fr的方法在本領(lǐng)域中是已知，并且包括，但不限于ono等人，mol.immunol.36(6)：387-395(1999)中報道的那些。人源化方法是本領(lǐng)域中已知的并且包括，但不限于methods36(1)：43-60(2005)中報道的那些。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)序列(也稱為"fr序列")可以含有人種系框架區(qū)序列。當(dāng)框架區(qū)序列完全是人種系序列時，當(dāng)施用于人(例如，治療或預(yù)防某疾病)時預(yù)期抗體引起很少的或不引起免疫原性反應(yīng)。fr序列優(yōu)選可以包括，例如，完全人fr序列如v-base(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)中所示的那些。這些fr序列可以適當(dāng)用于公開內(nèi)容a或b。種系序列可以基于其相似性歸類(tomlinson等人(j.mol.biol.227：776-798(1992)；williams等人(eur.j.immunol.23：1456-1461(1993)；和cox等人(nat.genetics7：162-168(1994))。優(yōu)選的種系序列可以適當(dāng)選自：vκ，其歸類為七個亞組；vλ，其歸類為十個亞組；和vh，其歸類為七個亞組。完全人vh序列可以優(yōu)選包括，例如，以下的vh序列：亞組vh1(例如，vh1-2，vh1-3，vh1-8，vh1-18，vh1-24，vh1-45，vh1-46，vh1-58，和vh1-69)；亞組vh2(例如，vh2-5，vh2-26，和vh2-70)；亞組vh3(vh3-7，vh3-9，vh3-11，vh3-13，vh3-15，vh3-16，vh3-20，vh3-21，vh3-23，vh3-30，vh3-33，vh3-35，vh3-38，vh3-43，vh3-48，vh3-49，vh3-53，vh3-64，vh3-66，vh3-72，vh3-73，和vh3-74)；亞組vh4(vh4-4，vh4-28，vh4-31，vh4-34，vh4-39，vh4-59，和vh4-61)；亞組vh5(vh5-51)；亞組vh6(vh6-1)；或亞組vh7(vh7-4和vh7-81)。這些還在例如，matsuda等人(j.exp.med.188：1973-1975(1998))中描述，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)基于這些序列的信息設(shè)計。還可以優(yōu)選使用其他完全人fr序列或與其相當(dāng)?shù)膮^(qū)域的序列。完全人vκ序列可以優(yōu)選包括，例如：a20，a30，l1，l4，l5，l8，l9，l11，l12，l14，l15，l18，l19，l22，l23，l24，o2，o4，o8，o12，o14，或o18，其歸類為亞組vk1；a1，a2，a3，a5，a7，a17，a18，a19，a23，o1，和o11，其歸類為亞組vk2；a11，a27，l2，l6，l10，l16，l20，和l25，其歸類為亞組vk3；b3，歸類為亞組vk4；b2(也稱為"vk5-2")，歸類為亞組vk5；或a10，a14，和a26，其歸類為亞組vk6(kawasaki等人(eur.j.immunol.31：1017-1028(2001))；(hoppeseylerbiol.chem.374：1001-1022(1993))；brensing-kuppers等人(gene191：173-181(1997))。完全人vλ序列可以優(yōu)選包括，例如：v1-2，v1-3，v1-4，v1-5，v1-7，v1-9，v1-11，v1-13，v1-16，v1-17，v1-18，v1-19，v1-20，和v1-22，其歸類為亞組vl1；v2-1，v2-6，v2-7，v2-8，v2-11，v2-13，v2-14，v2-15，v2-17，和v2-19，其歸類為亞組vl2；v3-2，v3-3，和v3-4，其歸類為亞組vl3；v4-1，v4-2，v4-3，v4-4，和v4-6，其歸類為亞組vl4；或v5-1，v5-2，v5-4，和v5-6，其歸類為亞組vl5(kawasaki等人genomeres.7：250-261(1997))。通常，這些fr序列彼此在一個或多個氨基酸殘基處有不同。這些fr序列可以用于修飾抗體氨基酸殘基?？梢杂糜谛揎椀耐耆薴r序列還包括，例如，kol，newm，rei，eu，tur，tei，lay，和pom(參見，例如，前述kabat等人(1991)；wu等人(j.exp.med.132：211-250(1970))。在本文所述的公開內(nèi)容a和b范圍內(nèi)，"柔性殘基"可以指顯示高的氨基酸多樣性的位置(在此處，當(dāng)與已知和/或天然抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比較時，輕鏈或重鏈可變區(qū)具有多個不同氨基酸)處存在的氨基酸殘基改變。顯示高多樣性的位置通常位于cdr中。kabat提供的數(shù)據(jù)，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstituteofhealthbethesdamd.)(1987和1991)，可以有效確定已知和/或天然抗體中具有高多樣性的位置。此外，網(wǎng)絡(luò)上多個數(shù)據(jù)庫(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/，bioinf.org.uk/abs/index.html)提供許多人輕鏈和重鏈序列和它們的位置的集合。這些序列和位置信息用于確定柔性殘基的位置。不受限制，例如，當(dāng)特定位置處的氨基酸殘基具有，優(yōu)選，2至20，3至19，4至18，5至17，6至16，7至15，8至14，9至13，或10至12個氨基酸殘基的變化性時，可以將該位置判斷為顯示(高的)多樣性。在一個實施方案中，可以理解，如果需要，在公開內(nèi)容a或b的抗體含有輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的全部或一部分時，抗體可以含有一個或多個適當(dāng)?shù)娜嵝詺埢?。例如，選擇具有fr序列(其最初含有根據(jù)離子濃度(氫離子濃度或鈣離子濃度)條件改變抗體的抗原結(jié)合活性的氨基酸殘基)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)序列可以設(shè)計為含有，除了這些氨基酸殘基之外的氨基酸殘基。在該情況下，例如，柔性殘基的數(shù)量和位置還可以在不限于具體實施方案的情況下確定，只要公開內(nèi)容a或b的抗體的抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變即可。具體而言，重鏈和/或輕鏈的cdr序列和/或fr序列可以含有至少一個柔性殘基。例如，在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，可以引入輕鏈可變區(qū)序列(前述vk5-2)的柔性殘基包括，但不限于，表1或表2中所示的一個或多個氨基酸殘基位置。同樣，適當(dāng)?shù)娜嵝詺埢梢砸耄?，含有輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的整個或一部分的離子濃度-依賴性抗體或沒有離子濃度依賴性的抗體，其中可以暴露在抗體表面的至少一個氨基酸殘基被修飾以便提高pi。[表1](位置根據(jù)kabat編號顯示。)[表2](位置根據(jù)kabat編號顯示。)在一個實施方案中，在人源化嵌合抗體時，嵌合抗體的pi通過修飾可能暴露在抗體表面的一個或多個氨基酸殘基增加，從而產(chǎn)生與缺少此種修飾的嵌合抗體相比、公開內(nèi)容a或b的具有縮短的血漿半衰期的人源化的抗體?？赡鼙┞对谌嗽椿贵w表面的氨基酸殘基的修飾可以在人源化抗體之前或同時進行。備選地，通過使用人源化抗體作為起始材料，可以修飾可能暴露在表面上的氨基酸殘基以進一步改變?nèi)嗽椿贵w的pi。adams等人(cancerimmunol.immunother.55(6)：717-727(2006))報道了，人源化抗體，曲妥珠單抗(trastuzumab)(抗原：her2)，貝伐單抗(bevacizumab)(抗原：vegf)，和帕妥珠單抗(pertuzumab)(抗原：her2)，它們使用相同的人抗體fr序列人源化，在血漿藥代動力學(xué)方面幾乎相當(dāng)。具體而言，可以理解，在使用相同fr序列進行人源化時，血漿藥代動力學(xué)幾乎是相當(dāng)?shù)摹８鶕?jù)公開內(nèi)容a的一個實施方案，除了人源化步驟之外，血漿中的抗原濃度通過修飾可能暴露在抗體表面上的氨基酸殘基，提高抗體的pi來降低。在公開內(nèi)容a或b的備選實施方案中，可以使用人抗體。通過修飾可以暴露在人抗體(從人抗體文庫，產(chǎn)生人抗體的小鼠，重組細(xì)胞等產(chǎn)生)的表面上的氨基酸殘基，并且增加人抗體的pi，最初產(chǎn)生的人抗體從血漿中去除抗原的能力可以增加。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的抗體可以含有修飾的糖鏈。具有修飾的糖鏈的抗體包括，例如，具有修飾的糖基化的抗體(wo99/54342)，缺乏巖藻糖的抗體(wo00/61739；wo02/31140，wo2006/067847；wo2006/067913)，和具有二等分glcnac糖鏈的抗體(wo02/79255)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體可以用于，例如，展現(xiàn)增加的針對癌細(xì)胞的抗腫瘤活性的技術(shù)或促進從血漿中去除對生物有害的抗原的技術(shù)。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a或b涉及具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的文庫，如上文所述的。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a或b涉及編碼上述具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的核酸(寡核苷酸)。在一個具體實施方案中，核酸可以使用適當(dāng)?shù)囊阎椒ǐ@得。對于具體實施方案，可以參考例如，wo2009/125825，wo2012/073992，wo2011/122011，wo2013/046722，wo2013/046704，wo2000/042072，wo2006/019447，wo2012/115241，wo2013/047752，wo2013/125667，wo2014/030728，wo2014/163101，wo2013/081143，wo2007/114319，wo2009/041643，wo2014/145159，wo2012/016227，和wo2012/093704，這些中的每個以其整體通過參考結(jié)合于本文。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a或b的核酸可以是分離的或純化的核酸。編碼公開內(nèi)容a或b的抗體的核酸可以是任何基因，并且可以是dna或rna，或其他核酸類似物。在本文所述的公開內(nèi)容a和b內(nèi)，在將抗體的氨基酸修飾后，修飾前的抗體的氨基酸序列可以是已知序列或新獲得的抗體的氨基酸序列。例如，抗體可以獲自抗體文庫，或通過從產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤或b細(xì)胞克隆編碼抗體的核酸獲得。從雜交瘤獲得編碼抗體的核酸的方法可以使用以下技術(shù)：通過常規(guī)免疫方法使用研究的抗原或表達研究的抗原的細(xì)胞作為致敏抗原進行免疫；將得到的免疫細(xì)胞與已知的親本細(xì)胞通過常規(guī)細(xì)胞融合方法融合；通過常規(guī)篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(雜交瘤)；使用反轉(zhuǎn)錄酶從獲得的雜交瘤的mrna合成抗體的可變區(qū)(v區(qū))的cdna；并且將cdna與編碼目標(biāo)抗體恒定區(qū)(c區(qū))的dna連接。用于獲得編碼上述重鏈和輕鏈的核酸的致敏抗原包括，但不限于，具有免疫原性的完整抗原和不完整抗原(包括不顯示免疫原性的半抗原)。例如，可能使用研究的整個蛋白或所述蛋白的部分肽。此外，物質(zhì)由多糖，核酸，脂質(zhì)，和已知是可能抗原的其他組合物組成。因此，在一些實施方案中，公開內(nèi)容a或b的抗體的抗原不特別限制?？乖梢酝ㄟ^例如，基于桿狀病毒的方法(參見，例如，wo98/46777)制備。雜交瘤可以，例如，根據(jù)g.kohler和c.milstein，methodsenzymol.73：3-46(1981))的方法制備。當(dāng)抗原的免疫原性低時，免疫可以通過將抗原與具有免疫原性的大分子，如白蛋白連接來進行。備選地，如果需要，可溶性抗原可以通過將抗原與其他分子連接來制備。當(dāng)跨膜分子如膜抗原(例如，受體)用作抗原時，膜抗原的胞外區(qū)的部分可以用作片段，或在其表面表達跨膜分子的細(xì)胞可以用作免疫原。在一些實施方案中，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以通過用適當(dāng)?shù)纳鲜鲋旅艨乖庖邉游铽@得。備選地，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以通過能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞的體外免疫制備。各種動物可以用于免疫和其他常規(guī)抗體產(chǎn)生步驟。常使用的動物包括嚙齒類動物、兔類動物和靈長類動物。動物可以包括，例如，嚙齒類如小鼠，大鼠和倉鼠；兔類如兔；和靈長類(包括猴如食蟹猴，獼猴，狒狒，和黑猩猩。此外，攜帶人抗體基因組庫(repertoire)的轉(zhuǎn)基因動物也是已知的，并且這些動物可以用于獲得人抗體(參見，例如，wo96/34096；mendez等人，nat.genet.15：146-156(1997)；wo93/12227，wo92/03918，wo94/02602，wo96/34096，和wo96/33735)。替代使用所述轉(zhuǎn)基因動物，還可能通過例如，用所需抗原或表達所需抗原的細(xì)胞體外致敏人淋巴細(xì)胞并且隨后將致敏的淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞如u266融合，獲得具有抗原結(jié)合活性的所需人抗體(jppat.publ.no.h01-59878)。動物免疫可以，例如，通過在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，生理鹽水等中適當(dāng)稀釋和懸浮致敏抗原，和將其與佐劑混合以乳化(如果需要)；并且隨后將其腹膜內(nèi)或皮下注射給動物來進行。然后，與弗氏不完全佐劑混合的致敏抗原可以優(yōu)選每四到21天施用數(shù)次?？贵w產(chǎn)生可以，例如，通過測量目標(biāo)抗體在動物血清中的滴度來確認(rèn)。獲自淋巴細(xì)胞或用所需抗原免疫的動物的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以使用常規(guī)融合劑(例如，聚乙二醇)與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤(goding，monoclonalantibodies：principlesandpractice，academicpress，1986，59-103)。如果需要，培養(yǎng)和擴增雜交瘤，并且由雜交瘤產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性通過例如，免疫沉淀、放射性免疫測定(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)評估。然后，如果需要，產(chǎn)生抗體的雜交瘤(其有關(guān)特異性、親和力或活性已經(jīng)確定)也可以通過如有限稀釋的方法亞克隆。編碼選擇的抗體的核酸可以使用可以特異結(jié)合抗體的探針(例如，與編碼抗體恒定區(qū)的序列互補的寡核苷酸)從雜交瘤或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(致敏的淋巴細(xì)胞等)克隆。備選地，核酸可以使用rt-pcr從mrna克隆。用于產(chǎn)生公開內(nèi)容a或b的抗體的重鏈和輕鏈可以源自，例如屬于ig抗體類型和亞類的任一種的抗體，并且igg可以是優(yōu)選的。在一個實施方案中，編碼構(gòu)成公開內(nèi)容a或b的抗體的重鏈(整體或其部分)和/或輕鏈(整體或其部分)的氨基酸序列的核酸，例如，通過遺傳改造技術(shù)修飾。具有人工序列修飾以，例如，降低對人的異源抗原性的重組抗體，如嵌合抗體或人源化抗體，可以適當(dāng)通過，例如，修飾編碼與抗體如小鼠抗體，大鼠抗體，兔抗體，倉鼠抗體，綿羊抗體，或駱駝抗體的成分相關(guān)的氨基酸序列的核苷酸殘基產(chǎn)生。嵌合抗體可以，例如，通過將編碼鼠源抗體可變區(qū)的dna與編碼人抗體恒定區(qū)的dna連接并且將連接的dna編碼序列整合入表達載體，然后將得到的重組載體引入宿主以表達所述基因而獲得。人源化抗體，也稱為重塑人抗體，是其中人抗體的一個或多個fr與分離自非人哺乳動物，如小鼠的抗體的一個或多個cdr框架連接，形成編碼序列的抗體。編碼所述人源化抗體的dna序列可以使用多個寡核苷酸作為模板通過重疊延伸pcr合成。重疊延伸pcr的材料和實驗方法在wo98/13388等中描述。例如，編碼例如，公開內(nèi)容a或b的抗體可變區(qū)的氨基酸序列的dna可以通過重疊延伸pcr，使用多個設(shè)計具有重疊核苷酸序列的寡核苷酸獲得。重疊dna隨后與編碼恒定區(qū)的dna符合讀框地(inframe)連接，形成編碼序列。如上文所述連接的dna可以隨后插入表達載體，從而可以表達dna，并且得到的載體可以引入宿主或宿主細(xì)胞。dna編碼的抗體可以通過培養(yǎng)宿主或或培養(yǎng)宿主細(xì)胞表達。表達的抗體可以從宿主等的培養(yǎng)基中適當(dāng)純化(ep239400；wo96/02576)。此外，可以選擇人源化抗體的經(jīng)由一個或多個cdr連接的一個或多個fr，例如，來允許cdr形成適于抗原的抗原結(jié)合位點。如果需要，構(gòu)成選擇的抗體可變區(qū)的一個或多個fr的氨基酸殘基，例如，可以用適當(dāng)?shù)闹脫Q修飾。在一個實施方案中，為了表達公開內(nèi)容a或b或其片段的抗體，可以將核酸盒克隆入適當(dāng)?shù)妮d體。為此，多種類型的載體，如噬菌粒載體是可用的。通常，噬菌粒載體可以含有多種元件，包括調(diào)節(jié)序列如啟動子或信號序列，表型選擇基因，復(fù)制起點和其他必要元件。在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立了用于將所需氨基酸修飾引入抗體的方法。例如，文庫可以通過引入可能暴露在公開內(nèi)容a或b的抗體的表面的至少一個修飾的氨基酸殘基和/或可以根據(jù)離子濃度條件而改變抗體的抗原結(jié)合活性的至少一個氨基酸構(gòu)建。此外，如果需要，柔性殘基可以使用kunkel等人(methodsenzymol.154：367-382(1987))的方法添加。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及含有編碼上述具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或上述具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的核酸的載體。在一個具體實施方案中，載體可以通過，例如，wo2009/125825，wo2012/073992，wo2011/122011，wo2013/046722，wo2013/046704，wo2000/042072，wo2006/019447，wo2012/115241，wo2013/047752，wo2013/125667，wo2014/030728，wo2014/163101，wo2013/081143，wo2007/114319，wo2009/041643，wo2014/145159，wo2012/016227，或wo2012/093704中所述的載體獲得，其各自通過參考以其整體結(jié)合于本文。在一個實施方案中，編碼公開內(nèi)容a或b的實施方案的核酸可以可操作地克隆入(插入)適當(dāng)?shù)妮d體并且引入宿主細(xì)胞中。例如，當(dāng)大腸桿菌用作宿主時，載體包括克隆載體，pbluescript載體(stratagene)或任意各種其他可商購載體。在一個實施方案中，表達載體用作含有公開內(nèi)容a或b的核酸的載體。表達載體可以用于允許多肽體外，在大腸桿菌中，在培養(yǎng)細(xì)胞中，或體內(nèi)表達。例如，可能使用pbest載體(promega)用于體外表達；pet載體(invitrogen)用于大腸桿菌表達；pme18s-fl3載體(genbank登錄號ab009864)用于培養(yǎng)細(xì)胞表達；和pme18s載體(takebe等人，mol.cellbiol.8：466-472(1988))用于體內(nèi)表達?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法，例如，通過連接酶反應(yīng)，使用限制性酶位點將dna插入載體(參見，currentprotocolsinmolecularbiologyedit.ausubel等人(1987)publish.johnwiley&sons.section11.4-11.11)。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及包含載體的宿主或宿主細(xì)胞，所述載體含有編碼上述具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或上述具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體的核酸。在一個具體實施方案中，宿主或宿主細(xì)胞可以通過，例如，wo2009/125825，wo2012/073992，wo2011/122011，wo2013/046722，wo2013/046704，wo2000/042072，wo2006/019447，wo2012/115241，wo2013/047752，wo2013/125667，wo2014/030728，wo2014/163101，wo2013/081143，wo2007/114319，wo2009/041643，wo2014/145159，wo2012/016227，或wo2012/093704中所述的方法制備，其各自通過參考以其整體結(jié)合于本文。公開內(nèi)容a或b的宿主細(xì)胞的類型不特別限制，并且宿主細(xì)胞包括，例如，細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，以及各種動物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以適當(dāng)用作生產(chǎn)系統(tǒng)，用于產(chǎn)生和表達抗體?？梢允褂谜婧撕驮思?xì)胞二者。用作宿主細(xì)胞的真核細(xì)胞包括，例如，動物細(xì)胞，植物細(xì)胞，和真菌細(xì)胞。動物細(xì)胞的實例包括哺乳動物細(xì)胞，例如，cho(puck等人，j.exp.med.108：945-956(1995))，cos，hek293，3t3，骨髓瘤，bhk(幼倉鼠腎)，hela，和vero；兩棲動物細(xì)胞，例如，非洲爪蟾卵母細(xì)胞(valle等人，nature291：338-340(1981))；和昆蟲細(xì)胞，例如，sf9，sf21，和tn5?？梢岳纾褂昧姿徕}方法，deae-葡聚糖方法，使用陽離子脂質(zhì)體dotap(boehringer-mannheim)的方法，電穿孔，和脂轉(zhuǎn)染將重組載體等引入宿主細(xì)胞。已知用作蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的植物細(xì)胞包括，例如，煙草-衍生的細(xì)胞和浮萍(lemnaminor)-衍生的細(xì)胞?？梢詮倪@些細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織，產(chǎn)生公開內(nèi)容a或b的抗體?；谡婢?xì)胞的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)包括使用酵母細(xì)胞的那些，例如，酵母屬的細(xì)胞如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和栗酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；和絲狀真菌的細(xì)胞，例如，曲霉屬如黑曲霉(aspergillusniger)。當(dāng)使用原核細(xì)胞時，可以使用基于細(xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)?；诩?xì)菌細(xì)胞的生產(chǎn)系統(tǒng)包括，例如，使用枯草桿菌(bacillussubtilis)以及大腸桿菌的那些。為了使用宿主細(xì)胞生產(chǎn)公開內(nèi)容a或b的抗體，將宿主細(xì)胞用含有編碼公開內(nèi)容a或b的抗體的核酸的表達載體轉(zhuǎn)化并培養(yǎng)以表達核酸。例如，當(dāng)動物細(xì)胞用作宿主時，培養(yǎng)基可以包括，例如，dmem，mem，rpmi1640，和imdm，其可以適當(dāng)與血清補充物如fbs或胎牛血清(fcs)組合使用。備選地，細(xì)胞可以無血清培養(yǎng)。另一方面，動物或植物可以用于體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)來生產(chǎn)公開內(nèi)容a或b的抗體，例如，可以將編碼公開內(nèi)容a或b的抗體的一種或多種核酸引入所述動物或植物，體內(nèi)產(chǎn)生抗體，并且可以隨后從動物或植物收集抗體。當(dāng)動物用作宿主時，使用哺乳動物或昆蟲的生產(chǎn)系統(tǒng)是可用的。優(yōu)選的哺乳動物包括，但不限于，山羊，豬，綿羊，小鼠，和牛(vickiglaser，spectrumbiotechnologyapplications(1993))。也可以使用轉(zhuǎn)基因動物。在一個實例中，制備編碼公開內(nèi)容a或b的抗體的核酸作為與編碼特異包括在乳汁中的多肽，如山羊β-酪蛋白的基因的融合基因。然后，將山羊胚胎用含有融合基因的寡核苷酸片段注射并移植入雌性山羊。目標(biāo)抗體可以從由轉(zhuǎn)基因山羊(其由接受胚胎的山羊生出)或其后代產(chǎn)生的乳汁獲得?？梢詫⒓に剡m當(dāng)施用給轉(zhuǎn)基因山羊以增加山羊產(chǎn)生的含有抗體的乳汁的量(ebert等人，bio/technology12：699-702(1994))。用于產(chǎn)生公開內(nèi)容a或b的抗體的昆蟲包括，例如，蠶。當(dāng)使用蠶時，其病毒基因組中插入有編碼目標(biāo)抗體的寡核苷酸的桿狀病毒用于感染蠶。目標(biāo)抗體可以獲自研究的蠶的體液(susumu等人，nature315：592-594(1985))。當(dāng)植物用于產(chǎn)生公開內(nèi)容a或b的抗體時，可以使用煙草。當(dāng)使用煙草時，由于將編碼目標(biāo)抗體的寡核苷酸插入植物表達載體，例如，pmon530得到的重組載體可以引入細(xì)菌如根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)。可以將得到的細(xì)菌用于感染煙草，例如，煙草(nicotianatabacum)(ma等人，eur.j.immunol.24：131-138(1994))并且從感染的煙草的葉獲得所需抗體。所述修飾的細(xì)菌也可以用于感染浮萍(lemnaminor)，并且從感染的浮萍的克隆的細(xì)胞獲得所需抗體(cox等人nat.biotechnol.24(12)：1591-1597(2006))。為了將在宿主細(xì)胞中表達的抗體分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔，到周質(zhì)空間或到胞外環(huán)境，適當(dāng)?shù)姆置谛盘柨梢哉先胙芯康亩嚯闹?。所述信號可以是目?biāo)抗體內(nèi)源的或可以是本領(lǐng)域中已知的外源信號。如上文所述生產(chǎn)的公開內(nèi)容a或b的抗體可以分離自宿主細(xì)胞或宿主的內(nèi)部或外部(如培養(yǎng)基和乳汁)，并且純化為基本上純的和勻質(zhì)的抗體?？贵w可以，例如，通過適當(dāng)選擇和組合色譜柱，過濾，超濾，鹽析，溶劑沉淀，溶劑萃取，蒸餾，免疫沉淀，sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦，透析，重結(jié)晶等適當(dāng)分離和純化。色譜包括，例如，親和色譜，離子交換色譜，疏水色譜，凝膠過濾色譜，反相色譜，和吸附色譜。所述色譜可以例如，通過使用液相色譜如hplc和fplc進行。用于親和色譜的柱可以是蛋白a柱或蛋白g柱。蛋白a柱包括，例如，hyperd，poros，sepharosef.f.(pharmacia)。如果需要，可以修飾抗體或肽可以在抗體純化前或后用適當(dāng)?shù)牡鞍仔揎椕柑幚砜贵w而部分缺失。對于此種蛋白修飾酶，例如，可以使用胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，蛋白激酶和葡糖苷酶。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及產(chǎn)生含有其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，所述方法可以包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞或養(yǎng)育宿主并從這些細(xì)胞的培養(yǎng)物，從宿主分泌的物質(zhì)，或通過本領(lǐng)域已知其他方式收集抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a涉及生產(chǎn)方法，其包括選自由以下組成的組的一個或多個步驟：(a)選擇能夠促進從血漿去除抗原的抗體；(b)選擇具有增強的對胞外基質(zhì)的結(jié)合活性的抗體；(c)選擇在中性ph條件下具有增強的fcγr-結(jié)合活性的抗體；(d)選擇在中性ph條件下具有增強的fcγriib-結(jié)合活性的抗體；(e)選擇具有保持的或增強的fcγriib-結(jié)合活性和減小的對選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib，和fcγriia組成的組的一種或多種激活性fcγr的結(jié)合活性的抗體；(f)選擇在中性ph條件下具有增強的fcrn-結(jié)合活性的抗體；(g)選擇具有pi的抗體；(h)確認(rèn)收集的抗體的pi，并且隨后選擇具有提高的pi的抗體；和(i)選擇與參照抗體相比其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變或增加的抗體。本文中，參照抗體包括，但不限于，天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)和修飾前的抗體(文庫構(gòu)建前或期間的抗體，例如，增加其pi前的離子濃度-依賴性抗體，或賦予離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域前具有提高的pi的抗體)。產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體后，可以通過抗體藥代動力學(xué)測定，使用如小鼠，大鼠，兔，狗，猴，人的血漿，評估得到的抗體，以選擇與參照抗體相比具有增強的從血漿的抗原去除的抗體。備選地，在產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體后，可以將得到的抗體與參照抗體就胞外基質(zhì)結(jié)合能力而言，通過電化學(xué)發(fā)光等進行比較，以選擇具有增加的對胞外基質(zhì)的結(jié)合的抗體。備選地，在產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體之后，可以將得到的抗體與參照抗體就在中性ph條件下對各種fcγr的結(jié)合活性而言，使用biacore(注冊商標(biāo))等進行比較，以選擇在中性ph條件下具有增加的對各種fcγr的結(jié)合活性的抗體。在該情況下，各種fcγrs可以是一種研究的fcγr，例如，fcγriib。類似地，還可能選擇其fcγriib-結(jié)合活性(在中性ph條件下)被保持或增加并且其對選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib和fcγriia等組成的組的一種或多種激活性fcγr的結(jié)合活性降低的抗體。在該情況下，fcγr可以是fcγr。備選地，在產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體之后，可以將得到的抗體與參照抗體就在中性ph條件下的fcrn-結(jié)合活性而言，使用biacore等已知技術(shù)進行比較，以選擇在中性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性的抗體。在該情況下，fcrn可以是人fcrn。備選地，在產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體之后，通過等電聚焦等評價得到的抗體的pi，選擇與參照抗體相比具有提高的pi的抗體。在該情況下，可能選擇其pi值增加，例如，至少0.01，0.03，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，或0.5或更多，或至少0.6，0.7，0.8，或0.9或更多的抗體；或其pi值增加至少1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，或1.5或更多，或至少1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，或2.5或更多，或3.0或更多的抗體。備選地，在產(chǎn)生公開內(nèi)容a的抗體之后，可以將得到的抗體與參照抗體就對所需抗原在低和高離子濃度條件下的結(jié)合活性而言，使用biacore等進行比較，以選擇其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變或增加的抗體。離子濃度可以是，例如，氫離子濃度或金屬離子濃度。當(dāng)離子濃度是金屬離子濃度時，其可以是例如，鈣離子濃度。結(jié)合活性是否改變或增加可以基于以下的存在評估，例如：(a)改變的或增強的細(xì)胞對抗原的攝?。?b)改變或增加的多次結(jié)合不同抗原分子的能力；(c)改變的或增強的血漿中抗原濃度的降低；或(d)改變的抗體的血漿保留。備選地，如果需要，這些選擇方法中的任意兩個或更多個可以適當(dāng)組合。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及用于產(chǎn)生或篩選含有其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變并且其pi通過修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基而提高的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體("具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體")的方法。所述生產(chǎn)方法可以，例如，通過根據(jù)需要適當(dāng)組合，本文中公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)所述的相關(guān)實施方案，例如，用于產(chǎn)生或篩選上述具有提高的pi的抗體的方法的實施方案，以及用于產(chǎn)生或篩選上述其抗原結(jié)合活性在高鈣離子濃度條件下比在低鈣離子濃度條件下高的鈣離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子濃度-依賴性抗體，或其文庫的方法的實施方案和/或用于產(chǎn)生或篩選上述其抗原結(jié)合活性在中性ph條件下比在酸性ph條件下高的ph-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ph-依賴性抗體，或其文庫的方法的實施方案進行。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a提供用于產(chǎn)生或篩選含有其胞外基質(zhì)結(jié)合活性增加的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，其中其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變并且其pi通過修飾可能暴露在抗體表面上的至少一個氨基酸殘基增加("具有提高的pi的離子濃度-依賴性抗體")。在該方法中可以考慮離子濃度-依賴性抗體的pi的增加。所述方法可以，例如，通過根據(jù)需要適當(dāng)組合，本文公開內(nèi)容a的范圍內(nèi)所述的相關(guān)實施方案，例如，用于產(chǎn)生或篩選上述具有提高的pi的抗體的方法的實施方案，以及用于產(chǎn)生或篩選上述其抗原結(jié)合活性在高鈣離子濃度條件下比在低鈣離子濃度條件下高的鈣離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子濃度-依賴性抗體，或其文庫的方法的實施方案和/或用于產(chǎn)生或篩選上述其抗原結(jié)合活性在中性ph條件下比在酸性ph條件下高的ph-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或ph-依賴性抗體，或其文庫的方法的實施方案來進行。例如，可以將得到的抗體與參照抗體就胞外基質(zhì)結(jié)合能力方面、通過電化學(xué)發(fā)光等已知技術(shù)進行比較以選擇具有增加的胞外基質(zhì)結(jié)合的抗體。本文中，參照抗體可以包括，但不限于，天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)和修飾前的抗體(文庫構(gòu)建前或期間的抗體，例如，其pi提高前的離子濃度-依賴性抗體或賦予其離子濃度-依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域前具有提高的pi的抗體)。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及產(chǎn)生包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，其中所述方法包括修飾可能暴露在抗體表面的至少一個氨基酸殘基從而提高等電點(pi)。在一些實施方案中，氨基酸殘基修飾包含選自由以下組成的組的修飾：(a)用不帶電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；(b)用帶正電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；和(c)用帶正電的氨基酸殘基置換不帶電的氨基酸殘基。在一些實施方案中，至少一個修飾的氨基酸殘基用組氨酸置換。在另一個實施方案中，抗體包含可變區(qū)和/或恒定區(qū)，并且可變區(qū)和/或恒定區(qū)中的氨基酸殘基被修飾。在另一個實施方案中，根據(jù)所述方法修飾的至少一個氨基酸殘基在cdr或fr中選自由以下組成的組的位置：(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，5，8，10，12，13，15，16，18，19，23，25，26，39，41，42，43，44，46，68，71，72，73，75，76，77，81，82，82a，82b，83，84，85，86，105，108，110，和112；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置1，3，7，8，9，11，12，16，17，18，20，22，37，38，39，41，42，43，45，46，49，57，60，63，65，66，68，69，70，74，76，77，79，80，81，85，100，103，105，106，107，和108；和(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56(根據(jù)kabat編號)。在另一個實施方案中，根據(jù)所述方法修飾的至少一個氨基酸殘基在cdr或fr中選自由以下組成的組的位置：(a)重鏈可變區(qū)的fr中的位置8，10，12，13，15，16，18，23，39，41，43，44，77，82，82a，82b，83，84，85，和105；(b)重鏈可變區(qū)的cdr中的位置31，61，62，63，64，65，和97；(c)輕鏈可變區(qū)的fr中的位置16，18，37，41，42，45，65，69，74，76，77，79，和107；和(d)輕鏈可變區(qū)的cdr中的位置24，25，26，27，52，53，54，55，和56。在一些實施方案中，抗原是可溶性抗原。在一些實施方案中，所述方法還包括比較根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體對于其相應(yīng)抗原在酸性ph(例如，ph5.8)和中性ph(例如，ph7.4)的kd。在另一個實施方案中，所述方法包括選擇對抗原具有2或更高的kd(酸性ph范圍(例如，ph5.8))/kd(中性ph范圍(例如，ph7.4))的抗體。在一些實施方案中，所述方法還包括比較根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體在高離子濃度(例如，氫離子或鈣離子濃度)和低離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇在高離子濃度下比在低離子濃度下具有更高抗原結(jié)合活性(例如，2-倍)的抗體。在一些實施方案中，在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，高鈣離子濃度可以在100μm至10mm之間，在200μm至5mm之間，在400μm至3mm之間，在200μm至2mm之間，或在400μm至1mm之間選擇。選擇在500μm至2.5mm之間的濃度(其接近體內(nèi)鈣離子的血漿(血液)濃度)，可以是優(yōu)選的。在一些實施方案中，低鈣離子濃度可以在0.1μm至30μm之間，在0.2μm至20μm之間，在0.5μm至10μm之間，或在1μm至5μm之間，或在2μm至4μm之間選擇。選擇在1μm至5μm之間的濃度(其接近體內(nèi)早期內(nèi)體中鈣離子的濃度)也可以是優(yōu)選的。在一些實施方案中，kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)(例如，kd(3μmca)/kd(2mmca))值的下限是2或更多，10或更多，或40或更多，并且其上限是400或更少，1000或更少，或10000或更少。在備選的一些實施方案中，kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)(例如，kd(3μmca)/kd(2mmca))值的下限是2或更多，5或更多，10或更多，或30或更多，并且其上限是50或更少，100或更少，或200或更少。在一些實施方案中，在離子濃度是氫離子濃度的情況下，低氫離子濃度(中性ph范圍)可以選自ph6.7至ph10.0，ph6.7至ph9.5，ph7.0至ph9.0，或ph7.0至ph8.0。低氫離子濃度可以優(yōu)選是ph7.4，其接近于體內(nèi)血漿(血液)ph，但為了方便測量，可以使用例如，ph7.0。在一些實施方案中，高氫離子濃度(酸性ph范圍)可以選自ph4.0至ph6.5，ph4.5至ph6.5，ph5.0至ph6.5，或ph5.5至ph6.5。酸性ph范圍可以優(yōu)選是ph5.8，其接近于早期內(nèi)體中體內(nèi)氫離子濃度，但為了方便測量，例如，可以使用ph6.0。在一些實施方案中，kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)(例如，kd(ph5.8)/kd(ph7.4))的下限是2或更多，10或更多，或40或更多，并且其上限是400或更少，1000或更少，或10000或更少。在一些實施方案中，所述方法還包括與當(dāng)施用區(qū)別僅在于其不包括根據(jù)本方法引入的一個或多個修飾的參照抗體時相比，比較在施用根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體后抗原從血漿的去除。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與不含有根據(jù)本方法引入的修飾的抗體相比，促進從血漿去除抗原(例如，2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述方法還包括與區(qū)別僅在于其不包括根據(jù)本方法引入的一個或多個修飾的抗體相比，比較根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與區(qū)別僅在于其不包括根據(jù)本方法引入的一個或多個修飾的抗體相比，具有增加的胞外基質(zhì)結(jié)合(例如，當(dāng)結(jié)合抗原時2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在另一個實施方案中，當(dāng)與修飾或改變至少一個氨基酸殘基以提高pi前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)或參照抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體))相比時，根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體(基本上)保留抗原結(jié)合活性。在該情況下，"以(基本上)保留抗原結(jié)合活性"可以意為與修飾或改變前的抗體的結(jié)合活性相比，具有至少50％或更多，優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選70％或75％或更多，并且還更優(yōu)選80％，85％，90％，或95％或更多的活性。在另外的實施方案中，公開內(nèi)容a涉及用于生產(chǎn)包含其抗原結(jié)合活性根據(jù)離子濃度條件而改變的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的方法，其中所述方法包括修飾可能暴露在抗體的恒定區(qū)的表面的至少一個氨基酸殘基從而提高等電點(pi)。在一些實施方案中，氨基酸殘基修飾包含選自由以下組成的組的修飾：(a)用不帶電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；(b)用帶正電的氨基酸殘基置換帶負(fù)電的氨基酸殘基；和(c)用帶正電的氨基酸殘基置換不帶電的氨基酸殘基。在一些實施方案中，至少一個修飾的氨基酸殘基用組氨酸置換。在另一個實施方案中，抗體包含可變區(qū)和/或恒定區(qū)，并且可變區(qū)和/或恒定區(qū)中的氨基酸殘基被修飾。在另一個實施方案中，根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置處：位置196，253，254，256，258，278，280，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443(根據(jù)eu編號)。在另一個實施方案中，根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置處：位置254，258，281，282，285，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，384，385，386，387，389，399，400，401，402，413，418，419，421，433，434，和443(根據(jù)eu編號)。在另一個實施方案中，根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在恒定區(qū)中選自由以下組成的組的位置處：位置282，309，311，315，342，343，384，399，401，402，和413(根據(jù)eu編號)。在一些實施方案中，所述方法還包括比較根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體在高離子濃度(例如，氫離子或鈣離子濃度)和低離子濃度條件的抗原結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇在高離子濃度比在低離子濃度具有更高抗原結(jié)合活性的抗體。在一些實施方案中，所述方法包括與當(dāng)施用區(qū)別僅在于其不包含根據(jù)本發(fā)明引入的一個或多個修飾的參照抗體相比，比較在施用根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體后抗原從血漿的去除。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與不含有根據(jù)本發(fā)明引入的修飾的抗體相比，促進從血漿去除抗原(例如，2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述方法包括與區(qū)別僅在于其不包括根據(jù)本發(fā)明引入的一個或多個修飾的抗體相比，比較根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與區(qū)別僅在于其不包含根據(jù)本發(fā)明引入的一個或多個修飾的抗體相比，具有增加的胞外基質(zhì)結(jié)合(例如，當(dāng)結(jié)合于抗原時2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述方法包括比較在中性ph(例如，ph7.4)根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體與包含天然igg的恒定區(qū)的參照抗體的fcγ受體(fcγr)-結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法包括選擇與包含天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比在中性ph(例如，ph7.4)具有增強的fcγr-結(jié)合活性的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，選擇的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體在中性ph下具有增強的fcγriib結(jié)合活性。在一些實施方案中，選擇的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體對優(yōu)選選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib和fcγriia組成的組的一種或多種激活性fcγr，和對fcγriib具有結(jié)合活性，并且與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，任選地所述fcγriib-結(jié)合活性被保持或增強，并且對激活性fcγr的結(jié)合活性降低。在一些實施方案中，所述方法還包括與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，比較根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體在中性ph條件下的fcrn-結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，在中性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性(例如，2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，當(dāng)與修飾或改變至少一個氨基酸殘基以提高pi前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)或參照抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體))相比時，根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體(基本上)保留抗原結(jié)合活性。在該情況下，"以(基本上)保留抗原結(jié)合活性"可以意為與修飾或改變前的抗體的結(jié)合活性相比，具有至少50％或更多，優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選70％或75％或更多，并且還更優(yōu)選80％，85％，90％，或95％或更多的活性。在另外的實施方案中，所述方法包括修飾可能暴露抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)的表面的至少一個氨基酸殘基從而提高等電點(pi)。在另一個實施方案中，根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在上文公開的恒定區(qū)中的位置中。在另一個實施方案中，根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在上文公開的可變區(qū)中的位置中。在另一個實施方案中，根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在上文公開的恒定區(qū)中的位置中并且根據(jù)本方法修飾的至少一個氨基酸殘基在上文公開的可變區(qū)中的位置中。在一些實施方案中，抗原是可溶性抗原。在一些實施方案中，所述方法還包括比較根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體對其相應(yīng)抗原在酸性ph(例如，ph5.8)和中性ph(例如，ph7.4)中的kd。在另一個實施方案中，所述方法包括選擇對抗原具有2或更高的kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)的抗體。在一些實施方案中，所述方法還包括比較根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體在高離子濃度(例如，氫離子或鈣離子濃度)條件和低離子濃度條件下的抗原結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇在高離子濃度比在低離子濃度具有更高抗原結(jié)合活性的抗體。在一些實施方案中，在離子濃度是鈣離子濃度的情況下，高鈣離子濃度可以在100μm至10mm之間，在200μm至5mm之間，在400μm至3mm之間，在200μm至2mm之間，或在400μm至1mm之間選擇。在500μm至2.5mm之間選擇的濃度也可以是優(yōu)選的。在一些實施方案中，低鈣離子濃度可以在0.1μm至30μm之間，在0.2μm至20μm之間，在0.5μm至10μm之間，或在1μm至5μm之間或在2μm至4μm之間選擇。在1μm至5μm之間選擇的濃度也可以是優(yōu)選的。在一些實施方案中，kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)(例如，kd(3μmca)/kd(2mmca))值的下限是2或更多，10或更多，或40或更多，并且其上限是400或更少，1000或更少，或10000或更少。在備選的一些實施方案中，kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)(例如，kd(3μmca)/kd(2mmca))值的下限是2或更多，5或更多，10或更多，或30或更多，并且其上限是50或更少，100或更少，或200或更少。在一些實施方案中，在離子濃度是氫離子濃度的情況下，低氫離子濃度(中性ph范圍)可以選自ph6.7至ph10.0，ph6.7至ph9.5，ph7.0至ph9.0，或ph7.0至ph8.0。低氫離子濃度可以優(yōu)選是ph7.4，其接近于體內(nèi)血漿(血液)中的ph，但為了方便測量，例如，可以使用ph7.0。在一些實施方案中，高氫離子濃度(酸性ph范圍)可以選自ph4.0至ph6.5，ph4.5至ph6.5，ph5.0至ph6.5，或ph5.5至ph6.5。例如酸性ph范圍可以是ph5.8或ph6.0。在一些實施方案中，kd(酸性ph范圍)/kd(中性ph范圍)(例如，kd(ph5.8)/kd(ph7.4))的下限是2或更多，10或更多，或40或更多，并且其上限是400或更少，1000或更少，或10000或更少。在一些實施方案中，所述方法還包括與當(dāng)施用區(qū)別僅在于其不包含根據(jù)本發(fā)明引入的一個或多個修飾的參照抗體時相比，比較在施用根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體后抗原從血漿的去除。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與不含有根據(jù)本發(fā)明引入的修飾的抗體相比，促進抗原從血漿的去除(例如，2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述方法還包括與區(qū)別僅在于其不包括根據(jù)本發(fā)明引入的一個或多個修飾的抗體相比，比較根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與區(qū)別僅在于其不包含根據(jù)本發(fā)明引入的一個或多個修飾的抗體相比，具有增加的胞外基質(zhì)結(jié)合(例如，當(dāng)與抗原復(fù)合時5-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述方法還包括比較根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體與包含天然igg的恒定區(qū)的參照抗體在中性ph(例如，ph7.4)的fcγ受體(fcγr)-結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法包括選擇與包含天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，在中性ph(例如，ph7.4)具有增強的fcγr-結(jié)合活性的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，選擇的根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體在中性ph具有增強的fcγriib結(jié)合活性。在一些實施方案中，選擇的根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體對優(yōu)選選自由fcγria，fcγrib，fcγric，fcγriiia，fcγriiib和fcγriia組成的組的一種或多種激活性fcγr，和對fcγriib具有結(jié)合活性，并且與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，任選地fcγriib-結(jié)合活性被保持或增強并且對激活性fcγr的結(jié)合活性降低。在一些實施方案中，所述方法還包括與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，比較根據(jù)本方法產(chǎn)生的抗體在中性ph條件下的fcrn-結(jié)合活性。在另一個實施方案中，所述方法還包括選擇與區(qū)別僅在于其恒定區(qū)是天然igg的恒定區(qū)的參照抗體相比，在中性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性(例如，2-倍)的根據(jù)所述方法產(chǎn)生的抗體。在另一個實施方案中，當(dāng)與修飾或改變至少一個氨基酸殘基以提高pi前的抗體(天然抗體(例如，天然ig抗體，優(yōu)選天然igg抗體)或參照抗體(例如，抗體修飾，或文庫構(gòu)建之前或期間的抗體))相比時，根據(jù)本方法產(chǎn)生抗體(基本上)保留抗原結(jié)合活性。在該情況下，"以(基本上)保留抗原結(jié)合活性"可以意為與修飾或改變前的抗體的結(jié)合活性相比，具有至少50％或更多，優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選70％或75％或更多，并且還更優(yōu)選80％，85％，90％，或95％或更多的活性。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及通過上述公開內(nèi)容a的方法獲得的抗體，其用于產(chǎn)生或篩選抗體。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容a涉及包含上述公開內(nèi)容a的抗體的組合物或藥物組合物。在一個實施方案中，公開內(nèi)容a的藥物組合物可以是用于加速抗原從受試者的生物流體(優(yōu)選，血漿，等)去除和/或用于增加胞外基質(zhì)結(jié)合(當(dāng)公開內(nèi)容a的抗體施用于(應(yīng)用于)受試者(優(yōu)選，體內(nèi)))的藥物組合物。公開內(nèi)容a的藥物組合物可以任選地含有藥用載體。本文中，藥物組合物可以通常指用于治療、預(yù)防、診斷或檢查疾病的藥劑。公開內(nèi)容a組合物或藥物組合物可以適當(dāng)配置。在一些實施方案中，它們可以腸胃外，例如，以在水或任意其他藥用液體中的無菌溶液或混懸液的形式施用。組合物可以通過適當(dāng)與藥用載體或介質(zhì)組合，以通?？山邮艿乃帉W(xué)實踐所需的單位劑量適當(dāng)配制。所述藥用載體或介質(zhì)包括，但不限于，無菌水，生理鹽水，植物油，乳化劑，懸浮劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑，賦形劑，媒介物，防腐劑和粘合劑。組合物中活性成分的量可以以落在適當(dāng)?shù)念A(yù)先確定的范圍內(nèi)的劑量的方式調(diào)節(jié)。在一些實施方案中，公開內(nèi)容a的組合物或藥物組合物可以腸胃外施用。組合物或藥物組合物可以適當(dāng)制備為，例如，可注射、經(jīng)鼻、經(jīng)肺或經(jīng)皮組合物。組合物或藥物組合物可以全身或局部施用，例如，通過靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射施用。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容提供其pi通過修飾可能暴露在表面的至少一個氨基酸殘基而提高的抗體(具有提高的pi的抗體)；產(chǎn)生這些抗體的方法；或這些抗體增強抗原從血漿的去除(當(dāng)將抗體體內(nèi)施用于受試者時)的用途?？梢岳斫?，本文所述的公開內(nèi)容a的范圍和本文相應(yīng)實施例中所述的內(nèi)容可以適當(dāng)用于該實施方案。在其他實施方案中，本公開內(nèi)容提供其pi通過修飾可能暴露在表面的至少一個氨基酸殘基減小的抗體("具有降低的pi的抗體")；產(chǎn)生這些抗體的方法；或這些抗體改善血漿保留(當(dāng)將抗體體內(nèi)施用于受試者時)的用途。本發(fā)明人揭示了，抗體的細(xì)胞內(nèi)化可以通過將特定氨基酸突變引入恒定區(qū)的氨基酸序列中的特定位點增加其pi而增強。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，由于通過將具有不同側(cè)鏈電荷性質(zhì)的氨基酸引入上述位點導(dǎo)致pi降低從而抑制抗體的細(xì)胞內(nèi)化，抗體血漿保留可以延長?？梢岳斫猓疚乃龅墓_內(nèi)容a的范圍和本文的相應(yīng)實施例中所述的內(nèi)容可以適當(dāng)應(yīng)用于所述實施方案。在一個實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于產(chǎn)生修飾的抗體(與抗體修飾前相比其在血漿中的半衰期延長或降低)的方法，其中所述方法包括：(a)修飾編碼修飾前的抗體的核酸，以改變位于選自由以下組成的組的位置的至少一個氨基酸殘基的電荷：位置196，253，254，256，257，258，278，280，281，282，285，286，306，307，308，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，388，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443(根據(jù)eu編號)；(b)培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達修飾的核酸并產(chǎn)生抗體；和(c)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中收集產(chǎn)生的抗體。另外的實施方案提供延長或降低抗體在血漿中的半衰期的方法，其中所述方法包括修飾位于選自由以下組成的組的位置的至少一個氨基酸殘基：位置196，253，254，256，257，258，278，280，281，282，285，286，306，307，308，309，311，315，327，330，342，343，345，356，358，359，361，362，373，382，384，385，386，387，388，389，399，400，401，402，413，415，418，419，421，424，430，433，434，和443(根據(jù)eu編號)。這些方法還可以包含確定與抗體修飾前相比，收集的和/或修飾的抗體在血漿的半衰期延長或降低。電荷的改變可以通過一個或多個氨基酸置換實現(xiàn)。在一些實施方案中，一個或多個置換的氨基酸殘基可以選自由以下組(a)和(b)的氨基酸殘基組成的組，但不限于其中：(a)glu(e)和asp(d)；以及(b)lys(k)，arg(r)和his(h)。在一些實施方案中，抗體可以是ig-型抗體如igg抗體。在一些實施方案中，抗體可以是嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體。在一些實施方案中，抗體可以是多特異性抗體如雙特異性抗體。公開內(nèi)容b在非限制性實施方案中，公開內(nèi)容b涉及fc區(qū)變體，其用途和其生產(chǎn)方法。在本文所述的公開內(nèi)容a和b范圍內(nèi)，"fc區(qū)變體"可以指，例如，通過用另一氨基酸修飾至少一個氨基酸從天然igg抗體的fc區(qū)修飾的fc區(qū)，或可以指通過用另一氨基酸另外修飾至少一個氨基酸從所述fc區(qū)變體修飾的fc區(qū)。本文中，所述fc區(qū)變體不僅包括引入有氨基酸修飾的fc區(qū)，而且也包括含有與前述fc區(qū)相同的氨基酸序列的fc區(qū)。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b涉及含有fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體，其在位置434處含有ala；在位置438處含有g(shù)lu，arg，ser，和lys中的任一種；并且在位置440處含有g(shù)lu，asp，和gln中的任一種(根據(jù)eu編號)(在本文所述的公開內(nèi)容b的范圍內(nèi)，為了描述的目的，所述fc區(qū)變體也稱為"新fc區(qū)變體")。在實踐中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體可以實際上結(jié)合在任意抗體(例如，多特異性抗體如雙特異性抗體)中，不論靶抗原的類型如何。例如，抗-因子ixa/因子x雙特異性抗體可以使用實施例20中所示的fc區(qū)變體產(chǎn)生(例如，f8m-f1847mv[f8m-f1847mv1(seqidno：323)和f8m-f1847mv2(seqidno：324)作為重鏈以及f8ml(seqidno：325)作為輕鏈]；f8m-f1868mv[f8m-f1868mv1(seqidno：326)和f8m-f1868mv2(seqidno：327)作為重鏈以及f8ml(seqidno：325)作為輕鏈]；和f8m-f1927mv[f8m-f1927mv1(seqidno：328)和f8m-f1927mv2(seqidno：329)作為重鏈以及f8ml(seqidno：325)作為輕鏈])。如上文所述的，wo2013/046704報道了，引入有突變以增加其在酸性條件下的fcrn結(jié)合(與具體突變的組合(代表性的實例是雙-殘基突變q438r/s440e(根據(jù)eu編號)))的fc區(qū)變體呈現(xiàn)顯著降低的對類風(fēng)濕因子的結(jié)合。然而，wo2013/046704未描述，由于q438r/s440e修飾其類風(fēng)濕因子結(jié)合降低的fc區(qū)變體與具有天然fc區(qū)的抗體相比在血漿保留方面更優(yōu)。因此，存在對安全和更有利的允許改善的血漿保留、但不結(jié)合預(yù)先存在的ada的fc區(qū)變體的需要。本發(fā)明人在本文中公開了允許改善的血漿保留、但不結(jié)合抗藥物抗體(預(yù)先存在的ada，等)的安全和更有利的fc區(qū)變體。尤其是，本文首先公開了，出人意料地，含有組合的氨基酸殘基突變(其是用ala(a)置換根據(jù)eu編號在位置434的氨基酸和具體的雙-殘基突變(代表性的實例是q438r/s440e))的fc區(qū)變體，對于延長抗體在血漿中的保留，同時保持顯著降低的對類風(fēng)濕因子的結(jié)合是優(yōu)選的。因此，本文中公開的公開內(nèi)容b的新fc區(qū)變體相對于wo2013/046704(其通過參考以其整體結(jié)合于本文)中所述的fc區(qū)變體提供有利和出人意料的改善。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b提供fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸置換的新組合，其增加抗體在酸性ph范圍內(nèi)和在中性ph范圍內(nèi)，尤其是，在酸性ph范圍內(nèi)的fcrn-結(jié)合活性。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體含有在位置434處的ala；在位置438處glu，arg，ser，和lys中的任一個；和在位置440處glu，asp，和gln中的任一個(根據(jù)eu編號)；并且更優(yōu)選含有在位置434處的ala；在位置438處的arg或lys；和在位置440處的glu或asp(根據(jù)eu編號)。優(yōu)選，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體另外含有在位置428處的ile或leu，和/或在位置436處ile，leu，val，thr，和phe中的任一個(根據(jù)eu編號)。更優(yōu)選，fc區(qū)變體含有在位置428處的leu，和/或在位置436處的val或thr(根據(jù)eu編號)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體可以是天然ig抗體的fc區(qū)變體，并且更優(yōu)選是天然igg(igg1，igg2，igg3，或igg4型)抗體的fc區(qū)變體。天然fc區(qū)在本文中部分在公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)描述。更具體而言，在公開內(nèi)容b中，天然fc區(qū)可以指未修飾或天然存在的fc區(qū)，并且優(yōu)選，天然ig抗體(其fc區(qū)氨基酸殘基保持未修飾)的未修飾或天然存在的fc區(qū)。fc區(qū)的抗體來源可以是ig如igm或igg，例如，人igg1，igg2，igg3，或igg4。在一個實施方案中，其可以是人igg1。同時，包含天然fc區(qū)的(參照)抗體可以指包含未修飾或天然存在的fc區(qū)的抗體。位置428，434，438，和440對于所有天然人igg1，igg2，igg3，和igg4抗體的fc區(qū)是共同的。然而，在fc區(qū)的位置436，天然人igg1，igg2，和igg4抗體共有tyr(y)，而天然人igg3抗體具有phe(f)。另一方面，stapleton等人(naturecomm.599(2011)報道，含有根據(jù)eu編號r435h的氨基酸置換的人igg3同種異型具有與igg1相當(dāng)?shù)脑谌酥械难獫{半衰期。因此，本發(fā)明人還認(rèn)為，血漿保留可以通過引入與位置436處的氨基酸置換組合的r435h氨基酸置換而增加在酸性條件下的fcrn結(jié)合來改善。wo2013/046704還具體報道了雙氨基酸殘基置換q438r/s440e，q438r/s440d，q438k/s440e，和q438k/s440d(根據(jù)eu編號)，當(dāng)與在酸性條件下可以增加fcrn結(jié)合的氨基酸置換組合時導(dǎo)致類風(fēng)濕因子結(jié)合的顯著降低。因此，在優(yōu)選的實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以含有選自由以下組成的組的置換的氨基酸位置的組合：(a)n434a/q438r/s440e；(b)n434a/q438r/s440d；(c)n434a/q438k/s440e；(d)n434a/q438k/s440d；(e)n434a/y436t/q438r/s440e；(f)n434a/y436t/q438r/s440d；(g)n434a/y436t/q438k/s440e；(h)n434a/y436t/q438k/s440d；(i)n434a/y436v/q438r/s440e；(j)n434a/y436v/q438r/s440d；(k)n434a/y436v/q438k/s440e；(l)n434a/y436v/q438k/s440d；(m)n434a/r435h/f436t/q438r/s440e；(n)n434a/r435h/f436t/q438r/s440d；(o)n434a/r435h/f436t/q438k/s440e；(p)n434a/r435h/f436t/q438k/s440d；(q)n434a/r435h/f436v/q438r/s440e；(r)n434a/r435h/f436v/q438r/s440d；(s)n434a/r435h/f436v/q438k/s440e；(t)n434a/r435h/f436v/q438k/s440d；(u)m428l/n434a/q438r/s440e；(v)m428l/n434a/q438r/s440d；(w)m428l/n434a/q438k/s440e；(x)m428l/n434a/q438k/s440d；(y)m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；(z)m428l/n434a/y436t/q438r/s440d；(aa)m428l/n434a/y436t/q438k/s440e；(ab)m428l/n434a/y436t/q438k/s440d；(ac)m428l/n434a/y436v/q438r/s440e；(ad)m428l/n434a/y436v/q438r/s440d；(ae)m428l/n434a/y436v/q438k/s440e；(af)m428l/n434a/y436v/q438k/s440d；(ag)l235r/g236r/s239k/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；和(ah)l235r/g236r/a327g/a330s/p331s/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e(根據(jù)eu編號)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以含有選自由以下組成的組的置換氨基酸的組合：(a)n434a/q438r/s440e；(b)n434a/y436t/q438r/s440e；(c)n434a/y436v/q438r/s440e；(d)m428l/n434a/q438r/s440e；(e)m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；(f)m428l/n434a/y436v/q438r/s440e；(g)l235r/g236r/s239k/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；和(h)l235r/g236r/a327g/a330s/p331s/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e(根據(jù)eu編號)。在一個實施方案中，優(yōu)選的是與天然igg的fc區(qū)相比，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的fcrn-結(jié)合活性在酸性ph條件下增加。當(dāng)與天然fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的測量的fcrn-結(jié)合活性(結(jié)合親和力)比較時，fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fcrn-結(jié)合活性(結(jié)合親和力)在ph范圍內(nèi)的增加可以對應(yīng)于測量的fcrn-結(jié)合活性(結(jié)合親和力)的增加。在該情況下，kd(天然fc區(qū))/kd(公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體)(其代表結(jié)合活性(結(jié)合親和力)的差異)，可以是至少1.5-倍，2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，10-倍，15-倍，20-倍，50-倍，70-倍，80-倍，100-倍，500-倍，或1000-倍。這樣的增加可以在酸性ph范圍內(nèi)和/或在中性ph范圍內(nèi)發(fā)生；然而，從公開內(nèi)容b的作用機制的角度，在酸性ph范圍內(nèi)的增加可以是優(yōu)選的。在一些實施方案中，其fcrn-結(jié)合活性在酸性ph范圍內(nèi)增加的公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的fcrn-結(jié)合活性(例如，在ph6.0和25℃)比天然igg的fc區(qū)的高，例如，1.5-倍，2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，6-倍，7-倍，8-倍，9-倍，10-倍，20-倍，30-倍，50-倍，75-倍，100-倍，200-倍，500-倍，1000-倍或更多。在一些實施方案中，fc區(qū)變體在酸性ph范圍內(nèi)增加的fcrn-結(jié)合活性可以比天然igg的fc區(qū)的fcrn-結(jié)合活性高至少5-倍或至少10-倍。通過引入氨基酸置換操作fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以偶爾降低抗體穩(wěn)定性(wo2007/092772)。具有差的穩(wěn)定性的蛋白在儲存期間傾向于容易聚集，并且藥物蛋白的穩(wěn)定性在藥劑的生產(chǎn)中是高度重要的。因此，fc區(qū)中的置換引起的穩(wěn)定性的降低可以導(dǎo)致難以開發(fā)穩(wěn)定抗體制劑(wo2007/092772)。就單體和高分子量物質(zhì)而言，藥物蛋白的純度在開發(fā)藥劑方面也是重要的。在用蛋白a純化后，野生型igg1不含有顯著量的高分子量物質(zhì)，而通過引入置換操作fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以產(chǎn)生大量高分子量物質(zhì)。在該情況下，所述高分子量物質(zhì)可能必須通過純化步驟從藥物中去除?？贵w中的氨基酸置換可以導(dǎo)致消極的結(jié)果，如治療性抗體的免疫原性的增加，其又可以引起細(xì)胞因子風(fēng)暴和/或和抗藥物抗體(adas)的產(chǎn)生。治療性抗體的臨床實用性和有效性可以受adas限制，因為它們影響治療性抗體的功效和藥代動力學(xué)并且有時導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。很多因素影響治療性抗體的免疫原性，并且效應(yīng)t-細(xì)胞表位的存在是因素之一。同樣，針對治療性抗體的預(yù)先存在的抗體的存在也可能是有問題的。所述預(yù)先存在的抗體的實例是類風(fēng)濕因子(rf)，一種針對抗體(即，igg)的fc部分的自身-抗體(針對自體蛋白的抗體)。類風(fēng)濕因子尤其是在患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中發(fā)現(xiàn)。在關(guān)節(jié)炎患者中，rf和igg關(guān)聯(lián)形成免疫復(fù)合物，其促進疾病進程。近來，已經(jīng)報道，具有asn434his突變的人源化抗-cd4igg1抗體誘導(dǎo)顯著的類風(fēng)濕因子結(jié)合(zheng等人，clin.pharmacol.ther.89(2)：283-290(2011))。詳細(xì)的研究確認(rèn)了，與親本人igg1相比，人igg1的asn434his突變增加類風(fēng)濕因子對抗體的fc區(qū)的結(jié)合。rf是針對人igg的多克隆自身-抗體。人igg序列的rf表位在克隆之間變化；然而，rf表位似乎位于ch2/ch3界面區(qū)以及ch3結(jié)構(gòu)域中，其可以與fcrn-結(jié)合表位重疊。因此，突變以增加在中性ph的fcrn-結(jié)合活性可以也可能增加對特定rf克隆的結(jié)合活性。在公開內(nèi)容b的情況下，術(shù)語"抗藥物抗體"或"ada"可以指具有針對位于治療性抗體上的表位的結(jié)合活性并且因此能夠結(jié)合治療性抗體的內(nèi)源性抗體。術(shù)語"預(yù)先存在的抗藥物抗體"或"預(yù)先存在的ada"可以指在向患者施用治療性抗體之前在患者的血液中存在和可檢測的抗藥物抗體。在一些實施方案中，預(yù)先存在的ada是人抗體。在另一個實施方案中，預(yù)先存在的ada是類風(fēng)濕因子。針對預(yù)先存在的ada的抗體fc區(qū)(變體)的結(jié)合活性可以，例如，由在酸性ph和/或在中性ph的電化學(xué)發(fā)光(ecl)反應(yīng)表示。ecl測定，例如，在moxness等人(clinchem.51：1983-1985(2005))和實施例6中描述。測定可以，例如，在mes緩沖液和37℃的條件下進行?？贵w的抗原結(jié)合活性可以，通過例如，biacore(注冊商標(biāo))分析確定。對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性可以在10℃至50℃的任意溫度評估。在一些實施方案中，人fc區(qū)對人預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)在15℃至40℃的溫度，例如，如20℃至25℃，或25℃確定。在另一個實施方案中，人預(yù)先存在的ada和人fc區(qū)之間的相互作用在ph7.4(或ph7.0)和25℃測量。本文所述的公開內(nèi)容b的范圍內(nèi)，對(預(yù)先存在的)ada的結(jié)合活性顯著增加或相當(dāng)?shù)谋硎隹梢砸鉃?，與測量的參照fc區(qū)變體或含有參照fc區(qū)變體的參照抗體的(預(yù)先存在的)ada-結(jié)合活性(結(jié)合親和力)相比，測量的公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體或含有其的抗體的(預(yù)先存在的)ada-結(jié)合活性(結(jié)合親和力)(即，kd)增加，例如，0.55-倍，0.6-倍，0.7-倍，0.8-倍，0.9-倍，1-倍，1.1-倍，1.2-倍，1.3-倍，1.4-倍，1.5-倍，1.6-倍，1.7-倍，1.8-倍，1.9-倍，2-倍，2.1-倍，2.2-倍，或2.3-倍或更多。對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性的該增加可以在個體患者或患者組中觀察到。在一個實施方案中，如在公開內(nèi)容b的情況下使用的，術(shù)語"多個患者"或"一個患者"不受限，并且可以包括正在用治療性抗體治療的患有疾病的所有人?；颊呖梢允腔加凶陨砻庖卟。珀P(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)的人。關(guān)節(jié)炎可以包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在公開內(nèi)容b的一個實施方案中，對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性在個體患者中顯著增加可以意為，當(dāng)與參照抗體對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性相比時，在患者中測量的包含fc區(qū)變體的抗體(例如，治療性抗體)對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％或更多。備選地，這可以意為，抗體的ecl反應(yīng)優(yōu)選高于250，或至少500，或至少1000，或甚至至少2000。優(yōu)選，該增加可以是相對于其ecl反應(yīng)小于500或250的參照抗體的增加。具體而言，在參照抗體對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性和具有fc區(qū)變體的抗體的該結(jié)合活性之間，ecl反應(yīng)優(yōu)選范圍在從小于250至至少250，小于250至至少500，小于500至500或更多，小于500至1000或更多，或比500至至少2000更少，不限于其中。在一個實施方案中，對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性增加可以意為，在患者組中，與對于參照抗體的ecl反應(yīng)為至少500(優(yōu)選，至少250或更多)的患者的比例相比，測量的具有對包含(a)在酸性ph具有增加的對fcrn的結(jié)合活性和(b)在中性ph具有增加的對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性的fc區(qū)變體的抗體的ecl反應(yīng)為至少500(優(yōu)選，至少250)的患者比例升高例如，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％(當(dāng)與對于參照抗體具有ecl反應(yīng)的患者的比例相比較時)。在公開內(nèi)容b的一個實施方案中，對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性降低可以意為，與參照抗體相比，測量的包含fc區(qū)變體的抗體的結(jié)合活性(即，kd或ecl反應(yīng))降低。所述降低可以在個體患者或患者組中觀察到。包含fc區(qū)變體的抗體在中性ph對預(yù)先存在的ada的親和力在每個患者中顯著降低可以意為，與參照抗體對預(yù)先存在的ada的在中性ph測量的結(jié)合活性相比，在患者中測量的在中性ph測量的對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性降低例如，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％。備選地，例如，含有fc區(qū)變體的抗體對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性在個體患者中顯著降低可以意為，與對參照抗體的ecl反應(yīng)相比，曾經(jīng)是500或更多(優(yōu)選，1000或更多，或2000或更多)的對抗體的ecl反應(yīng)被測量為小于500，優(yōu)選小于250。在優(yōu)選的實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體和包含它們的抗體在中性ph對預(yù)先存在的ada具有低結(jié)合活性。具體而言，優(yōu)選的是，與含有天然igg的fc區(qū)的參照抗體對預(yù)先存在的ada在中性ph(例如，ph7.4)的結(jié)合活性相比，含有公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體在中性ph對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性更低或未顯著增加。對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)低或親和力在基線水平可以意為在個體患者中小于500，或小于250的ecl反應(yīng)，但不限于其。例如，對預(yù)先存在的ada的結(jié)合活性在患者組中低可以意為，ecl反應(yīng)在所述組中的90％，優(yōu)選95％，并且更優(yōu)選98％的患者中小于500?？梢詢?yōu)選選擇公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體或含有它們的抗體，其在中性ph對血漿中的(預(yù)先存在的)ada的結(jié)合活性不顯著增加，并且其在中性ph和/或在酸性ph的fcrn-結(jié)合活性增加。優(yōu)選在酸性ph(例如，ph5.8)的fcrn-結(jié)合活性增加。在一個實施方案中，與天然igg的fc區(qū)相比，fc區(qū)變體優(yōu)選在中性ph條件(例如，ph7.4)下不具有顯著增加的對ada的結(jié)合活性，并且ada可以是預(yù)先存在的ada，優(yōu)選類風(fēng)濕因子(rf)。在一個實施方案中，可以優(yōu)選的是，與天然igg的fc區(qū)相比，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體在酸性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性，并且由此，它們呈現(xiàn)降低的在血漿中的清除率(cl)，延長的在血漿中的保留時間，或延長的在血漿中的半衰期(t1/2)。它們的關(guān)聯(lián)在本領(lǐng)域中是已知的。在一個實施方案中，可以優(yōu)選的是，與天然igg的fc區(qū)相比，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體在酸性ph條件下具有增加的fcrn-結(jié)合活性，但在中性ph條件下不具有顯著增加的ada-結(jié)合活性，并且它們呈現(xiàn)降低的在血漿中的清除率(cl)，延長的在血漿中的保留時間，或延長的在血漿中的半衰期(t1/2)。ada可以是預(yù)先存在的ada，優(yōu)選類風(fēng)濕因子(rf)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體是有利的，因為與包含氨基酸置換組合n434y/y436v/q438r/s440e(根據(jù)eu編號)的參照fc區(qū)變體相比，它們的血漿保留得到改善。實施例5至7比較兩種fc區(qū)變體的血漿保留：wo2013/046704中所述的fc區(qū)變體f1718(在四個位點引入突變的fc區(qū)：n434y/y436v/q438r/s440e)和新的fc區(qū)變體f1848m(在四個位點引入突變：n434a/y436v/q438r/s440e)。兩個fc區(qū)變體之間氨基酸突變的差異僅在根據(jù)eu編號位置434處，其中引入的氨基酸突變對于f1718是y(酪氨酸)并且對于f1848m是a(丙氨酸)。盡管如此，當(dāng)與天然igg1比較時，f1848m呈現(xiàn)改善的血漿保留，而f1718在血漿保留方面不顯示此種改善(參見實施例(7-2))。因此，與含有氨基酸置換組合n434y/y436v/q438r/s440e的參照fc區(qū)變體相比，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體可以優(yōu)選具有改善的血漿保留。本文的實施例(5-2)和(7-3)中所述的實驗結(jié)果表明，在多種fc區(qū)變體中，f1847m，f1886m，f1889m，和f1927m比f1848m在血漿保留時間方面進一步改進。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，與含有置換n434y/y436v/q438r/s440e的參照fc區(qū)變體相比，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體(包括f1847m，f1886m，f1889m，或f1927m，以及f1848m)具有改善的血漿保留。對fcγr或補體蛋白的結(jié)合可以也具有不利影響(例如，不適當(dāng)?shù)难“寮せ?。不結(jié)合效應(yīng)受體如fcγriia受體的fc區(qū)變體可以更安全和/或更有利。在一些實施方案中，公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體僅具有弱的效應(yīng)受體-結(jié)合活性或不結(jié)合效應(yīng)受體。效應(yīng)受體的實例包括，激活性fcγr，特別是fcγri，fcγrii，和fcγriii。fcγri包括fcγria，fcγrib，和fcγric，和其亞型。fcγrii包括fcγriia(具有兩個同種異型：r131和h131)和fcγriib。fcγriii包括fcγriiia(其具有兩個同種異型：v158和f158)和fcγriiib(其具有兩個同種異型：fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)。僅具有弱的效應(yīng)受體-結(jié)合活性或不結(jié)合所述受體的抗體包括，例如，含有沉默fc區(qū)的抗體和不具有fc區(qū)的抗體(例如，fab，f(ab)'2，scfv，sc(fv)2，和雙抗體)。僅具有弱的或不具有效應(yīng)受體-結(jié)合活性的fc區(qū)的實例，例如，在strohl等人(curr.op.biotech.20(6)：685-691(2009))中描述，并且具體包括，例如，去糖基化的fc區(qū)(n297a和n297q)，和由操作fc區(qū)以沉默其效應(yīng)子功能(或抑制免疫性)得到的沉默的fc區(qū)(igg1-l234a/l235a，igg1-h268q/a330s/p331s，igg1-c226s/c229s，igg1-c226s/c229s/e233p/l234v/l235a，igg1-l234f/l235e/p331s，igg2-v234a/g237a，igg2-h268q/v309l/a330s/a331s，igg4-l235a/g237a/e318a，和igg4-l236e)。wo2008/092117描述了包含含有置換g236r/l328r，l235g/g236r，n325a/l328r，或n325l/l328r(根據(jù)eu編號)的沉默的fc區(qū)的抗體。wo2000/042072描述包含在位置eu233(根據(jù)eu編號位置233)，eu234，eu235，和eu237的一個或多個處含有置換的沉默的fc區(qū)的抗體。wo2009/011941描述包含缺乏eu231至eu238的殘基的沉默的fc區(qū)的抗體。davis等人(j.rheum.34(11)：2204-2210(2007))描述了具有含有置換c220s/c226s/c229s/p238s的沉默的fc區(qū)的抗體。shields等人(j.biol.chem.276(9)：6591-6604(2001))描述了包含含有置換d265a的沉默的fc區(qū)的抗體。這些氨基酸殘基的修飾也可以適當(dāng)引入公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體中。表述"對效應(yīng)受體弱的結(jié)合"可以意為效應(yīng)受體-結(jié)合活性是，天然igg或含有天然iggfc區(qū)的抗體的例如，95％或更少，優(yōu)選90％或更少，85％或更少，80％或更少，75％或更少，更優(yōu)選70％或更少，65％或更少，60％或更少，55％或更少，50％或更少，45％或更少，40％或更少，35％或更少，30％或更少，25％或更少，20％或更少，15％或更少，10％或更少，9％或更少，8％或更少，7％或更少，6％或更少，5％或更少，4％或更少，3％或更少，2％或更少，或1％或更少。"沉默的fc區(qū)"是含有一個或多個氨基酸置換，插入，添加，缺失等的fc區(qū)變體，其與天然fc區(qū)相比降低對效應(yīng)受體的結(jié)合。因為效應(yīng)受體-結(jié)合活性可以顯著降低，所述沉默的fc區(qū)可以不再結(jié)合效應(yīng)受體。沉默的fc區(qū)可以包括，例如，在選自由以下組成的組的一個或多個位置處含有氨基酸置換的fc區(qū)：eu234，eu235，eu236，eu237，eu238，eu239，eu265，eu266，eu267，eu269，eu270，eu271，eu295，eu296，eu297，eu298，eu300，eu324，eu325，eu327，eu328，eu329，eu331，和eu332。這些氨基酸位置的修飾也可以適當(dāng)引入公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體中。在另一個實施方案中，沉默的fc區(qū)在選自由以下組成的組的一個或多個位置具有置換：eu234，eu235，eu236，eu237，eu238，eu239，eu265，eu266，eu267，eu269，eu270，eu271，eu295，eu296，eu297，eu298，eu300，eu324，eu325，eu327，eu328，eu329，eu331，和eu332，并且所述位置優(yōu)選選自由以下組成的組：eu235，eu237，eu238，eu239，eu270，eu298，eu325，和eu329，其中所述置換利用選自下表的氨基酸殘基：位置eu234處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，arg，asn，asp，gln，glu，gly，his，lys，met，phe，pro，ser，和thr。位置eu235處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，asn，asp，gln，glu，gly，his，ile，lys，met，pro，ser，thr，val，和arg。位置eu236處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，asn，gln，his，leu，lys，met，phe，pro，和tyr。位置eu237處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，asn，asp，gln，glu，his，ile，leu，lys，met，pro，ser，thr，val，tyr，和arg。位置eu238處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，asn，gln，glu，gly，his，ile，lys，thr，trp，和arg。位置eu239處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：gln，his，lys，phe，pro，trp，tyr，和arg。位置eu265處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，arg，asn，gln，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，ser，thr，trp，tyr，和val。位置eu266處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，arg，asn，asp，gln，glu，gly，his，lys，phe，pro，ser，thr，trp，和tyr。位置eu267處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，his，lys，phe，pro，trp，和tyr。位置eu269處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，arg，asn，gln，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr，和val。位置eu270處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，arg，asn，gln，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr，和val。位置eu271處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，his，phe，ser，thr，trp，和tyr。位置eu295處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，asn，asp，gly，his，phe，ser，trp，和tyr。位置eu296處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，gly，lys，和pro。位置eu297處的氨基酸優(yōu)選ala用置換。位置eu298處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，gly，lys，pro，trp，和tyr。位置eu300處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，lys，和pro。位置eu324處的氨基酸優(yōu)選用lys或pro置換。位置eu325處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：ala，arg，gly，his，ile，lys，phe，pro，thr，trp，tyr，和val。位置eu327處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，gln，his，ile，leu，lys，met，phe，pro，ser，thr，trp，tyr，和val。位置eu328處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，asn，gly，his，lys，和pro。位置eu329處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：asn，asp，gln，glu，gly，his，ile，leu，lys，met，phe，ser，thr，trp，tyr，val，和arg。位置eu330處的氨基酸優(yōu)選用pro或ser置換。位置eu331處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，gly，和lys。位置eu332處的氨基酸優(yōu)選用選自由以下組成的組的氨基酸置換：arg，lys，和pro。沉默的fc區(qū)優(yōu)選可以含有在eu235利用lys或arg的置換，在eu237利用lys或arg的置換，在eu238利用lys或arg的置換，在eu239利用lys或arg的置換，在eu270利用phe的置換，在eu298利用gly的置換，在eu325利用gly的置換，或在eu329利用lys或arg的置換。更優(yōu)選，沉默的fc區(qū)可以含有在eu235利用精氨酸的置換或在eu239利用賴氨酸的置換。甚至更優(yōu)選，沉默的fc區(qū)可以含有l(wèi)235r/s239k置換。這些氨基酸殘基的修飾還可以適當(dāng)引入公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體中。在一個實施方案中，包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體僅具有弱的補體蛋白-結(jié)合活性或不結(jié)合補體蛋白。在一些實施方案中，補體蛋白是c1q。在一些實施方案中，弱的補體蛋白-結(jié)合活性是指與天然igg或含有天然iggfc區(qū)的抗體的補體蛋白-結(jié)合活性相比，降低10-倍或更多，50-倍或更多，或100-倍或更多的補體蛋白-結(jié)合活性。fc區(qū)的補體蛋白-結(jié)合活性可以通過氨基酸修飾如氨基酸置換，插入，添加，或缺失來降低。在一個實施方案中，可以以與如上文所述相同的方式評估公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體或包含fc區(qū)變體的抗體的在中性ph范圍內(nèi)和/或在酸性ph范圍內(nèi)的(人)fcrn-結(jié)合活性。在一個實施方案中，修飾抗體恒定區(qū)以產(chǎn)生公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的方法可以基于，例如，評估數(shù)種恒定區(qū)同種型(igg1，igg2，igg3，和igg4)以選擇在酸性ph范圍內(nèi)具有降低的抗原結(jié)合活性和/或在酸性ph范圍內(nèi)具有增加的解離速率的同種型。備選方法可以基于將氨基酸置換引入天然igg同種型的氨基酸序列以降低在酸性ph范圍(例如，ph5.8)內(nèi)的抗原結(jié)合活性和/或增加在酸性ph范圍內(nèi)的解離速率?？贵w恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)序列在同種型(igg1，igg2，igg3，和igg4)之間變化較大，并且鉸鏈-區(qū)氨基酸序列的差異可以對抗原結(jié)合活性具有顯著影響。因此，可以通過根據(jù)抗原或表位的類型選擇適當(dāng)?shù)耐N型來選擇在酸性ph范圍內(nèi)具有降低的抗原結(jié)合活性和/或在酸性ph范圍內(nèi)具有增加的解離速率的同種型。此外，因為鉸鏈區(qū)氨基酸序列的差異可以對抗原結(jié)合活性具有顯著影響，所以天然同種型的氨基酸序列中的氨基酸置換可以位于鉸鏈區(qū)中。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b提供含有上述公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體加速將以抗原結(jié)合的形式內(nèi)化入細(xì)胞的抗體以游離于抗原的形式釋放到細(xì)胞外的用途。本文中，"以抗原結(jié)合的形式內(nèi)化入細(xì)胞的抗體以游離于抗原的形式釋放到細(xì)胞外"不一定意味著以抗原結(jié)合的形式內(nèi)化入細(xì)胞的抗體以游離于抗原的形式完全釋放到細(xì)胞外?？山邮艿氖牵c修飾其fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之前(例如，增加抗體在酸性ph范圍內(nèi)的fcrn-結(jié)合活性之前)相比，以游離于抗原的形式釋放到細(xì)胞外的抗體的比例增加。優(yōu)選的是，釋放到細(xì)胞外的抗體保持其抗原結(jié)合活性。"從血漿去除抗原的能力"或相當(dāng)?shù)男g(shù)語可以指當(dāng)體內(nèi)施用或分泌抗體時從血漿去除抗原的能力。因此，"抗體從血漿去除抗原的能力增加"可以意為，當(dāng)施用抗體時，例如，與修飾其fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域之前相比，從血漿去除抗原的速率增加?？贵w從血漿去除抗原的活性的增加可以，例如，通過體內(nèi)施用可溶性抗原和抗體，和在施用后測量可溶性抗原在血漿中的濃度來評估?？扇苄钥乖梢允强贵w-結(jié)合的或抗體-游離的抗原，并且其濃度可以分別確定為"血漿中抗體-結(jié)合的抗原濃度"和"血漿中抗體-游離的抗原濃度"。后者與"血漿中游離抗原的濃度"同義。"血漿中總抗原濃度"可以指抗體-結(jié)合的抗原濃度和抗體-游離的抗原濃度的總和。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b提供延長含有公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體的血漿保留時間的方法。天然人igg能夠結(jié)合源自非人動物的fcrn。例如，因為與對人fcrn的結(jié)合相比，天然人igg能夠更強烈結(jié)合小鼠fcrn(ober等人，intl.immunol.13(12)：1551-1559(2001))，所以可以將抗體施用于小鼠來評估抗體的性質(zhì)。備選地，例如，其自身fcrn基因被破壞，作為替代具有和表達人fcrn基因作為轉(zhuǎn)基因的小鼠(roopenian等人，meth.mol.biol.602：93-104(2010))也適于評估抗體。本文所述的公開內(nèi)容a和b范圍內(nèi)，可以確定未結(jié)合于抗體的游離抗原的血漿濃度或游離抗原濃度與總抗原濃度的比例(例如，ng等人，pharm.res.23(1)：95-103(2006))。備選地，當(dāng)抗原顯示特定體內(nèi)功能時，抗原是否結(jié)合于中和抗原功能的抗體(拮抗分子)可以通過測試抗原功能是否被中和來評估。抗原功能是否被中和可以通過測量反映抗原功能的特定體內(nèi)標(biāo)志物來評估?？乖欠窠Y(jié)合于激活抗原功能的抗體(激動分子)可以通過測量反映抗原功能的特定體內(nèi)標(biāo)志物來評估。對于測量(如確定游離抗原在血漿中的濃度，確定游離抗原在血漿中的量和總抗原在血漿中的量的比例，和體內(nèi)標(biāo)志物測量)沒有特別限制；然而，測量可以優(yōu)選在抗體施用后某時期后進行。在公開內(nèi)容b的范圍內(nèi)，"在抗體施用后某時期后"不特別限制，并且所述時期可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)施用的抗體的性質(zhì)等適當(dāng)確定，并且包括，例如，抗體施用后一天，三天，七天，14天，或28天。本文中，術(shù)語"血漿抗原濃度"可以指"血漿中總抗原濃度"(其是抗體-結(jié)合的抗原濃度和抗體-游離的抗原濃度的總和)，或"血漿中游離抗原濃度"(其是抗體-游離抗原濃度)?？乖c抗體的摩爾比可以使用下式：c＝a/b計算，其中值a是每個時間點抗原的摩爾濃度，值b是每個時間點抗體的摩爾濃度，并且值c是每個時間點的抗原摩爾濃度/抗體的摩爾濃度(抗原/抗體的摩爾比)。較小的c值表示每個抗體去除抗原的更高效率，并且較大c值表示每個抗體去除抗原的更低效率。在一些方面，與施用含有天然人iggfc區(qū)的參照抗體作為人fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域時相比，當(dāng)施用公開內(nèi)容b的抗體時，抗原/抗體的摩爾比降低2-倍，5-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍，200-倍，500-倍，或1,000-倍或更多。血漿中總抗原濃度或抗原/抗體摩爾比的降低可以使用本領(lǐng)域中已知的方法評估，如wo2011/122011的實施例6，8和13中所述。更具體而言，當(dāng)公開內(nèi)容b中的目標(biāo)抗體不與小鼠對應(yīng)抗原交叉反應(yīng)時，它們可以基于抗原-抗體共注射模型或穩(wěn)態(tài)抗原輸注模型，使用人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠品系32或276(jacksonlaboratories，methodsmol.biol.602：93-104(2010))評估。當(dāng)抗體與小鼠對應(yīng)物交叉反應(yīng)時，其可以通過簡單地將抗體注射入人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠品系32或276(jacksonlaboratories)來評估。在共注射模型中，將抗體和抗原的混合物施用給小鼠。在穩(wěn)態(tài)抗原輸注模型中，將用抗原溶液填充的輸注泵植入小鼠以在血漿中實現(xiàn)恒定抗原濃度，并且隨后將抗體注射入小鼠。將所有測試抗體以相同劑量施用。血漿中的總抗原濃度，血漿中的游離抗原濃度，和血漿中的抗體濃度可以在適當(dāng)?shù)臅r間點測量。為了評估公開內(nèi)容b的抗體的長期效果，血漿中總的或游離的抗原濃度，或抗原/抗體的摩爾比可以在施用后兩天，四天，七天，14天，28天，56天，或84天測量。換句話說，對于評估抗體的性質(zhì)，長時期血漿中的抗原濃度可以通過在施用抗體后兩天，四天，七天，14天，28天，56天，或84天測量血漿中的總的或游離的抗原濃度，或抗原/抗體的摩爾比來確定。血漿中的抗原濃度或抗原/抗體的摩爾比是否隨抗體降低可以在如上文所述的一個或多個時間點評估所述降低來確定。為了評估公開內(nèi)容b的抗體的短期效應(yīng)，血漿中的總的或游離的抗原濃度，或抗原/抗體的摩爾比可以在施用后15分鐘，一小時，兩小時，四小時，八小時，12小時，或24小時測量。換句話說，對于評估抗體的性質(zhì)，短的時期內(nèi)血漿中抗原濃度可以通過測量血漿中的總的或游離的抗原濃度，或施用后15分鐘，一小時，兩小時，四小時，八小時，12小時，或24小時抗原/抗體的摩爾比確定。當(dāng)人中的血漿保留難以確定時，其可以基于在小鼠(例如，正常小鼠，表達人抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠，或表達人fcrn的轉(zhuǎn)基因小鼠)或在猴(例如，食蟹猴)中的血漿保留預(yù)測。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b涉及包含上述公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體。在不背離本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識的情況下，可以應(yīng)用本文所述公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)描述的抗體的各種實施方案，除非上下文中有不一致。在一個實施方案中，包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體用作治療性抗體，用于治療患有自身免疫病、移植排斥(移植物相對宿主疾病)、其他炎性疾病、或過敏疾病的人患者，如wo2013/046704中所述。在一個實施方案中，包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體可以具有修飾的糖鏈。具有修飾的糖鏈的抗體可以包括，例如，具有修飾的糖基化的抗體(wo99/54342)，缺乏巖藻糖的抗體(wo00/61739，wo02/31140，wo2006/067847，wo2006/067913)，和具有g(shù)lcnac分為兩部分的糖鏈的抗體(wo02/79255)。在一個實施方案中，可以將抗體去糖基化。在一些實施方案中，抗體包含，例如，在重鏈糖基化位點處突變以抑制該位置處的糖基化，如wo2005/03175中所述。所述未糖基化的抗體可以通過修飾重鏈糖基化位點，即，通過引入n297q或n297a置換(根據(jù)eu編號)，并且在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達蛋白來制備。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b涉及包括含有所述fc區(qū)變體的抗體的組合物或藥物組合物。在不背離本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識的情況下，可以應(yīng)用本文公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)所述的組合物或藥物組合物的各種實施方案，除非上下文中有不一致。所述組合物可以用于增強血漿保留(在受試者中，當(dāng)將公開內(nèi)容b的抗體施用(應(yīng)用)于受試者時)。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b涉及編碼fc區(qū)變體或含有fc區(qū)變體的抗體的核酸。本文所述的公開內(nèi)容的a和b范圍內(nèi)描述的核酸的各種實施方案可以在不背離本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識的情況下應(yīng)用，除非上下文中有不一致。備選地，公開內(nèi)容b涉及包含所述核酸的載體。本文所述的公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)各種實施方案可以在不背離本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識的情況下應(yīng)用，除非上下文中有不一致。備選地，公開內(nèi)容b涉及包含所述載體的宿主或宿主細(xì)胞。本文所述公開內(nèi)容a和b的范圍內(nèi)的各種實施方案可以在不背離本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識的情況下應(yīng)用，除非上下文中有不一致。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b涉及用于生產(chǎn)包含fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體的方法，其包括培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，或培養(yǎng)上述宿主并且從細(xì)胞培養(yǎng)物，從宿主分泌的物質(zhì)收集fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體。在該情況下，公開內(nèi)容b可以包括任選地還包括以下中的任一項或多項的生產(chǎn)方法：(a)選擇與天然igg的fc區(qū)相比在酸性ph條件下具有增強的fcrn-結(jié)合活性的fc區(qū)變體；(b)選擇與天然igg的fc區(qū)相比其對(預(yù)先存在的)ada的結(jié)合活性在中性ph條件下不顯著增強的fc區(qū)變體；(c)選擇與天然igg的fc區(qū)相比具有增加的血漿保留的fc區(qū)變體；和(d)選擇與包含天然igg的fc區(qū)的參照抗體相比，包含能夠促進從血漿去除抗原的fc區(qū)變體的抗體。從評估公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的血漿保留的角度，不受限制，其可以優(yōu)選，公開內(nèi)容b中產(chǎn)生的包含fc區(qū)變體的抗體和"包含天然igg的fc區(qū)的參照抗體"彼此相同(除了要比較的fc區(qū)以外)。fcrn可以是人fcrn。例如，在產(chǎn)生包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體后，可以將所述抗體與包含天然iggfc區(qū)的參照抗體就在酸性ph條件(例如，ph5.8)下的fcrn-結(jié)合活性，使用biacore(注冊商標(biāo))或其他已知技術(shù)進行比較，以選擇其fcrn-結(jié)合活性在酸性ph條件下增加的fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體。備選地，例如，在產(chǎn)生包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體后，可以將所述抗體與包含天然iggfc區(qū)的參照抗體就在中性ph條件下的ada-結(jié)合活性通過電化學(xué)發(fā)光(ecl)或已知技術(shù)進行比較，以選擇其ada-結(jié)合活性在中性ph條件下未顯著增加的fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體。備選地，例如，在產(chǎn)生包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體后，可以將所述抗體與包含天然iggfc區(qū)的參照抗體，通過使用血漿(例如，來自小鼠，大鼠，兔，狗，猴，或人)進行抗體藥代動力學(xué)測試進行比較，以選擇被證明在受試者中具有改善的血漿保留的fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體。備選地，例如，在產(chǎn)生包含公開內(nèi)容b的fc區(qū)變體的抗體后，可以將所述抗體與包含天然iggfc區(qū)的參照抗體，通過使用血漿(例如，來自小鼠，大鼠，兔，狗，猴，或人)進行抗體藥代動力學(xué)測試進行比較，以選擇具有增強的抗原從血漿去除的fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體。備選地，例如，如果需要，上述選擇方法可以適當(dāng)組合。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b涉及產(chǎn)生包含fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體的方法，其中所述方法包括以這樣的方式進行氨基酸置換，使得得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體包含在位置434處的ala；在位置438處的glu，arg，ser，或lys；和在位置440處的glu，asp，或gln(根據(jù)eu編號)。在另外的實施方案中，所述方法包含以這樣的方式置換氨基酸，使得得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體還包含，在位置428處的ile或leu和/或在位置436處的ile，leu，val，thr，或phe(根據(jù)eu編號)。在另一個實施方案中，氨基酸以這樣的方式置換，使得根據(jù)所述方法產(chǎn)生的得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體還包括在位置428處的leu和/或在位置436處的val或thr(根據(jù)eu編號)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容b涉及用于生產(chǎn)包含fcrn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體的方法，其中所述方法包括以這樣的方式進行氨基酸置換，使得得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體包含在位置434處的ala；在位置438處的arg或lys；和在位置440處的glu或asp(根據(jù)eu編號)。在另外的實施方案中，所述方法包括以這樣的方式置換氨基酸，使得得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體還包含，在位置428處的ile或leu和/或在位置436處的ile，leu，val，thr，或phe(根據(jù)eu編號)。在另一個實施方案中，以這樣的方式置換氨基酸，使得根據(jù)所述方法產(chǎn)生的得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體還包括在位置428處的leu和/或在位置436處的val或thr(根據(jù)eu編號)。在一個實施方案中，所述方法包括分別在位置434，438，和440用ala；glu，arg，ser，或lys；和glu，asp，或gln置換所有氨基酸。在另外的實施方案中，所述方法包括以這樣的方式置換氨基酸，使得得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體還包含，在位置428處的ile或leu和/或在位置436處的ile，leu，val，thr，或phe(根據(jù)eu編號)。在另一個實施方案中，以這樣的方式置換氨基酸，使得根據(jù)所述方法產(chǎn)生的得到的fc區(qū)變體或包含所述變體的抗體還包括在位置428處的leu和/或在位置436處的val或thr(根據(jù)eu編號)。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b涉及通過上述公開內(nèi)容b的生產(chǎn)方法中的任一種獲得的fc區(qū)變體或包含所述fc區(qū)變體的抗體。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容b提供用于降低包含在酸性ph具有增加的fcrn-結(jié)合活性的fc區(qū)變體的抗體的(預(yù)先存在的)ada-結(jié)合活性的方法；和用于產(chǎn)生在酸性ph(例如，ph5.8)具有增加的fcrn-結(jié)合活性和降低的預(yù)先存在的ada-結(jié)合活性的fc區(qū)變體的方法，所述方法包括：(a)提供包含與參照抗體相比其fcrn-結(jié)合活性在酸性ph增加的fc區(qū)(變體)的抗體；和(b)將以下引入fc區(qū)，根據(jù)eu編號，(i)在位置434處利用ala的氨基酸置換；(ii)在位置438處利用glu，arg，ser，和lys中的任一個的氨基酸置換；和(iii)在位置440處利用glu，asp，和gln中的任一個的氨基酸置換，(iv)任選地，在位置428處利用ile或leu的氨基酸置換；和/或(v)任選地，在位置436處利用ile，leu，val，thr，和phe中的任一個的氨基酸置換。在一些實施方案中，步驟(a)中的fc結(jié)構(gòu)域(變體)優(yōu)選是人iggfc結(jié)構(gòu)域(變體)。此外，為了增加在酸性ph的fcrn-結(jié)合活性和降低在中性ph范圍(例如，ph7.4)內(nèi)的(預(yù)先存在的)ada-結(jié)合活性，fc區(qū)(變體)含有選自由以下組成的組的氨基酸置換的組合：(a)n434a/q438r/s440e；(b)n434a/q438r/s440d；(c)n434a/q438k/s440e；(d)n434a/q438k/s440d；(e)n434a/y436t/q438r/s440e；(f)n434a/y436t/q438r/s440d；(g)n434a/y436t/q438k/s440e；(h)n434a/y436t/q438k/s440d；(i)n434a/y436v/q438r/s440e；(j)n434a/y436v/q438r/s440d；(k)n434a/y436v/q438k/s440e；(l)n434a/y436v/q438k/s440d；(m)n434a/r435h/f436t/q438r/s440e；(n)n434a/r435h/f436t/q438r/s440d；(o)n434a/r435h/f436t/q438k/s440e；(p)n434a/r435h/f436t/q438k/s440d；(q)n434a/r435h/f436v/q438r/s440e；(r)n434a/r435h/f436v/q438r/s440d；(s)n434a/r435h/f436v/q438k/s440e；(t)n434a/r435h/f436v/q438k/s440d；(u)m428l/n434a/q438r/s440e；(v)m428l/n434a/q438r/s440d；(w)m428l/n434a/q438k/s440e；(x)m428l/n434a/q438k/s440d；(y)m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；(z)m428l/n434a/y436t/q438r/s440d；(aa)m428l/n434a/y436t/q438k/s440e；(ab)m428l/n434a/y436t/q438k/s440d；(ac)m428l/n434a/y436v/q438r/s440e；(ad)m428l/n434a/y436v/q438r/s440d；(ae)m428l/n434a/y436v/q438k/s440e；(af)m428l/n434a/y436v/q438k/s440d；(ag)l235r/g236r/s239k/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e；和(ah)l235r/g236r/a327g/a330s/p331s/m428l/n434a/y436t/q438r/s440e。所述方法可以任選地進一步包括：(c)評估與參照抗體的結(jié)合活性相比，包含產(chǎn)生的fc區(qū)變體的抗體的(預(yù)先存在的)ada-結(jié)合活性是否降低。備選地，所述方法可以用作增強以抗原結(jié)合的形式內(nèi)化入細(xì)胞的抗體以游離于抗原的形式釋放到細(xì)胞外，而不顯著增加抗體在中性ph下的(預(yù)先存在的)ada-結(jié)合活性的方法。公開內(nèi)容c公開內(nèi)容c還涉及抗-il-8抗體，編碼所述抗體的核酸，包含所述抗體的藥物組合物，產(chǎn)生所述抗體的方法，和所述抗體在治療il-8相關(guān)疾病中的用途，如下文中所述。在不背離本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技術(shù)知識以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實施方案的情況下，下文中給出的術(shù)語的意義在本文公開內(nèi)容c的描述中適用。i.公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)的定義在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，"酸性ph"是指可以選自，例如，ph4.0至ph6.5的ph。在一個實施方案中，酸性ph是指，但不限于，ph4.0，ph4.1，ph4.2，ph4.3，ph4.4，ph4.5，ph4.6，ph4.7，ph4.8，ph4.9，ph5.0，ph5.1，ph5.2，ph5.3，ph5.4，ph5.5，ph5.6，ph5.7，ph5.8，ph5.9，ph6.0，ph6.1，ph6.2，ph6.3，ph6.4，或ph6.5。在一個具體實施方案中，術(shù)語酸性ph是指ph5.8。在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，"中性ph"是指選自，例如，6.7至ph10.0的ph。在一個實施方案中，中性ph是指，但不限于，ph6.7，ph6.8，ph6.9，ph7.0，ph7.1，ph7.2，ph7.3，ph7.4，ph7.5，ph7.6，ph7.7，ph7.8，ph7.9，ph8.0，ph8.1，ph8.2，ph8.3，ph8.4，ph8.5，ph8.6，ph8.7，ph8.8，ph8.9，ph9.0，ph9.5，或ph10.0。在一個具體實施方案中，術(shù)語中性ph是指ph7.4。術(shù)語"il-8"，如公開內(nèi)容c中使用的，是指源自任意脊椎動物，靈長類(例如，人，食蟹猴，獼猴)和其他哺乳動物(例如，狗和兔)的任意天然il-8，除非另有說明。術(shù)語"il-8"包括全長il-8，未加工的il-8以及由細(xì)胞中加工得到的任意形式的il-8。術(shù)語"il-8"還包括天然il-8的衍生物，例如，剪接變體或等位基因變體。示例性人il-8的氨基酸序列在seqidno：66中顯示。術(shù)語"抗-il-8抗體"和"結(jié)合il-8的抗體"是指能夠以足夠親和力結(jié)合il-8從而抗體用作靶向il-8的診斷劑和/或治療劑的抗體。在一個實施方案中，抗-il-8抗體對不相關(guān)，非-il-8蛋白的結(jié)合程度，例如，小于抗體對il-8的結(jié)合的約10％。"親和力"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)通常是指分子(例如，抗體)的單個結(jié)合位點和其結(jié)合伙伴(例如，抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另有說明，如本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)使用的，"結(jié)合親和力"是指固有結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對(例如，抗體和抗原)的成員之間的1：1相互作用。分子x對于其伙伴y的親和力可以通常由解離常數(shù)(kd)表示。結(jié)合親和力可以使用本領(lǐng)域中已知的方法測量，包括本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)所述的那些。在某些實施方案中，結(jié)合il-8的抗體可以具有如下的解離常數(shù)(kd)，例如,≤1000nm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm或≤0.001nm(例如，10-8m或更少，10-8m至10-13m，10-9m至10-13m)。術(shù)語"抗體"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)以最寬泛的意義使用，并且包括，但不限于，單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們呈現(xiàn)所需抗原結(jié)合活性即可。與參照抗體"結(jié)合相同表位的抗體"是指阻斷參照抗體對其抗原的結(jié)合達例如，50％，60％，70％，或80％或更多的抗體；并且相反，參照抗體阻斷抗體對其抗原的結(jié)合達例如，50％，60％，70％，或80％或更多。本文中，可以使用示例性競爭測定，但不限于其。"嵌合抗體"是指重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而其余部分源自不同的來源或物種的抗體。"人源化"抗體是指包含來自非人hvr的氨基酸殘基和來自人frs的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體可以包含基本上至少一個，并且通常兩個可變區(qū)，其中(或基本上全部)hvrs(例如，cdrs)對應(yīng)于非人抗體的那些，并且全部(或基本上全部)的frs對應(yīng)于人抗體的那些。人源化抗體任選地可以包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分。如在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)使用的術(shù)語"單克隆抗體"是指獲自基本上同質(zhì)抗體的群體的抗體，即，構(gòu)成該群體的單個抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了可能的變體抗體以外，例如，含有天然存在的突變或單克隆抗體制劑的生產(chǎn)期間產(chǎn)生的那些，其通常以小量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，單克隆抗體制劑中的每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。因此，修飾語"單克隆"表示抗體的特性為獲自基本上同質(zhì)的抗體群體，并且不要理解為需要通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，要根據(jù)公開內(nèi)容c使用的單克隆抗體可以通過各種技術(shù)制備，包括但不限于雜交瘤方法，重組dna方法，噬菌體展示方法，和利用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的轉(zhuǎn)基因動物的方法，所述方法和制備單克隆抗體的其他示例性方法是本文所述的。在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，"天然抗體"是指具有各種天然存在的結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子。在一個實施方案中，天然igg抗體，例如，是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由二硫鍵鍵合的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。以n-至c-末端的順序，每個重鏈具有可變區(qū)(vh)，也稱為可變重鏈結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，接著三個恒定結(jié)構(gòu)域(ch1，ch2，和ch3)。同樣，以n-至c-末端的順序，每個輕鏈具有可變區(qū)(vl)，也稱為可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，接著恒定輕鏈(cl)結(jié)構(gòu)域?？贵w輕鏈可以基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列歸于兩種類型型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。用于公開內(nèi)容c的所述恒定結(jié)構(gòu)域包括任何報道的同種異型(等位基因)或任何亞類/同種型的那些。重鏈恒定區(qū)包括，但不限于，天然igg抗體(igg1，igg2，igg3，和igg4)的恒定區(qū)。已知igg1等位基因包括，例如，ighg1*01，ighg1*02，ighg1*03，ighg1*04，和ighg1*05(參見imgt.org)，并且這些中的任一種可以用作天然人igg1序列。恒定結(jié)構(gòu)域序列可以源自單個等位基因或亞類/同種型，或源自多個等位基因或亞類/同種型。具體而言，所述抗體包括，但不限于，分別是其ch1源自ighg1*01并且ch2和ch3源自ighg1*02和ighg1*01的抗體。"效應(yīng)子功能"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是指可歸因于抗體的fc區(qū)的生物活性，其可以隨抗體同種型而改變?？贵w效應(yīng)子功能的實例包括：c1q結(jié)合補體-依賴性細(xì)胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，b細(xì)胞受體)的下調(diào)；和b細(xì)胞激活，但不限于此。術(shù)語"fc區(qū)"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)用于限定含有恒定區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈的c-末端區(qū)。該術(shù)語包括天然fc區(qū)和變體fc區(qū)。天然fc區(qū)表示天然抗體的fc區(qū)。在一個實施方案中，人igg重鏈fc區(qū)從cys226或pro230的氨基酸殘基延伸到重鏈的羧基末端。然而，fc區(qū)的c-末端賴氨酸(lys447)或甘氨酸-賴氨酸(殘基446-447)可以存在或可以不存在。除非在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)另外指出，fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基編號根據(jù)eu編號系統(tǒng)，也稱為eu索引，如kabat等人，sequenceofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1991中所述的。"框架區(qū)"或"fr"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是指除了高變區(qū)(hvr)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的fr通常由四個fr結(jié)構(gòu)域組成：fr1，fr2，fr3，fr4。因此，hvr和fr序列通常在vh(或vl)中以以下順序出現(xiàn)：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。"人共有框架區(qū)"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是代表人免疫球蛋白vl或vh框架區(qū)序列的選擇中最常出現(xiàn)的氨基酸殘基的框架區(qū)。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列的選擇來自可變結(jié)構(gòu)域序列的亞組。通常，序列的亞組是根據(jù)kabat等人，sequenceofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991)的亞組。在一個實施方案中，vl的亞組是亞組κi，如前文kabat等人中的。在一個實施方案中，vh的亞組是亞組iii，如前文kabat等人中的。"受體(acceptor)人框架區(qū)"，為了在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)目的，是包含源自人免疫球蛋白框架區(qū)或人共有框架區(qū)的vl或vh框架區(qū)的氨基酸序列的框架區(qū)。"源自"人免疫球蛋白框架區(qū)或人共有框架區(qū)的受體人框架區(qū)可以包含其相同氨基酸序列，或其可以含有現(xiàn)有的氨基酸序列置換。在一些實施方案中，現(xiàn)有的氨基酸置換的數(shù)量是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一個實施方案中，vl受體人框架區(qū)與vl人免疫球蛋白框架區(qū)序列或人共有框架區(qū)序列相同。術(shù)語"可變區(qū)"或"可變結(jié)構(gòu)域"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是指參與抗體對抗原的結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈(分別是vh和vl)的可變區(qū)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)域包含四個保守的框架區(qū)(frs)和三個高變區(qū)(hvrs)。(參見，kindt等人，kubyimmunology，第6版，w.h.freeman&co.，第91頁(2007)。)單個vh或vl結(jié)構(gòu)域足以賦予抗原結(jié)合特異性，但不限于其。此外，結(jié)合特定抗原的抗體可以分別使用來自結(jié)合抗原的抗體的vh或vl結(jié)構(gòu)域以篩選互補vl或vh結(jié)構(gòu)域的文庫而分離。參見，例如，portolano等人，j.immunol.150：880-887(1993)；clarkson等人，nature352：624-628(1991)。如在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)使用的術(shù)語"高變區(qū)"或"hvr"是指抗體可變結(jié)構(gòu)域在序列中高變("互補決定區(qū)"或"cdrs")和/或形成結(jié)構(gòu)限定的環(huán)("高變環(huán)")和/或含有抗原-接觸殘基("抗原接觸處")的區(qū)域中的每個。通常，抗體包含六個高變區(qū)：三個在vh(h1，h2，h3)中，并且三個在vl(l1，l2，l3)中。不限于其中，本文中的示例性hvr包括：(a)高變環(huán)，其中氨基酸殘基是26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)，和96-101(h3)(chothia和lesk，j.mol.biol.196：901-917(1987))；(b)cdr，其中氨基酸殘基是24-34(l1)，50-56(l2)，89-97(l3)，31-35b(h1)，50-65(h2)，和95-102(h3)(kabat等人，sequenceofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991))；(c)抗原接觸處，其中氨基酸殘基是27c-36(l1)，46-55(l2)，89-96(l3)，30-35b(h1)，47-58(h2)，和93-101(h3)(maccallum等人，j.mol.biol.262：732-745(1996))；和(d)(a)，(b)，和/或(c)的組合，包括hvr氨基酸殘基46-56(l2)，47-56(l2)，48-56(l2)，49-56(l2)，26-35(h1)，26-35b(h1)，49-65(h2)，93-102(h3)，和94-102(h3)。除非另有說明，hvrs和可變區(qū)中的其他殘基(例如，fr殘基)如在前文kabat等人中編號。"個體"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是哺乳動物。哺乳動物包括，但不限于，馴養(yǎng)動物(例如，牛，綿羊，貓，狗，和馬)，靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)，兔，和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實施方案中，"個體"是人。"分離的"抗體在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是從其天然環(huán)境的成分分離的抗體。在一些實施方案中，將抗體純化到大于95％或99％純度，純度如，例如，通過電泳(例如，sds-page，等電聚焦電泳(ief)，毛細(xì)管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相hplc)確定。對于評估抗體純度的方法的綜述，參見，例如，flatman等人，j.chromatogr.b848：79-87(2007)。"分離的"核酸在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是指從其天然環(huán)境的成分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細(xì)胞中含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色體外或存在于不同于其天然染色體位置的染色體位置。"編碼抗-il-8抗體的分離的核酸"在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)是指編碼抗-il-8抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括在單個載體或分離的載體中的所述一種或多種核酸，在宿主細(xì)胞中的一個或多個位置存在的一種或多種核酸。在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)，術(shù)語"宿主細(xì)胞"，"宿主細(xì)胞系"和"宿主細(xì)胞培養(yǎng)物"可交替使用，并且指其中已經(jīng)引入外源核酸的細(xì)胞，包括所述細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括"轉(zhuǎn)化子"和"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"，其包括原代轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和源自其的后代，不考慮后代數(shù)量。后代與其母體細(xì)胞的核酸含量可以不完全相同，而是可以含有突變。在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物活性的突變體后代包括在本文中。術(shù)語"載體"，如在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)使用的，是指能夠傳播與其連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語包括自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)的載體以及引入宿主細(xì)胞并變?yōu)檎嫌谄浠蚪M中的載體。某些載體能夠引導(dǎo)它們可操作連接的核酸的表達。所述載體本文中稱為"表達載體"。在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)，術(shù)語"藥品說明書"用于指通常包括在治療性產(chǎn)品的商用包裝中的使用說明，其含有關(guān)于適應(yīng)證、使用、劑量、施用、組合療法、禁忌和/或關(guān)于使用所述治療產(chǎn)品的警告的信息。在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)，"氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)(％)"就參照多肽序列而言，定義為為了獲得最大序列同一性百分?jǐn)?shù)，通過引入缺口(如果需要)并且不考慮任何保守性置換作為序列同一性的部分，在序列比對后，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。為了確定氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對可以在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)以各種方式實現(xiàn)，例如，通過使用公眾可獲得的計算機軟件如blast，blast-2，align，megalign(dnastar)軟件，或genetyx(注冊商標(biāo))(genetyxco.，ltd.)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定用于比對序列的適當(dāng)參數(shù)，包括實現(xiàn)與被比較的序列的全長的最大比對所需的任何算法。然而，為了本文的目的，氨基酸序列同一性％的值，例如，使用序列比較計算機程序align-2產(chǎn)生。align-2由genentech，inc.授權(quán)，并且源代碼以用戶文檔資料在美國版權(quán)局，washingtond.c.，20559提交，其在美國版權(quán)登記號txu510087下注冊。align-2程序可從genentech，inc.，southsanfrancisco，california公開獲得，或可以從源代碼編譯。應(yīng)該編譯align-2程序用于在unix(注冊商標(biāo))操作系統(tǒng)上使用，包括數(shù)字unix(注冊商標(biāo))v4.0d。所有序列比較參數(shù)由align-2程序設(shè)置并且不改變。在align-2用于氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列a與給定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性％(其可以備選地表述為具有或包含與給定氨基酸序列b的某一氨基酸序列同一性％的給定氨基酸序列a)如下計算：100乘以分?jǐn)?shù)x/y，其中x是通過序列比對程序align-2的a和b的程序比對中得分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)量，并且其中y是b中氨基酸殘基的總數(shù)。將理解，在氨基酸序列a的長度不等于氨基酸序列b的長度時，a與b的氨基酸序列同一性％將不等于b與a的氨基酸序列同一性％。除非另外具體說明，氨基酸序列同一性的所有％值使用本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)所表明的align-2計算機程序獲得。在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，"藥物組合物"通常是指治療、預(yù)防、檢查或診斷疾病的藥劑。"藥用載體"是指藥物組合物中除活性成分之外的成分，其對于受試者是無毒的。所述藥用載體包括，但不限于，緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。如在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)使用的，"治療(treatment)"(和其語法上的變化形式如"治療(treat)"或"治療(treating)")是指試圖改變被治療的個體的天然過程的臨床干預(yù)。對于預(yù)防或在臨床病理過程中可以進行所述臨床干預(yù)。所需治療效果包括，但不限于，預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥狀，減少疾病的任何直接或間接病理結(jié)果，預(yù)防轉(zhuǎn)移，降低疾病進展的速率，緩解或減輕疾病狀態(tài)和緩和或改善預(yù)后。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體可以用于減緩疾病或病癥的進程。在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，抗體或藥物組合物的"有效量"是指當(dāng)以實現(xiàn)所需治療或預(yù)防結(jié)果所需的劑量和時期使用時有效的量。ii.組合物和方法在一個實施方案中，公開內(nèi)容c是基于對于il-8具有ph-依賴性親和力的抗-il-8抗體作為藥物組合物的可適用性。公開內(nèi)容c的抗體，例如，在診斷或治療其中il-8過量存在的疾病中是有用的。a.示例性抗-il-8抗體在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供對il-8具有ph-依賴性親和力的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供對il-8具有ph-依賴性親和力的抗-il-8抗體，其包含在以下的氨基酸序列內(nèi)具有至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個氨基酸置換的序列：(a)包含seqidno：67的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：68的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：69的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：70的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：71的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：72的氨基酸序列的hvr-l3。在另一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供對il-8具有ph-依賴性親和力的抗-il-8抗體，其在以下的氨基酸序列中的至少一個中包含至少一個氨基酸置換：(a)包含seqidno：67的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：68的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：69的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：70的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：71的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：72的氨基酸序列的hvr-l3。除非另有說明，氨基酸可以用任意其他氨基酸置換。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含選自由以下組成的組的位置的一個或多個氨基酸置換：序列seqidno：67中位置1處的天冬氨酸；(b)序列seqidno：67中位置2處的酪氨酸；(c)序列seqidno：67中位置3處的酪氨酸；(d)序列seqidno：67中位置4處的亮氨酸；(e)序列seqidno：67中位置5處的絲氨酸；(f)序列seqidno：68中位置1處的亮氨酸；(g)序列seqidno：68中位置2處的異亮氨酸；(h)序列seqidno：68中位置3處的精氨酸；(i)序列seqidno：68中位置4處的天冬酰胺；(j)序列seqidno：68中位置5處的賴氨酸；(k)序列seqidno：68中位置6處的丙氨酸；(l)序列seqidno：68中位置7處的天冬酰胺；(m)序列seqidno：68中位置8處的甘氨酸；(n)序列seqidno：68中位置9處的酪氨酸；(o)序列seqidno：68中位置10處的蘇氨酸；(p)序列seqidno：68中位置11處的精氨酸；(q)序列seqidno：68中位置12處的谷氨酸；(r)序列seqidno：68中位置13處的酪氨酸；(s)seqidno：68中位置14處的絲氨酸序列；(t)序列seqidno：68中位置15處的丙氨酸；(u)序列seqidno：68中位置16處的絲氨酸；(v)序列seqidno：68中位置17處的纈氨酸；(w)序列seqidno：68中位置18處的賴氨酸；(x)序列seqidno：68中位置19處的甘氨酸；(y)序列seqidno：69中位置1處的谷氨酸；(z)序列seqidno：69中位置2處的天冬酰胺；(aa)序列seqidno：69中位置3處的酪氨酸；(ab)序列seqidno：69中位置4處的精氨酸；(ac)序列seqidno：69中位置5處的酪氨酸；(ad)序列seqidno：69中位置6處的天冬氨酸；(ae)序列seqidno：69中位置7處的纈氨酸；(af)序列seqidno：69中位置8處的谷氨酸；(ag)序列seqidno：69中位置9處的亮氨酸；(ah)序列seqidno：69中位置10處的丙氨酸；(ai)序列seqidno：69中位置11處的酪氨酸；(aj)序列seqidno：70中位置1處的精氨酸；(ak)序列seqidno：70中位置2處的丙氨酸；(al)序列seqidno：70中位置3處的絲氨酸；(am)序列seqidno：70中位置4處的谷氨酸；(an)序列seqidno：70中位置5處的異亮氨酸；(ao)序列seqidno：70中位置6處的異亮氨酸；(ap)序列seqidno：70中位置7處的酪氨酸；(aq)序列seqidno：70中位置8處的絲氨酸；(ar)序列seqidno：70中位置9處的酪氨酸；(as)序列seqidno：70中位置10處的亮氨酸；(at)序列seqidno：70中位置11處的丙氨酸；(au)序列seqidno：71中位置1處的天冬酰胺；(av)序列seqidno：71中位置2處的丙氨酸；(aw)序列seqidno：71中位置3處的賴氨酸；(ax)序列seqidno：71中位置4處的蘇氨酸；(ay)序列seqidno：71中位置5處的亮氨酸；(az)序列seqidno：71中位置6處的丙氨酸；(ba)序列seqidno：71中位置7處的天冬氨酸；(bb)序列seqidno：72中位置1處的谷氨酰胺；(bc)序列seqidno：72中位置2處的組氨酸；(bd)序列seqidno：72中位置3處的組氨酸；(be)序列seqidno：72中位置4處的苯丙氨酸；(bf)序列seqidno：72中位置5處的甘氨酸；(bg)序列seqidno：72中位置6的苯丙氨酸；(bh)序列seqidno：72中位置7處的脯氨酸；(bi)序列seqidno：72中位置8處的精氨酸；和(bj)序列seqidno：72中位置9處的蘇氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含選自由以下組成的組的位置處的一個或多個氨基酸置換：(a)序列seqidno：68中位置6處的丙氨酸；(b)序列seqidno：68中位置8處的甘氨酸；(c)序列seqidno：68中位置9處的酪氨酸；(d)序列seqidno：68中位置11處的精氨酸；和(e)序列seqidno：69中位置3處的酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含選自由以下組成的組的位置處的氨基酸置換的一種或多種組合：(a)序列seqidno：68中位置6處的丙氨酸；(b)序列seqidno：68中位置8處的甘氨酸；(c)序列seqidno：68中位置9處的酪氨酸；(d)序列seqidno：68中位置11處的精氨酸；和(e)序列seqidno：69中位置3處的酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含在以下位置處的氨基酸置換：(a)序列seqidno：68中位置9處的酪氨酸；(b)序列seqidno：68中位置11處的精氨酸；和(c)序列seqidno：69中位置3處的酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含在以下位置處的氨基酸置換：(a)序列seqidno：68中位置6處的丙氨酸；(b)序列seqidno：68中位置8處的甘氨酸；(d)序列seqidno：68中位置9處的酪氨酸；(e)序列seqidno：68中位置11處的精氨酸；和(f)序列seqidno：69中位置3處的酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含：(a)在序列seqidno：68中位置6處用天冬氨酸置換丙氨酸；(b)在序列seqidno：68中位置11處用脯氨酸置換精氨酸；和(c)在序列seqidno：69中位置3處用組氨酸置換酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含：(a)在序列seqidno：68中位置8處用酪氨酸置換甘氨酸；和(b)在序列seqidno：68中位置9處用組氨酸置換酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含：(a)在序列seqidno：68中位置6處用天冬氨酸置換丙氨酸；(b)在序列seqidno：68中位置8處用酪氨酸置換甘氨酸；(c)在序列seqidno：68中位置9處用組氨酸置換酪氨酸；(d)在序列seqidno：68中位置11處用脯氨酸置換精氨酸；和(e)在序列seqidno：69中位置3處用組氨酸置換酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含hvr-h2，其包含seqidno：73的氨基酸序列。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含hvr-h3，其包含seqidno：74的氨基酸序列。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含含有seqidno：67的氨基酸序列的hvr-h1，含有seqidno：73的氨基酸序列的hvr-h2，和包含seqidno：74的氨基酸序列的hvr-h3。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含選自由以下組成的組的位置處的一個或多個氨基酸置換：(a)序列seqidno：70中位置8處的絲氨酸；(b)序列seqidno：71中位置1處的天冬酰胺；(c)序列seqidno：71中位置5處的亮氨酸；和(d)序列seqidno：72中位置1處的谷氨酰胺。在另一個實施方案中，抗-il-8抗體包含這些置換中的任意2，3，或全部4個的組合。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含選自由以下組成的組的位置處的氨基酸置換的一種或多種組合：(a)序列seqidno：70中位置8處的絲氨酸；(b)序列seqidno：71中位置1處的天冬酰胺；(c)序列seqidno：71中位置5處的亮氨酸；和(d)序列seqidno：72中位置1處的谷氨酰胺。在另一個實施方案中，抗-il-8抗體包含這些置換中的任意2，3，或全部4個的組合。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含在以下位置處的氨基酸置換：(a)序列seqidno：71中位置1處的天冬酰胺；(b)序列seqidno：71中位置5處的亮氨酸；和(c)序列seqidno：72中位置1處的谷氨酰胺。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含在以下位置處的氨基酸置換：(a)序列seqidno：70中位置8處的絲氨酸；(b)序列seqidno：71中位置1處的天冬酰胺；(c)序列seqidno：71中位置5處的亮氨酸；和(d)序列seqidno：72中位置1處的谷氨酰胺。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含：(a)在序列seqidno：71中位置1處用賴氨酸置換天冬酰胺；(b)在序列seqidno：71中位置5處的用組氨酸置換亮氨酸；和(c)在序列seqidno：72中位置1處用賴氨酸置換谷氨酰胺。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含：(a)在序列seqidno：70中位置8處用谷氨酸置換絲氨酸；(b)在序列seqidno：71中位置1處用賴氨酸置換天冬酰胺；(c)在序列seqidno：71中位置5處用組氨酸置換亮氨酸；和(c)在序列seqidno：72中位置1處用賴氨酸置換谷氨酰胺。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含hvr-l2，其包含seqidno：75的氨基酸序列。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含hvr-l3，其包含seqidno：76的氨基酸序列。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體具有包含seqidno：70的氨基酸序列的hvr-l1，包含seqidno：75的氨基酸序列的hvr-l2，和包含seqidno：76的氨基酸序列的hvr-l3。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含在下述位置的氨基酸置換：(a)序列seqidno：77中位置55處的丙氨酸；(b)序列seqidno：77中的位置57處的甘氨酸；(c)序列seqidno：77中位置58處的酪氨酸；(d)序列seqidno：77中位置60處的精氨酸；(e)序列seqidno：77中位置84處的谷氨酰胺；(f)序列seqidno：77中位置87處的絲氨酸；和(g)序列seqidno：77中位置103處的酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含：(a)在序列seqidno：77中用天冬氨酸置換位置55處的丙氨酸；(b)在序列seqidno：77中位置57處用酪氨酸置換甘氨酸；(c)在序列seqidno：77中位置58處用組氨酸置換酪氨酸；(d)在序列seqidno：77中位置60處用脯氨酸置換精氨酸；(e)在序列seqidno：77中位置84處用蘇氨酸置換谷氨酰胺；(f)在序列seqidno：77中位置87處用天冬氨酸置換絲氨酸；(g)和在序列seqidno：77中位置103處用組氨酸置換酪氨酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含具有seqidno：78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含具有seqidno：79的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含具有seqidno：78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno：79的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。包含具有seqidno：78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno：79的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗-il-8抗體可以是以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的抗-il-8抗體。包含具有seqidno：78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno：79的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗-il-8抗體可以是在體內(nèi)(例如，在血漿中)穩(wěn)定保持il-8-中和活性的抗-il-8抗體。包含具有seqidno：78的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno：79的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的抗-il-8抗體可以是具有低免疫原性的抗體。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且在以下的至少任意一個氨基酸序列中含有至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：102的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：103的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：104的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：105的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：106的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：107的氨基酸序列的hvr-l3。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且含有以下各氨基酸序列中的至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：108的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：109的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：110的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：111的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：112的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：113的氨基酸序列的hvr-l3。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且在以下的至少任意一種氨基酸序列中含有至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：114的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：115的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：116的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：117的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：118的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：119的氨基酸序列的hvr-l3。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且在以下的至少任意一種氨基酸序列中含有至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：120的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：121的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：122的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：123的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：124的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：125的氨基酸序列的hvr-l3。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且在以下的至少任意一種氨基酸序列中含有至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：126的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：127的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：128的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：129的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：130的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：131的氨基酸序列的hvr-l3。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且在以下的至少任意一種氨基酸序列中含有至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：132的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：133的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：134的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：135的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：136的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：137的氨基酸序列的hvr-l3。在備選的方面，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體還包括對il-8具有ph-依賴性親和力并且在以下的至少任意一種氨基酸序列中含有至少一個氨基酸置換的那些：(a)包含seqidno：138的氨基酸序列的hvr-h1；(b)包含seqidno：139的氨基酸序列的hvr-h2；(c)包含seqidno：140的氨基酸序列的hvr-h3；(d)包含seqidno：141的氨基酸序列的hvr-l1；(e)包含seqidno：142的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)包含seqidno：143的氨基酸序列的hvr-l3。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體具有il-8-中和活性。il-8-中和活性是指抑制il-8的生物活性的活性，或可以指抑制il-8的受體結(jié)合的活性。在備選的方面中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體是以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的抗-il-8抗體。在公開內(nèi)容c的情況下，以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的抗-il-8抗體是指與在中性ph對il-8的結(jié)合親和力相比其在酸性ph對il-8的結(jié)合親和力降低的抗體。例如，ph-依賴性抗-il-8抗體包括在中性ph比在酸性ph對il-8具有更高親和力的抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在中性ph具有是在酸性ph的親和力至少2倍，3倍，5倍，10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，35倍，40倍，45倍，50倍，55倍，60倍，65倍，70倍，75倍，80倍，85倍，90倍，95倍，100倍，200倍，400倍，1000倍，10000倍或更多倍高的il-8親和力。結(jié)合親和力可以使用，不特別限制，表面等離子共振方法(如biacore(注冊商標(biāo)))測量。結(jié)合速率常數(shù)(kon)和解離速率常數(shù)(koff)可以使用biacore(注冊商標(biāo))t200評價軟件(gehealthcare)，基于簡單的一對一langmuir結(jié)合模型，通過同時匹配結(jié)合和解離傳感圖計算。平衡解離常數(shù)(kd)計算為koff/kon的比率。為了篩選其結(jié)合親和力根據(jù)ph改變的抗體，不特別限制，可以使用elisa，動力學(xué)排除測定(kinexatm)，等以及表面等離子共振方法(如biacore(注冊商標(biāo)))。ph-依賴性il-8-結(jié)合能力是指以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的性質(zhì)。同時，抗體是否能夠多次結(jié)合il-8可以通過wo2009/125825中所述方法評估。在一個實施方案中，優(yōu)選的是公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在中性ph具有小的對il-8的解離常數(shù)(kd)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在中性ph對il-8的解離常數(shù)是，例如，0.3nm或更少，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在中性ph對il-8的解離常數(shù)是，例如，0.1nm或更少，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在中性ph對il-8的解離常數(shù)是，例如，0.03nm或更少，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在ph7.4對il-8具有小的解離常數(shù)(kd)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph7.4對il-8的解離常數(shù)是，例如，0.3nm或更少，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph7.4對il-8的解離常數(shù)是，例如，0.1nm或更少，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph7.4對il-8的解離常數(shù)是，例如，0.03nm或更少，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在酸性ph對il-8具有大的解離常數(shù)(kd)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在酸性ph對il-8的解離常數(shù)是，例如，3nm或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在酸性ph對il-8的解離常數(shù)是，例如，10nm或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在酸性ph對il-8的解離常數(shù)是，例如，30nm或更多，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在ph5.8對il-8具有大的解離常數(shù)(kd)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8對il-8的解離常數(shù)是，例如，3nm或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8對il-8的解離常數(shù)是，例如，10nm或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8對il-8的解離常數(shù)是，例如，30nm或更多，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體對il-8的結(jié)合親和力在中性ph比在酸性ph高。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在酸性ph和中性ph之間的解離常數(shù)比，[kd(酸性ph)/kd(中性ph)]，是例如，30或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在酸性ph和中性ph之間的解離常數(shù)比，[kd(酸性ph)/kd(中性ph)]，是例如，100或更多，例如，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，或9500，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在ph5.8和ph7.4之間的解離常數(shù)比，[kd(ph5.8)/kd(ph7.4)]，是30或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8和ph7.4之間的解離常數(shù)比，[kd(ph5.8)/kd(ph7.4)]，是例如，100或更多，例如，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，或9500，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在酸性ph具有大的解離速率常數(shù)(koff)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在酸性ph的解離速率常數(shù)是，例如，0.003(1/s)或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在酸性ph的解離速率常數(shù)是，例如，0.005(1/s)或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在酸性ph的解離速率常數(shù)是，例如，0.01(1/s)或更多，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在ph5.8具有大的解離速率常數(shù)(koff)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8的解離速率常數(shù)是，例如，0.003(1/s)或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8的解離速率常數(shù)是，例如，0.005(1/s)或更多，但不限于其。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體在ph5.8的解離速率常數(shù)是，例如，0.01(1/s)或更多，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在溶液中(例如，在pbs中)穩(wěn)定地保持il-8-中和活性?；钚允欠裨谌芤褐蟹€(wěn)定保持可以通過測量加入溶液的公開內(nèi)容c的抗體的il-8-中和活性在某溫度儲存一定時期之前和之后是否改變來評估。在一個實施方案中，儲存期是，例如，一、二、三或四周，但不限于其。在一個實施方案中，儲存溫度是，例如，25℃，30℃，35℃，40℃，或50℃，但不限于其。在一個實施方案中，儲存溫度是，例如，40℃，但不限于其中；并且儲存期是，例如，兩周，但不限于其。在一個實施方案中，儲存溫度是，例如，50℃，但不限于其中；并且儲存期是，例如，一周，但不限于其。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在體內(nèi)(例如，在血漿中)穩(wěn)定保持il-8-中和活性?；钚栽隗w內(nèi)是否穩(wěn)定保持可以通過測量加入動物(例如，小鼠)或人的血漿中的公開內(nèi)容c的抗體的il-8-中和活性在某溫度儲存一定時期之前和之后是否改變來評估。在一個實施方案中，儲存期是，例如，一、二、三或四周，但不限于其。在一個實施方案中，儲存溫度是，例如，25℃，30℃，35℃，或40℃，但不限于其。在一個實施方案中，儲存溫度是，例如，40℃，但不限于其中；并且儲存期是，例如，兩周，但不限于其。在一個實施方案中，與單獨抗體相比，當(dāng)抗體與il-8形成復(fù)合物時，細(xì)胞攝取公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體的速率更大。公開內(nèi)容c的il-8抗體在其與細(xì)胞外(例如，血漿中)的il-8復(fù)合時，比不與il-8復(fù)合時更容易攝入細(xì)胞。在一個實施方案中，優(yōu)選的是，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體的預(yù)測的免疫原性(其在人宿主中預(yù)測)降低。"低免疫原性"可以意為，不限于其中，例如，施用的抗-il-8抗體在至少一半或更多的施用以足夠量的抗體達足夠的時期以實現(xiàn)治療功效的個體中不引起活體的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)可以包括抗藥物抗體的產(chǎn)生。"低抗藥物抗體產(chǎn)生"可與"低免疫原性"可交換。人中的免疫原性可以利用t細(xì)胞表位預(yù)測程序評估。所述t細(xì)胞表位預(yù)測程序包括epibase(lonza)，itope/tced(antitope)，epimatrix(epivax)等。epimatrix是用于預(yù)測研究的蛋白的免疫原性的系統(tǒng)，其中肽片段的序列通過將用于分析其免疫原性的蛋白的氨基酸序列分為每個九個氨基酸來自動設(shè)計，從而預(yù)測其結(jié)合八個主要ii型mhc等位基因(drb1*0101，drb1*0301，drb1*0401，drb1*0701，drb1*0801，drb1*1101，drb1*1301，和drb1*1501)的能力(degroot等人，clin.immunol.131(2)：189-201(2009))。其中抗-il-8抗體的氨基酸序列的氨基酸被修飾的序列可以使用上述t細(xì)胞表位預(yù)測程序分析，以設(shè)計具有降低的免疫原性的序列。降低公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體的免疫原性的優(yōu)選的氨基酸修飾位點包括，但不限于，seqidno：78所示的抗-il-8抗體的重鏈序列中根據(jù)kabat編號在位置81和/或位置82b處的氨基酸。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供與使用參照抗體時相比增強從個體中去除il-8的方法，其包括向個體施用公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及與使用參照抗體時相比，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在增強從個體中去除il-8中的用途。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體，其用于與使用參照抗體時相比增強從個體中去除il-8。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在生產(chǎn)與使用對照抗體時相比增強il-8的體內(nèi)去除的藥物組合物中的用途。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及藥物組合物，其包含與使用參照抗體時相比增強il-8的去除的公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及與使用參照抗體時相比增強去除il-8的方法，其包括向受試者施用公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體。在公開內(nèi)容c的實施方案中，參照抗體是指在修飾以獲得公開內(nèi)容c的抗體之前的抗-il-8抗體，或其il-8結(jié)合親和力在酸性和中性phs都強的抗體。參照抗體可以是包含seqidnos：83和84，或seqidnos：89和87的氨基酸序列的抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供藥物組合物，其包含公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體，特征在于公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體結(jié)合il-8并且隨后結(jié)合胞外基質(zhì)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體在生產(chǎn)藥物組合物中的用途，特征在于公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體結(jié)合il-8并且隨后結(jié)合胞外基質(zhì)。在上述任意實施方案中，抗-il-8抗體可以是人源化抗體。在一個方面，公開內(nèi)容c的抗體包含上述實施方案中的任一個的重鏈可變區(qū)和上實施方案述中的任一個的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗體包含seqidno：78的重鏈可變區(qū)和seqidno：79的輕鏈可變區(qū)中的每個，并且還可以包含其序列中的翻譯后修飾。在進一步的方面，根據(jù)上述實施方案中的任一個的抗-il-8抗體可以單個或組合地結(jié)合下述1至7節(jié)中所述的特征中的任一個。1.嵌合抗體和人源化抗體在某些實施方案中，公開內(nèi)容c中提供的抗體可以是嵌合抗體。某些嵌合抗體，例如，在美國專利號4,816,567；和morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa81：6851-6855(1984)中描述。在一個實例中，嵌合抗體可以包含非人可變區(qū)(例如，源自小鼠，大鼠，倉鼠，兔，或非人靈長類如猴的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低在人中的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變區(qū)，其中hvrs，例如，cdrs(或其部分)源自非人抗體，并且frs(或其部分)源自人抗體序列。人源化抗體任選地還將包含人恒定區(qū)的至少一部分。在一些實施方案中，人源化抗體中的一些fr殘基可以用來自非人抗體(例如，hvr殘基源自的抗體)的對應(yīng)殘基置換，例如，來保留或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體和制備它們的方法，例如，在almagro等人，front.biosci.13：1619-1633(2008)中綜述，并且在，例如，riechmann等人，nature332：323-329(1988)；queen等人，proc.natlacad.sci.usa86：10029-10033(1989)；美國專利號5，821,337，7,527,791，6,982,321，和7,087,409；kashmiri等人，methods36：25-34(2005)(描述特異性決定區(qū)(sdr)接枝(grafting))；padlan，mol.immunol.28：489-498(1991)(描述"表面重建(resurfacing)")；dall'acqua等人，methods36：43-60(2005)(描述"fr改組(shuffling)")；和osbourn等人，methods36：61-68(2005)和klimka等人，br.j.cancer83：252-260(2000)(描述"引導(dǎo)的選擇"方法來fr改組)進一步描述?？梢杂糜谌嗽椿娜丝蚣軈^(qū)包括但不限于使用"最匹配"方法選擇的框架區(qū)(參見，例如，sims等人，j.immunol.151：2296(1993))；源自輕鏈或重鏈可變區(qū)的特定亞組的人抗體共有序列的框架區(qū)(參見，例如，carter等人，proc.natl.acad.sci.usa，89：4285(1992)；和presta等人，j.immunol.，151：2623(1993))；和源自篩選fr文庫的框架區(qū)(參見，例如，baca等人，j.biol.chem.272：10678-10684(1997)和rosok等人，j.biol.chem.271：22611-22618(1996))。2.抗體片段在某些實施方案中，公開內(nèi)容c中提供的抗體可以是抗體片段?？贵w片段包括，但不限于，fab，fab'，fab'-sh，f(ab')2，fv，和scfv片段，和下文描述的其他片段。對于某些抗體片段的綜述，參見hudson等人，nat.med.9：129-134(2003)。對于scfv片段的綜述，參見例如，pluckthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，vol.113，rosenburg和mooreeds.，(springer-verlag，newyork)，pp.269-315(1994)；還參見wo93/16185；和美國專利號5,571,894和5,587,458。雙抗體(diabodies)是可以是二價或雙特異性的具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段。參見，例如，ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，nat.med.9：129-134(2003)；和hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993)。三抗體和四抗體也在hudson等人，nat.med.9：129-134(2003)中描述。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分的抗體片段。在某些實施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體可以是人單結(jié)構(gòu)域抗體(domantis，inc.，waltham，ma；參見，例如，美國專利號6,248,516b1)。抗體片段可以通過各種技術(shù)制備，包括但不限于蛋白水解消化完整抗體以及通過重組宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌或噬菌體)生產(chǎn)，如在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)描述的。3.人抗體在某些實施方案中，公開內(nèi)容c中提供的抗體可以是人抗體。人抗體可以通過本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)制備。人抗體總的來講在vandijk和vandewinkel，curr.opin.pharmacol.5：368-74(2001)以及l(fā)onberg，curr.opin.immunol.20：450-459(2008)中描述。人抗體可以通過將免疫原施用給已經(jīng)修飾以響應(yīng)抗原攻擊產(chǎn)生完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體的轉(zhuǎn)基因動物來制備。所述動物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替代動物(非人)的免疫球蛋白基因座，或在染色體外存在或隨機整合入動物的染色體。在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中，動物(非人)的免疫球蛋白基因座通常被失活。對于從轉(zhuǎn)基因動物獲得人抗體的方法的綜述，參見lonberg，nat.biotech.23：1117-1125(2005)。對于xenomousetm技術(shù)還參見美國專利號6,075,181和6,150,584；對于humabtm技術(shù)參見美國專利號5,770,429；對于k-mmousetm技術(shù)參見美國專利號7,041,870，并且對于velocimousetm技術(shù)參見美國專利申請公開號us2007/0061900。來自通過所述動物產(chǎn)生的完整抗體的人可變區(qū)可以進一步修飾，例如，通過與不同人恒定區(qū)組合修飾。人抗體還可以基于雜交瘤的方法制備。用于生產(chǎn)人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細(xì)胞系，例如，在kozbor，j.immunol.133：3001(1984)；brodeur等人，monoclonlantibodyproductiontechniquesandapplications，pp.51-63(marceldekker，inc.，newyork，1987)；和boerner等人，j.immunol.147：86(1991)中描述。經(jīng)由人b-細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的人抗體在li等人，proc.natl.acad.sci.usa103：3557-3562(2006)中描述。其他方法包括，例如，美國專利號7,189,826中描述的方法，用于從雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)單克隆人igm抗體，以及，例如，在ni，xiandaimianyixue，26(4)：265-268(2006)中描述的用于人-人雜交瘤的方法。人雜交瘤技術(shù)(三源雜交瘤(trioma)技術(shù))還在vollmers等人，histol.&histopath.20(3)：927-937(2005)和vollmers等人，methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology27(3)：185-91(2005)中描述。人抗體還可以通過分離選自人源的噬菌體展示文庫的fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列產(chǎn)生?？梢詫⑺隹勺兘Y(jié)構(gòu)域序列與所需人恒定結(jié)構(gòu)域組合。從抗體文庫選擇人抗體的技術(shù)在下文描述。4.文庫-衍生的抗體公開內(nèi)容c的抗體可以通過對組合文庫篩選具有所需一種活性或多種活性的抗體而分離。例如，多種本領(lǐng)域中已知的方法用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫和對所述文庫篩選具有所需結(jié)合特性的抗體。所述方法在hoogenboom等人，meth.mol.biol.178：1-37(o'brien等人，ed.，人press，totowa，nj，2001)，以及，例如，在mccafferty等人，nature348：552-554(1990)；clackson等人，nature352：624-628(1991)；marks等人，j.mol.biol.222：581-597(1992)；marks和bradbury，在meth.mol.biol.248：161-175(lo，ed.，humanpress，totowa，nj，2003)；sidhu等人，j.mol.biol.338(2)：299-310(2004)；lee等人，j.mol.biol.340(5)：1073-1093(2004)；fellouse，proc.natl.acad.sci.usa101(34)：12467-12472(2004)；和lee等人，j.immunol.meth.284(1-2)：119-132(2004)中綜述。在某些噬菌體展示方法中，vh和vl編碼序列的組庫(repertoires)可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)分開克隆并隨機重組在噬菌體文庫中。對得到的噬菌體文庫篩選結(jié)合抗原的噬菌體，如winter等人，ann.rev.immunol.12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示抗體片段，其為單鏈fv(scfv)片段或為fab片段。備選地，可以(例如，從人)克隆未免疫(naive)組庫以提供不進行任何免疫的針對寬范圍的非自身以及自身抗原的抗體的單個來源，如griffiths等人，emboj.12：725-734(1993)所述的。最后，未免疫文庫也可以通過從干細(xì)胞克隆未重排的v基因片段，并使用含有隨機序列的pcr引物來編碼高變cdr3區(qū)并完成體外重排來經(jīng)由合成構(gòu)建(參見下文hoogenboom和winter，j.mol.biol.，227：381-388(1992)；描述人抗體噬菌體文庫的專利公開包括，例如：美國專利號5,750,373；和美國申請公開號2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936，和2009/0002360。本文中，分離自人抗體文庫的抗體或抗體片段被認(rèn)為是人抗體或人抗體片段。5.多特異性抗體在某些實施方案中，根據(jù)公開內(nèi)容c提供的抗體可以是，例如，多特異性抗體如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，結(jié)合特異性之一是針對il-8，并且另一個是針對任意其他抗原。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結(jié)合il-8上的兩個不同表位。雙特異性抗體還可以用于將細(xì)胞毒性劑定位到表達il-8的細(xì)胞。雙特異性抗體可以制備為全長抗體或抗體片段。用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括，但不限于，重組共表達具有不同特異性的兩條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見milstein和cuello，nature305：537(1983))；wo93/08829；和traunecker等人，emboj.10：3655(1991))和"杵臼結(jié)構(gòu)(knob-in-hole)"方法(參見美國專利號5,731,168)。多特異性抗體可以通過使用靜電控制效應(yīng)制備fc-異源二聚分子(wo2009/089004a1)，通過交聯(lián)兩種或更多種抗體或片段(美國專利號4,676,980；和brennan等人，science229：81(1985))，通過使用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體(kostelny等人，j.immunol.148(5)：1547-1553(1992))，通過使用"雙抗體"技術(shù)來制備雙特異性抗體片段(hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993))，通過使用單鏈fv(sfv)二聚體(gruber等人，j.immunol.152：5368(1994))，或其他方法來制備。三特異性抗體的制備，例如，在tutt等人，j.immunol.147：60(1991)中描述。具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合位點的改造的抗體，包括"章魚抗體"，也包括在本文中(參見，例如，us2006/0025576)。在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)，抗體或抗體片段還包括"雙重作用fab"或"daf"，其包含結(jié)合il-8以及另一個不同抗原的抗原結(jié)合位點(參見us2008/0069820，例如)。6.抗體變體抗體的氨基酸序列變體可以通過將適當(dāng)?shù)男揎椧刖幋a所述抗體的核苷酸序列，或通過肽合成來制備。所述修飾包括，例如，缺失，和/或插入，和/或置換抗體氨基酸序列中的殘基。最終構(gòu)建體可以利用缺失，插入和置換的任意組合實現(xiàn)，只要最終構(gòu)建體是具有公開內(nèi)容c的情況下描述的所需性質(zhì)的抗體即可。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供具有一個或多個氨基酸置換的抗體變體。所述置換位點可以抗體中的任意位置。用于保守置換的氨基酸顯示在表10中標(biāo)題″保守型置換″下。導(dǎo)致更實質(zhì)改變的典型置換的氨基酸顯示在表10中標(biāo)題″典型置換″下，并且進一步參考氨基酸側(cè)鏈類型描述。[表10]最初殘基典型置換保守性置換ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp，lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser：alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu氨基酸可以根據(jù)常見側(cè)鏈性質(zhì)分為：(1)疏水的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水的：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性的：asp，glu；(4)堿性的：his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly，pro；和(6)芳族的：trp，tyr，phe。非保守性置換將需要將這些類型中的一種的成員交換為另一種類型。氨基酸插入包括融合在n末端和/或c末端包括一個、兩個、或三個至一百個或更多個殘基的多肽，以及將一個或多個氨基酸殘基插入序列中。具有這種末端插入的抗體包括，例如，具有n-末端甲硫氨?；鶜埢目贵w?？贵w分子的其他插入變體包括將抗體n-或c-末端融合于增加抗體的血漿半衰期的酶(例如，adept)或多肽的那些。7.糖基化的變體在一個實施方案中，根據(jù)公開內(nèi)容c提供的抗體可以是糖基化的抗體?？梢酝ㄟ^以產(chǎn)生或去除糖基化位點的方式改變氨基酸序列的方式向抗體添加或從抗體缺失糖基化位點。當(dāng)抗體包含fc區(qū)時，可以改變與其連接的糖鏈。由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體通常含有分枝的，分兩支的寡糖，其通過n-連接連接于fc區(qū)的ch2結(jié)構(gòu)域的asn297(參見wright等人tibtech15：26-32(1997))。寡糖包括，例如，甘露糖，n-乙酰葡糖胺(glcnac)，半乳糖，和唾液酸，以及巖藻糖，其在分兩支的寡糖結(jié)構(gòu)的“莖”中連接于glcnac。在一個實施方案中，將公開內(nèi)容c的抗體中的寡糖修飾以產(chǎn)生具有某些改善的性質(zhì)的抗體變體。8.fc區(qū)變體在一個實施方案中，將一個或多個氨基酸修飾引入根據(jù)公開內(nèi)容c提供的抗體的fc區(qū)中，由此產(chǎn)生fc區(qū)變體。fc區(qū)變體包括在天然人fc區(qū)序列(例如，人igg1，igg2，igg3，或igg4的fc區(qū))中具有一個、兩個、三個或更多個氨基酸的修飾(例如，置換)的那些。公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體可以含有具有以下五個性質(zhì)中的至少一個的fc區(qū)，不限于其中：(a)在酸性ph，相對于天然fc區(qū)對于fcrn的結(jié)合親和力，增加的fc區(qū)對于fcrn的結(jié)合親和力；(b)相對于天然fc區(qū)對于預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力，降低的fc區(qū)對于預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力；(c)相對于天然fc區(qū)的血漿半衰期，增加的fc區(qū)的血漿半衰期；(d)相對于天然fc區(qū)的血漿清除，降低的fc區(qū)的血漿清除；和(e)相對于天然fc區(qū)對于效應(yīng)受體的結(jié)合親和力，降低的fc區(qū)對于效應(yīng)受體的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，fc區(qū)具有上述性質(zhì)中的2，3或4個。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括在酸性ph具有增加的fcrn-結(jié)合親和力的那些。具有增加的fcrn-結(jié)合親和力的fc區(qū)變體包括，但不限于，與包含天然iggfc區(qū)的抗體的fcrn-結(jié)合親和力相比，其fcrn-結(jié)合親和力增加多達2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，10-倍，15-倍，20-倍，30-倍，50-倍，或100-倍的fc區(qū)變體。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括不結(jié)合預(yù)先存在的ada，并且同時具有改善的血漿保留的安全和有利的fc區(qū)變體。如公開內(nèi)容c的范圍中使用的，術(shù)語"ada"是指對治療性抗體上的表位具有結(jié)合親和力的內(nèi)源性抗體。如公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)使用的，術(shù)語"預(yù)先存在的ada"是指在向患者施用治療性抗體前存在于患者的血液中的可檢測的抗藥物抗體。預(yù)先存在的ada包括類風(fēng)濕因子。具有低的對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力的fc區(qū)變體包括，但不限于，與包含天然iggfc區(qū)的抗體的ada-結(jié)合親和力相比，其ada-結(jié)合親和力降低到1/10或更少，1/50或更少，或1/100或更少的fc區(qū)變體。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括其對補體蛋白的結(jié)合親和力低或不結(jié)合補體蛋白的fc區(qū)變體。補體蛋白包括c1q。具有低的對補體蛋白的結(jié)合親和力的fc區(qū)變體包括，但不限于，與包含天然iggfc區(qū)的抗體的補體蛋白-結(jié)合親和力相比，其對補體蛋白的結(jié)合親和力降低至1/10或更少，1/50或更少，或1/100或更少的fc區(qū)變體。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括其對效應(yīng)受體的結(jié)合親和力低或?qū)π?yīng)受體不具有結(jié)合親和力的fc區(qū)變體。效應(yīng)受體包括，但不限于，fcγri，fcγrii，和fcγriii。fcγri包括，但不限于，fcγria，fcγrib，和fcγric，以及其亞型。fcγrii包括，但不限于，fcγriia(其具有兩個同種異型：r131和h131)和fcγriib。fcγriii包括，但不限于，fcγriiia(其具有兩個同種異型：v158和f158)和fcγriiib(其具有兩個同種異型：fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)。對效應(yīng)受體具有低結(jié)合親和力的fc區(qū)變體包括，但不限于，與包含天然iggfc區(qū)的抗體的結(jié)合親和力相比，其對效應(yīng)受體的結(jié)合親和力降低至至少1/10或更少，1/50或更少，或1/100或更少的fc區(qū)變體。在一個實施方案中，與天然fc區(qū)相比，fc區(qū)變體包括包含由以下組成的組的位置處的任一個處的一個或多個氨基酸置換的fc區(qū)：位置235，236，239，327，330，331，428，434，436，438，和440(根據(jù)eu編號)。在一個實施方案中，與天然fc區(qū)相比，fc區(qū)變體包括包含根據(jù)eu編號在位置235，236，239，428，434，436，438，和440處的氨基酸置換的fc區(qū)。在一個實施方案中，與天然fc區(qū)相比，fc區(qū)變體包括包含根據(jù)eu編號在位置235，236，327，330，331，428，434，436，438，和440處的氨基酸置換的fc區(qū)。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括包含選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸置換的fc區(qū)：l235r，g236r，s239k，a327g，a330s，p331s，m428l，n434a，y436t，q438r，和s440e。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括包含m428l，n434a，y436t，q438r，和s440e的氨基酸置換的fc區(qū)。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括包含l235r，g236r，s239k，m428l，n434a，y436t，q438r，和s440e的氨基酸置換的fc區(qū)。在一個實施方案中，fc區(qū)變體包括包含l235r，g236r，a327g，a330s，p331s，m428l，n434a，y436t，q438r，和s440e的氨基酸置換的fc區(qū)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以是以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的抗-il-8抗體。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以在體內(nèi)(例如，在血漿)中穩(wěn)定保持il-8-中和活性。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以是具有低免疫原性的抗體。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有其在酸性ph(例如，ph5.8)的fcrn-結(jié)合親和力與天然fc區(qū)在酸性ph的fcrn-結(jié)合親和力相比增加的fc區(qū)。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有與天然fc區(qū)對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力相比，其對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有與天然fc區(qū)相比其在血漿中半衰期延長的fc區(qū)。包含seqidno：80的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有與天然fc區(qū)相比其對效應(yīng)受體的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)。在另一個實施方案中，抗-il-8抗體包含上述性質(zhì)中的任意2，3，4，5，6，或全部7個的組合。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以是以ph-依賴性的方式結(jié)合il-8的抗-il-8抗體。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以在體內(nèi)(例如，在血漿中)穩(wěn)定保持il-8-中和活性。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以是具有低免疫原性的抗體。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有其在酸性ph的fcrn-結(jié)合親和力與天然fc區(qū)的fcrn-結(jié)合親和力相比增加的fc區(qū)。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有與天然fc區(qū)對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力相比其對預(yù)先存在的ada的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有其在血漿中的半衰期與天然fc區(qū)相比延長的fc區(qū)。包含seqidno：81的氨基酸序列和/或seqidno：82的氨基酸序列的抗-il-8抗體可以含有與天然fc區(qū)相比其對效應(yīng)受體的結(jié)合親和力降低的fc區(qū)。在另一個實施方案中，抗-il-8抗體包含上述性質(zhì)中的任意2，3，4，5，6，或全部7個的組合。在某些實施方案中，公開內(nèi)容c包括具有一些但不具有全部效應(yīng)子功能的抗體變體?？贵w變體可以對于其中某些效應(yīng)子功能(如補體和adcc)是不必需的或有害的情況是所需候選物?？梢猿Ｒ?guī)進行本領(lǐng)域中已知的體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定以確認(rèn)cdc和/或adcc活性的降低/完全喪失。例如，可以進行fc受體(fcr)結(jié)合測定以確認(rèn)缺少fcγr結(jié)合(因此缺少adcc活性)，但保留fcrn結(jié)合能力的抗體。介導(dǎo)adcc和nk細(xì)胞的原代培養(yǎng)的細(xì)胞僅表達fcγriii，而單核細(xì)胞表達fcγri，fcγrii和fcγriii。造血細(xì)胞上的fcr表達在ravetch等人，annu.rev.immunol.9：457-492(1991)的第464頁上的表3中總結(jié)。評估研究的分子的adcc活性的體外測定的非限制性實例在美國專利號5,500,362中描述(參見，例如hellstrom.等人，proc.natlacad.sci.usa83：7059-7063(1986)，hellstrom等人，proc.natlacad.sci.usa82：1499-1502(1985)；美國專利號5,821,337，和bruggemann等人，j.exp.med.166：1351-1361(1987))。備選地，非放射性同位素測定可用于評估效應(yīng)細(xì)胞功能(參見，例如，用于流式細(xì)胞術(shù)的acti(tm)非放射性細(xì)胞毒性測定(celltechnology，inc.mountainview，ca；和cytotox96tm非放射性細(xì)胞毒性測定(promega，madison，wi))。用于此種測定的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細(xì)胞。備選地或另外，目標(biāo)抗體變體的adcc活性可以在例如，clynes等人，proc.natl.acad.sci.usa95：652-656(1998)中公開的動物模型體內(nèi)評估。還可以進行c1q結(jié)合測定以確認(rèn)抗體不能結(jié)合c1q并且缺乏cdc活性。參見，例如，wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結(jié)合elisa。為了評估補體激活，可以進行cdc測定(參見，例如，gazzano-santoro等人，j.immunol.meth.202：163(1996)；cragg等人，blood101：1045-1052(2003)；和cragg等人，blood103：2738-2743(2004))。fcrn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期的確定可以使用本領(lǐng)域中已知的方法進行(參見，例如，petkova等人，intl.immunol.18(12)：1759-1769(2006))。具有降低的效應(yīng)子功能的抗體包括在位置238，265，269，270，297，327或329置換一個或多個的fc區(qū)殘基的那些(美國專利號6,737,056)。所述fc區(qū)變體包括具有位置265，269，270，297或327處的兩個或更多個殘基的置換的fc區(qū)變體，包括所謂的"dana"fc區(qū)變體，其殘基265和297置換為丙氨酸(美國專利號7,332,581)。具有改善的或減小的對fcr組的結(jié)合的抗體變體在下文描述。(參見，例如，美國專利號6,737,056；wo2004/056312，和shields等人，j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001)。)具有增加的血液半衰期和改善的在酸性ph的fcrn結(jié)合的抗體在us2005/0014934中描述。描述的抗體包含具有改善fc區(qū)對fcrn的結(jié)合的一個或多個置換的fc區(qū)。所述fc區(qū)變體包括具有選自fc區(qū)中238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434的一個或多個位置處的置換的那些，例如，fc區(qū)中位置434的置換(美國專利號7,371,826)。對于fc區(qū)變體的其他實例，還參見duncan等人，nature322：738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；和wo94/29351。9.抗體衍生物在某些實施方案中，可以進一步修飾公開內(nèi)容c中提供的抗體以含有本領(lǐng)域中已知和容易得到的另外的非蛋白結(jié)構(gòu)部分。適于衍生抗體的結(jié)合部分包括，但不限于，水可溶性聚合物?？扇苄跃酆衔锏膶嵗ǎ幌抻?，聚乙二醇(peg)，乙二醇或丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧雜環(huán)戊烷，聚-1,3,6-三氧雜環(huán)己烷，乙烯/馬來酸苷共聚物，聚氨基酸(同源聚合物或無規(guī)共聚物)，聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氧乙基化醇(例如，甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛在工業(yè)上有利，因為其在水中的穩(wěn)定性。該聚合物可以是任意分子量，并且可以是分支的或不分支的。與抗體連接的聚合物的數(shù)量可以改變，并且如果連接多于一個聚合物，它們可以是相同或不同分子。通常，用于衍生的聚合物的數(shù)量和/或類型可以基于以下考慮因素確定，所述考慮因素包括但不限于，當(dāng)抗體衍生物用于限定的療法時要改善的抗體的特定性質(zhì)或功能，等。在另一個實施方案中，可以提供公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體和可以通過暴露于照射選擇性加熱的非蛋白結(jié)構(gòu)部分的綴合物。在一個實施方案中，非蛋白結(jié)構(gòu)部分是，例如，碳納米管(參見，例如，kam等人，proc.natl.acad.sci.usa102：11600-11605(2005))。照射可以是任意波長的并且包括，不限于，對人無害但可以將非蛋白結(jié)構(gòu)部分加熱到溫度從而殺死接近抗體-非蛋白結(jié)構(gòu)部分的細(xì)胞的波長。b.重組方法和組合物公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體可以使用重組方法和組合物產(chǎn)生，例如，如美國專利號4,816,567中所述的。一個實施方案提供編碼作為公開內(nèi)容c提供的抗-il-8抗體的一種或多種分離的核酸。所述一種或多種核酸可以編碼包含抗體的vl的氨基酸序列和/或包含抗體的vh的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個實施方案中，提供包含所述核酸的一種或多種載體(例如，表達載體)。在一個實施方案中，提供包含所述一種或多種核酸的宿主細(xì)胞。在一個此種實施方案中，宿主細(xì)胞包含(例如，轉(zhuǎn)化有)：(1)編碼抗體的vl和抗體的vh的核酸的載體，或(2)包含編碼抗體的vl的核酸的第一載體和編碼抗體的vh的核酸的第二載體。在一個實施方案中，宿主是真核(例如，中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞或淋巴細(xì)胞(例如，y0，ns0，sp20細(xì)胞))。在一個實施方案中，提供產(chǎn)生公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體的方法，其中所述方法包括在適于表達抗體的條件下培養(yǎng)包含編碼上文提供的抗-il-8抗體的核酸的宿主細(xì)胞，并且任選地回收抗體(例如，從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)。為了重組生產(chǎn)抗-il-8抗體，分離編碼抗體的一種或多種核酸，例如，如上文所述的，并插入一種或多種載體用于在宿主細(xì)胞中進一步克隆和/或表達。所述一種或多種核酸可以容易地使用常規(guī)步驟分離并測序(例如，通過使用特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的核酸的寡核苷酸探針)。用于克隆或表達編碼抗體的載體的合適的宿主細(xì)胞包括在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)描述的原核或真核細(xì)胞。例如，抗體可以在細(xì)菌中生產(chǎn)，尤其是當(dāng)不需要糖基化和fc效應(yīng)子功能時。對于抗體片段和多肽在細(xì)菌中的表達，參見例如，美國專利號5,648,237，5,789,199，和5,840,523(還參見charlton，methodsinmolecularbiology，vol.248(b.k.c.lo，ed.，humanapress，totowa，nj，2003)，pp.245-254，用于在大腸桿菌中表達抗體片段)。表達后，抗體可以從細(xì)菌細(xì)胞糊以可溶性級分分離并可以進一步純化。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母是用于克隆或表達編碼抗體的載體的合適宿主，包括其糖基化通路已經(jīng)"人源化"的真菌和酵母菌株，其能夠生產(chǎn)具有部分或完全人糖基化模式的抗體。參見gerngross，nat.biotech.22：1409-1414(2004)，和li等人，nat.biotech.24：210-215(2006)。用于表達糖基化的抗體的合適的宿主細(xì)胞還源自多細(xì)胞生物(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細(xì)胞的實例包括植物和昆蟲細(xì)胞。不特別限制，桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞聯(lián)合用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾(spodopterafrugiperda)細(xì)胞并且已經(jīng)鑒定了多種桿狀病毒株。植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。參見美國專利號5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978，和6,417,429(描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的plantibodiestm技術(shù))。脊椎動物細(xì)胞也可以用作宿主。例如，適于懸浮生長的哺乳動物細(xì)胞系是有用的。可用的哺乳動物宿主細(xì)胞的其他實例是sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1細(xì)胞系(cos-7)；人胚胎腎細(xì)胞系(graham等人，j.genvirol.36：59(1977)中描述的293細(xì)胞)；幼倉鼠腎細(xì)胞(bhk)；小鼠睪丸支持細(xì)胞(mather，biol.reprod.23：243-251(1980)中所述的tm4細(xì)胞)；猴腎細(xì)胞(cv1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(vero-76)；人宮頸癌細(xì)胞(hela)；犬腎細(xì)胞(mdck；buffalo大鼠肝細(xì)胞(brl3a)；人肺細(xì)胞(w138)；人肝細(xì)胞(hepg2)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562)；tri細(xì)胞，如mather等人，annalsn.y.acad.sci.383：44-68(1982)中所述；mrc5細(xì)胞；和fs4細(xì)胞。其他有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞，包括dhfr-cho細(xì)胞(urlaub等人，proc.natl.acad.sci.usa77：4216(1980))；和骨髓瘤細(xì)胞系如y0，ns0和sp20，但不限于此。對于適于抗體生產(chǎn)的其他哺乳動物宿主細(xì)胞的綜述，參見yazaki和wu，methodsinmolecularbiology，vol.248(b.k.c.lo，ed.，humanapress，totowa，nj)，pp.255-268(2003)。通過在適于抗體表達的條件下培養(yǎng)如上文所述攜帶編碼所述抗體的核酸的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的公開內(nèi)容c的抗體可以從宿主細(xì)胞內(nèi)部或外部(培養(yǎng)基，乳汁，等)分離，并純化為基本上純的同質(zhì)抗體。通常用于純化多肽的分離/純化方法可以適當(dāng)用于分離和純化所述抗體；然而，方法不限于上述實例?？贵w可以例如，通過適當(dāng)選擇和組合柱色譜，濾器，超濾，鹽析，溶劑沉淀，溶劑萃取，蒸餾，免疫沉淀，sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦，透析和重結(jié)晶(不限于其中)適當(dāng)分離和純化。色譜包括，但不限于，親和色譜，離子交換色譜，疏水色譜，凝膠過濾色譜，反相色譜，和吸附色譜。所述色譜可以使用液相色譜，例如，hplc和fplc進行。用于親和色譜的柱包括，但不限于，蛋白a柱和蛋白g柱。蛋白a柱包括，但不限于，hyperd，poros，sepharosef.f.(pharmacia)等。關(guān)注于抗-il-8抗體的特性(如上述復(fù)合物的增加的胞外基質(zhì)結(jié)合活性和增強的細(xì)胞攝取)，公開內(nèi)容c提供用于選擇具有增加的胞外基質(zhì)結(jié)合的抗體和具有增強的細(xì)胞攝取的抗體的方法。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于生產(chǎn)包含其對il-8的結(jié)合活性是以ph-依賴性的方式的可變區(qū)的抗-il-8抗體的方法，其包括以下的步驟：(a)評估抗-il-8抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合；(b)選擇強烈結(jié)合胞外基質(zhì)的抗-il-8抗體；(c)培養(yǎng)包含攜帶編碼抗體的核酸的載體的宿主；和(d)從培養(yǎng)基分離抗體。與胞外基質(zhì)的結(jié)合可以通過任意方法評估，不特別限制，只要它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，可以使用elisa系統(tǒng)進行測定，用于檢測抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合，其中將抗體加入至固定有胞外基質(zhì)的平板，并且將針對所述抗體的標(biāo)記的抗體加入其中。備選地，該測定可以例如，使用電化學(xué)發(fā)光(ecl)方法進行，其中將抗體和釕抗體的混合物加入固定有胞外基質(zhì)的平板中并且抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合基于釕的電化學(xué)發(fā)光評估。在上述步驟(i)中評估對胞外基質(zhì)結(jié)合的抗-il-8抗體可以是抗體本身或與il-8接觸。在步驟(ii)中"選擇強烈結(jié)合胞外基質(zhì)的抗-il-8抗體"意為，在胞外基質(zhì)結(jié)合的評估中，基于代表胞外基質(zhì)和抗-il-8抗體之間的結(jié)合的值比代表胞外基質(zhì)和對照抗體之間的結(jié)合的值高的標(biāo)準(zhǔn)選擇抗-il-8抗體，并且可以是，例如，2-倍，3-倍，4-倍，5-倍，6-倍，7-倍，8-倍，9-倍，10-倍，20-倍，50-倍，100-倍，或更多；然而，比率不特別限于上述實例。除了il-8的存在，條件優(yōu)選與在評估抗-il-8抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合的步驟中相同。用于比較數(shù)種修飾的抗-il-8抗體的對照抗-il-8抗體可以是未修飾的抗-il-8抗體。在該情況下，條件優(yōu)選相同，除了存在il-8以外。具體而言，在一個實施方案中，公開內(nèi)容c包括從多種不與il-8接觸的抗-il-8抗體中選擇具有代表胞外基質(zhì)結(jié)合的更高值的抗體。在另一個實施方案中，公開內(nèi)容c包括從多種與il-8接觸的抗-il-8抗體中選擇代表胞外基質(zhì)結(jié)合的更高值的抗體。在一個備選實施方案中，在步驟(ii)中"選擇強烈結(jié)合胞外基質(zhì)的抗-il-8抗體"意為，當(dāng)評估胞外基質(zhì)結(jié)合時，可以基于抗體和胞外基質(zhì)之間的結(jié)合根據(jù)il-8的存在而改變的標(biāo)準(zhǔn)來選擇抗體。表示與il-8接觸的抗-il-8抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合的值與表示不與il-8接觸的抗-il-8抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合的值的比率可以是，例如，2至1000。此外，值之間的比率可以是2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，或1000。c.測定可以通過本領(lǐng)域中已知的各種方法對在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)提供的抗-il-8抗體就其物理/化學(xué)性質(zhì)和/或生物活性進行鑒定、篩選或表征。1.結(jié)合測定和其他測定在一個方面，可以通過已知方法對公開內(nèi)容c的抗體評估其抗原結(jié)合活性，所述方法例如，elisa，蛋白質(zhì)印跡，動力學(xué)排除測定(kinexatm)，和使用裝置如biacore(gehealthcare)的表面等離子共振。在一個實施方案中，結(jié)合親和力可以使用biacoret200(gehealthcare)以下列方式測量。通過胺偶聯(lián)方法將適量的捕獲蛋白(例如，蛋白a/g(pierce))固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上，并且允許捕獲目標(biāo)抗體。然后，將稀釋的抗原溶液和運行緩沖液(作為參照溶液：例如，0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph7.4)注射以將抗原分子與捕獲在傳感芯片上的抗體相互作用。使用10mm甘氨酸hcl溶液(ph1.5)再生傳感芯片。在預(yù)定的溫度(例如，37℃，25℃，或20℃)進行測量。結(jié)合速率常數(shù)kon(1/ms)和解離速率常數(shù)koff(1/s)(二者都是動力學(xué)參數(shù))從通過測量獲得的傳感圖計算。每種抗體對于抗原的kd(m)基于這些常數(shù)計算。使用biacoret200評價軟件(gehealthcare)計算每個參數(shù)。在一個實施方案中，il-8可以如下文所述定量。將包含小鼠igg恒定區(qū)的抗-人il-8抗體固定在板上。包含結(jié)合于人源化抗-il-8抗體的il-8的溶液(其不與上述抗-人il-8抗體競爭)，等分到固定化平板上。攪拌后，加入生物素化的抗-人igκk輕鏈抗體并使其反應(yīng)一定時期。然后，進一步加入sulfo-tag-標(biāo)記的鏈霉親和素并使其反應(yīng)一定時期。然后，加入測定緩沖液并立即用sectorimager2400(mesoscalediscovery)進行測量。2.活性測定在一個方面，提供測定以鑒別具有生物活性的抗-il-8抗體。生物活性包括，例如，il-8-中和活性和阻斷il-8信號的活性。公開內(nèi)容c還提供體內(nèi)和/或體外具有所述生物活性的抗體。在一個實施方案中，確定il-8中和水平的方法不特別限制并且其還可以通過下文所述方法確定。pathhuntertmcho-k1cxcr2β-arrestin細(xì)胞系(discoverx，cat.#93-0202c2)是人工細(xì)胞系，其被產(chǎn)生用于表達已知為人il-8受體的人cxcr2并且在接收由人il-8導(dǎo)致的信號時發(fā)出化學(xué)發(fā)光。當(dāng)將人il-8加入細(xì)胞的培養(yǎng)基中時，化學(xué)發(fā)光以取決于加入的人il-8的濃度的方式從細(xì)胞發(fā)出。當(dāng)將人il-8與抗-人il-8抗體組合加入培養(yǎng)基時，與不加入抗體時相比，細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光降低或不可檢測，因為抗-人il-8抗體可以阻斷il-8信號傳導(dǎo)。具體而言，抗體的人il-8-中和活性越強，化學(xué)發(fā)光水平越弱；并且抗體的人il-8-中和活性越弱，化學(xué)發(fā)光水平越高。因此，抗-人il-8抗體的人il-8-中和活性可以通過檢查上述差異來評估。d.藥物制劑包含本文公開內(nèi)容c描述的范圍內(nèi)所述的抗-il-8抗體的藥物制劑可以通過將具有所需純度的抗-il-8抗體與一種或多種任選的藥用載體混合來以凍干的制劑或水溶液制劑形式制備(參見，例如，remington'spharmaccuticalsciences第16版，osol，a.ed.(1980))。藥用載體在使用的劑量和濃度通常是無毒的，并且包括但不限于緩沖劑如磷酸鹽，檸檬酸鹽，組氨酸，和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲鎓；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚，丁基或芐基醇；對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；雷瑣酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)的多肽；蛋白如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸；單糖類，二糖類，和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑如edta；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；形成鹽的平衡離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如，zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子性表面活性劑如tweentm，pluronicstm，或聚乙二醇(peg)。本文中的示例性藥用載體還包括間質(zhì)藥物分散劑如可溶性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(shasegp)，例如，人可溶性ph-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，如rhuph20(hylenextm，baxterinternational，inc.)。某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20，在美國申請公開號2005/0260186和2006/0104968中描述。在一個方面，將shasegp與一種或多種糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanases)如軟骨素酶組合。示例性的凍干的抗體制劑在美國專利號6,267,958中描述。水性抗體制劑包括美國專利號6,171,586和wo2006/044908中描述的那些；并且wo2006/044908制劑包括組氨酸-乙酸鹽緩沖液。本文中公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)的制劑還可以含有多于一種對于治療的特定適應(yīng)證所必需的活性成分，優(yōu)選彼此沒有不利影響的具有互補活性的那些。所述活性成分適當(dāng)?shù)匾詫τ陬A(yù)期目的有效的量組合存在。活性成分可以在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳液，納米粒子和納米膠囊)中或大乳液中，分別裝入，例如，通過凝聚技術(shù)或通過界面多聚化制備的微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。所述技術(shù)在remington'spharmaceuticalsciences第16版，osol，a.ed.(1980)中公開?？梢灾苽涑掷m(xù)-釋放制劑。持續(xù)-釋放制劑的適當(dāng)實例包括含有公開內(nèi)容c的抗-il8抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)是成形的物品的形式，例如，膜或微膠囊。用于體內(nèi)施用的制劑通常是無菌的。無菌性可以容易實現(xiàn)，例如，通過經(jīng)無菌過濾膜過濾實現(xiàn)。e.治療方法和組合物在一些實施方案中，根據(jù)公開內(nèi)容c提供的抗-il-8抗體用于治療方法。在一個方面，提供用作藥物組合物的抗-il-8抗體。在備選的方面，提供用于治療其中il-8過量存在的疾病的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，提供用于治療其中il-8過量存在的疾病的方法的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于治療患有其中il-8過量存在的疾病(例如，由于存在過量il-8引起的疾病)的個體的方法，其包括向個體施用有效量的抗-il-8抗體。在另一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于所述方法的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及包含有效量的抗-il-8抗體的藥物組合物，其用于治療其中il-8過量存在的疾病。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及抗-il-8抗體在制備用于其中il-8過量存在的疾病的藥物組合物中的用途。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及有效量的抗-il-8抗體在治療其中il-8過量存在的疾病中的用途。其中il-8過量存在的疾病包括，但不限于，炎性皮膚病如炎性角化病(銀屑病，等)，特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)，和接觸性皮炎；自身免疫病如慢性炎性疾病，包括慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)，和貝赫切特病(behcetdiseas)；炎性腸病如克羅恩病(crohn'sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis)；炎性肝病如乙型肝炎(hepatitisb)，丙型肝炎(hepatitisc)，酒精性肝炎(alcoholichepatitis)，和藥物引起的過敏性肝炎；炎性腎病如腎小球性腎炎(glomerularnephritis)；炎性呼吸道疾病如支氣管炎和哮喘；慢性炎性血管疾病如動脈粥樣硬化(atherosclerosis)；多發(fā)性硬化；口瘡；聲帶炎(chorditis)；人工器官/人工血管引起的炎癥；惡性腫瘤如卵巢癌，肺癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌，黑素瘤，頭頸癌和腎癌；感染造成的膿毒病；囊性纖維化(cysticfibrosis)；肺纖維化；和急性肺損傷。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于抑制具有生物活性的il-8的積累的抗-il-8抗體。"抑制il-8的積累"可以通過防止體內(nèi)預(yù)先存在的il-8的量增加或通過降低體內(nèi)預(yù)先存在的il-8的量來實現(xiàn)。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供抑制個體中il-8的積累從而抑制具有生物活性的il-8的積累的抗-il-8抗體。本文中，"體內(nèi)存在的il-8"可以指與抗-il-8抗體復(fù)合的il-8或游離il-8；備選地，其可以指作為其總和的總il-8。本文中，"體內(nèi)存在"可以意為"體內(nèi)分泌到細(xì)胞外"。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于抑制具有生物活性的il-8的積累的方法，其包括施用有效量的抗-il-8抗體的步驟。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及抑制具有生物活性的il-8的積累的藥物組合物，其包括有效量的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于抑制具有生物活性的il-8的積累。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及有效量的抗-il-8抗體在抑制具有生物活性的il-8的積累中的用途。在一個實施方案中，與不具有ph-依賴性結(jié)合活性的抗-il-8抗體相比，公開內(nèi)容c的抗-il-8抗體抑制il-8的積累。在上述實施方案中，"個體"優(yōu)選是人。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于抑制血管生成(例如，新血管生成)的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于抑制個體中新血管生成的方法，其包括向所述個體施用有效量的抗-il-8抗體，并且還提供用于所述方法的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及用于抑制新血管生成的藥物組合物，其包含有效量的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于抑制新血管生成。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及有效量的抗-il-8抗體在抑制新血管生成中的用途。在上述實施方案中，"個體"優(yōu)選是人。在備選的方面，公開內(nèi)容c提供抗-il-8抗體，其用于抑制對中性粒細(xì)胞遷移的促進。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c提供用于抑制對個體中中性粒細(xì)胞遷移的促進的方法，其包括向個體施用有效量的抗-il-8抗體；并且還提供用于所述方法的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及用于抑制個體中對中性粒細(xì)胞遷移的促進的藥物組合物，其包含有效量的抗-il-8抗體。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及抗-il-8抗體在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于抑制個體中對中性粒細(xì)胞遷移的促進。在一個實施方案中，公開內(nèi)容c涉及有效量的抗-il-8抗體在抑制個體中對中性粒細(xì)胞遷移的促進的用途。在上述實施方案中，"個體"優(yōu)選是人。在一個備選實施方案中，公開內(nèi)容c提供藥物組合物，其包含本文中提供的抗-il-8抗體，例如，用于上述治療方法中的任一個。在一個實施方案中，藥物組合物包含公開內(nèi)容c中提供的抗-il-8抗體和藥用載體。公開內(nèi)容c的抗體可以單獨或與其他藥劑組合用于治療。例如，公開內(nèi)容c的抗體可以與至少一種另外的治療劑共同施用。公開內(nèi)容c的抗體(和任意另外的治療劑)可以通過任意適當(dāng)?shù)姆绞绞┯茫c胃外，肺內(nèi)和鼻內(nèi)，并且如果需要用于局部治療，病灶內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下施用。劑量給藥可以是通過任意合適的途徑，例如，通過注射如靜脈內(nèi)或皮下注射，部分取決于施用是短期或長期。各種劑量給藥時間表包括，但不限于，在各個時間點單次或多次施用，本文中可以考慮推注施用，和脈沖輸注。優(yōu)選以與良好醫(yī)學(xué)實踐相一致的方式配制、劑量給藥和施用公開內(nèi)容c的抗體。在此情況下考慮的因素包括治療的特定病癥，治療的特定哺乳動物，個體患者的臨床狀況，病癥的原因，遞送藥物組合物的部位，施用方法，施用時間表，和醫(yī)療執(zhí)業(yè)者已知的其他因素。抗體不需要，但任選地與一種或多種目前用于預(yù)防或治療目標(biāo)病癥的藥劑一起配制。所述其他藥劑的有效量取決于在制劑中存在的抗體的量，病癥或療法的類型，和以上討論的其他因素。這些通常可以以與在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)描述的相同的劑量和經(jīng)由相同的施用途徑使用，或在本文公開內(nèi)容c的描述的范圍內(nèi)描述的劑量的1至99％，或以經(jīng)驗/臨床上確定為合適的任意劑量和任意途徑使用。為了預(yù)防或治療疾病，公開內(nèi)容c的抗體的適當(dāng)劑量(當(dāng)與一種或多種其他另外的治療劑單獨或組合使用時)取決于要治療的疾病的類型，抗體的類型，疾病的嚴(yán)重度和進程，施用抗體變體是否用于預(yù)防性或治療性目的，之前的治療，患者的臨床史和對抗體的反應(yīng)，和主治醫(yī)師的判斷?？贵w一次或經(jīng)一系列治療適當(dāng)施用給患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重度，約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg至10mg/kg)的抗體可以是施用給患者的初始候選劑量，例如，通過單次施用或多次分開的施用，或通過連續(xù)輸注。一個典型的每日劑量范圍可以從約1mg/kg至100mg/kg或更多，取決于上述因素。對于經(jīng)數(shù)天或更長的重復(fù)施用，取決于病況，治療通?？梢猿掷m(xù)，直到觀察到疾病癥狀的所需抑制效果。典型的抗體劑量可以落在，例如，約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍內(nèi)。因此，可以向患者施用例如，約0.5mg/kg，例如，2.0mg/kg，例如，4.0mg/kg，或例如，10mg/kg(或其任意組合)的一個或多個劑量。所述劑量可以間歇性施用，例如，每周或每三周(例如，以患者接收約二至約二十個劑量，或約六個劑量的抗體的方式)?？赡苁┯闷鹗几叩募虞d劑量，接著一個或多個較低劑量；然而，其他劑量方案可以是有用的。該療法的進展可以容易通過常規(guī)技術(shù)和測定監(jiān)視。f.制品在公開內(nèi)容c的另一方面，本公開內(nèi)容提供制品，其包含用于治療，預(yù)防和/或診斷上述病癥的物質(zhì)。所述制品包括容器和在容器上或與容器關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或藥品說明書(packageinsert)。合適的容器包括，例如，瓶，小瓶，靜脈內(nèi)溶液袋。容器可以由各種材料如玻璃或塑料形成。所述容器容納組合物，所述組合物是其本身或與有效治療、預(yù)防和/或診斷所述病癥的另一組合物組合，并且可以具有無菌接口(例如，容器可以是具有可由皮下注射針刺破的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性成分是公開內(nèi)容c的抗體。標(biāo)簽或藥品說明書表示，組合物用于治療選擇的病癥。此外，制品可以包括：(a)第一容器，其包含含有公開內(nèi)容c的抗體的組合物；和(b)第二容器，其包含含有另外的細(xì)胞毒性劑或不同治療劑的組合物。公開內(nèi)容c的實施方案中的制品還可以包括藥品說明書，其表明組合物可以用于治療特定病癥。備選地或另外，制品還可以包括，例如，第二(或第三)容器，其包含藥用緩沖劑如注射用抑菌水(bwfi)，磷酸鹽緩沖鹽水，ringer's溶液和葡萄糖溶液。制品還可以包括從商業(yè)角度或用戶角度所需的其他材料，包括其他緩沖劑，稀釋劑，過濾器，針頭和注射器?；诒绢I(lǐng)域普通技術(shù)知識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，公開內(nèi)容c還包括本文所述的整體實施方案中的一個或多個的全部或部分的所有組合，除了存在技術(shù)矛盾的情況。公開內(nèi)容a，b，或c本文中引用的全部技術(shù)背景文獻通過參考結(jié)合于本文中。如本文中使用的，術(shù)語"和/或"理解為包括術(shù)語"和/或"之前和之后的項目的組合的意思，其包括通過所述術(shù)語適當(dāng)連接的項目的所有組合。在多種要素在本文中利用術(shù)語如第一、第二、第三、第四等描述時，要理解，要素不受這些術(shù)語限制。這些術(shù)語僅用于將要素與其他要素區(qū)分，并且要理解，在不偏離公開內(nèi)容a、b、和c的范圍的情況下，例如，第一要素可以稱為第二要素，并且類似地，第二要素能夠稱為第一要素。除非另外明確陳述或除非在上下文存在不一致，本文中以單數(shù)形式表示的任何術(shù)語意為還包括復(fù)數(shù)形式，并且本文中以復(fù)數(shù)形式表示的任何術(shù)語意為還包括單數(shù)形式。本文中使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方案，并且不意在限制本公開內(nèi)容。除非另外不同定義，本文中使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語)解釋為具有與公開內(nèi)容a，b和c涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的意義，并且將不以理想化的或過于正式的意義解釋。如本文中使用的，術(shù)語"包含"意在指定描述的項目(成員、步驟、要素、數(shù)量等)的存在，除非上下文明確另外指示；并且術(shù)語不排除其他項目(成員、步驟、要素、數(shù)量等)的存在。本公開內(nèi)容a，b和c的實施方案參考示意說明描述，為了清楚，可以將其放大。除非上下文中存在不一致，本文中使用的數(shù)值要理解為基于本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技術(shù)知識，表示一定范圍的值。例如，表述"1mg"理解為描述為"約1mg"，具有一定變化。例如，表述"1至5項"理解為具體描述并且分別為"1項，2項，3項，4項，5項"，除非上下文存在不一致。實施例下文中，公開內(nèi)容a，b和c將通過實施例1至4和21至23，實施例5至7，19和20，以及實施例8至19，分別具體描述，但它們不要被認(rèn)為限制于其中。要理解，考慮到上述提供的一般描述，可以實踐各種其他實施方案。實施例1具有提高的pi的ph-依賴性結(jié)合人il-6受體的人抗體的產(chǎn)生wo2009/125825中公開的fv4-igg1是以ph-依賴性的方式結(jié)合人il-6受體的抗體，并且包含vh3-igg1(seqidno：24)作為重鏈以及vl3-ck(seqidno：32)作為輕鏈。為了增加fv4-igg1的pi，向fv4-igg1的可變區(qū)引入減少帶負(fù)電的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)的數(shù)量、同時增加帶正電的氨基酸(如精氨酸和賴氨酸)的氨基酸置換。具體而言，通過在重鏈vh3-igg1中用谷氨酰胺置換位置16處的谷氨酸，用精氨酸置換位置43處的谷氨酸，用賴氨酸置換位置64處的谷氨酰胺，和用谷氨酰胺置換位置105處的谷氨酸(根據(jù)kabat編號)，產(chǎn)生vh3(高_pi)-igg1(seqidno：25)，其為具有提高的pi的重鏈。類似地，通過在輕鏈vl3-ck中用精氨酸置換位置18處的絲氨酸，用精氨酸置換位置24處的谷氨酰胺，用賴氨酸置換位置45處的谷氨酸，用谷氨酰胺置換位置79處的谷氨酸，和用賴氨酸置換位置107處的谷氨酸(根據(jù)kabat編號)，產(chǎn)生vl3(高_pi)-ck(seqidno：33)，其為具有提高的pi的輕鏈。當(dāng)在vl3-ck的位置79處引入置換時，將涉及在位置80處用脯氨酸置換丙氨酸和在位置83處用異亮氨酸置換丙氨酸的修飾同時引入，盡管目的不是用于提高pi。通過參照實施例2的方法產(chǎn)生以下抗體：(a)低_pi-igg1，其包含vh3-igg1作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(b)中_pi-igg1，其包含vh3-igg1作為重鏈和vl3(高_pi)-ck作為輕鏈；和(c)高_pi-igg1，其包含vh3(高_pi)-igg1作為重鏈和vl3(高_pi)-ck作為輕鏈。接著，使用genetyx-sv/rcver9.1.0(genetyxcorporation)，使用本領(lǐng)域中已知的方法計算每種產(chǎn)生的抗體的理論pi(參見，例如，skoog等人，trendsanalyt.chem.5(4)：82-83(1986))。認(rèn)為抗體分子中的所有半胱氨酸的側(cè)鏈形成二硫鍵，并且半胱氨酸側(cè)鏈對pka的貢獻從計算中排除。計算的理論pi值在表3中顯示。在低_pi-igg1的理論pi是6.39的同時，中_pi-igg1和高_pi-igg1的那些分別是8.70和9.30，表明理論pi值以逐步的方式增加。wo2011/122011公開了fv4-igg1-f11(下文，稱為低_pi-f11)和fv4-igg1-f939(下文，稱為低_pi-f939)，其fcrn-介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝取通過將氨基酸置換引入fv4-igg1的fc區(qū)和賦予在中性ph條件下fcrn-結(jié)合能力而增強。此外，wo2013/125667公開了fv4-igg1-f1180(下文，稱為低_pi-f1180)，其fcγr-介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝取通過將氨基酸置換引入fv4-igg1的fc區(qū)以增加其在中性ph條件的fcγr-結(jié)合能力而增強。同時，將用于通過在內(nèi)體中增加其在酸性ph條件的fcrn結(jié)合而增強抗體的血漿保留的氨基酸修飾引入fv4-igg1-f1180。通過增加含有這些新fc區(qū)變體的抗體的pi，產(chǎn)生下文所示抗體。具體而言，將wo2011/122011中的vh3-igg1-f11(seqidno：30)和vh3-igg1-f939(seqidno：26)，和wo2013/125667中的vh3-igg1-f1180(seqidno：28)各自進行在位置16處用谷氨酰胺對谷氨酸的置換，在位置43處用精氨酸對谷氨酸的置換，在位置64處用賴氨酸對谷氨酰胺的置換，和在位置105處用谷氨酰胺對谷氨酸的置換(根據(jù)kabat編號)，以分別產(chǎn)生vh3(高_pi)-f11(seqidno：31)，vh3(高_pi)-f939(seqidno：27)，和vh3(高_pi)-f1180(seqidno：29)，其為具有提高的pi的重鏈。以下抗體通過參照實施例2的方法，使用這些重鏈產(chǎn)生：(1)低_pi-f939，其包含vh3-igg1-f939作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(2)中_pi-f939，其包含vh3(高_pi)-f939作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(3)高_pi-f939，其包含vh3(高_pi)-f939作為重鏈和vl3(高_pi)-ck作為輕鏈；(4)低_pi-f1180，其包含vh3-igg1-f1180作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(5)中_pi-f1180，其包含vh3-igg1-f1180作為重鏈和vl3(高_pi)-ck作為輕鏈；(6)高_pi-f1180，其包含vh3(高_pi)-f1180作為重鏈和vl3(高_pi)-ck作為輕鏈；(7)低_pi-f11，其包含vh3-igg1-f11作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；和(8)高_pi-f11，其包含vh3(高_pi)-f11作為重鏈和vl3(高_pi)-ck作為輕鏈。接著，對于每種產(chǎn)生的抗體的理論pi，使用genetyx-sv/rcver9.1.0(genetyxcorporation)，通過與在前所述相似的方法計算。計算的理論pi值在表3中顯示。在所有新的含有fc區(qū)變體的抗體中，理論pi值以低_pi，中_pi和高_pi的順序，以逐步的方式增加。[表3]抗體名稱理論pi低_pi-igg16.39中_pi-igg18.70高_pi-igg19.30低_pi-f9396.67中_pi-f9398.70高_pi-f9399.42低_pi-f11806.39中_pi-f11808.70高_pi-f11809.29低_pi-f116.39高_pi-f119.28實施例2顯示ph-依賴性結(jié)合的具有提高的pi的抗體的抗原去除效果(2-1)pi-調(diào)節(jié)的ph-依賴性的結(jié)合人il-6受體的抗體的體內(nèi)測定如下文所示，使用實施例1中產(chǎn)生的各種ph-依賴性結(jié)合人il-6受體的抗體進行體內(nèi)測定：低_pi-igg1，高_pi-igg1，低_pi-f939，中_pi-f939，高_pi-f939，低_pi-f1180，中_pi-f1180，和高_pi-f1180。將通過參照實施例3的方法制備的可溶性人il-6受體(也稱為″hsil-6r″)，抗-人il-6受體抗體，和人免疫球蛋白制備物sanglopor同時施用于人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrntg品系32+/+小鼠，jacksonlaboratories；methodsmol.biol.602：93-104(2010))，并且評估隨后的可溶性人il-6受體的體內(nèi)動力學(xué)。含有可溶性人il-6受體，抗-人il-6受體抗體和sanglopor(濃度分別為5μg/ml，0.1mg/ml，和100mg/ml)的混合溶液通過尾靜脈以10ml/kg施用一次。因為抗-人il-6受體抗體充分超過可溶性人il-6受體存在，所以認(rèn)為幾乎所有可溶性人il-6受體被抗體結(jié)合。施用后15分鐘，七小時，一天，兩天，三天和七天，收集血液。將收集的血液立即在4℃和15,000rpm進行離心15分鐘以獲得血漿。將分離的血漿儲存在設(shè)為-20℃或以下的冰箱中，直到進行測量。(2-2)通過電化學(xué)發(fā)光方法測量血漿中的可溶性人il-6受體濃度小鼠血漿中的可溶性人il-6受體濃度通過電化學(xué)發(fā)光方法測量。分別制備調(diào)節(jié)至250，125，62.5，31.25，15.61，7.81，或3.90pg/ml的濃度用于校準(zhǔn)曲線的可溶性人il-6受體樣品，和稀釋50-倍或更多的小鼠血漿測定樣品。將樣品與用sulfo-tagnhs酯(mesoscalediscovery)釕標(biāo)記的單克隆抗-人il-6r抗體(r&d)，生物素化的抗-人il-6r抗體(r&d)，和托珠單抗(tocilizumab)(cas編號：375823-41-9)(其是結(jié)合人il-6受體的抗體)混合，并且隨后將它們在37℃反應(yīng)過夜。將托珠單抗的終濃度調(diào)節(jié)至333μg/ml。然后，將反應(yīng)溶液分散到鏈霉親和素goldmulti-array平板(mesoscalediscovery)中。在室溫另外一小時的反應(yīng)后，洗滌反應(yīng)溶液。然后，在將readbuffert(x4)(mesoscalediscovery)分散入平板后，立即使用sectorimager2400(mesoscalediscovery)進行測量。使用分析軟件，softmaxpro(moleculardevices)，基于在校準(zhǔn)曲線中的響應(yīng)計算可溶性人il-6受體的濃度。靜脈內(nèi)施用后，觀察到的人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿中可溶性人il-6受體的濃度的改變在圖1，2和3中顯示。圖1顯示增強抗原去除的效果，其中可變區(qū)的pi在天然igg1恒定區(qū)的情況下增加。圖2顯示增強抗原去除的效果，其中可變區(qū)的pi在被賦予在中性ph條件下結(jié)合fcrn的能力的抗體(f939)中增加。圖3顯示增強抗原去除的效果，其中可變區(qū)的pi在其fcγr-結(jié)合能力在中性ph條件下增強的抗體(f1180)中增加。在所有情形中表明，通過提高抗體的pi，通過ph-依賴性結(jié)合的抗體來去除抗原的速率可以加速。也已經(jīng)表明，通過進一步賦予在中性ph條件下對fcrn或fcγr的結(jié)合能力的增加，與當(dāng)在ph-依賴性結(jié)合抗體中僅pi提高時相比，抗原去除速率可以進一步加速(比較圖1和圖2以及3)。(2-3)pi-調(diào)節(jié)的ph-依賴性結(jié)合人il-6受體的抗體的體內(nèi)輸注測定下文使用實施例1中產(chǎn)生的各種ph-依賴性結(jié)合人il-6受體的抗體：低_pi-igg1，高_pi-igg1，低_pi-f11，和高_pi-f11，進行體內(nèi)測定。將含有可溶性人il-6受體的輸注泵(mini-osmotic泵模型2004；alzet)皮下移植在人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrntg品系32+/+小鼠，jacksonlaboratories；methodsmol.biol.602：93-104(2010))的背部，以產(chǎn)生其可溶性人il-6受體的血漿濃度保持恒定的模型動物。將抗-人il-6受體抗體施用給模型動物，并且評估施用后抗體的體內(nèi)動力學(xué)。具體而言，將通過本領(lǐng)域中已知的方法獲得的單克隆抗-小鼠cd4抗體以20mg/kg施用于尾靜脈中一次，以抑制小鼠自身可能產(chǎn)生的針對可溶性人il-6受體的中和抗體的產(chǎn)生。然后，將含有92.8μg/ml的可溶性人il-6受體的輸注泵皮下移植在小鼠背部。移植輸注泵后三天，將抗-人il-6受體抗體以1mg/kg施用入尾靜脈一次。施用抗-人il-6受體抗體后15分鐘，七小時，一天，兩天，三或四天，六或七天，13或14天，20或21天，和27或28天，從小鼠收集血液。收集的血液立即在15,000rpm和4℃離心15分鐘，獲得血漿。將分離的血漿儲存在-20℃或以下的冰箱中，直到進行測量。(2-4)通過電化學(xué)發(fā)光方法測量血漿hsil-6r濃度通過電化學(xué)發(fā)光方法測量小鼠血漿中的hsil-6r濃度。將調(diào)節(jié)至250，125，62.5，31.25，15.61，7.81，或3.90pg/ml的用于校準(zhǔn)曲線的hsil-6r樣品和稀釋50-倍或更多的小鼠血漿測定樣品與用sulfo-tagnhs酯(mesoscalediscovery)釕標(biāo)記的單克隆抗-人il-6r抗體(r&d)，生物素化的抗-人il-6r抗體(r&d)，和托珠單抗混合，并且將它們在37℃反應(yīng)過夜。將托珠單抗的終濃度調(diào)節(jié)至333μg/ml。然后，將反應(yīng)溶液分散到鏈霉親和素goldmulti-array平板(mesoscalediscovery)中。在室溫反應(yīng)另外一小時后，洗滌反應(yīng)溶液。然后，在將readbuffert(x4)(mesoscalediscovery)分散到平板中后，立即使用sectorimager2400(mesoscalediscovery)進行測量。使用分析軟件softmaxpro(moleculardevices)，基于在校準(zhǔn)曲線中的響應(yīng)計算hsil-6r濃度。測量的人il-6受體濃度的改變在圖4中顯示。對于其fc區(qū)是天然igg1的fc區(qū)的抗體(高_pi-igg1)和含有在中性ph條件下具有增強的對fcrn的結(jié)合的新fc區(qū)變體的抗體(高_pi-f11)，可溶性人il-6受體的血漿濃度在施用高-pi抗體(也稱為"高_pi")的情況下減少(與施用低-pi抗體(也稱為"低_pi")相比)。不受特定理論限制，獲自這些實驗的結(jié)果還可以如下解釋：當(dāng)施用的抗體的fc區(qū)是天然igg抗體的fc區(qū)時，認(rèn)為攝入細(xì)胞主要通過非特異性攝取(胞飲)發(fā)生。本文中，因為細(xì)胞膜帶負(fù)電，所以施用的抗體-抗原復(fù)合物的pi越高(即，分子的電荷作為整體傾向于正電荷)，復(fù)合物可以越容易接近細(xì)胞膜，并且非特異性攝取可以越容易發(fā)生。當(dāng)具有提高的pi的抗體與抗原形成復(fù)合物時，該復(fù)合物作為整體也具有提高的pi(與在原始抗體和抗原之間形成的復(fù)合物相比)；因此，可以增加細(xì)胞內(nèi)攝入。因此，通過增加顯示ph-依賴性抗原結(jié)合的抗體的pi，從血漿去除抗原的速度或速率可以進一步加速，并且血漿中的抗原濃度可以保持在較低水平。在這些實施例中，通過引入降低帶負(fù)電的氨基酸的數(shù)量和/或增加帶正電的氨基酸的數(shù)量的氨基酸置換(其可能暴露在抗體分子的表面(在抗體可變區(qū)中))完成抗體pi的提高。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通過所述pi提高獲得的效應(yīng)主要(或基本上)不取決于靶抗原的類型或構(gòu)成抗體的氨基酸序列，但可以預(yù)期取決于pi。例如，wo2007/114319和wo2009/041643以通用術(shù)語描述以下事項。因為igg抗體的分子量足夠大，其主要代謝通路不涉及腎分泌。已知具有fc的igg抗體具有長的半衰期，因為它們通過細(xì)胞(包括血管的內(nèi)皮細(xì)胞)中表達的fcrn的補救途徑而再循環(huán)，并且認(rèn)為igg主要在內(nèi)皮細(xì)胞中代謝。更具體而言，認(rèn)為非特異攝入內(nèi)皮細(xì)胞的igg通過結(jié)合fcrn而再循環(huán)，并且不能結(jié)合fcrn的分子被代謝。其fcrn-結(jié)合能力降低的igg具有較短的血液半衰期，并且相反，血液半衰期可以通過增加其對fcrn的結(jié)合能力而延長。這種方式，之前的用于控制igg在血液中的動力學(xué)的方法涉及修飾fc以改變對fcrn的結(jié)合能力；然而，wo2007/114319(主要是在fr區(qū)中置換氨基酸的技術(shù))和wo2009/041643(主要是在cdr區(qū)中置換氨基酸的技術(shù))的工作實施例表明，不論靶抗原類型如何，通過修飾抗體的可變區(qū)的pi，可以在不修飾fc的情況下控制其血液半衰期。認(rèn)為igg抗體非特異性攝入內(nèi)皮細(xì)胞的速率取決于帶負(fù)電的細(xì)胞表面和igg抗體的物理化學(xué)庫侖相互作用。因此，認(rèn)為降低(增加)igg抗體的pi和因此降低(增加)庫侖相互作用，降低(增加)其非特異的內(nèi)皮細(xì)胞的攝入，并且因此，降低(增加)其在內(nèi)皮細(xì)胞中的代謝，由此使得能夠控制血漿藥代動力學(xué)。因為內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞表面的負(fù)電荷之間的庫侖相互作用是物理化學(xué)相互作用，所以認(rèn)為該相互作用不主要取決于構(gòu)成抗體的氨基酸序列本身。因此，本文中提供的控制血漿藥代動力學(xué)的方法不僅適用于特定抗體，而且它們可以廣泛用于任何含有抗體可變區(qū)的多肽。本文中，庫侖相互作用的降低(增加)意為表示為吸引力的庫侖力的降低(增加)和/或表示為排斥力的庫侖力的增加(降低)。用于完成上述的氨基酸置換可以是單個氨基酸置換或多個氨基酸置換的組合。在一些實施方案中，提供用于將單個氨基酸置換或多個氨基酸置換的組合引入暴露在抗體分子表面的一個或多個位置。備選地，引入的多個氨基酸置換可以在構(gòu)象上彼此接近安置。本發(fā)明人產(chǎn)生這樣的想法，例如，當(dāng)用帶正電的氨基酸(優(yōu)選精氨酸或賴氨酸)置換可以暴露在抗體分子表面的氨基酸時或當(dāng)使用預(yù)先存在的帶正電的氨基酸(優(yōu)選精氨酸或賴氨酸)時，可以優(yōu)選進一步用帶正電的氨基酸置換一個或多個構(gòu)象上與那些氨基酸接近的氨基酸(在某些情況下，甚至埋在抗體分子內(nèi)的一個或多個氨基酸)，由此產(chǎn)生在構(gòu)象上接近的位置局部聚簇的正電荷。本文中，"構(gòu)象上接近的一個或多個位置"的定義不特別限制，但例如，其可以意為在彼此的20a內(nèi)，優(yōu)選15a內(nèi)，或更優(yōu)選10a內(nèi)引入單個氨基酸置換或多個氨基酸置換的狀態(tài)。目的氨基酸置換是否在暴露在抗體分子表面的位置，或氨基酸置換是否在位置上接近可以通過已知方法如x-射線晶體學(xué)確定。這樣，通過注意到pi是表示分子的總體電荷的一個指標(biāo)，并且埋在抗體分子內(nèi)的電荷和抗體分子表面上的電荷在沒有任何區(qū)別的情況下處理，本發(fā)明人還認(rèn)為，通過廣泛和深入考慮來自電荷的影響產(chǎn)生抗體分子，其包括不僅pi而且抗體分子上的表面電荷和電荷的局部聚簇，抗原從血漿的去除速率可以進一步加速并且血漿中的抗原濃度可以保持在甚至較低水平。受體如fcrn或fcγr在細(xì)胞膜上表達，并且認(rèn)為在中性ph條件對fcrn或fcγr具有增強的親和力的抗體主要通過這些fc受體而被攝入細(xì)胞。因為細(xì)胞膜帶負(fù)電，所以當(dāng)其pi高(分子作為整體的電荷向正電荷改變)時，施用的抗體-抗原復(fù)合物更容易接近細(xì)胞膜，并且通過fc受體的攝取可以更容易發(fā)生。因此，當(dāng)它們與抗原形成復(fù)合物時，在中性ph條件下對fcrn或fcγr具有增強的親和力的抗體以及提高的pi還顯示增加的通過fc受體的細(xì)胞內(nèi)攝取。因此，通過以ph-依賴性的方式結(jié)合抗原并且在中性ph條件下對fcrn或fcγr具有增強的親和力的抗體從血漿去除抗原的速度可以通過增加其pi來加速，并且血漿抗原濃度可以保持在較低水平。實施例3具有提高的pi的ph-依賴性結(jié)合抗體的胞外基質(zhì)結(jié)合的評價。(3-1)胞外基質(zhì)結(jié)合能力的評價進行以下實驗以評價賦予抗體以ph-依賴性抗原結(jié)合性質(zhì)和進一步修飾pi對于其胞外基質(zhì)結(jié)合能力的影響。以與實施例1的方法類似的方式，產(chǎn)生具有不同pi的三種類型的抗體，其為顯示對il-6受體的ph-依賴性結(jié)合的抗體：低_pi-igg1，中_pi-igg1，和高_pi-igg1。作為不顯示對il-6受體的ph-依賴性結(jié)合的普通抗體，通過參照實施例2的方法分別產(chǎn)生wo2009125825中所述的包含h54(seqidno：34)和l28(seqidno：35)的低_pi(nph)-igg1以及包含h(wt)(seqidno：36)和l(wt)(seqidno：37)的高_pi(nph)-igg1。以與實施例1的方法類似的方式，對這些抗體計算理論pi并顯示在表4中。對il-6受體不顯示ph-依賴性結(jié)合的抗體還顯示具有與顯示ph-依賴性結(jié)合的抗體類似的增加的pi。[表4]抗體名稱理論pi低_pi-igg16.39中_pi-igg18.70高_pi-igg19.30低_pi(nph)-igg16.10高_pi(nph)-igg19.35(3-2)通過電化學(xué)發(fā)光(ecl)方法評價抗體對胞外基質(zhì)的結(jié)合使用tbs(takara)將胞外基質(zhì)(bdmatrigelbasementmembranematrix；由bd制造)稀釋至2mg/ml。以5μl/孔將稀釋的胞外基質(zhì)分散在multi-array96孔板，高結(jié)合(highbind)，bare(由mesoscalediscovery：msd制造)中，并在4℃固定過夜。然后，將ph7.4的含有150mmnacl，0.05％吐溫20，0.5％bsa，和0.01％nan3的20mmaces緩沖液分散在板中用于封閉。使用20mmph7.4的aces緩沖液(aces-t緩沖液)(含有150mmnacl，0.05％吐溫20，和0.01％nan3)將要評估的抗體稀釋至30，10，和3μg/ml，并且隨后使用含有150mmnacl，0.01％吐溫20，0.1％bsa，和0.01％nan3的20mmph7.4的aces緩沖液(dilution緩沖液)進一步稀釋，分別產(chǎn)生10，3.3，和1μg/ml的終濃度。將稀釋的抗體溶液加入去除封閉溶液的板中，并且將其在室溫振蕩一小時。去除抗體溶液，加入含有0.25％戊二醛(glutaraldehyde)的aces-t緩沖液，并且之后使其靜置10分鐘，將板用含有0.05％吐溫20的dpbs(由wakopurechemicalindustries制造)洗滌。使用sulfo-標(biāo)簽nhs酯(由msd制造)通過sulfo-標(biāo)記的山羊抗-人igg(γ)(由zymedlaboratories制造)制備用于ecl檢測的抗體。將用于檢測的抗體在稀釋緩沖液中稀釋到1μg/ml，加入板中，并且隨后在暗處在室溫振蕩一小時。去除用于檢測的抗體，并且加入通過用超純水稀釋msdread緩沖液t(4x)(由msd制造)制備的2-倍稀釋的溶液；并且隨后在sector成像儀2400(由msd制造)上測量發(fā)光量。結(jié)果顯示在圖5中。顯示ph-依賴性結(jié)合的抗體以及不顯示ph-依賴性結(jié)合的抗體都顯示通過增加其pi而增加對胞外基質(zhì)的結(jié)合。此外，出人意料地，通過提高pi改善胞外基質(zhì)結(jié)合的效果在具有ph-依賴性抗原結(jié)合的抗體中顯著。換句話說，發(fā)現(xiàn)以ph-依賴性的方式結(jié)合抗原并且具有高pi的抗體(高_pi-igg1)具有最強的對胞外基質(zhì)的親和力。不限于特定理論，獲自這些實驗的結(jié)果還可以如下解釋。已知將組氨酸修飾引入抗體可變區(qū)是向抗體賦予ph-依賴性抗原結(jié)合性質(zhì)的一種方法(參見例如，wo2009/125825)。組氨酸在其側(cè)鏈上具有咪唑基團，并且在中性ph至堿性ph條件下不帶電，但已知在酸性ph條件下帶正電。使用組氨酸的該性質(zhì)，通過將組氨酸引入抗體可變區(qū)，特別是在與抗原相互作用的位點相鄰位置的一個或多個cdr中，技術(shù)人員可以在中性和酸性ph條件之間改變與抗原相互作用的位點處的電荷環(huán)境和構(gòu)象環(huán)境?？梢灶A(yù)期所述抗體具有以ph-依賴性的方式改變的抗原親和力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，通過所述組氨酸引入獲得的效果主要(基本上)不依賴于靶抗原的類型或構(gòu)成抗體的氨基酸序列，而是依賴于組氨酸引入的位點或引入的組氨酸殘基的數(shù)量。wo2009/041643整體描述如下：蛋白-蛋白相互作用由疏水相互作用，靜電相互作用，和氫鍵組成，并且所述結(jié)合的強度通?？梢允褂媒Y(jié)合常數(shù)(親和力)或表觀結(jié)合常數(shù)(親合力)表示。ph-依賴性結(jié)合(其中結(jié)合強度在中性ph條件(例如，ph7.4)和酸性ph條件(例如，ph5.5至ph6.0)之間改變)，取決于天然存在的蛋白-蛋白相互作用。例如，前述igg分子和fcrn(已知其是igg分子的拯救受體)之間的結(jié)合，在酸性ph條件下顯示強烈結(jié)合并且在中性ph條件下顯示非常弱的結(jié)合。組氨酸殘基參與到很多以ph-依賴性的方式改變的蛋白-蛋白相互作用中。因為組氨酸殘基的pka接近6.0至6.5，所以組氨酸殘基中質(zhì)子解離的狀態(tài)在中性和酸性ph條件之間改變。更具體而言，組氨酸殘基在中性ph條件下不帶電并且是中性的，并且作為氫原子受體行使功能；而在酸性ph條件下，其帶正電并且作為氫原子供體行使功能。此外在上述igg分子-fcrn相互作用中，報道了存在于igg分子上的組氨酸殘基參與ph-依賴性結(jié)合中(martin等人，mol.cell.7(4)：867-877(2001))。因此，參與蛋白-蛋白相互作用的氨基酸殘基置換為組氨酸殘基，或在相互作用位點引入組氨酸可以對蛋白-蛋白相互作用賦予ph依賴性。對抗體和抗原之間的蛋白-蛋白相互作用進行類似處理；并且通過將組氨酸引入抗-蛋清溶菌酶抗體的cdr序列，成功獲得了在酸性ph條件下具有減小的抗原親和力的抗體突變體(ito等人，febslett.309(1)：85-88(1992))。此外，已經(jīng)報道了由于在cdr序列中引入組氨酸而在癌組織的低ph下特異性結(jié)合抗原并且在中性ph條件下弱結(jié)合相應(yīng)抗原的抗體(wo2003/105757)。同時，引入以提高pi的氨基酸殘基優(yōu)選是具有帶正電的側(cè)鏈的賴氨酸，精氨酸，或組氨酸。這些氨基酸側(cè)鏈的標(biāo)準(zhǔn)pka對于賴氨酸是10.5，對于精氨酸是12.5，并且對于組氨酸是6.0(skoog等人，trendsanal.chem.5(4)：82-83(1986))?；诒绢I(lǐng)域中已知的酸堿平衡理論，這些pka值意為，在ph10.5的溶液中，50％的賴氨酸側(cè)鏈帶正電并且其余50％不帶電。隨著溶液的ph增加，賴氨酸側(cè)鏈的帶正電比例降低，并且在比賴氨酸的pka高1個ph值的ph11.5的溶液中，帶正電的比例變?yōu)榇蠹s9％。另一方面，隨著溶液的ph降低，帶正電的比例增加，并且在比賴氨酸的pka低1個ph值的ph9.5的溶液中，帶正電的比例變?yōu)榧s91％。該理論對于精氨酸和組氨酸以類似的方式適用。更具體而言，在中性ph(例如，ph7.0)溶液中接近100％的賴氨酸或精氨酸帶正電，而大約9％的組氨酸帶正電。因此，在組氨酸在中性ph條件帶正電的情況下，因為與賴氨酸或精氨酸相比，該水平低，所以認(rèn)為賴氨酸和精氨酸是引入用于提高pi的更有利的氨基酸。此外，根據(jù)holash等人(proc.natl.acad.sci.99(17)：11393-11398(2002)，在認(rèn)為提高pi的修飾的引入作為增加胞外基質(zhì)結(jié)合的修飾是有效的同時，已經(jīng)認(rèn)為由于上述原因，與引入組氨酸的置換相比，引入賴氨酸或精氨酸的置換是更有利的氨基酸修飾。如本文中首先公開的，通過組合組氨酸的引入(以賦予ph-依賴性抗原結(jié)合性質(zhì))連同抗體的提高pi的修飾，抗體對胞外基質(zhì)的親和力的出人意料的協(xié)同增加是可能的。實際上，在高_pi-igg1的pi是9.30的同時，高_pi(nph)-igg1的pi是9.35，并且因此高_pi-igg1的值稍低。盡管如此，對于高_pi-igg1而言，對胞外基質(zhì)的實際親和力明顯更強。這表明，對胞外基質(zhì)的親和力不能僅由pi水平解釋，并且可以說引入提高pi的修飾和組氨酸修飾的組合顯示協(xié)同效果。該結(jié)果是出人意料的和未預(yù)料到的現(xiàn)象。然而，技術(shù)人員必須注意，因為蛋白中氨基酸側(cè)鏈的pka極大地受周圍環(huán)境影響，所以它們將并不總是匹配上述理論pka值。更具體而言，以上描述在本文中基于一般科學(xué)理論提供；然而，技術(shù)人員可以容易猜測，在實際蛋白中可以存在很多例外。例如，在hayes等人，j.biol.chem.250(18)：7461-7472(1975)中，在實驗確定肌球蛋白中含有的組氨酸的pka時，盡管值以約6.0為中心，還報道它們在5.37至8.05之間變化。天然地，具有高pka的組氨酸在中性ph條件下主要帶正電。因此，上述理論不否認(rèn)在蛋白的實際三維結(jié)構(gòu)中引入組氨酸的提高pi的效果。充分可能的是，引入組氨酸的氨基酸修飾，如在利用賴氨酸或精氨酸的情況下觀察到的，也可以發(fā)揮pi提高的效果。實施例4通過在恒定區(qū)中的一個氨基酸置換提高pi已經(jīng)描述了用于通過將氨基酸置換引入抗體可變區(qū)增加以ph-依賴性的方式結(jié)合抗原的抗體的pi的方法。此外，用于提高抗體的pi的方法可以通過在抗體恒定區(qū)中進行少至一個氨基酸置換來進行。將一個氨基酸置換加入至抗體恒定區(qū)以提高pi的方法不特別限制，但例如，其可以通過wo2014/145159中所述的方法進行。如在可變區(qū)的情況下的，引入恒定區(qū)的氨基酸置換優(yōu)選是降低帶負(fù)電的氨基酸(如，天冬氨酸或谷氨酸)的數(shù)量同時增加帶正電的氨基酸(如精氨酸或賴氨酸)的那些。不受限制，恒定區(qū)中引入氨基酸置換的位置優(yōu)選是其中氨基酸側(cè)鏈可以暴露在抗體分子表面的位置。優(yōu)選的實施例包括在這種可以暴露在抗體分子表面的位置引入多個氨基酸置換的組合的方法。備選地，引入的多個氨基酸置換優(yōu)選是這樣的位置，它們在構(gòu)象上彼此接近。此外，不受限制地，引入的多個氨基酸置換優(yōu)選置換為帶正電的氨基酸，從而在某些情況下，它們導(dǎo)致多個正電荷存在于構(gòu)象上接近的位置的狀態(tài)。"構(gòu)象上接近的位置"的定義不特別限制，但例如，其可以意為單個氨基酸置換或多個氨基酸置換引入彼此的20a內(nèi)，優(yōu)選15a內(nèi)，或更優(yōu)選10a內(nèi)的狀態(tài)。目的氨基酸置換是否在暴露在抗體分子表面的位置，或氨基酸置換的多個位置是否在相鄰位置，可以通過已知方法如x-射線晶體學(xué)確定。此外，除了上述方法，在構(gòu)象上接近的位置賦予多個正電荷的方法包括，使用igg恒定區(qū)中最初帶正電的氨基酸的方法。所述帶正電的氨基酸位置的實例包括(a)根據(jù)eu編號位置255，292，301，344，355，或416的精氨酸；和(b)根據(jù)eu編號位置121，133，147，205，210，213，214，218，222，246，248，274，288，290，317，320，322，326，334，338，340，360，370，392，409，414，或439的賴氨酸。通過在構(gòu)象上臨近這些帶正電的氨基酸的位置處用帶正電的氨基酸進行置換，可能在構(gòu)象上臨近的位置賦予多個正電荷。(4-1)ph-依賴性抗-ige結(jié)合抗體的生產(chǎn)通過參照實施例2的方法產(chǎn)生以下三種抗體，其為ph-依賴性抗-人ige抗體：(1)ab1，其是常規(guī)抗體，包含ab1h(seqidno：38)作為重鏈和ab1l(seqidno：39)作為輕鏈；(2)ab2，其是常規(guī)抗體，包含ab2h(seqidno：40)作為重鏈和ab2l(seqidno：41)作為輕鏈；以及(3)ab3，其是常規(guī)抗體，包含ab3h(seqidno：42)作為重鏈和ab3l(seqidno：43)作為輕鏈。(4-2)評價人ige結(jié)合的ph依賴性如下評價ab1在ph7.4和ph5.8對人ige的親合力。使用biacoret100(gehealthcare)進行人ige和ab1的動力學(xué)分析。使用以下兩種緩沖液作為運行緩沖液進行測量：(1)1.2mmcacl2/0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph7.4；和(2)1.2mmcacl2/0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph5.8。通過酰胺偶聯(lián)方法將適量的蛋白a/g(actigen)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上以捕獲目標(biāo)抗體。接著，通過注射稀釋的ige溶液和運行緩沖液(用作參照溶液)將人ige與捕獲在傳感芯片上的抗體進行相互作用。對于運行緩沖液，使用上述緩沖液(1)和(2)中的任一種，并且使用各個緩沖液稀釋人ige。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在25℃進行?；诮Y(jié)合速率常數(shù)ka(1/ms)和解離速率常數(shù)kd(1/s)(其是從通過測量獲得的傳感圖計算的動力學(xué)參數(shù))對于每個抗體計算人ige的kd(m)。使用biacoret100評價軟件(gehealthcare)計算每個參數(shù)。如下計算ab2和ab3對人ige在ph7.4和ph5.8的親和力。使用biacoret200(gehealthcare)評價抗-hige抗體對hige的結(jié)合活性(解離常數(shù)kd(m))。使用以下兩種緩沖液作為運行緩沖液進行測量：(1)1.2mmcacl2/0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph7.4；和(2)1.2mmcacl2/0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph5.8。通過利用鏈霉親和素和生物素之間的親和力，將適量的通過將生物素添加至存在于化學(xué)合成的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(又名，gpc3)蛋白-衍生的肽(具有(vddapgnsqqatpkdneistfhnlgnvhsplk(seqidno：44)的氨基酸序列)("生物素化的gpc3肽")的c末端lys產(chǎn)生的肽加入至傳感芯片sa(gehealthcare)并且固定在芯片上。注射適當(dāng)濃度的hige并且通過捕獲生物素化的gpc3肽固定在芯片上。注射適當(dāng)濃度的抗-hige抗體作為分析物，并且使其與傳感芯片上的hige相互作用。然后，為了再生傳感芯片，注射10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在37℃進行。通過分析測量結(jié)果，通過使用biacoret200評價軟件(gehealthcare)曲線擬合計算結(jié)合速率常數(shù)ka(1/ms)和解離速率常數(shù)kd(1/s)，并且基于那些值計算解離常數(shù)kd(m)。結(jié)果在表5中提供。所有抗體，ab1，ab2和ab3，顯示對人ige的ph-依賴性結(jié)合，并且顯示當(dāng)與它們在中性ph條件(ph7.4)的親和力比較時，它們在酸性ph條件(ph5.8)的親和力顯著弱化。因此，預(yù)期向活體動物施用這些抗體顯示加速人ige(其是抗原)的去除的效果。[表5]在表6中顯示以與實施例1的方法類似的方式計算的對于ab1-ab3的理論pi值(pis)。[表6]抗體名稱理論piab16.77ab26.48ab36.48(4-3)通過恒定區(qū)中的單個氨基酸修飾產(chǎn)生具有增加的-pi的抗體實施例(4-1)中產(chǎn)生的ab1是具有天然人igg1作為恒定區(qū)的抗體。通過修飾ab1h(其是ab1的重鏈)的fc區(qū)，通過用天冬氨酸置換根據(jù)eu編號位置238處的脯氨酸和用丙氨酸置換根據(jù)eu編號位置298處絲氨酸，產(chǎn)生ab1h-p600。此外，通過參照實施例2的方法，通過分別將表7-1和7-2中指出的各種單個氨基酸置換引入ab1h-p600的fc區(qū)，產(chǎn)生各種fc變體。對于所有fc變體，將ab1l(seqidno：39)用作輕鏈。這些抗體對hfcγrii2b的親和力與p600變體相當(dāng)(數(shù)據(jù)未顯示)。[表7-1]變體名稱添加于p600的氨基酸突變biacore成像p600none1.001.00p828q196k1.270.98p829s337r0.170.89p830l358k1.242.35p831p387r3.851.30p836e345q1.85無數(shù)據(jù)p837e345r1.88無數(shù)據(jù)p838d356q1.87無數(shù)據(jù)p839d356n2.17無數(shù)據(jù)p840t359k2.25無數(shù)據(jù)p841n361r1.86無數(shù)據(jù)p842q362k2.37無數(shù)據(jù)p843e380r-0.04無數(shù)據(jù)p844e382q1.24無數(shù)據(jù)p845e382k1.38無數(shù)據(jù)p846q386k1.71無數(shù)據(jù)p847n389k1.57無數(shù)據(jù)p848s415r1.38無數(shù)據(jù)p849q418r2.21無數(shù)據(jù)p850q419k2.22無數(shù)據(jù)p851n421r1.431.56p852s424k1.40無數(shù)據(jù)p854l443r1.93無數(shù)據(jù)p905n384r1.342.36p906g385r1.741.12p907h433r0.093.55p908n434r0.421.88p909h435r0.730.77p910l309r1.731.80p912t307r0.241.30p914d399r1.723.78p915s400r0.852.01p917a327r-0.052.49p918l328r-0.060.00p919p329r-0.060.00[表7-2]p920a330r0.011.67p921p331r-0.070.02p923q311r1.632.88p924n315r2.082.66p925y296r-0.050.34p926q295r-0.060.04p927e294r0.250.29p928e293r0.200.04p929p291r0.470.53p930a287r-0.070.00p931n286r0.681.27p932h285r1.381.96p934v282r1.541.67p935g281r-0.062.14p937e272r0.210.56p938p271r-0.060.04p939d270r-0.070.01p940e269r-0.050.01p941h268r0.470.44p942e258r無數(shù)據(jù)3.07p944t256r無數(shù)據(jù)1.49p945s254r無數(shù)據(jù)5.70p9461253r無數(shù)據(jù)1.05p947m252r無數(shù)據(jù)0.94p948l251r無數(shù)據(jù)0.13(4-4)使用新的含有fc區(qū)變體的抗體通過biacore的人fcγriib-結(jié)合測定使用biacore(注冊商標(biāo))t200(gehealthcare)進行可溶性人fcγriib(又名″hfcγriib″)和抗原-抗體復(fù)合物之間的含有fc區(qū)變體的抗體結(jié)合測定。以his-標(biāo)簽標(biāo)記的分子的形式，使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生可溶性hfcγriib。通過胺偶聯(lián)方法，使用his捕獲試劑盒(gehealthcare)將適量的抗-his抗體固定在傳感芯片cm5(gehealthcare)上以捕獲hfcγriib。接著，注射抗體-抗原復(fù)合物和運行緩沖液(作為參照溶液)，并且允許與捕獲在傳感芯片上的hfcγriib的相互作用發(fā)生。將20mmph7.4的n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸，150mmnacl，1.2mmcacl2，和0.05％(w/v)吐溫20用作運行緩沖液，并且各個緩沖液還用于稀釋可溶性hfcγriib。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在25℃進行?；趶耐ㄟ^測量獲得的傳感圖計算的結(jié)合(ru)進行分析，并且在p600的結(jié)合量定義為1.00時，顯示相對值。為了計算參數(shù)，使用biacore(注冊商標(biāo))t100評價軟件(gehealthcare)。結(jié)果顯示在表7-1和7-2(參見表中"biacore"欄)和在圖6中顯示。顯示多個fc變體具有增強的對固定在biacore(注冊商標(biāo))傳感芯片上的hfcγriib的親和力。不受限于特定理論，該結(jié)果可以解釋如下。已知biacore(注冊商標(biāo))傳感芯片帶負(fù)電，并且該帶電狀態(tài)可以認(rèn)為是類似細(xì)胞膜表面。更具體而言，推測抗原-抗體復(fù)合物對固定在帶負(fù)電的biacore傳感芯片上的hfcγriib的結(jié)合類似于抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合存在于帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面上的hfcγriib的方式。通過將提高pi的修飾引入fc區(qū)產(chǎn)生的抗體是在與引入修飾前的那些比較時，其中fc區(qū)(恒定區(qū))的電荷帶更多正電的抗體。因此，可以認(rèn)為fc區(qū)(正電荷)和傳感芯片表面(負(fù)電荷)之間的庫侖相互作用通過提高pi的氨基酸修飾而增強。此外，預(yù)期所述效果類似地在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面發(fā)生；因此，還預(yù)期它們顯示加速體內(nèi)攝入細(xì)胞的速度或速率的效果。從上述結(jié)果，當(dāng)與ab1h-p600對hfcγriib的結(jié)合相比時，對于變體對hfcγriib的結(jié)合超過約1.2倍或更多的比率被認(rèn)為對抗體對傳感芯片上的hfcγriib的結(jié)合具有強烈的電荷效應(yīng)。因此，預(yù)期得到電荷效應(yīng)的修飾包括，例如，根據(jù)eu編號位置196，282，285，309，311，315，345，356，358，359，361，362，382，384，385，386，387，389，399，415，418，419，421，424，或443的修飾。優(yōu)選所述修飾在位置282，309，311，315，345，356，359，361，362，385，386，387，389，399，418，419，或443處。在所述位置引入的氨基酸置換優(yōu)選是精氨酸或賴氨酸。其中可以預(yù)期所述電荷效應(yīng)的氨基酸突變位置的另一實例包括根據(jù)eu編號位置430處的谷氨酸。要引入在位置430處的優(yōu)選的氨基酸置換是帶正電的精氨酸或賴氨酸，或在不帶電殘基中，置換為甘氨酸或蘇氨酸是優(yōu)選的。(4-5)由表達hfcγriib的細(xì)胞對含有fc區(qū)變體的抗體的攝取為了使用產(chǎn)生的新的含有fc區(qū)變體的抗體評價細(xì)胞內(nèi)被攝入表達hfcγriib的細(xì)胞系的速率，進行以下測定。使用已知方法產(chǎn)生組成型表達hfcγriib的mdck(madin-darby犬腎)細(xì)胞系。使用這些細(xì)胞，評價抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取。具體而言，根據(jù)建立的方案將phrodored(lifetechnlogies)用于標(biāo)記人ige(抗原)，并且在培養(yǎng)溶液中形成抗原-抗體復(fù)合物，其中抗體濃度是10.8mg/ml并且抗原濃度是12.5mg/ml。將含有抗原-抗體復(fù)合物的培養(yǎng)溶液加入至上述組成型表達hfcγriib的mdck細(xì)胞的培養(yǎng)板中并孵育一小時，并且隨后使用incellanalyzer6000(gehealthcare)定量攝入細(xì)胞的抗原的熒光強度。攝入的抗原量表示為與采用為1.00的p600值的相對值。表7-1和7-2(參見表中"成像"欄)和圖7顯示結(jié)果。在多個fc變體中觀察到源自細(xì)胞中抗原的強熒光。盡管不限于特定理論，該結(jié)果可以如下解釋：加入細(xì)胞培養(yǎng)溶液的抗原和抗體在培養(yǎng)溶液中形成抗原-抗體復(fù)合物?？乖?抗體復(fù)合物經(jīng)由抗體fc區(qū)結(jié)合表達在細(xì)胞膜上的hfcγriib，并且以受體-依賴性的方式攝入細(xì)胞中。用于此實驗的ab1是以ph-依賴性的方式結(jié)合抗原的抗體；因此，抗體可以從抗原解離。因為解離的抗原如之前描述用phrodored標(biāo)記，其在內(nèi)體中發(fā)熒光。因此，與對照相比在細(xì)胞內(nèi)更強的熒光強度被認(rèn)為表明，抗原-抗體復(fù)合物攝入細(xì)胞更快或以更高頻率發(fā)生。本文中，與ab1h-p600的熒光強度相比，變體的攝入細(xì)胞中的抗原的熒光強度的高于約1.05倍或更多的比率被認(rèn)為對攝入細(xì)胞的抗原具有電荷效應(yīng)。與ab1h-p600的熒光強度相比，攝入變體的細(xì)胞的抗原的熒光強度的高于約1.5倍或更多的比率被認(rèn)為對攝入細(xì)胞的抗原具有強的電荷效應(yīng)。因此，上述結(jié)果表明，通過將提高pi的修飾引入fc區(qū)的適當(dāng)?shù)奈恢茫c引入修飾前相比，可以加速攝入細(xì)胞內(nèi)。顯示所述效果的氨基酸位置修飾是，例如，根據(jù)eu編號位置253，254，256，258，281，282，285，286，307，309，311，315，327，330，358，384，385，387，399，400，421，433，或434。優(yōu)選地，修飾是在根據(jù)eu編號的位置254，258，281，282，285，309，311，315，327，330，358，384，399，400，421，433，或434處。引入在所述位置的氨基酸置換優(yōu)選是精氨酸或賴氨酸。不受限制，為了提高抗體的pi將氨基酸置換引入恒定區(qū)中的位置可以是，例如，根據(jù)eu編號在位置285處的氨基酸殘基。備選地，其他實例可以包括根據(jù)eu編號在位置399處氨基酸殘基的氨基酸置換。實施例5在酸性ph條件下具有增強的fcrn結(jié)合的fc變體的產(chǎn)生，用于改善在血漿中的保留在內(nèi)體中的酸性ph條件下，已知攝入細(xì)胞的igg抗體通過結(jié)合fcrn返回血漿。因此，與不結(jié)合fcrn的蛋白相比，igg抗體通常具有長的血漿半衰期。已知利用該性質(zhì)通過增加其在酸性ph條件下的fcrn親和力(通過在抗體fc區(qū)引入氨基酸修飾)來增強抗體的血漿保留的方法。具體而言，已知通過增加其在酸性ph條件下對fcrn的親和力(通過氨基酸修飾，如m252y/s254t/t256e(yte)修飾)來改善抗體的血漿保留的方法(dall'acqua等人，j.biol.chem.281：23514-23524(2006))，m428l/n434s(ls)修飾(zalevsky等人，nat.biotechnol.28：157-159(2010))，和n434h修飾(zheng等人，clinicalpharmacology&therapeutics89(2)：283-290(2011))。另一方面，如上文所述的，還已知在酸性ph條件下具有增加的fcrn親和力的fc變體顯示不希望有的對類風(fēng)濕因子(rf)的親和力(wo2013/046704)。因此，為了產(chǎn)生可以改善血漿保留(具有降低的對類風(fēng)濕因子的結(jié)合或基本上不結(jié)合對類風(fēng)濕因子)的fc變體而進行以下研究。(5-1)新的含有fc區(qū)變體的抗體的生產(chǎn)如下文所示，產(chǎn)生在酸性ph條件下具有增加的fcrn親和力的fc變體，如包括已知修飾，yte，ls，或n434h的那些，以及多個新的fc變體(f1847m，f1848m，f1886m，f1889m，f1927m，和f1168m)。通過參照實施例1的方法產(chǎn)生編碼重鏈的序列(其中氨基酸修飾引入fv4-igg1(其是抗-人il-6受體抗體)的重鏈(vh3-igg1m)的fc區(qū))。這些重鏈用于通過參照實施例2的方法產(chǎn)生以下抗體：(a)fv4-igg1，其包含vh3-igg1m(seqidno：46)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(b)fv4-yte，其包含vh3-yte(seqidno：47)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(c)fv4-ls，其包含vh3-ls(seqidno：48)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(d)fv4-n434h，其包含vh3-n434h(seqidno：49)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(e)fv4-f1847m，其包含vh3-f1847m(seqidno：50)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(f)fv4-f1848m，其包含vh3-f1848m(seqidno：51)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(g)fv4-f1886m，其包含vh3-f1886m(seqidno：52)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(h)fv4-f1889m，其包含vh3-f1889m(seqidno：53)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；(i)fv4-f1927m，其包含vh3-f1927m(seqidno：54)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈；和(j)fv4-f1168m，其包含vh3-f1168m(seqidno：55)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈。(5-2)對人fcrn的結(jié)合動力學(xué)分析通過參照實施例2的方法產(chǎn)生含有vh3-igg1m或上述變體作為重鏈和l(wt)(seqidno：37)作為輕鏈的抗體，并且如下評價對人fcrn的結(jié)合活性。使用biacoret100(gehealthcare)進行人fcrn和每種所述抗體的動力學(xué)分析。通過胺偶聯(lián)方法將適量的蛋白l(actigen)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上以捕獲目標(biāo)抗體。接著，通過注射稀釋的fcrn溶液和運行緩沖液(用作參照溶液)將人fcrn與捕獲在傳感芯片上的抗體進行相互作用。對于運行緩沖液，使用50mm磷酸鈉，150mmnacl，和0.05％(w/v)吐溫20(ph6.0)，并且各個緩沖液還用于稀釋fcrn。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在25℃進行?；诮Y(jié)合速率常數(shù)ka(1/ms)和解離速率常數(shù)kd(1/s)(其是從通過測量獲得的傳感圖計算的動力學(xué)參數(shù))對每個抗體計算對于人fcrn的kd(m)。biacoret100評價軟件(gehealthcare)用于計算每個參數(shù)。結(jié)果在表8中顯示。[表8]實施例6具有增強的fcrn結(jié)合的含有fc區(qū)變體的抗體在酸性ph條件下對類風(fēng)濕因子的親和力的評價抗藥物抗體(adas)影響治療性抗體的功效和藥代動力學(xué)，并且有時導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用；因此，治療性抗體的臨床應(yīng)用和功效可以受ada的產(chǎn)生的限制。很多因素影響治療性抗體的免疫原性，并且效應(yīng)t細(xì)胞表位的存在是一個因素。此外，在施用治療性抗體前在患者中存在ada(也稱為"預(yù)先存在的ada")可能具有類似的問題。具體而言，在患有自身疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)的患者的治療性抗體的情況下，類風(fēng)濕因子(rf)(其是針對人igg的自身抗體)可以引起"預(yù)先存在的ada"問題。近來，報道了，具有n434h(asn434his)突變的人源化抗-cd4igg1抗體引起顯著的類風(fēng)濕因子結(jié)合(zheng等人，clinicalpharmacology&therapeutics89(2)：283-290(2011))。詳細(xì)研究確認(rèn)，與母體人igg1相比，人igg1中的n434h突變增加類風(fēng)濕因子對抗體的fc區(qū)的結(jié)合。類風(fēng)濕因子是針對人igg的多克隆自身抗體，并且其在人igg中的表位根據(jù)克隆而不同，并且似乎位于ch2/ch3交界區(qū)，并且在可以與fcrn-結(jié)合表位重疊的ch3結(jié)構(gòu)域。因此，增加對fcrn的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)的突變可以增加類風(fēng)濕因子對特定克隆的結(jié)合活性(結(jié)合親和力)。實際上，關(guān)于在酸性ph或中性ph對fcrn具有增加的親和力的fc，還已知不僅n434h修飾而且很多其他氨基酸修飾類似地增加fc對類風(fēng)濕因子的結(jié)合(wo2013/046704)。另一方面，在wo2013/046704中作為實例提供選擇性抑制對類風(fēng)濕因子的親和力而不影響對fcrn的親和力的多種氨基酸修飾，并且它們當(dāng)中，已經(jīng)指出兩個氨基酸突變的組合，即q438r/s440e，q438r/s440d，q438k/s440e，和q438k/s440d。因此，將q438r/s440e引入首先在本文中公開的在酸性ph條件下具有新的增加的親和力的fc以研究是否可以降低對類風(fēng)濕因子的結(jié)合。(6-1)含有fc區(qū)變體的抗體的類風(fēng)濕因子結(jié)合測定通過利用電化學(xué)發(fā)光(ecl)在ph7.4使用來自30個ra患者的個體血清(proteogenex)進行對類風(fēng)濕因子的結(jié)合測定。將50-倍稀釋的血清樣品，生物素化的測試抗體(1μg/ml)，和sulfo-tagnhs酯(mesoscalediscovery)-標(biāo)記的測試抗體(1μg/ml)各自混合并在室溫孵育三小時。之后，將混合物加入至鏈霉親和素-包被的multi-array96-孔板(mesoscalediscovery)中，并且將板在室溫孵育兩小時并且隨后洗滌。在向每孔加入讀取緩沖液t(x4)(mesoscalediscovery)之后，立即將板放在sector成像儀2400讀數(shù)器(mesoscalediscovery)上，并且測量化學(xué)發(fā)光。該測定的結(jié)果在圖8至17中顯示。具有天然人igg1的fv4-igg1(圖8)僅顯示弱的對類風(fēng)濕因子的結(jié)合，而現(xiàn)有的具有增加的fcrn結(jié)合的fc變體，fv4-yte(圖9)，fv4-ls(圖10)，和fv4-n434h(圖11)，在很多供體中全部顯示顯著增加的類風(fēng)濕因子結(jié)合。另一方面，所有具有增加的fcrn結(jié)合的新的fc區(qū)變體，fv4-f1847m(圖12)，fv4-f1848m(圖13)，fv4-f1886m(圖14)，fv4-f1889m(圖15)，fv4-f1927m(圖16)，和fv4-f1168m(圖17)，僅顯示弱的類風(fēng)濕因子結(jié)合，并且這表明，作為增加fcrn結(jié)合的修飾的結(jié)果，對類風(fēng)濕因子的結(jié)合被顯著抑制。圖18顯示30個ra患者的血清中對于每種變體的類風(fēng)濕因子-結(jié)合親和力的平均值。所有六種新的變體顯示比三種預(yù)先存在的變體(yte，ls和n434h)低的親和力，并且與天然人igg1相比，它們還顯示較低的對類風(fēng)濕因子的親和力。由此，當(dāng)考慮臨床開發(fā)具有改善的對fcrn的親和力的治療性抗體用于自身免疫疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等時，與類風(fēng)濕因子相關(guān)的風(fēng)險(其是現(xiàn)有的fc變體的問題)在本文中首先公開的fc變體中得到遏制，并且因此它們可以比現(xiàn)有已知的fc變體更安全地使用。實施例7在酸性ph條件下具有增加的fcrn結(jié)合的fc變體在食蟹猴中的pk評價在實施例7中，通過以下方法，使用本文中提供的新的含有fc區(qū)變體的抗體(其對類風(fēng)濕因子的結(jié)合被確認(rèn)為被抑制)評價改善食蟹猴中血漿保留的效果。(7-1)新的含有fc區(qū)變體的抗體的產(chǎn)生產(chǎn)生以下抗-人ige抗體：(a)ohb-igg1，其包含ohbh-igg1(seqidno：56)作為重鏈和ohbl-ck(seqidno：57)作為輕鏈；(b)ohb-ls，其包含ohbh-ls(seqidno：58)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈；(c)ohb-n434a，其包含ohbh-n434a(seqidno：59)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈；(d)ohb-f1847m，其包含ohbh-f1847m(seqidno：60)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈；(e)ohb-f1848m，其包含ohbh-f1848m(seqidno：61)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈；(f)ohb-f1886m，其包含ohbh-f1886m(seqidno：62)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈；(g)ohb-f1889m，其包含ohbh-f1889m(seqidno：63)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈；和(h)ohb-f1927m，其包含ohbh-f1927m(seqidno：64)作為重鏈和ohbl-ck作為輕鏈。(7-2)對新的含有fc區(qū)變體的抗體的猴pk測定評價向食蟹猴施用抗-人ige抗體后抗-人ige抗體在血漿中的體內(nèi)動力學(xué)。將抗-人ige抗體溶液以2mg/kg靜脈內(nèi)施用一次。施用后五分鐘，(兩小時)，七小時，一天，兩天，三天，(四天)，七天，14天，21天，28天，35天，42天，49天，和56天進行血液收集。將收集的血液立即在4℃和15,000rpm進行離心5分鐘，獲得血漿。將分離的血漿儲存在設(shè)置為-80℃或更低的冰箱中，直到進行測量。使用八種類型的抗-人ige抗體，即ohb-igg1，ohb-ls，ohb-n434a，ohb-f1847m，ohb-f1848m，ohb-f1886m，ohb-f1889m，和ohb-f1927m。(7-3)通過elisa測量抗-人ige抗體在血漿中的濃度通過elisa測量抗-人ige抗體在食蟹猴的血漿中的濃度。首先，將抗-人iggκ鏈抗體(抗體溶液)分散在nunc-immuno平板，maxisorp(nalgenuncinternational)中并讓其在4℃靜置過夜，產(chǎn)生抗-人iggκ鏈抗體-固定的板。制備血漿濃度為640，320，160，80，40，20或10ng/ml的校準(zhǔn)曲線樣品，和稀釋100-倍或更多的食蟹猴血漿測量樣品。這些校準(zhǔn)曲線樣品和血漿測量樣品這樣產(chǎn)生，使得食蟹猴ige(公司內(nèi)制備的產(chǎn)物)以1μg/ml的濃度加入。隨后，將樣品分散在抗-人iggκ鏈抗體-固定的板中，并讓其在室溫靜置兩小時。然后，分散hrp-抗人iggγ鏈抗體(southernbiotech)，并且讓其在室溫靜置一小時。隨后，使用tmb鉻精(chromogen)溶液(lifetechnologies)作為底物進行生色反應(yīng)，并且在通過加入1n硫酸(wako)終止反應(yīng)后，通過微孔板讀數(shù)器測量450nm的吸光度。使用分析軟件softmaxpro(moleculardevices)從校準(zhǔn)曲線的吸光度計算猴血漿中抗-人ige抗體的濃度。測量的猴血漿中抗-人ige抗體的濃度的改變在圖19中顯示。從測量的猴血漿中抗-人ige抗體的濃度的改變，使用phoenixwinnonlinver.6.2(pharsightcorporation)的瞬時分析計算去除清除。計算的藥代動力學(xué)參數(shù)在表9中顯示。將來自血漿中對于施用的樣品抗體陽性的個體的樣品從猴血漿中抗-人ige抗體濃度和清除的改變的計算中排除。[表9]抗人ige抗體施用后施用的樣品的去除清除(7-4)通過電化學(xué)發(fā)光方法測量血漿中針對施用的樣品的抗體通過電化學(xué)發(fā)光方法測量猴血漿中針對施用的樣品的抗體。使用sulfo-tagnhs酯(mesoscalediscovery)釕-標(biāo)記的施用的樣品，使用ez-linkmicrosulfo-nhs-生物素化試劑盒(pierce)生物素化的施用的樣品，和食蟹猴血漿測量樣品等量混合，并且讓其在4℃靜置過夜。將樣品加入至multi-array96-孔鏈霉親和素goldplate(mesoscalediscovery)，然后使其在室溫反應(yīng)兩小時，并洗滌。然后，將讀取緩沖液t(x4)(mesoscalediscovery)分散入板中后，立即使用sector成像儀2400(mesoscalediscovery)進行測量。結(jié)果，確認(rèn)與天然igg1的fc區(qū)相比，所有新的fc變體顯示極大改善的血漿保留。(7-5)對于fc變體的小鼠pk測定進行以下實驗以比較f1718(其是wo2013/046704中所述的fc變體)，和f1848m(其是這次新發(fā)現(xiàn)的fc變體)，其為增加在酸性ph下fcrn結(jié)合的fc變體。通過參照實施例1的方法產(chǎn)生編碼其中將氨基酸修飾引入fv4-igg1(抗-人il-6受體抗體)的重鏈(vh3-igg1)的fc區(qū)的重鏈的序列。使用這些重鏈，參照實施例2的方法產(chǎn)生以下抗體：(a)包含vh3-igg1作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈的fv4-igg1；和(b)包含vh3-f1718(seqidno：65)作為重鏈和vl3-ck作為輕鏈的fv4-f1718。將上述抗-人il-6受體抗體以1mg/kg施用到人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrntg品系32+/+小鼠；jacksonlaboratories，methodsmol.biol.602：93-104(2010)的尾靜脈一次。施用抗-人il-6受體抗體后15分鐘，七小時，一天，兩天，三天，七天，14天，21天，和28天，收集血液。將收集的血液立即在15,000rpm和4℃離心15分鐘，獲得血漿。將分離的血漿儲存在-20℃或以下的冰箱中，直到進行測量。(7-6)通過elisa測量血漿中抗-人il-6受體抗體的濃度小鼠血漿中抗-人il-6受體抗體的濃度通過elisa測量。首先，將抗體的抗-人igg(γ-鏈特異性)f(ab')2片段(sigma)分散在nunc-immuno平板，maxisorp(nalgenuncinternational)中并使其在4℃靜置過夜，產(chǎn)生固定有抗-人igg的平板。分別制備含有血漿濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，或0.0125μg/ml的抗-人il-6受體抗體的校準(zhǔn)曲線樣品和稀釋100-倍或更多的小鼠血漿測量樣品。將200μl的20ng/ml可溶性人il-6受體加入至100μl的校準(zhǔn)曲線樣品或血漿測量樣品，并且隨后讓混合的溶液在室溫靜置一小時。隨后，將混合的溶液分散在固定抗-人igg的板的每個孔中，并且將板在室溫靜置一小時。然后，加入生物素化的抗-人il-6r抗體(r&d)，在室溫反應(yīng)一小時。隨后，加入鏈霉親和素-polyhrp80(stereospecificdetectiontechnologies)，在室溫反應(yīng)一小時，并且該反應(yīng)溶液的顯色反應(yīng)使用tmb單成分hrp微孔底物(tmbonecomponenthrpmicrowellsubstrate)(biofxlaboratories)作為底物進行。在通過加入1n硫酸(showachemical)終止反應(yīng)后，在微孔板讀數(shù)器上測量每孔中反應(yīng)溶液在450nm的吸光度。小鼠血漿中的抗體濃度使用分析軟件softmaxpro(moleculardevices)從校準(zhǔn)曲線的吸光度計算。結(jié)果在圖20中顯示。f1718(其是wo2013/046704中所述的在酸性ph增加fcrn結(jié)合的fc變體)不顯示任何延長抗體pk的效果，但顯示與天然igg1相當(dāng)?shù)难獫{保留。f1718具有引入fc區(qū)的四個突變，即n434y/y436v/q438r/s440e。相反，本文中首次公開的f1848m引入有四個突變，即n434a/y436v/q438r/s440e。引入這兩種類型的fc的氨基酸突變的僅有的差異是在根據(jù)eu編號位置434引入的氨基酸突變在f1718中是y(酪氨酸)并且在f1848m中是a(丙氨酸)。在實施例(7-2)中，與天然igg1相比，f1848m顯示改善的血漿保留，而f1718在血漿保留方面不顯示任何改善。因此，不受限制，這提示a(丙氨酸)優(yōu)選作為要在位置434引入的氨基酸突變，用于改善血漿保留。(7-7)預(yù)測的fc變體的免疫原性評分抗藥物抗體(ada)的產(chǎn)生影響治療性抗體的功效和藥代動力學(xué)，并且有些情況下帶來嚴(yán)重的副作用；并且因此，治療性抗體的臨床利用和藥效可以受ada的產(chǎn)生的限制。已知治療性抗體的免疫原性受很多因素影響，并且尤其是，尤其是治療性抗體攜帶的效應(yīng)t細(xì)胞表位的重要性已經(jīng)報道很多次。已經(jīng)開發(fā)了用于預(yù)測t細(xì)胞表位的計算機工具如epibase(lonza)，itope/tced(antitope)，和epimatrix(epivax)。使用這些計算機工具，可以預(yù)測每個氨基酸序列中的t細(xì)胞表位(walle等人，expertopin.biol.ther.7(3)：405-418(2007))，并且可以評價治療性抗體的可能的免疫原性。epimatrix用于計算評價的fc變體的免疫原性。epimatrix是用于通過將要預(yù)測其免疫原性的蛋白的氨基酸序列以九個氨基酸分段自動設(shè)計肽片段的序列，并且隨后計算其結(jié)合八種ii型主要mhc等位基因(drb1*0101，drb1*0301，drb1*0401，drb1*0701，drb1*0801，drb1*1101，drb1*1301，和drb1*1501)的能力，預(yù)測研究的蛋白的免疫原性的系統(tǒng)(clin.immunol.131(2)：189-201(2009))。wo2013/046704中描述的f1718和f1756(n434y/y436t/q438r/s440e)含有n434y突變。相反，新公開的f1848m和f1847m含有n434a突變。這四種變體，即f1718，f1848m，f1756和f1847m的免疫原性得分，如上文所述計算的，在表31的″epimatrix得分″欄顯示。此外，關(guān)于epimatrix得分，對于tregitope含量校準(zhǔn)的免疫原性得分在″treg調(diào)節(jié)的epx得分″欄顯示。tregitope是主要在天然存在的抗體序列中大量存在的肽片段序列，并且是認(rèn)為通過激活抑制性t細(xì)胞(treg)抑制免疫原性的序列。[表31]根據(jù)這些結(jié)果，″epimatrix得分″和″treg調(diào)節(jié)的epx得分″二者都顯示，與n434y變體相比，n434a變體f1848m和f1847m的免疫原性得分減少。這提示，a(丙氨酸)優(yōu)選作為要在位置434引入的氨基酸突變用于較低的免疫原性得分。實施例8人源化抗-人il-8抗體的產(chǎn)生(8-1)人源化抗-人il-8抗體hws-4的產(chǎn)生美國專利號6,245,894中公開的人源化抗il-8抗體結(jié)合人il-8(hil-8)并且阻斷其生理功能。修飾的人源化抗-il-8抗體可以通過將美國專利號6,245,894中公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列與實際上各種已知人抗體恒定區(qū)序列中的任一種組合而產(chǎn)生。因此，這些修飾的抗體的人抗體恒定區(qū)序列不特別限制，但天然人igg1序列或天然人igg4序列可以用作重鏈恒定區(qū)，并且天然人κ序列可以用作輕鏈恒定區(qū)序列。從美國專利號6,245,894中公開的人源化il-8抗體中，將hws4h-igg1的編碼序列(seqidno：83)與重鏈可變區(qū)rvhg組合并且用于重鏈恒定區(qū)的天然人抗-igg1序列通過參照實施例1的方法產(chǎn)生。此外，hws4l-k0mt的編碼序列(seqidno：84)(其組合輕鏈可變區(qū)rvla和用于輕鏈恒定區(qū)的天然人κ序列)通過參照實施例1的方法產(chǎn)生。產(chǎn)生組合上述重鏈和輕鏈的抗體，并且命名為人源化ws-4抗體(下文，hws-4)。(8-2)人源化抗-人il-8抗體hr9的生產(chǎn)使用不同于hws-4中使用的fr的人共有框架區(qū)序列產(chǎn)生新的人源化抗體。具體而言，vh3-23和vh3-64的雜交序列用作重鏈fr1，vh3-15和vh3-49中看到的序列用作fr2，vh3-72中看到的序列用作fr3(條件是不包括根據(jù)kabat編號的82a)，并且jh1中看到的序列用作fr4。這些序列與hws-4重鏈的cdr序列連接，產(chǎn)生hr9-igg1(seqidno：85)，一種新的人源化抗體重鏈。接著，產(chǎn)生兩種類型的抗體，即，具有hws4h-igg1作為重鏈和hws4l-k0mt作為輕鏈的hws-4，和具有hr9-igg1作為重鏈和hws4l-k0mt作為輕鏈的hr9。在本文所述的公開內(nèi)容c的范圍內(nèi)，尤其是涉及輕鏈時，hr9寫為hr9/hws4l。根據(jù)附于產(chǎn)品的方案使用freestyle293f細(xì)胞(invitrogen)表達抗體。通過參照實施例2的方法從培養(yǎng)上清純化抗體。結(jié)果，以表11中所示的量獲得抗體。出人意料地，hr9的表達水平是hws-4的表達水平的大約8倍。[表11]抗體產(chǎn)率/1ml培養(yǎng)基(μg)hws-46.4hr950(8-3)hws-4和hr9的人il-8-結(jié)合活性使用biacoret200(gehealthcare)如下確定hws-4和hr9對人il-8的結(jié)合親和力。使用具有0.05％吐溫20，20mmaces，和150mmnacl(ph7.4)的組成的運行緩沖液。通過胺偶聯(lián)方法將適量的蛋白a/g(pierce)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上并且捕獲目標(biāo)抗體。接著，通過注射稀釋的人il-8溶液和運行緩沖液(用作參照溶液)使人il-8與捕獲在傳感芯片上的抗體相互作用。對于運行緩沖液，使用具有上述組成的溶液，并且該緩沖液還用于稀釋人il-8。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在37℃進行?；诮Y(jié)合速率常數(shù)kon(1/ms)和解離速率常數(shù)koff(1/s)(其是從通過測量獲得的傳感圖計算的動力學(xué)參數(shù))計算每個抗體對于人il-8的kd(m)。biacoret200評價軟件(gehealthcare)用于計算每個參數(shù)。結(jié)果顯示在表12中。確認(rèn)hws-4和hr9具有相當(dāng)?shù)膶θ薸l-8的結(jié)合親和力。[表12]抗體名稱kon(1/ms)koff(1/s)kd(m)hws49.74e+052.03e-042.09e-10hr91.11e+062.17e-041.95e-10對于開發(fā)抗體藥物，抗體分子的生產(chǎn)水平是重要因素，并且通常，希望的是高生產(chǎn)水平。從上述檢測特別值得注意的是，選擇更適當(dāng)?shù)娜斯灿锌蚣軈^(qū)-衍生的序列用于與hws-4的hvr序列組合，并且得到hr9，其具有改善的生產(chǎn)水平，同時保持對人il-8的結(jié)合親和力。實施例9具有ph-依賴性il-8親和力的抗體的產(chǎn)生(9-1)賦予ph依賴性的hr9-修飾的抗體的生產(chǎn)為了向?qū)嵤├?中獲得hr9抗體賦予ph-依賴性il-8親和力，進行研究。在不受特定理論限制的同時，對il-8具有ph-依賴性親和力的抗體可以顯示以下體內(nèi)行為。施用于活體生物的抗體可以在保持中性ph環(huán)境中(例如，在血漿中)強烈結(jié)合il-8，并且阻斷其功能。一部分所述il-8/抗體復(fù)合物通過與細(xì)胞膜的非特異性相互作用(胞飲)(下文，稱為非特異的攝取)攝入細(xì)胞中。在內(nèi)體的酸性ph條件下，前述抗體對il-8的結(jié)合親和力變?nèi)?，并且因此抗體與il-8解離。然后，從il-8解離的抗體可以經(jīng)由fcrn返回細(xì)胞外。以此方式返回細(xì)胞外(進入血漿中)的前述抗體可以再次結(jié)合另一個il-8并阻斷其功能。認(rèn)為對il-8具有ph-依賴性親和力的抗體能夠通過上述機制多次結(jié)合il-8。相反，不具有前述抗體所具有的性質(zhì)的抗體，抗體分子僅能夠中和抗原一次，但不能多次中和抗原。通常，因為igg抗體具有兩個fabs，單個抗體分子可以中和兩分子的il-8。另一方面，能夠多次結(jié)合il-8的抗體能夠任意次數(shù)地結(jié)合il-8，只要它們保持在活體內(nèi)。例如，因為被施用直到被去除，攝入細(xì)胞十次的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體的單個分子，可以中和最多20個分子的il-8。因此，可以多次結(jié)合il-8的抗體具有能夠甚至以小量的抗體中和多個il-8分子的優(yōu)勢。從另外一個角度，可以多次結(jié)合il-8的抗體具有能夠保持能夠比當(dāng)施用相同量的不具有所述性質(zhì)的抗體時更長時期中和il-8的狀態(tài)的優(yōu)勢。從另一角度，可以多次結(jié)合il-8的抗體具有能夠比當(dāng)施用相同量的不具有所述性質(zhì)的抗體時更強烈地阻斷il-8的生物活性的優(yōu)勢。為了實現(xiàn)這些優(yōu)勢，將氨基酸修飾(主要是組氨酸)引入hr9-igg1和ws4l-k0mt的可變區(qū)，目的是產(chǎn)生能夠多次結(jié)合il-8的抗體。具體而言，通過參照實施例1和2的方法產(chǎn)生表13中所示的變體。表13中所示的標(biāo)記如″y97h″顯示引入突變的位置，由kabat編號定義，引入突變前的氨基酸，和引入突變后的氨基酸。具體而言，當(dāng)表示為″y97h″時，其表示根據(jù)kabat編號位置97的氨基酸殘基從y(酪氨酸)置換為h(組氨酸)。此外，當(dāng)引入多個氨基酸置換的組合時，以如″n50h/l54h″的方式描述。[表13]抗體名稱引入重鏈的突變引入輕鏈的突變hr9/ws4l無無hr9/l16無l54hh89/ws4ly97h無h89/l12y97hn50hh89/l16y97hl54h(9-2)ph-依賴性il-8親和力如下文所述，使用biacoret200(gehealthcare)確定實施例9-1中產(chǎn)生的抗體的人il-8-結(jié)合親和力。使用以下兩種運行緩沖液：(1)0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph7.4；和(2)0.05％吐溫20，20mmaces，150mmnacl，ph5.8。通過胺偶聯(lián)方法將適量的蛋白a/g(pierce)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上并且捕獲目標(biāo)抗體。接著，通過注射稀釋的人il-8溶液和運行緩沖液(用作參照溶液)將人il-8與傳感芯片上捕獲的抗體相互作用。對于運行緩沖液，使用上述溶液中的任一種，并且各個緩沖液還用于稀釋人il-8。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在37℃進行?；诮Y(jié)合速率常數(shù)kon(1/ms)和解離速率常數(shù)koff(1/s)(其是從通過測量獲得的傳感圖計算的動力學(xué)參數(shù))計算每個抗體對人il-8的kd(m)。biacoret200評價軟件(gehealthcare)用于計算每個參數(shù)。結(jié)果顯示在表14-1中。首先，與hr9比較，在輕鏈中含有l(wèi)54h修飾的hr9/l16在中性ph(ph7.4)具有稍微增強的人il-8-結(jié)合親和力，但在酸性ph(ph5.8)具有降低的人il-8-結(jié)合親和力。另一方面，通過將各種輕鏈與在重鏈中含有y97h修飾的h89組合產(chǎn)生的抗-il-8抗體(h89/ws4l，h89/l12，和h89/l16)全部顯示在酸性ph降低的人il-8-結(jié)合親和力以及在中性ph降低的人il-8-結(jié)合親和力。[表14-1](9-3)用于賦予ph依賴性的修飾的抗體的生產(chǎn)和評價評價9-2中發(fā)現(xiàn)的有希望的修飾和新的氨基酸突變的組合，并且作為結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下組合。[表14-2]抗體名稱引入重鏈的一個或多個突變引入輕鏈的一個或多個突變h89/l63y97hn50h/l54hh89/l118y97hn50h/l54h/q89k通過參照實施例1和2的方法產(chǎn)生變體，并且通過與實施例9-2類似的方法評價對人il-8的結(jié)合親和力。結(jié)果也在表14中顯示。具有h89-igg1(seqidno：86)作為重鏈和l63-k0mt(seqidno：87)作為輕鏈的h89/l63在中性ph(ph7.4)顯示與hr9相當(dāng)?shù)娜薸l-8-結(jié)合親和力，并且在酸性ph(ph5.8)顯示降低的人il-8-結(jié)合親和力。具體而言，h89/l63在ph5.8的koff(解離速率常數(shù))和kd(解離常數(shù))都比hr9的那些高。這意為在內(nèi)體中的酸性ph條件下，h89/l63具有容易釋放人il-8的性質(zhì)。出人意料地發(fā)現(xiàn)，h89/l118(其具有h89-igg1作為重鏈和l118-k0mt(seqidno：88)作為輕鏈)與hr9相比在中性ph條件具有增強的人il-8-結(jié)合親和力(kd)，但和與hr9相比在酸性ph條件下具有減弱的人il-8-結(jié)合親和力(kd)。不特別限制，通常，當(dāng)可以多次結(jié)合抗原的抗體用作藥物產(chǎn)品時，ph-依賴性抗原結(jié)合抗體優(yōu)選具有強的結(jié)合親和力(小的kd)，從而它們在中性ph條件下(如在血漿中)可以強烈地中和抗原。另一方面，抗體優(yōu)選具有大的解離速率常數(shù)(koff)和/或弱的結(jié)合親和力(大的kd)，從而它們可以在酸性ph條件(如在內(nèi)體中)快速釋放抗原。與hr9相比，h89/l118在這些中性ph和酸性ph條件兩者下都具有可獲得的有利性質(zhì)。因此，對于hr9鑒定了有用的氨基酸修飾，如對于其重鏈的y97h和對于其輕鏈的n50h/l54h/q89k。不限于其中，已經(jīng)表明，作為藥物較好的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體能夠通過選自這些修飾的單個或多個氨基酸修飾的組合產(chǎn)生。不受特定理論限制，考慮的是，當(dāng)使用ph-依賴性抗原結(jié)合抗體作為藥物時的重要因素是施用于身體的抗體是否可以在內(nèi)體中釋放抗原。在這一點上，在酸性ph條件下足夠弱的結(jié)合(大的解離常數(shù)(kd))或足夠快的解離速率(大的解離速率常數(shù)(koff))被認(rèn)為是重要的。因此，在以下實驗中研究通過biacore獲得的h89/l118的kd或koff是否足以在體內(nèi)內(nèi)體中解離抗原。實施例10產(chǎn)生用于小鼠pk測定的高-親和力抗體用于確認(rèn)抗體對在小鼠中去除人il-8的速率的效果的方法不特別限制。在一個情況中，方法包括將抗體在與人il-8混合的條件下施用于小鼠，并且隨后比較從小鼠血漿去除人il-8的速率。本文中，希望的是，要用于小鼠pk測定的參照抗體在中性ph和酸性ph條件都具有足夠強的結(jié)合親和力。然后，對賦予hr9高-親和力的修飾進行檢索，并且由此，產(chǎn)生具有h998-igg1(seqidno：89)作為重鏈和l63-k0mt作為輕鏈的h998/l63。通過實施例9-2相似的方法將h998/l63用于評價人il-8-結(jié)合親和力。得到的傳感圖顯示在圖21中。h998/l63在中性ph和酸性ph條件中都顯示出人意料地緩慢解離速率，并且顯示其具有比hr9更強的il-8-結(jié)合親和力。然而，已知，由于biacore的機械限制，分析值如解離速率常數(shù)(koff)和解離常數(shù)(kd)在蛋白-蛋白相互作用具有低解離速率的情況下不能準(zhǔn)確計算。對于h998/l63不能獲得準(zhǔn)確的分析值，其分析值在本文中顯示。然而，從實驗結(jié)果確認(rèn)，h998/l63在中性ph和酸性ph都具有非常強的結(jié)合親和力，并且適合作為要用于小鼠pk測定的比較的抗體。實施例11使用ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體h89/l118的小鼠pk測定(11-1)使用h89/l118的小鼠pk測定使用實施例9中產(chǎn)生的h89/l118和實施例10中產(chǎn)生的h998/l63評價人il-8的體內(nèi)去除速率。向小鼠(c57bl/6j，charlesriver)中同時施用人il-8和抗-人il-8抗體后，評價人il-8的藥代動力學(xué)。將人il-8和抗-人il-8抗體(分別是10μg/ml和200μg/ml)的混合溶液以10ml/kg的單個劑量施用于尾靜脈。此時，因為就人il-8而言存在足夠過量的抗-人il-8抗體，所以認(rèn)為幾乎所有人il-8結(jié)合于抗體。施用后五分鐘，兩小時，四小時，七小時，一天，兩天，三天，七天，14天，21天，和28天，收集血液。將收集的血液立即在15,000rpm和4℃離心15分鐘，獲得血漿。將分離的血漿儲存在設(shè)為-20℃或以下的冰箱中，直到進行測量。(11-2)血漿中人il-8濃度的測量通過電化學(xué)發(fā)光方法確定小鼠血漿中的人il-8濃度。首先，將包含小鼠igg恒定區(qū)的抗-人il-8抗體(內(nèi)部制備)分散到multi-array96-孔板(mesoscalediscovery)中，并且使其在室溫靜置一小時。然后將含有5％bsa(w/v)的pbs-tween溶液用于在室溫封閉兩小時以制備固定有抗-人il-8抗體的平板。制備以275，91.7，30.6，10.2，3.40，1.13，或0.377ng/ml的血漿濃度含有人il-8的校準(zhǔn)曲線樣品和稀釋25-倍或更多的小鼠血漿測量樣品。將樣品與hws-4混合并讓其在37℃反應(yīng)過夜。隨后，將50μl的混合溶液分散在固定有抗-人il-8抗體的平板的每個孔中，并且將溶液在室溫攪拌一小時。將hws-4的終濃度調(diào)節(jié)至25μg/ml。然后，在與生物素小鼠抗-人igκ輕鏈(bdpharmingen)在室溫反應(yīng)一小時，并且隨后與sulfo-tag標(biāo)記的鏈霉親和素(mesoscalediscovery)在室溫反應(yīng)一小時后，分散讀取緩沖液t(x1)(mesoscalediscovery)，立即利用sector成像儀2400(mesoscalediscovery)進行測量。使用分析軟件，softmaxpro(moleculardevices)，基于校準(zhǔn)曲線的響應(yīng)計算人il-8濃度。得到的人il-8在血漿中的濃度的數(shù)據(jù)顯示在圖22中，并且人il-8從小鼠血漿的清除率(cl)的值在表15中顯示。[表15]從圖22看出，與和h998/l63同時施用人il-8比較，與h89/l118同時施用的人il-8顯示出人意料地快速從小鼠血漿去除。此外，定量表示人il-8從小鼠血漿的去除速率的cl值表明，與h998/l63相比，人il-8的去除速率對于h89/l118增加約19-倍。不受特定理論限制，從獲得的數(shù)據(jù)可以猜測以下內(nèi)容。大多數(shù)與抗體同時施用的人il-8結(jié)合血漿中的抗體并且以復(fù)合形式存在。由于抗體的強親和力，結(jié)合于h998/l63的人il-8可以以抗體結(jié)合的狀態(tài)存在，甚至在內(nèi)體中的酸性ph條件下。之后，h998/l63可以經(jīng)由fcrn返回血漿，同時仍然以人il-8-復(fù)合的形式；因此，當(dāng)這發(fā)生時，人il-8同時也返回血漿中。因此，大多數(shù)攝入細(xì)胞的人il-8可以再次返回血漿。即，當(dāng)同時施用h998/l63時，人il-8從血漿去除的速率顯著降低。另一方面，如之前描述的，以與h89/l118(ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體)復(fù)合的形式攝入細(xì)胞的人il-8，可以在內(nèi)體中的酸性ph條件下與抗體解離。從抗體解離的人il-8在轉(zhuǎn)移到溶酶體后會降解。因此，與在酸性ph和中性ph都具有強的結(jié)合親和力的il-8-結(jié)合抗體如h998/l63相比，ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體可以顯著加速人il-8的去除。(11-3)利用增加的劑量的h89/l118的小鼠pk測定接著，如下進行驗證改變h89/l118的劑量的效果的實驗。同時向小鼠(c57bl/6j，charlesriver)施用人il-8和h89/l118(2mg/kg或8mg/kg)后，評價人il-8的藥代動力學(xué)。以10ml/kg的單個劑量將人il-8(2.5μg/ml)和抗-人il-8抗體(200μg/ml或800μg/ml)的混合溶液施用于尾靜脈。此時，因為與人il-8相比存在足夠過量的抗-人il-8抗體，所以認(rèn)為幾乎所有人il-8結(jié)合于抗體。施用后五分鐘，七小時，一天，兩天，三天，七天，14天，21天，和28天，收集血液。將收集的血液立即在15,000rpm和4℃離心15分鐘，獲得血漿。將分離的血漿儲存在設(shè)為-20℃或以下的冰箱中，直到進行測量。小鼠血漿中的人il-8濃度的測量通過實施例11-2類似的方法進行。得到的關(guān)于血漿中人il-8濃度的數(shù)據(jù)顯示在圖23中，并且人il-8從小鼠血漿的清除率(cl)的值顯示在表16中。[表16]由此，確認(rèn)與施用以2mg/kg的h89/l118的組相比，施用以8mg/kg抗體的組具有大約2-倍慢的人il-8去除速率。下文中，本發(fā)明人描述基于科學(xué)背景概述為帶來前述結(jié)果的可能因素之一的內(nèi)容，但公開內(nèi)容c的內(nèi)容不限于以下討論的內(nèi)容。在經(jīng)由fcrn從內(nèi)體內(nèi)部返回血漿中的抗體中，優(yōu)選的是結(jié)合人il-8的抗體的比例低。關(guān)于內(nèi)體中存在的人il-8，希望其具有高比例的不被抗體結(jié)合的游離形式。當(dāng)人il-8與不具有ph-依賴性il-8-親和力的抗體一起施用時，認(rèn)為內(nèi)體中的大多數(shù)(接近100％)人il-8以與抗體復(fù)合的形式存在，并且小量(接近0％)被認(rèn)為是游離。另一方面，當(dāng)與ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體(例如h89/l118)一起施用時，特定部分的人il-8應(yīng)該以游離形式存在于內(nèi)體中。假想地，在此情況下游離形式的比例可以如下理解：[內(nèi)體中游離人il-8的比例(％)]＝[內(nèi)體中游離人il-8濃度]/[內(nèi)體中總?cè)薸l-8濃度]x100。理想的是，通過上述等式理解的內(nèi)體中游離人il-8的比例更高，并且例如，20％比0％更優(yōu)選，40％比20％更優(yōu)選，60％比40％更優(yōu)選，80％比60％更優(yōu)選，和100％比80％更優(yōu)選。因此，在上述內(nèi)體中游離人il-8的比例和在酸性ph對人il-8的結(jié)合親和力(kd)和/或解離速率常數(shù)(koff)之間有關(guān)聯(lián)。即，在酸性ph對人il-8的結(jié)合親和力越弱和/或解離速率越強，則內(nèi)體中游離人il-8的比例越高。然而，在可以使游離人il-8的比例在內(nèi)體中接近100％的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體的情況下，進一步在酸性ph弱化結(jié)合親和力和/或增加解離速率不一定導(dǎo)致游離人il-8的比例的有效增加。技術(shù)人員可以容易理解，例如，即使游離人il-8的比例從99.9％改善到99.99％，這種改善程度可能是不顯著的。此外，根據(jù)一般化學(xué)平衡理論，當(dāng)抗-il-8抗體和人il-8共存并且其結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)達到平衡時，游離人il-8的比例明確通過三個參數(shù)確定：抗體濃度，抗原濃度，和解離常數(shù)(kd)。本文中，當(dāng)抗體濃度高時，當(dāng)抗原濃度高時，或當(dāng)解離常數(shù)(kd)小時，復(fù)合物容易形成并且游離人il-8的比例降低。另一方面，當(dāng)抗體濃度低時，當(dāng)抗原濃度低時，或當(dāng)解離常數(shù)(kd)大時，復(fù)合物形成變得困難，并且游離人il-8的比例增加。同時，在該實驗中，當(dāng)以8mg/kg施用h89/l118時去除人il-8的速率低于當(dāng)以2mg/kg施用抗體時的速率。這因此提示，在內(nèi)體中，與當(dāng)以2mg/kg施用抗體時相比，當(dāng)以8mg/kg施用抗體時，游離人il-8的比例減少。該降低的原因可能是增加抗體劑量四倍增加內(nèi)體中的抗體濃度，并且由此促進內(nèi)體中il-8-抗體復(fù)合物的形成。即，在施用以增加的劑量的抗體的組中，游離人il-8在內(nèi)體中的比例降低，并且因此去除人il-8的速率降低。這還提示，當(dāng)以8mg/kg施用抗體時，h89/l118在酸性ph條件下的解離常數(shù)(kd)的程度不足以將游離人il-8變?yōu)榻咏?00％。更具體而言，如果其是在酸性ph條件下具有較大解離常數(shù)(kd)(較弱結(jié)合)的抗體，甚至當(dāng)以8mg/kg施用抗體時，其可以實現(xiàn)接近100％游離il-8的狀態(tài)，并且人il-8去除的速率等于當(dāng)以2mg/kg施用抗體時的速率?；谏鲜鰞?nèi)容，為了確認(rèn)研究的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體是否可以實現(xiàn)在內(nèi)體內(nèi)接近100％游離人il-8的比例，不特別限制，技術(shù)人員可以驗證是否存在增加體內(nèi)抗原-去除效果的程度的空間。例如，一種方法比較當(dāng)使用新的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體時與當(dāng)時用h89/l118時人il-8去除的速率，在此情況下，與h89/l118相比，新的抗體在酸性ph具有更弱的結(jié)合親和力和/或在酸性ph具有增加的解離速率。在前述新的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體顯示與h89/l118相當(dāng)?shù)娜薸l-8去除速率的情況下，這提示，h89/l118在酸性ph的結(jié)合親和力和/或解離速率已經(jīng)處于足以實現(xiàn)游離人il-8在內(nèi)體的比例接近100％的水平。另一方面，在前述新ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體顯示更高的人il-8去除速率的情況下，這提示h89/l118在酸性ph的結(jié)合親和力和/或解離速率具有改善空間。實施例12ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體h553/l118的產(chǎn)生和評價(12-1)具有ph-依賴性il-8結(jié)合能力的抗體h553/l118的生產(chǎn)本文中，本發(fā)明人旨在產(chǎn)生與h89/l118相比，在酸性ph條件下具有甚至更弱的人il-8-結(jié)合親和力和/或更高的解離速率的抗體。使用h89/l118作為基礎(chǔ)引入氨基酸修飾(主要涉及組氨酸)，通過與實施例9類似的方法產(chǎn)生表17中所示的修飾的抗體。此外，通過與實施例9-2類似的方法確定這些抗體的人il-8-結(jié)合親和力。部分結(jié)果顯示在表17中。顯示包含h553-igg1(seqidno：90)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈的抗體h553/l118，和包含h496-igg1(seqidno：101)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈的抗體h496/l118具有比h89/l118進一步增加的ph依賴性。[表17]在獲得的h553/l118中，將兩種氨基酸修飾，y55h和r57p，引入h89/l118的重鏈中。另一方面，h496/l118，其中僅將r57p引入h89/l118的重鏈中，與h89/l118相比，在中性ph具有增強的對人il-8的結(jié)合親和力，但在酸性ph具有幾乎不改變的人il-8-結(jié)合親和力。更具體而言，引入h89/l118的r57p修飾是僅增強在中性ph的人il-8-結(jié)合親和力但不改變在酸性ph的結(jié)合親和力的修飾。此外，與h89/l118相比，通過將y55h修飾引入h496/l118的重鏈產(chǎn)生的h553/l118在中性ph具有保持的或稍微增強的結(jié)合親和力，但另一方面，在酸性ph具有減小的結(jié)合親和力。即，將兩個氨基酸修飾(y55h和r57p)的組合引入h89/l118使得進一步增強在酸性ph降低結(jié)合親和力，同時在中性ph保持或稍微增強結(jié)合親和力的性質(zhì)。(12-2)使用h553/l118的小鼠pk測定使用h553/l118評價小鼠中人il-8去除速率，通過與實施例11-2類似的方法進行。將得到的關(guān)于血漿中人il-8濃度的數(shù)據(jù)在圖24中顯示，并且人il-8從小鼠血漿的清除率(cl)的值在表18中顯示。[表18]由此，當(dāng)比較施用以2mg/kg抗體的小鼠的數(shù)據(jù)時，在h553/l118和h89/l118之間未觀察到大的差異；然而，確認(rèn)的是，當(dāng)比較施用以8mg/kg抗體的小鼠的數(shù)據(jù)時，與h89/l118相比，h553/l118以2.5倍作用加速人il-8的去除。從另外一個角度，在2mg/kg和8mg/kg之間，h553/l118不顯示人il-8去除速率的差異，并且關(guān)于h89/l118未觀察到由于增加抗體劑量造成的抗原去除速率的降低。沒有特別限制，獲得該結(jié)果的一個原因可以如下討論。當(dāng)以2mg/kg和以8mg/kg施用抗體時，h533/l118顯示相當(dāng)?shù)娜薸l-8去除速率。這可以表明，內(nèi)體中游離il-8的比例可以達到接近100％的水平，因為h553/l118在酸性ph對il-8的結(jié)合足夠弱，甚至在8mg/kg-施用的條件下。換句話說，這提示，盡管h89/l118可以以2mg/kg的劑量實現(xiàn)最大的人il-8去除效果，但其效果在約8mg/kg的高劑量下可能弱化。另一方面，h553/l118可以甚至在8mg/kg的高劑量下實現(xiàn)最大的去除人il-8的效果。(12-3)使用h553/l118的穩(wěn)定性評價顯示h553/l118是可以比h89/l118更顯著地加速在小鼠中人il-8的去除的抗體。然而，為了該抗體在體內(nèi)長期持續(xù)該對人il-8的抑制性效果，同樣重要的是，在施用的抗體存在于體內(nèi)(例如，血漿中)的期間，穩(wěn)定保持il-8-中和活性(該抗體的il-8-中和活性的穩(wěn)定性)。因此，通過以下方法評價這些抗體在小鼠血漿中的穩(wěn)定性。通過本領(lǐng)域中已知的方法從c57bl/6j(charlesriver)的血液收集小鼠血漿。將200μl的200mmpbs(sigma，p4417)加入至800μl的小鼠血漿中，得到1ml。此外，將疊氮化鈉以0.1％的終濃度作為防腐劑加入。然后，將每種抗體(hr9，h89/l118和h553/l118)加入至上述小鼠血漿中得到0.2mg/ml的終濃度。此刻，收集一部分樣品作為初始樣品。剩余樣品儲存在40℃。儲存后一周和二周，收集每種樣品的一部分，并且將它們用作儲存一周的樣品和儲存兩周的樣品。所有樣品在-80℃冷凍并儲存，直到進行每個分析。接著，如下對小鼠血漿中含有的抗-il-8抗體評價其人il-8-中和活性：cxcr1和cxcr2是人il-8的已知受體。pathhunter(注冊商標(biāo))cho-k1cxcr2β-阻抑蛋白細(xì)胞系(discoverxco.，cat.#93-0202c2)表達人cxcr2，并且是人工產(chǎn)生的細(xì)胞系，從而當(dāng)傳遞人il-8-介導(dǎo)的信號時發(fā)出化學(xué)發(fā)光。其不特別限制，抗-人il-8抗體具有的人il-8-中和活性可以使用該細(xì)胞評價。當(dāng)將人il-8加入細(xì)胞的培養(yǎng)溶液時，特定量的化學(xué)發(fā)光以依賴于添加的人il-8的濃度的方式呈現(xiàn)。當(dāng)將人il-8和抗-人il-8抗體一起加入培養(yǎng)溶液中時，在抗-人il-8抗體結(jié)合人il-8之后，人il-8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被阻斷。由此，通過添加人il-8引起的化學(xué)發(fā)光將被抗-人il-8抗體抑制，并且化學(xué)發(fā)光將比不加抗體時弱，或根本不存在化學(xué)發(fā)光。因此，隨著抗體具有的人il-8中和活性變得更強，化學(xué)發(fā)光的程度變得更弱；并且隨著抗體具有的人il-8中和活性變得更弱，化學(xué)發(fā)光的程度變得更強。這對于已經(jīng)加入小鼠血漿并儲存一定時期的抗體也是一樣。如果抗體的中和活性不由于在小鼠血漿中的儲存改變，儲存前和后上述化學(xué)發(fā)光的程度應(yīng)該不改變。另一方面，在其中和活性由于在小鼠血漿中的儲存而降低的抗體的情形中，與儲存前相比，通過使用儲存的抗體的化學(xué)發(fā)光程度將增加。隨后，上述細(xì)胞系用于檢查小鼠血漿中儲存的抗體的中和活性是否得到保持。首先，將細(xì)胞系懸浮在assaycomplete(tm)cellplating0試劑中，并且隨后以5000個細(xì)胞/孔接種在384-孔板中。開始細(xì)胞培養(yǎng)后一天，進行以下實驗以確定要加入的人il-8的濃度。將系列稀釋的人il-8溶液(其含有45nm(400ng/ml)至0.098nm(0.1ng/ml)的人il-8終濃度)加入到細(xì)胞培養(yǎng)溶液中。接著，根據(jù)產(chǎn)品的方案添加檢測試劑，并且使用化學(xué)發(fā)光檢測器檢測相對化學(xué)發(fā)光水平。從該結(jié)果，確認(rèn)細(xì)胞對人il-8的反應(yīng)性，并且確定適于確認(rèn)抗-人il-8抗體的中和活性的人il-8濃度。本文中，人il-8濃度設(shè)為2nm。接著，前述添加抗-人il-8抗體的小鼠血漿用于評價其中含有的抗體的中和活性。將上文確定的濃度的人il-8和前述含有抗-人il-8抗體的小鼠血漿加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。確定要加入的小鼠血漿的量，從而含有范圍從2μg/ml(13.3nm)至0.016μg/ml(0.1nm)的抗-人il-8抗體的階梯濃度。接著，根據(jù)產(chǎn)品方案添加檢測試劑，并且使用化學(xué)發(fā)光檢測器檢測相對化學(xué)發(fā)光水平。本文中，在每個抗體濃度的相對化學(xué)發(fā)光水平的相對值通過將不添加人il-8和抗體的孔中的平均相對化學(xué)發(fā)光水平定義為0％，和將僅添加人il-8但不添加抗體的孔中的平均相對化學(xué)發(fā)光水平定義為100％來計算。使用表達人cxcr2的細(xì)胞的人il-8抑制測定的結(jié)果顯示在圖25a(其顯示來自最初樣品(在小鼠血漿中沒有防腐劑處理)的結(jié)果)，圖25b(其顯示在40℃儲存一周的樣品的結(jié)果)，和圖25c(其顯示在40℃儲存兩周的樣品的結(jié)果)中。由此，對于hr9和h89/l118未觀察到儲存在小鼠血漿中之前和之后人il-8-中和活性的差異。另一方面，h553/l118顯示在兩周的儲存后人il-8-中和活性降低。因此，與hr9和h89/l118相比，h553/l118的人il-8-中和活性在小鼠血漿中容易降低，并且顯示h553/l118是關(guān)于il-8中和活性具有不穩(wěn)定性質(zhì)的抗體。實施例13使用計算機系統(tǒng)具有降低的預(yù)測的免疫原性得分的抗體的產(chǎn)生(13-1)各種il-8-結(jié)合抗體的預(yù)測的免疫原性得分抗藥物抗體(ada)的產(chǎn)生影響治療性抗體的功效和藥代動力學(xué)，并且有些情況下帶來多種副作用；因此，治療性抗體的臨床利用和藥物功效可能受ada產(chǎn)生限制。已知治療性抗體的免疫原性受很多因素影響，并且，存在很多描述效應(yīng)t細(xì)胞表位在治療性抗體中的重要性的報道。已經(jīng)開發(fā)了用于預(yù)測t細(xì)胞表位的計算機工具如epibase(lonza)，itope/tced(antitope)，和epimatrix(epivax)。使用這些計算機工具，可以預(yù)測每個氨基酸序列中的t細(xì)胞表位(walle等人，expertopin.biol.ther.7(3)：405-418(2007))，并且可以評價治療性抗體的可能的免疫原性。本文中，epimatrix用于計算每種抗-il-8抗體的免疫原性得分。epimatrix是用于通過將要預(yù)測其免疫原性的蛋白的氨基酸序列以九個氨基酸分段自動設(shè)計肽片段的序列，并且隨后計算其結(jié)合八種ii型主要mhc等位基因(drb1*0101，drb1*0301，drb1*0401，drb1*0701，drb1*0801，drb1*1101，drb1*1301，和drb1*1501)的能力，預(yù)測研究的蛋白的免疫原性的系統(tǒng)(clin.immunol.131(2)：189-201(2009))。每個抗-il-8抗體的重鏈和輕鏈的免疫原性得分(如上文所述計算)在表19的"epimatrix得分"欄中顯示。此外，關(guān)于epimatrix得分，對于tregitope含量校準(zhǔn)的免疫原性得分在"treg調(diào)節(jié)的epx得分"欄顯示。tregitope是主要在天然的抗體序列中大量存在的肽片段序列，并且是認(rèn)為通過激活抑制性t細(xì)胞(treg)抑制免疫原性的序列。此外，關(guān)于這些得分，對于重鏈和輕鏈的得分的總和在"總共"欄中顯示。[表19]根據(jù)這些結(jié)果，"epimatrix得分"和"treg調(diào)節(jié)的epx得分"都顯示與hws-4(其是已知人源化抗-人il-8抗體)相比，h89/l118，h496/l118和h553/l118的免疫原性得分降低。此外，利用epimatrix，可行的是比較通過考慮重鏈和輕鏈得分對于作為整體的抗體分子預(yù)測的ada產(chǎn)生頻率與由各種可商購抗體引起的實際ada產(chǎn)生頻率。進行所述分析的結(jié)果顯示在圖26中。由于系統(tǒng)限制，圖26中使用的符號對于hws-4是"ws4"，對于hr9是"hr9"，對于h89/l118是"h89l118"，對于h496/l118是"h496l118"，并且對于h553/l118是"h553l118"。如圖26中所示的，由各種可商購抗體引起的人中ada產(chǎn)生的頻率已知對于campath(阿侖單抗(alemtuzumab))是45％，對于rituxan(利妥昔單抗(rituximab))是27％，對于zenapax(達克珠單抗(daclizumab))是14％。另一方面，在從氨基酸序列預(yù)測的ada產(chǎn)生頻率對于hws-4(其是已知人源化抗-人il-8抗體)是10.42％的同時，與hws-4相比，本文中新鑒定的h89/l118(5.52％)，h496/l118(4.67％)，或h553/l118(3.45％)的頻率顯著較低。(13-2)具有降低的預(yù)測的免疫原性得分的修飾的抗體的生產(chǎn)如上文所述的，與hws-4相比，h89/l118，h496/l118，和h553/l118的免疫原性得分較低；然而，如從表19顯而易見的，對于重鏈的免疫原性得分高于對于輕鏈的免疫原性得分，這提示對于重鏈的氨基酸序列的改善仍存在空間(尤其是從免疫原性的角度)。然后，在h496的重鏈可變區(qū)中進行可以降低免疫原性得分的氨基酸修飾的搜索。作為仔細(xì)搜索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三個變體，h496v1(其中根據(jù)kabat編號位置52c處的丙氨酸用天冬氨酸置換)，h496v2(其中位置81處的谷氨酰胺用蘇氨酸置換)，和h496v3(其中位置82b處的絲氨酸用天冬氨酸置換)。此外，產(chǎn)生含有所有這三種修飾的h1004s。通過與實施例13-1類似的方法計算的免疫原性得分的結(jié)果顯示在表20中。[表20]與h496相比，三條重鏈，h496v1，h496v2，和h496v3(其全部含有單個修飾)，顯示減小的免疫原性得分。此外，h1004(含有三個修飾的組合)實現(xiàn)顯著的免疫原性得分改善。本文中，除了l118之外，鑒定l395作為適于與h1004組合的輕鏈。因此，在免疫原性得分的計算中，使用l118組合和l395組合。如表20中所示，h1004/l118和h1004/l395(其是重鏈和輕鏈的組合)也顯示非常低的免疫原性得分。接著，以與實施例13-1類似的方式對這些組合預(yù)測ada產(chǎn)生的頻率。結(jié)果在圖27中顯示。圖27中使用的符號對于h496v1/l118是"v1"，對于h496v2/l118是"v2"，對于h496v3/l118是"v3"，對于h1004/l118是"h1004l118"，并且對于h1004/l395是"h1004l395"。出人意料地，h1004/l118和h1004/l395(其具有顯著降低的免疫原性得分)也顯示對ada產(chǎn)生頻率預(yù)測的值的改善，并且顯示預(yù)測的值為0％。(13-3)h1004/l395的il-8-結(jié)合親和力的測量產(chǎn)生h1004/l395，其是包含h1004-igg1m(seqidno：91)作為重鏈和l395-k0mt(seqidno：82)作為輕鏈的抗體。如下文描述使用biacoret200(gehealthcare)測量h1004/l395對人il-8的結(jié)合親和力。使用以下兩種運行緩沖液，并且在各個溫度進行測量：(1)0.05％吐溫20，40mmaces，150mmnacl，ph7.4，40℃；和(2)0.05％吐溫20，40mmaces，150mmnacl，ph5.8，37℃。通過胺偶聯(lián)方法將適量的蛋白a/g(pierce)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上并且捕獲目標(biāo)抗體。接著，注射稀釋的人il-8溶液或運行緩沖液(用作參照溶液)以允許捕獲在傳感芯片上的抗體與人il-8的相互作用。對于運行緩沖液，使用上述溶液中的任一種，并且各個緩沖液還用于稀釋人il-8。為了再生傳感芯片，使用25mmnaoh和10mm甘氨酸-hcl(ph1.5)。基于結(jié)合速率常數(shù)kon(1/ms)和解離速率常數(shù)koff(1/s)(其是從通過測量獲得的傳感圖計算的動力學(xué)參數(shù))計算每個抗體對于人il-8的kd(m)。biacoret200評價軟件(gehealthcare)用于計算每個參數(shù)。測量結(jié)果顯示在表21中。與h89/l118相比，h1004/l395(具有降低的免疫原性得分)在中性ph具有相當(dāng)?shù)膶τ谌薸l-8的kd，但在酸性ph具有增加的kd和koff；并且顯示其具有在內(nèi)體中容易從il-8解離的性質(zhì)。[表21-1]實施例14ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體h1009/l395的產(chǎn)生和評價(14-1)各種ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體的生產(chǎn)通過實施例13中的評價獲得h1004/l395(其具有ph-依賴性il-8結(jié)合能力和降低的免疫原性得分)。隨后，進行深入研究，產(chǎn)生在小鼠血漿中具有這些有利性質(zhì)以及穩(wěn)定性的變體?；趆1004/l395通過引入各種修飾產(chǎn)生以下修飾的抗體。[表21-2]重鏈h1004a52cd/r57p/q81t/s82bd/y97hh0932a52cd/g54h/y55h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1000d31e/a52cd/g54h/y55h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1009a52cd/g54y/y55h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1022a52cd/g54h/y55h/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1023a52cd/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1028a52cd/g54y/y55h/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1029s30d/d31k/a52cd/g54h/y55h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1031s30d/d31k/a52cd/g54h/y55h/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1032s30d/d31k/a52cd/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1037s30d/d31k/a52cd/g54y/y55h/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1040d31e/a52cd/g54h/y55h/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1041d31e/a52cd/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1046d31e/a52cd/g54y/y55h/t56h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1047s30d/d31k/a52cd/r57p/q81t/s82bd/y97hh1048d31e/a52cd/r57p/q81t/s82bd/y97hh1049s30d/d31k/a52cd/g54y/y55h/r57p/q81t/s82bd/y97hh1050d31e/a52cd/g54y/y55h/r57p/q81t/s82bd/y97h[表21-3]l395n50k/l54h/q89kl442s31e/n50k/l54h/q89k通過組合上述18種類型的重鏈和兩種類型的輕鏈產(chǎn)生總共36種類型的抗體。如下文所述對這些抗體進行各種評價。以與實施例13-3的方法類似的方式測量在中性和酸性ph條件下的人il-8-結(jié)合親和力。在獲得的結(jié)果中，在ph7.4的kd，以及在ph5.8的kd和koff顯示在表22中。接著，通過下述方法評價在pbs中儲存抗體后關(guān)于il-8結(jié)合的穩(wěn)定性。將各個抗體用dpbs(sigma-aldrich)透析過夜，并且隨后將每種抗體的濃度調(diào)節(jié)至0.1mg/ml。此刻，收集一些抗體樣品作為起始樣品。剩余樣品在50℃儲藏一周，并且隨后收集作為用于熱加速測試的樣品。接著，使用最初樣品和用于熱加速測試的樣品如下進行il-8-結(jié)合親和力的biacore測量。使用biacoret200(gehealthcare)分析人il-8對修飾的抗體的結(jié)合水平。通過使用0.05％吐溫20，40mmaces，和150mmnacl(ph7.4)作為運行緩沖液在40℃進行測量。通過胺偶聯(lián)方法將適量的蛋白a/g(pierce)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上并且捕獲目標(biāo)抗體。接著，注射稀釋的人il-8溶液或運行緩沖液(用作參照溶液)以使捕獲在傳感芯片上的抗體與人il-8相互作用。運行緩沖液還用于稀釋人il-8。為了再生傳感芯片，使用25mmnaoh和10mm甘氨酸-hcl(ph1.5)。測量的人il-8結(jié)合水平和在該結(jié)合水平捕獲的抗體的量使用biacoret200評價軟件(gehealthcare)提取。對于初始樣品和用于熱加速測試的樣品計算每1000ru量的捕獲的抗體的人il-8-結(jié)合的量。此外，計算對于初始樣品與用于熱加速測試的樣品的人il-8-結(jié)合水平的比率。得到的初始樣品與用于熱加速測試的樣品的il-8-結(jié)合水平的比率也顯示在表22中。[表22]通過上述研究，獲得h1009/l395，其是包含h1009-igg1m(seqidno：92)作為重鏈和l395-k0mt作為輕鏈的抗體。如表22中所示，與h89/l118相比，h1009/l395在中性ph具有稍微增強的人il-8-結(jié)合親和力，但另一方面，在酸性ph具有減小的結(jié)合親和力，即，ph-依賴性進一步加強。此外，當(dāng)暴露于嚴(yán)格條件如在50℃在pbs中，與h89/l118相比，h1009/l395具有稍微增強的il-8結(jié)合穩(wěn)定性。因此，選擇h1009/l395作為其在小鼠血漿中的中和活性可以穩(wěn)定保持，同時保持其ph-依賴性il-8結(jié)合能力的抗體。(14-2)h1009/l395的穩(wěn)定性評價接著，以與實施例12-3的方法類似的方式，評價h1009/l395的il-8中和活性在小鼠血漿中是否穩(wěn)定保持。本文中，使用h1009/l395-f1886s，其將在之后實施例19中詳細(xì)描述。該抗體具有與h1009/l395相同的可變區(qū)，和與天然人igg1相比具有在酸性ph條件下增強fcrn結(jié)合的修飾和用于降低其對fcγr(s)的結(jié)合的修飾的恒定區(qū)。h1009/l395的可變區(qū)，尤其是hvr周圍的區(qū)域，負(fù)責(zé)該抗體的人il-8-結(jié)合和il-8-中和活性，并且引入恒定區(qū)的修飾被認(rèn)為不影響這些性質(zhì)。如下進行小鼠血漿的穩(wěn)定性評價。將150μl的200mm磷酸鹽緩沖液(ph6.7)加入到585μl的小鼠血漿中。然后，疊氮化鈉作為防腐劑以0.1％的終濃度加入。將每種抗體(hr9，h89/l118，或h1009/l395-f1886s)以0.4mg/ml的終濃度加入上述小鼠血漿中。此刻，收集樣品的一部分作為初始樣品。剩余樣品儲存在40℃。開始儲存后一周和二周，收集每種樣品的一部分，并且將它們用作儲存一周的樣品和儲存兩周的樣品。所有樣品在-80℃冷凍并儲存，直到進行分析。人il-8-中和活性的測量使用表達人cxcr2的細(xì)胞，通過與實施例12-3相似的方法進行。然而，這次用于確認(rèn)抗-人il-8抗體的中和活性的人il-8的濃度是1.2nm。使用上述抗體與表達人cxcr2的細(xì)胞獲得的人il-8抑制測定的結(jié)果在圖28a(其顯示對于最初樣品(沒有在小鼠血漿中的儲存處理)的結(jié)果，圖28b(其顯示對于在40℃儲存一周的樣品的結(jié)果)，和圖28c(其顯示在40℃儲存兩周的樣品的結(jié)果)中顯示。由此，出人意料地，甚至在將其在小鼠血漿中在40℃儲存兩周后，人il-8-中和活性在h1009/l395-f1886s中保持，并且il-8-中和活性比在h553/l118的情形中更穩(wěn)定保持。(14-3)使用h1009/l395的小鼠pk測定通過以下方法評價由h1009/h395在小鼠中去除人il-8的速率。h1009/l395，h553/l118，和h998/l63用作抗體。通過實施例11中所示方法進行向小鼠的施用和血液收集，以及小鼠血漿中人il-8濃度的測量。得到的人il-8在血漿中的濃度的數(shù)據(jù)在圖29中顯示，并且人il-8從小鼠血漿的清除率(cl)的值在表23中顯示。[表23]由此，當(dāng)將h1009/l395以2mg/kg施用時，在小鼠中人il-8去除的速率與h553/l118的相當(dāng)，并且表明，h1009/l395實現(xiàn)內(nèi)體中接近100％的游離il-8。顯示定量表示從小鼠血漿去除人il-8的速率的清除率(cl)值是h998/l63的大約30-倍高。沒有特別限制，增加人il-8去除速率的效果可以如下理解。通常，在以幾乎恒定濃度保持抗原的活體中，抗原的產(chǎn)生速率和去除速率也將保持在幾乎恒定值。當(dāng)抗體在該條件施用時，甚至在抗原生產(chǎn)速率不受影響的情況下，抗原去除的速率可以由于抗原與抗體的復(fù)合物的形成而改變。通常，因為抗原-去除速率大于抗體-去除速率，在此種情況下，已經(jīng)與抗體形成復(fù)合物的抗原的去除速率降低。當(dāng)抗原去除速率降低時，血漿中的抗原濃度增加，但在此情況下增加程度也可以由當(dāng)抗原單獨存在時的去除速率與當(dāng)抗原形成復(fù)合物時的去除速率的比率定義。即，與抗原單獨存在時的去除速率相比，如果形成復(fù)合物時的去除速率減少至十分之一，則施用抗體的生物的血漿中的抗原濃度可以比抗體施用前增加到大約十倍。本文中，清除率(cl)可以用作去除速率。更具體而言，向生物施用抗體后發(fā)生的抗原濃度的增加(抗原積累)可以由抗體施用前和抗體施用后每種條件下的抗原cl來定義。本文中，施用h998/l63和h1009/l395時人il-8的cl大約30-倍的差異的存在提示，將這些抗體施用給人時血漿中人il-8濃度的提高水平之間可以存在大約30-倍的差異。此外，血漿中人il-8濃度的30-倍的差異的產(chǎn)生表明，在各個條件下完全阻斷人il-8的生物活性所需的抗體的量將存在大約30-倍的差異。即，與h998/l63相比，h1009/l395可以以大約1/30的量阻斷血漿中il-8的生物活性，這是非常小的抗體量。此外，當(dāng)將h1009/l395和h998/l63以相同劑量單獨地施用于人時，h1009/l395將能夠長時期以較高強度阻斷il-8的生物活性。為了長時期阻斷il-8的生物活性，需要穩(wěn)定保持il-8-中和活性。如實施例14中所示，使用小鼠血漿的實驗闡明，h1009/l395可以長時期保持其人il-8-中和活性。還表明具有這些顯著性質(zhì)的h1009/l39，從體內(nèi)中和il-8的功效的角度是具有較好效果的抗體。實施例15使用ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體h1009/l395評價胞外基質(zhì)結(jié)合如實施例14中所示的h1009/l395在消除人il-8方面出色的30-倍好的效果是出人意料的效果。已知，當(dāng)施用ph-依賴性抗原結(jié)合抗體時的抗原去除速率取決于抗體-抗原復(fù)合物攝入細(xì)胞的速率。即，如果當(dāng)抗原-抗體復(fù)合物形成時(與不形成復(fù)合物時相比)ph-依賴性抗原結(jié)合抗體攝入細(xì)胞的速率增加，則ph-依賴性抗體的抗原-去除效果可以增加。用于增加抗體攝入細(xì)胞的速率的已知方法包括賦予抗體在中性ph條件下結(jié)合fcrn的能力的方法(wo2011/122011)，用于增強抗體對fcγr(s)的結(jié)合能力的方法(wo2013/047752)，和使用促進含有多價抗體和多價抗原的復(fù)合物的形成的方法(wo2013/081143)。然而，上述技術(shù)不用在h1009/l395的恒定區(qū)。此外，已知il-8形成同源二聚體的同時，發(fā)現(xiàn)由h1009/l395結(jié)合的人il-8以單體的形式存在，因為h1009/l395識別人il-8的形成同源二聚體的表面。因此，該抗體將不形成多價復(fù)合物。更具體而言，當(dāng)上述技術(shù)不用于h1009/l395時，h1009/l395顯示30-倍高的人il-8-去除效果。然后，本發(fā)明人進行關(guān)于可以帶來以h1009/l395為代表的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體的上述性質(zhì)的可能因素的以下討論。然而，以下僅是本發(fā)明人基于技術(shù)背景推測的一種可能性，并且公開內(nèi)容c的內(nèi)容不限于以下討論的內(nèi)容。人il-8是具有高等電點(pi)的蛋白，并且通過已知方法計算的理論等電點是大約10。即，在中性ph條件下，人il-8是其電荷向正面轉(zhuǎn)變的蛋白。由h1009/l395代表的ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體也是電荷朝正面轉(zhuǎn)變的蛋白，并且h1009/l395的理論等電點是大約9。即，通過h1009/l395(具有高等電點并且最初富含正電荷的蛋白)結(jié)合具有高等電點的人il-8產(chǎn)生的復(fù)合物的等電點將比單獨h1009/l395更高。如實施例3中所示，增加抗體的等電點(其包括增加抗體上的正電荷數(shù)和/或減少抗體的負(fù)電荷數(shù))，可以被認(rèn)為增加抗體-抗原復(fù)合物向細(xì)胞中的非特異的攝取。與單獨抗-il-8抗體相比，抗-il-8抗體和具有高等電點的人il-8之間形成的復(fù)合物的等電點更高，并且復(fù)合物可以更容易攝入細(xì)胞中。如之前描述的，對于胞外基質(zhì)的親和力也是可能影響向細(xì)胞內(nèi)攝取的因素。然后，檢查單獨抗體和具有人il-8-抗體的復(fù)合物之間在胞外基質(zhì)結(jié)合方面是否存在差異。通過ecl(電發(fā)光)方法評價結(jié)合于胞外基質(zhì)的抗體的量使用tbs(takara，t903)將胞外基質(zhì)(bdmatrigel基底膜基質(zhì)/由bd制造)稀釋至2mg/ml。將稀釋的胞外基質(zhì)以5μl/孔分散在multi-array96孔板，高結(jié)合，bare(由mesoscalediscovery：msd制造)中，并且在4℃固定過夜。然后，使用含有150mmnacl，0.05％吐溫20，0.5％bsa，和0.01％nan3的20mmaces緩沖液(ph7.4)進行封閉。如下制備要評價的抗體。要單獨添加的抗體樣品通過使用緩沖液1(含有150mmnacl，0.05％吐溫20，和0.01％nan3的20mmaces緩沖液，ph7.4)將每個抗體稀釋到9μg/ml，并且隨后使用緩沖液2(含有150mmnacl，0.05％吐溫20，0.1％bsa，和0.01％nan3的20mmaces緩沖液，ph7.4)進一步稀釋到3μg/ml的終濃度來制備。另一方面，作為與人il-8的復(fù)合物添加的抗體樣品如下制備：以十倍于抗體的摩爾濃度將人il-8添加至抗體樣品，然后使用緩沖液-1稀釋每種抗體從而使抗體濃度分別變?yōu)?μg/ml，并且隨后使用緩沖液-2將它們中的每個進一步稀釋到3μg/ml的抗體終濃度。此時，人il-8濃度是大約0.6μg/ml。將其在室溫震蕩一小時用于復(fù)合物形成。接著，從平板移除封閉溶液，將單獨抗體或作為復(fù)合物的抗體的溶液加入所述平板，并且將此在室溫震蕩一小時。然后，在去除單獨抗體溶液或復(fù)合物溶液后，加入含有0.25％戊二醛的緩沖液-1。然后，將平板靜置10分鐘后，將其用含有0.05％吐溫20的dpbs(由wakopurechemicalindustries制造)洗滌。用于ecl檢測的抗體通過使用sulfo-標(biāo)簽nhs酯(由msd制造)sulfo-標(biāo)記山羊抗-人igg(γ)(由zymedlaboratories制造)制備。將用于ecl檢測的抗體用緩沖液-2稀釋至1μg/ml，加入平板中，并且隨后在暗處在室溫震蕩一小時。去除用于ecl檢測的抗體，加入通過使用超純水2-倍稀釋msd讀取緩沖液t(4x)(由msd制造)產(chǎn)生的溶液，并且隨后由sector成像儀2400(由msd制造)測量發(fā)光量。結(jié)果顯示在圖30中。有趣的是，所有抗-il-8抗體如h1009/l395幾乎不顯示像單獨抗體一樣的對胞外基質(zhì)的任何結(jié)合(-il8)，但在與人il-8形成復(fù)合物后與胞外基質(zhì)結(jié)合(+hil8)。如上文所述的，抗-il-8抗體通過結(jié)合人il-8獲得對胞外基質(zhì)的親和力的性質(zhì)尚未被闡述。此外，不受限制，將該性質(zhì)與ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體結(jié)合可以更有效增加il-8去除的速率。實施例16使用非-fcrn-結(jié)合抗體的小鼠pk測定使用以下方法確認(rèn)人il-8和ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體之間的復(fù)合物是否形成以及在小鼠中復(fù)合物攝入細(xì)胞是否增加。首先，產(chǎn)生包含h1009/l395的可變區(qū)和缺乏對各種fc受體的結(jié)合親和力的fc區(qū)的抗體變體。具體而言，作為在酸性ph條件下用于缺失對人fcrn的結(jié)合能力的修飾，將重鏈h1009-igg1在位置253將丙氨酸置換為異亮氨酸和在位置254將天冬氨酸置換為絲氨酸(根據(jù)eu編號)。此外，作為用于缺失對小鼠fcγr(s)的結(jié)合的修飾，將位置235處的亮氨酸用精氨酸置換，將在位置236處的甘氨酸用精氨酸置換，和將在位置239處的絲氨酸用賴氨酸置換。產(chǎn)生1009-f1942m(seqidno：93)作為含有這些修飾中的四種的重鏈。此外，產(chǎn)生包含h1009-f1942m作為重鏈和l395-k0mt作為輕鏈的h1009/l395-f1942m。因為具有該fc區(qū)的抗體在酸性ph條件下缺乏fcrn結(jié)合親和力，所以其不從內(nèi)體轉(zhuǎn)移到血漿。因此，與包含天然fc區(qū)的抗體相比，所述抗體在活體中從血漿快速去除。在該情況下，在將包含天然fc區(qū)的抗體結(jié)合入細(xì)胞后，僅它們中不被fcrn營救的一部分在轉(zhuǎn)移到溶酶體后被降解，但在包含不具有fcrn-結(jié)合親和力的fc區(qū)的抗體的情況下，結(jié)合入細(xì)胞的所有抗體都在溶酶體中降解。更具體而言，在包含所述修飾的fc區(qū)的抗體的情況下，施用的抗體從血漿去除的速率可以與結(jié)合入細(xì)胞的速率相當(dāng)。即，細(xì)胞內(nèi)攝取其fcrn-結(jié)合親和力被缺失的抗體的速率也可以通過測量這些抗體從血漿去除的速率來確認(rèn)。然后，測試與單獨h1009/l395-f1942m的攝取相比，h1009/l395-f1942m和人il-8之間形成的復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取是否增加。具體而言，測試當(dāng)單獨施用抗體時和當(dāng)與人il-8形成復(fù)合物后施用抗體時抗體從血漿去除的速率是否將改變。評價在將抗-人il-8抗體單獨施用給人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrntg品系32+/+小鼠；jacksonlaboratories；methodsmol.biol.602：93-104(2010))和將人il-8和抗-人il-8抗體同時施用給人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠時，抗-人il-8抗體各自的生物動力學(xué)(biokinetics)?？?人il-8抗體溶液(200μg/ml)，和人il-8(10μg/ml)和抗-人il-8抗體(200μg/ml)的混合溶液分別以10ml/kg施用于尾靜脈一次。在該情況下，因為抗-人il-8抗體以足夠超過人il-8的量存在，所以認(rèn)為幾乎所有人il-8結(jié)合抗體。施用后五分鐘，兩小時，七小時，一天，和兩天收集血液。將收集的血液立即在4℃和15,000rpm離心15分鐘，獲得血漿。將分離的血漿在設(shè)為-20℃或以下的冰箱中儲存，直到進行測量。通過電化學(xué)發(fā)光方法測量小鼠血漿中的抗-人il-8抗體濃度。首先，向使用含有5％bsa(w/v)的pbs-吐溫溶液在室溫封閉過夜的鏈霉親和素goldmulti-array板(mesoscalediscovery)，將抗-人κ輕鏈山羊iggbiotin(ibl)在室溫反應(yīng)一小時，產(chǎn)生固定有抗-人抗體的平板。制備含有在血漿中濃度為3.20，1.60，0.800，0.400，0.200，0.100，和0.0500μg/ml的抗-人il-8抗體的用于校準(zhǔn)曲線的樣品和稀釋100-倍或更高的用于小鼠血漿測量的樣品。將每種樣品與人il-8混合，并且隨后以50μl/孔分散在固定有抗-人抗體的板中，并且隨后在室溫攪拌一小時。將人il-8調(diào)節(jié)至333ng/ml的終濃度。然后，將包含小鼠igg恒定區(qū)的抗-人il-8抗體(內(nèi)部制備)加入板中，并讓其在室溫反應(yīng)一小時。此外，將用sulfo-tagnhs酯(mesoscalediscovery)釕-標(biāo)記的抗-小鼠igg(beckmancoulter)加入板中，并且讓其反應(yīng)一小時。然后，在將讀取緩沖液t(x1)(mesoscalediscovery)分散到板中后，立即使用sector成像儀2400(mesoscalediscovery)進行測量。使用分析軟件，softmaxpro(moleculardevices)，基于校準(zhǔn)曲線的響應(yīng)計算抗-人il-8抗體濃度。由此獲得的小鼠血漿中抗體濃度顯示在圖31中，并且在各個條件下的抗體清除率顯示在表24中。[表24]顯示與h1009/l395-f1942m的攝取速率相比，細(xì)胞內(nèi)攝取h1009/l395-f1942m和人il-8的復(fù)合物的速率增加至少2.2倍。本文中，因為作為可以實際上是5-倍，10-倍，或30-倍的值的一種可能性包括在內(nèi)的以下原因而標(biāo)注為"至少2.2-倍"。因為與去除h1009/l395-f1942m的速率相比，從小鼠血漿去除人il-8的速率非常快，所以施用后血漿中人il-8結(jié)合的h1009/l395-f1942m的比例快速降低。更具體而言，甚至當(dāng)與人il-8同時施用時，不是存在于血漿中的所有h1009/l395-f1942m都是人il-8-結(jié)合的形式，并且實際上，施用后大約七小時，它們中的大多數(shù)已經(jīng)以游離形式存在。因為在這種條件下評價攝取速率，所以即使與h1009/l395-f1942m的攝取速率相比，h1009/l395-f1942m和人il-8的復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取速率實際增加五-倍，十-倍，或30-倍，也僅部分反映該實驗系統(tǒng)的結(jié)果；因此，效果可以可能表示為大約2.2-倍的增加。因此，從這些獲得的結(jié)果，盡管與體內(nèi)h1009/l395的實際細(xì)胞內(nèi)攝取速率比較，顯示h1009/l395和il-8的復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取速率增加，但是該效果不限于獲得的2.2-倍增加的值。不特別限制，可以從目前獲得的研究結(jié)果進行以下解釋。當(dāng)h1009/l395(其是ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體)與人il-8形成復(fù)合物時，該復(fù)合物具有更高的等電點并且比抗體單獨存在時更多向正電荷轉(zhuǎn)換。同時，與抗體單獨的親和力相比，復(fù)合物對胞外基質(zhì)的親和力增加。性質(zhì)如等電點的升高和胞外基質(zhì)結(jié)合的增強可以被認(rèn)為是促進體內(nèi)抗體攝入細(xì)胞的因素。此外，根據(jù)小鼠實驗，顯示與h1009/l395的攝取速率相比，h1009/l395和人il-8的復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取速率增加2.2-倍或更高。由此，理論解釋以及體外性質(zhì)和體內(nèi)現(xiàn)象一致地支持以下假說：h1009/l395和人il-8形成復(fù)合物，促進復(fù)合物攝入細(xì)胞，并且導(dǎo)致人il-8的去除的顯著增加。迄今已經(jīng)報道了多種針對il-8的抗體，但迄今沒有關(guān)于與il-8形成復(fù)合物時對胞外基質(zhì)的結(jié)合親和力增加和復(fù)合物攝入細(xì)胞的增加的報道。此外，基于當(dāng)抗體與il-8形成復(fù)合物時觀察到抗-il-8抗體的細(xì)胞內(nèi)攝取的增加的研究結(jié)果，技術(shù)人員可以考慮，在血漿中與il-8形成復(fù)合物的抗-il-8抗體快速攝入細(xì)胞，同時未與il-8形成復(fù)合物的游離抗體傾向于保留在血漿中而不被攝入細(xì)胞。在該情況下，當(dāng)抗-il-8抗體是ph-依賴性的時，攝入細(xì)胞的抗-il-8抗體在細(xì)胞中釋放il-8分子并且隨后返回細(xì)胞外部，并且隨后其能夠結(jié)合另一il-8分子；并且因此，復(fù)合物形成時細(xì)胞內(nèi)攝取的增加可以具有更強烈去除il-8的進一步效果。即，選擇對胞外基質(zhì)具有增加的結(jié)合的抗-il-8抗體或具有增加的細(xì)胞內(nèi)攝入的抗-il-8抗體也可以是公開內(nèi)容c的另一個實施方案。實施例17使用計算機系統(tǒng)免疫原性預(yù)測ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體h1009/l395接著，通過與實施例13-1相似的方法對于h1009/l395預(yù)測免疫原性得分和ada產(chǎn)生頻率。結(jié)果顯示在表25和圖32中。在圖32中，h1009/l395稱為"h1009l395"。[表25]表25中的結(jié)果表明，h1009/l395具有與h1004/l395相同的低免疫原性得分水平。此外，根據(jù)圖32中的結(jié)果，對于h1009/l395的預(yù)測的ada產(chǎn)生頻率為0％，并且這也與h1004/l395的相似。因此，與已知抗-人il-8抗體hws-4相比，對于h1009/l395預(yù)測的免疫原性大大減少。因此，認(rèn)為h1009/l395在人中具有非常低的免疫原性，并且能夠長期穩(wěn)定保持抗-il-8-中和活性。實施例18在酸性ph條件下使用具有增強的fcrn-結(jié)合能力的h89/l118變體的食蟹猴pk測定如上述實施例中所述，在抗體具有天然igg1作為其恒定區(qū)的情況中，ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體h1009/l395是具有較好性質(zhì)的抗體。然而，所述抗體還可以用作在恒定區(qū)中含有氨基酸置換的抗體，例如，含有在酸性ph具有增強的fcrn結(jié)合的fc區(qū)的那些，如實施例5中舉例說明的。因此，h89/l118用于確認(rèn)在酸性ph具有增強的fcrn結(jié)合的fc區(qū)也可以在ph-依賴性il-8-結(jié)合抗體中行使功能。(18-1)在酸性ph具有增強的fcrn結(jié)合的h89/l118fc區(qū)-修飾的抗體的生產(chǎn)將實施例5-1中所述用于增強fcrn結(jié)合的各種修飾引入h89/l118的fc區(qū)。具體而言，以下變體通過將用于f1847m，f1848m，f1886m，f1889m，f1927m，和f1168m的修飾引入h89-igg1的fc區(qū)產(chǎn)生：(a)h89/l118-igg1，其包含h89-igg1m(seqidno：94)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈；(b)h89/l118-f1168m，其包含h89-f1168m(seqidno：95)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈；(c)h89/l118-f1847m，其包含h89-f1847m(seqidno：96)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈；(d)h89/l118-f1848m，其包含h89-f1848m(seqidno：97)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈；(e)h89/l118-f1886m，其包含h89-f1886m(seqidno：98)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈；(f)h89/l118-f1889m，其包含h89-f1889m(seqidno：99)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈；和(g)h89/l118-f1927m，其包含h89-f1927m(seqidno：100)作為重鏈和l118-k0mt作為輕鏈。使用這些抗體通過下述方法進行食蟹猴pk測定。(18-2)含有新fc區(qū)變體的抗體的食蟹猴pk測定將抗-人il-8抗體施用于食蟹猴后，評價抗-人il-8抗體的生物動力學(xué)。將抗-人il-8抗體溶液以2mg/kg靜脈內(nèi)施用。施用后五分鐘，四小時，一天，兩天，三天，七天，十天，14天，21天，28天，35天，42天，49天，和56天收集血液。將收集的血液立即在4℃和15,000rpm離心十分鐘，獲得血漿。將分離的血漿在設(shè)為-60℃或以下的冰箱中儲存，直到進行測量。食蟹猴血漿中的抗-人il-8抗體濃度通過電化學(xué)發(fā)光方法測量。首先，將抗-hκ捕獲ab(抗體溶液)分散在multi-array96-孔板(mesoscalediscovery)中，并且在室溫攪拌一小時。然后，含有5％bsa(w/v)的pbs-吐溫溶液用于在室溫封閉兩小時，制備固定有抗-人抗體的平板。制備含有在血漿中濃度為40.0，13.3，4.44，1.48，0.494，0.165，和0.0549μg/ml的抗-人il-8抗體的用于校準(zhǔn)曲線的樣品和稀釋500-倍或更高的用于食蟹猴血漿測量的樣品，將50μl的溶液分散在固定抗-人抗體的板的每個孔中，并將溶液在室溫攪拌一小時。然后，向前述板中加入抗-hκ報告ab，生物素綴合物(抗體溶液)，并且使其在室溫反應(yīng)一小時。在進一步加入sulfo-tag標(biāo)記的鏈霉親和素(mesoscalediscovery)并使其在室溫反應(yīng)一小時后，將讀取緩沖液t(x1)(mesoscalediscovery)分散在板中，并且立即使用ector成像儀2400(mesoscalediscovery)進行測量。使用分析軟件，softmaxpro(moleculardevices)，基于校準(zhǔn)曲線的響應(yīng)計算抗-人il-8抗體濃度。對于每種抗體的半衰期(t1/2)和清除率(cl)獲得的結(jié)果顯示在表26中，并且食蟹猴血漿中抗體濃度的改變顯示在圖33中。[表26]上述結(jié)果確認(rèn)，與具有天然igg1fc區(qū)的抗體相比，所有fc區(qū)變體顯示延長的血漿中保留。尤其是，h89/l118-f1886m顯示最理想的血液動力學(xué)。實施例19具有降低的對fcγr的結(jié)合能力的fc區(qū)已知天然人igg1的fc區(qū)結(jié)合免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞的一種或多種fcγ受體(下文，稱為fcγr(s))，并且呈現(xiàn)效應(yīng)子功能如對靶細(xì)胞的adcc和adcp。另一方面，il-8是可溶性細(xì)胞因子，并且主要預(yù)期用作藥物的抗-il-8抗體通過在il-8過量存在的位點處中和il-8的功能而顯示藥學(xué)作用。所述il-8過量存在的位點不特別限制，并且例如，可以是發(fā)炎的位點。通常已知在此種發(fā)炎的位點，各種免疫細(xì)胞聚集并被激活。經(jīng)由fc受體向這些細(xì)胞傳遞不想要的激活信號和在不想要的細(xì)胞中誘導(dǎo)活性如adcc和adcp通常是不希望的。因此，不特別限制，從安全的角度，可以優(yōu)選體內(nèi)施用的抗-il-8抗體對fcγr具有低親和力。(19-1)具有降低的對fcγr的結(jié)合的修飾的抗體的生產(chǎn)將氨基酸修飾進一步引入h1009/l395-f1886m的fc區(qū)，目的是降低對各種人和食蟹猴fcγr的結(jié)合能力。具體而言，h1009-f1886s(seqidno：81)通過將h1009-f1886m重鏈進行以下置換中的每一種產(chǎn)生：位置235處r替換為l，位置236處r替換為g，和位置239處k替換為s(根據(jù)eu編號)。類似地，h1009-f1974m(seqidno：80)通過將h1009-f1886m在位置235處將r置換為l和在位置236處將r置換為g(根據(jù)eu編號)，和將根據(jù)eu編號位置327至位置331的區(qū)域用天然人igg4序列的該區(qū)域置換來產(chǎn)生。產(chǎn)生h1009/l395-f1886s和h1009/l395-f1974m，作為具有這些重鏈以及l(fā)395-k0mt作為輕鏈的抗體。(19-2)對各種人fcγr的親和力的確認(rèn)接著，h1009/l395-f1886s或h1009/l395-f1974m對人或食蟹猴中可溶形式的fcγria或fcγriiia的親和力通過以下方法確認(rèn)。對h1009/l395-f1886s或h1009/l395-f1974m對人或食蟹猴中可溶性形式的fcγria或fcγriiia的結(jié)合，使用biacoret200(gehealthcare)進行測定。人和食蟹猴中可溶性fcγria和fcγriiia由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法以his-標(biāo)簽標(biāo)記的分子的形式產(chǎn)生。通過胺偶聯(lián)方法將適量的rproteinl(biovision)固定在傳感芯片cm4(gehealthcare)上并且捕獲目標(biāo)抗體。接著，將可溶性fcγria或fcγriiia與運行緩沖液(用作參照溶液)注射，并且使得與捕獲在傳感芯片上的抗體相互作用。hbs-ep+(gehealthcare)用作運行緩沖液，并且hbs-ep+還用于稀釋可溶性fcγria或fcγriiia。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5的甘氨酸-hcl。所有測量在20℃進行。結(jié)果顯示在圖34中。本文中，用于人fcγria，人fcγriiia，食蟹猴fcγria，和食蟹猴fcγriiia的標(biāo)識以相同順序分別是：hfcγria，hfcγriiia，cynofcγria，和cynofcγriiia。顯示h1009/l395-f1886m結(jié)合所有fcγrs，而另一方面，確認(rèn)h1009/l395-f1886s和h1009/l395-f1974m不結(jié)合fcγrs中的任一種。(19-3)fc變體的小鼠il-8去除測定接著，對于h1009/l395-f1886s和h1009/l395-f1974m，通過以下實驗確認(rèn)人il-8去除速率和抗體在小鼠血漿中的保留。本文中，三個劑量的h1009/l395-f1886s，2mg/kg，5mg/kg，和10mg/kg，用于評價，從而也可以對于h1009/l395-f1886s評價增加抗體劑量的效果。向人fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrntg品系32+/+小鼠；jacksonlaboratories；methodsmol.biol.602：93-104(2010))同時施用人il-8和抗-人il-8抗體后，評價人il-8的生物動力學(xué)。將人il-8(10μg/ml)和抗-人il-8抗體(200μg/ml，500μg/ml，或1000μg/ml)的混合溶液以10ml/kg通過尾靜脈施用一次。在該情況下，因為抗-人il-8抗體以充分超過人il-8的量存在，所以幾乎所有人il-8被認(rèn)為結(jié)合抗體。施用后五分鐘，兩小時，四小時，七小時，一天，兩天，三天，七天，14天，21天，和28天收集血液。將收集的血液立即在4℃和15,000rpm離心15分鐘，獲得血漿。將分離的血漿在設(shè)為-20℃或以下的冰箱中儲存，直到進行測量。通過與實施例11相似的方法測量小鼠血漿中的人il-8濃度。得到的關(guān)于血漿中人il-8濃度的數(shù)據(jù)在圖35中顯示，并且人il-8從小鼠血漿的清除率(cl)的值顯示在表27中。首先，顯示包含天然igg1的fc區(qū)的h1009/l395和包含修飾的fc區(qū)的h1009/l395-f1886s當(dāng)與2mg/kg-施用組比較時具有相當(dāng)?shù)娜薸l-8-去除效果。接著，當(dāng)改變h1009/l395-f1886s抗體的劑量時，在2mg/kg和10mg/kg劑量之間未觀察到人il-8清除率值的顯著差異，而在施用后一天存在血漿il-8濃度的微小差異。這強烈提示，甚至當(dāng)以高劑量施用抗體時，包含h1009/l395的可變區(qū)的抗體也顯示充足的il-8-去除效果。[表27]抗體名稱劑量人il-8cl(ml/d/kg)h1009/l3952mg/kg740h1009/l395-f1886s2mg/kg628h1009/l395-f1886s5mg/kg458h1009/l395-f1886s10mg/kg560(19-4)fc變體的食蟹猴pk測定接著，抗體在食蟹猴中的血漿保留通過以下方法，使用h1009/l395-f1886s或h1009/l395-f1974m驗證。在向食蟹猴單獨施用抗-人il-8抗體的情況下或在向食蟹猴同時施用人il-8和抗-人il-8抗體的情況下，評價抗-人il-8抗體的生物動力學(xué)。將抗-人il-8抗體溶液(2mg/ml)，或人il-8(100μg/kg)和抗-人il-8抗體(2mg/kg)的混合溶液，以1ml/kg靜脈內(nèi)施用一次。施用后五分鐘，四小時，一天，兩天，三天，七天，十天，14天，21天，28天，35天，42天，49天，和56天收集血液。將收集的血液立即在4℃和15,000rpm離心分鐘，獲得血漿。將分離的血漿在設(shè)在-60℃或以下的冰箱中儲存，直到進行測量。通過實施例18的方法測量食蟹猴血漿中的抗-人il-8抗體濃度。得到的血漿中抗-人il-8抗體濃度的數(shù)據(jù)顯示在圖36中，并且抗-人il-8抗體從食蟹猴血漿中的半衰期(t1/2)和清除率(cl)的值顯示在表28中。首先，與具有天然人igg1的fc區(qū)的hr9和h89/l118相比，具有有改善的功能的fc區(qū)的h1009/l395-f1886s顯示具有顯著延長的血漿保留。此外，當(dāng)h1009/l395-f1886s與人il-8同時施用時，血漿濃度的改變與抗體單獨施用時相當(dāng)。不特別限制，根據(jù)該研究結(jié)果，以下討論是可能的。如上文所述的，顯示與單獨h1009/l395的攝取相比，h1009/l395和人il-8的復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取增加。通常，認(rèn)為高分子量蛋白非特異性或以受體-依賴性的方式結(jié)合入細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到溶酶體，并且由溶酶體中存在的各種降解酶降解。因此，如果蛋白攝入細(xì)胞的速率增加，則該蛋白的血漿保留也可能變差。然而，在抗體的情形中，其具有在內(nèi)體中通過fcrn返回血漿的性質(zhì)；并且因此，只要通過fcrn功能充分營救，血漿保留可以不受影響，即使細(xì)胞內(nèi)攝取速率加速。本文中，甚至當(dāng)將h1009/l395-f1886s與人il-8同時施用給食蟹猴時，血漿保留不受影響。這表明以下可能性：在對于h1009/l395-f1886s抗體攝入細(xì)胞的速率增加的同時，抗體被充分地由fcrn營救從而其可以返回血漿。此外，另一種fc變體h1009/l395-f1974m也顯示與h1009/l395-f1886s相當(dāng)?shù)难獫{保留。在這些fc變體引入有如上文所述具有降低對各種fcγr的結(jié)合能力的不同修飾的同時，顯示其不影響抗體本身的血漿保留。由此，顯示與具有天然igg1fc區(qū)的抗體相比，h1009/l395-f1886s和h1009/l395-f1974m在食蟹猴中的血漿保留顯著延長并且非常令人滿意。[表28]t1/2cl日ml/d/kghr920.263.72h89/l11811.882.95h1009/l395-f1886s35.751.64h1009/l395-f1886s+hil-872.241.11h1009/l395-f1974m+hil-843.781.60如上述實施例表明的，通過包含ph-依賴性il-8結(jié)合能力(具有作為與il-8的復(fù)合物快速攝入細(xì)胞的特點)，作為顯著增加人il-8的體內(nèi)去除速率的抗體，首次獲得h1009/l395。此外，與已知的hws-4抗體相比，該抗體在中性ph條件下的il-8-結(jié)合親和力也增加，并且該抗體在中性ph條件如在血漿中可以更強烈地中和人il-8。此外，其是在血漿條件下具有出色的穩(wěn)定性并且其il-8中和活性在體內(nèi)施用后不降低的抗體。此外，h1009/l395(其基于與hws-4相比具有極大改善的生產(chǎn)水平的hr9構(gòu)建)是從生產(chǎn)水平的角度適于制造的抗體。此外，在計算機免疫原性預(yù)測中，該抗體對于其免疫原性顯示非常低的得分，并且該得分顯著低于已知的hws-4抗體和一些其他已知可商購抗體的得分。即，預(yù)期h1009/l395幾乎不會在人中產(chǎn)生ada，并且將能夠安全長期使用。因此，與已知的抗-人il-8抗體相比，h1009/l395顯示各方面的改善，并且作為藥物非常有用。如上文所述的具有天然iggfc區(qū)的h1009/l395足夠有用；然而，包含功能-改善的fc區(qū)的h1009/l395的變體也可以適當(dāng)用作具有增強的實用性的抗體。具體而言，可能在酸性ph條件下增加fcrn結(jié)合以延長血漿保留和長期保持效果。此外，包含引入有降低對fcγr(s)的結(jié)合能力的一種或多種修飾的fc區(qū)的變體可以用作高安全性治療性抗體，以避免在施用的生物中不希望有的免疫細(xì)胞激活和細(xì)胞毒性活性的產(chǎn)生。作為此種fc變體，本文中開發(fā)的f1886s或f1974m的使用是特別有利的，但其不限于這些fc變體；并且只要fc變體具有類似的功能，則包含其他修飾的fc區(qū)的治療性抗體用作公開內(nèi)容c的實施方案。由此，本發(fā)明人通過深入研究產(chǎn)生的公開內(nèi)容c的抗體(包括h1009/l395-f1886s和h1009/l395-f1974m)可以保持人il-8的生物活性被安全和長期抑制的情形。本文中，已經(jīng)實現(xiàn)了由已知的抗-il-8抗體不能實現(xiàn)的水平，并且預(yù)期公開內(nèi)容c的這些抗體用作高質(zhì)量精制的抗-il-8抗體藥物。實施例20抗-因子ixa/因子x雙特異性抗體wo2012/067176中公開的人源化抗-因子ixa/因子x雙特異性抗體結(jié)合人因子ixa和因子x并且誘導(dǎo)血液的共聚集活性。wo2012/067176中描述的人源化抗-因子ixa/因子x雙特異性抗體f8m(q499-z121/j327-z119/l404-k：h鏈(seqidno：330)/h鏈(seqidno：331)/共有l(wèi)鏈(seqidno：332))用在本實施例中并且f8m包含兩個不同h鏈和兩個相同共有l(wèi)鏈。通過wo2012/067176的實施例中所述的方法產(chǎn)生f8m。(20-1)抗-因子ixa/因子x雙特異性抗體的生產(chǎn)通過參照實施例2的方法產(chǎn)生以下三種抗體，作為基于f8m的抗-因子ixa/因子x雙特異性抗體：(a)f8m-f1847mv，其是包含f8m-f1847mv1(seqidno：323)和f8m-f1847mv2(seqidno：324)作為重鏈以及f8ml(seqidno：325)作為輕鏈的常規(guī)抗體；(b)f8m-f1868mv，其是包含f8m-f1868mv1(seqidno：326)和f8m-f1868mv2(seqidno：327)作為重鏈以及f8ml(seqidno：325)作為輕鏈的常規(guī)抗體；和(c)f8m-f1927mv，其是包含f8m-f1927mv1(seqidno：328)和f8m-f1927mv2(seqidno：329)作為重鏈以及f8ml(seqidno：325)作為輕鏈的常規(guī)抗體。重鏈序列包括如下實施例5提到的關(guān)于增強fcrn結(jié)合和降低類風(fēng)濕因子結(jié)合相同的fc變體序列：[表29]序列名稱實施例5中的名稱f8m-f1847mv1(seqidno：323)f1847mf8m-f1847mv2(seqidno：324)f1847mf8m-f1868mv1(seqidno：326)f1868mf8m-f1868mv2(seqidno：327)f1868mf8m-f1927mv1(seqidno：328)f1927mf8m-f1927mv2(seqidno：329)f1927m(20-2)單克隆抗體，f8m-f1847mv，f8m-f1868mv，和f8m-f1927mv在食蟹猴中的藥代動力學(xué)研究在以0.6mg/kg的劑量向雄性食蟹猴單次靜脈內(nèi)推注施用后，分別評價單克隆抗體，f8m-f1847mv，f8m-f1868mv，和f8m-f1927mv的藥代動力學(xué)。通過夾心elisa確定f8m-f1847mv，f8m-f1868mv，和f8m-f1927mv的血漿濃度。使用winnonlinver6.4軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。如表30中所示，f8m-f1847mv，f8m-f1868mv，和f8m-f1927mv的半衰期是分別29.3天，54.5天和35.0天。使用食蟹猴的f8mpk研究在不同天以6mg/kg的劑量進行，并且揭示半衰期是19.4天。明確的是，f8m-f1847mv，f8m-f1868mv，和f8m-f1927mv的半衰期比f8m長。這提示，抗-因子ixa/x雙特異性抗體的半衰期能夠通過上述實施例5中提及的關(guān)于fc區(qū)序列的相同修飾來延長。[表30]向雄性食蟹猴靜脈內(nèi)施用后，f8m-f1847mv，f8m-f1868mv，和f8m-f1927mv以及f8m的半衰期f8m-f1847mvf8m-f1868mvf8m-f1927mvf8m半衰期(天)29.354.535.019.4實施例21使用pi-提高的fab變體從血漿清除ige的評價為了增強人ige的清除，在該實施例中使用ph-依賴性抗原結(jié)合抗體評價抗體的fab中提高pi的置換。向抗體可變區(qū)添加氨基酸置換以提高pi的方法不特別限制，但例如，其可以通過wo2007/114319或wo2009/041643中所述的方法進行。引入可變區(qū)的氨基酸置換優(yōu)選是減少帶負(fù)電的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)的數(shù)量同時增加帶正電的氨基酸(如精氨酸和賴氨酸)的那些。此外，氨基酸置換可以引入在抗體可變區(qū)中的任意位置。沒有特別限制，引入氨基酸置換的位點優(yōu)選在氨基酸側(cè)鏈可以暴露在抗體分子表面的位置。(21-1)通過修飾可變區(qū)中的氨基酸具有提高的pi的抗體的生產(chǎn)測試的抗體在表32和表33中總結(jié)。通過在ab1h(seqidno：38)中引入提高pi的置換h32r來制備重鏈，ab1h003(也稱為h003，seqidno：144)。其他重鏈變體也根據(jù)參照實施例1中所示的方法通過在ab1h中引入表32中所示的各個置換來制備。所有重鏈變體與作為輕鏈的ab1l(seqidno：39)一起表達。該抗體的ph-依賴性結(jié)合性質(zhì)總結(jié)在表5(ab1)中。類似地，我們還評價了輕鏈中提高pi的置換。通過將提高pi的置換g16k引入ab1l來制備輕鏈，ab1l001t(也稱為l001，seqidno：164)。其他輕鏈變體也根據(jù)參照實施例1中所示的方法通過將表33中所示的各個置換引入ab1l來制備。所有輕鏈變體與作為重鏈的ab1h一起表達。[表32]該實施例中評價的ab1h的重鏈變體[表33]該實施例中評價的ab1l的輕鏈變體(21-2)使用pi-提高的變體通過biacore的人fcγriib-結(jié)合測定關(guān)于產(chǎn)生的含有fc區(qū)變體的抗體，使用biacoret200(gehealthcare)進行可溶性人fcγriib和抗原-抗體復(fù)合物之間的結(jié)合測定。通過本領(lǐng)域中已知的方法以his-標(biāo)簽標(biāo)記的分子的形式產(chǎn)生可溶性人fcγriib(ncbi登記號nm_004001.3)。通過胺偶聯(lián)方法使用his捕獲試劑盒(gehealthcare)將適量的抗-his抗體固定在傳感芯片cm5(gehealthcare)以捕獲人fcγriib。接著，注射抗體-抗原復(fù)合物和運行緩沖液(作為參照溶液)，并且使得與捕獲在傳感芯片上的人fcγriib發(fā)生相互作用。20mmn-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸，150mmnacl，1.2mmcacl2，和0.05％(w/v)吐溫20(ph7.4)用作運行緩沖液，并且各個緩沖液也用于稀釋可溶性人fcγriib。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5甘氨酸-hcl。所有測量在25℃進行。基于通過測量獲得的傳感圖計算的結(jié)合(ru)進行分析，并且顯示當(dāng)ab1h/ab1l(最初ab1)的結(jié)合量定義為1.00時的相對值。為了計算參數(shù)，使用biacoret100評價軟件(gehealthcare)。spr分析結(jié)果總結(jié)在表32和33中。顯示一些變體具有增強的對固定在biacore傳感芯片上的人fcγriib的結(jié)合。通過將一個或多個提高pi的修飾引入可變區(qū)產(chǎn)生的抗體是與引入修飾前的那些相比可變區(qū)的電荷帶更多正電的抗體。因此，可以認(rèn)為可變區(qū)(正電荷)和傳感芯片表面(負(fù)電荷)之間的庫侖相互作用通過提高pi的氨基酸修飾而加強。此外，預(yù)期該效果在相同的帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面類似地發(fā)生；因此，還預(yù)期它們顯示加速體內(nèi)攝入細(xì)胞的速度的效果。本文中，認(rèn)為與最初ab1對hfcγriib的結(jié)合相比，變體約1.2倍或更多的對hfcγriib的結(jié)合是關(guān)于抗體對傳感芯片上的hfcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。在pi-提高的重鏈變體中，單獨或組合具有q13k，g15r，s64k，t77r，d82an，d82ag，d82as，s82br，e85g或q105r置換(根據(jù)kabat編號)的抗體，顯示更高的對hfcγriib的結(jié)合。推測重鏈中單個氨基酸置換或這些置換的組合關(guān)于對傳感芯片上hfcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。因此，通過將提高pi的修飾引入抗體的重鏈可變區(qū)而預(yù)期顯示加速體內(nèi)攝入細(xì)胞的速度或速率的效果的一個或多個位置可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置13，15，64，77，82a，82b，85和105。引入所述位置的氨基酸置換可以是天冬酰胺，甘氨酸，絲氨酸，精氨酸或賴氨酸，并且優(yōu)選精氨酸或賴氨酸。在pi-提高的輕鏈變體中，單獨或組合具有g(shù)16k，q24r，a25r，s26r，e27r，q37r，g41r，q42k，s52k，s52r，s56k，s56r，s65r，t69r，t74k，s76r，s77r，q79k置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更高的對人fcγriib的結(jié)合。推測輕鏈中這些置換中的單個氨基酸置換或組合對傳感芯片上人fcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。因此，通過將提高pi的修飾引入抗體的輕鏈可變區(qū)而預(yù)期顯示加速體內(nèi)攝入細(xì)胞的速度或速率的效果的一個或多個位置可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置16，24，25，26，27，37，41，42，52，56，65，69，74，76，77，和79。引入所述位置的氨基酸置換可以是精氨酸或賴氨酸。(21-3)含有pi-提高的fab區(qū)變體的抗體的細(xì)胞攝取為了使用產(chǎn)生的含有fab區(qū)變體的抗體評價細(xì)胞內(nèi)攝入表達hfcγriib的細(xì)胞系的速率，進行與上述(4-5)類似的測定，條件是攝入的抗原量以取為1.00的ab1h/ab1l(最初ab1)值的相對值提供。細(xì)胞攝取的定量結(jié)果總結(jié)在表32和33中。在多種fc變體中觀察到源自細(xì)胞中的抗原的強的熒光。本文中，與最初ab1的熒光強度相比，攝入變體的細(xì)胞的抗原的約1.5倍或更多的熒光強度被認(rèn)為對攝入細(xì)胞中的抗原有強的電荷效應(yīng)。在pi-提高的重鏈變體中，單獨或組合具有p41r，g44r，t77r，d82an，d82ag，d82as，s82br或e85g置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更強的細(xì)胞內(nèi)抗原攝取。推測重鏈中這些置換的單個氨基酸置換或組合對細(xì)胞內(nèi)抗原抗體復(fù)合物攝入具有強的電荷效應(yīng)。因此，通過將提高pi的修飾引入抗體的重鏈可變區(qū)而預(yù)期引起抗原-抗體復(fù)合物更快速或更高頻率地攝入細(xì)胞的一個或多個位置可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置41，44，77，82a，82b或85。引入所述位置的氨基酸置換可以是天冬酰胺，甘氨酸，絲氨酸，精氨酸或賴氨酸，并且優(yōu)選精氨酸或賴氨酸。在pi-提高的輕鏈變體中，單獨或組合具有g(shù)16k，q24r，a25r，a25k，s26r，s26k，e27r，e27q，e27k，q37r，g41r，q42k，s52k，s52r，s56r，s65r，t69r，t74k，s76r，s77r或q79k置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更強的細(xì)胞內(nèi)抗原攝取。推測輕鏈中這些置換的單個氨基酸置換或組合對細(xì)胞內(nèi)抗原抗體復(fù)合物攝入具有強的電荷效應(yīng)。具有四個或更多個氨基酸置換的變體傾向于比具有更少氨基酸置換的那些變體顯示更強的電荷效應(yīng)。通過將提高pi的修飾引入抗體的輕鏈可變區(qū)而預(yù)期引起抗原-抗體復(fù)合物更快速或更高頻率地攝入細(xì)胞的一個或多個位置可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置16，24，25，26，27，37，41，42，52，56，65，69，74，76，77或79。引入所述位置的氨基酸置換可以是谷氨酰胺，精氨酸或賴氨酸，并且優(yōu)選精氨酸或賴氨酸。不限于特定理論，該結(jié)果可以解釋如下：加入細(xì)胞培養(yǎng)溶液的抗原和抗體在培養(yǎng)溶液中形成抗原-抗體復(fù)合物?？乖?抗體復(fù)合物經(jīng)由抗體fc區(qū)結(jié)合表達在細(xì)胞膜上的人fcγriib，并且以受體-依賴性的方式攝入細(xì)胞中。用于該實驗的抗體以ph-依賴性的方式結(jié)合抗原；因此，抗體可以在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體(酸性ph條件)中與抗原解離。因為解離的抗原被轉(zhuǎn)運到溶酶體并積累，其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)熒光。因此，認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)強的熒光強度表示抗原-抗體復(fù)合物攝入細(xì)胞更快或更高頻率地發(fā)生。(21-4)在小鼠共注射模型中評價人ige的清除在小鼠共注射模型中測試一些具有ph-依賴性抗原結(jié)合的抗-ige抗體(最初ab1，ab1h/ab1l013，ab1h/ab1l014，ab1h/ab1l007)以評價它們加速從血漿清除ige的能力。在共注射模型中，c57bl6j小鼠(jacksonlaboratories)通過用與抗-ige抗體預(yù)混和的ige單次靜脈內(nèi)注射分別施用。所有組接受0.2mg/kgige連同1.0mg/kg的抗-ige抗體。通過抗-igeelisa確定總ige血漿濃度。首先，將抗-人ige(克隆107，mabtech)分散在微孔板(nalgenuncinternational)中，并且在室溫靜置兩小時或在4℃過夜，以制備固定有抗-人ige抗體的平板。將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和樣品與過量的抗-ige抗體(內(nèi)部制備)混合，形成免疫復(fù)合物的均勻結(jié)構(gòu)。將這些樣品加入固定有抗-人ige抗體的平板中，并且在4℃放置過夜。然后，將這些樣品與人gpc3核蛋白(內(nèi)部制備)，生物素化抗-gpc3抗體(內(nèi)部制備)，鏈霉親和素polyhrp80綴合物(stereospecificdetectiontechnologies)按順序反應(yīng)一小時。之后，加入supersignal(注冊商標(biāo))elisapico化學(xué)發(fā)光底物(thermofisherscientific)。用spectramaxm2(moleculardevices)讀取化學(xué)發(fā)光。使用softmaxpro(moleculardevices)計算人ige的濃度。圖37描述ige在c57bl6j小鼠中的血漿濃度時間曲線。在施用具有ph-依賴性抗原結(jié)合的pi-提高的fab變體后，血漿總ige濃度低于最初ab1的那個。這些結(jié)果表明，具有ph-依賴性抗原結(jié)合的高pi變體的抗原-抗體免疫復(fù)合物能夠更強地結(jié)合胞質(zhì)膜受體如fcγrs，其增加抗原-抗體免疫復(fù)合物的細(xì)胞攝取。攝入細(xì)胞的抗原能夠有效從內(nèi)體內(nèi)的抗體釋放，造成ige去除加速。用ab1h/ab1l007(其在體外研究中顯示弱的功效)處理的小鼠的ige濃度比其他含有pi-提高的fab變體的抗體更高。這些結(jié)果還提示，為了推測體內(nèi)抗原從血漿清除的評價，使用通過上述incellanalyzer6000的熒光強度的體外系統(tǒng)的靈敏度可以比上述體外biacore系統(tǒng)更高。實施例22使用pi-提高的fab變體從血漿清除c5的評價為了增強人ige的清除，在該實施例中使用ph-依賴性抗原結(jié)合抗體評價抗體的fab部分中提高pi的置換。(22-1)c5的制備[重組人c5的表達和純化]使用freestyle293-f細(xì)胞系(thermofisher，carlsbad，ca，usa)瞬時表達重組人c5(ncbigenbank登記號：np_001726.2，seqidno：207)。將表達人c5的條件培養(yǎng)基用等體積的milliq水稀釋，然后施加于q-瓊脂糖凝膠ff或q-瓊脂糖凝膠hp陰離子交換柱(gehealthcare，uppsala，sweden)上，接著用nacl梯度洗脫。匯集含有人c5的級分，然后將鹽濃度和ph分別調(diào)節(jié)至80mmnacl和ph6.4。將得到的樣品施加于sp-瓊脂糖凝膠hp陽離子交換柱(gehealthcare，uppsala，sweden)并且用nacl梯度洗脫。匯集含有人c5的級分并且進行cht陶瓷羥基磷灰石柱(bio-radlaboratories，hercules，ca，usa)。然后將人c5洗脫物施加于superdex200凝膠過濾柱(gehealthcare，uppsala，sweden)。匯集含有人c5的級分并儲存在-150℃。將內(nèi)部制備的重組人c5或血漿來源的人c5(calbiochem，cat#204888)用于研究。重組食蟹猴c5(ncbigenbank登記號：xp_005580972，seqidno：208)的表達和純化以與人對等物完全相同的方式進行。(22-2)合成的鈣文庫的制備用作合成的人重鏈文庫的抗體重鏈可變區(qū)的基因文庫由10個重鏈文庫組成。基于人b-細(xì)胞組庫(repertoires)中的種系頻率和v-基因家族的生物物理性質(zhì)，為該文庫選擇種系框架區(qū)vh1-2，vh1-69，vh3-23，vh3-66，vh3-72，vh4-59，vh4-61，vh4-b，vh5-51，和vh6-1。模擬人b細(xì)胞抗體組庫，合成的人重鏈文庫在抗體-結(jié)合位點多樣化?？贵w輕鏈可變區(qū)的基因文庫設(shè)計為具有鈣結(jié)合基序并且參考人b細(xì)胞抗體組庫，在會促進抗原識別的位置多樣化。對抗原的鈣-依賴性結(jié)合產(chǎn)生特性的抗體輕鏈可變區(qū)的基因文庫的設(shè)計在wo2012/073992中描述。將重鏈可變區(qū)文庫和輕鏈可變區(qū)文庫的組合插入噬菌粒載體，并且參考(deheard等人，meth.mol.biol.178：87-100(2002))構(gòu)建噬菌體文庫。在fab和piii蛋白之間的接頭區(qū)將胰蛋白酶-切割位點引入噬菌粒載體。在基因iii的n2和ct結(jié)構(gòu)域之間具有胰蛋白酶切割位點的改進的m13ko7輔助噬菌體用于fab展示的噬菌體制備。(22-3)鈣依賴性抗-c5抗體的分離將噬菌體展示文庫用補充有終濃度分別為4％和1.2mm的bsa和cacl2的tbs稀釋。作為淘選方法，參考一般方案(junutula等人，j.immunol.methods332(1-2)：41-52(2008)，d'mello等人，j.immunol.methods247(1-2)：191-203(2001)，yeung等人，biotechnol.prog.18(2)：212-220(2002)，jensen等人，mol.cellproteomics2(2)：61-69(2003)，應(yīng)用常規(guī)磁珠選擇。作為磁珠，應(yīng)用neutravidin包被的珠子(sera-magspeedbeadsneutravidin-包被)或鏈霉親和素包被的珠子(dynabeadsm-280鏈霉親和素)。人c5(calbiochem，cat#204888)用ez-linknhs-peg4-biotin(pierce，catno.21329)標(biāo)記。初輪的噬菌體選擇，將噬菌體展示文庫與生物素化的人c5(312.5nm)在室溫孵育60分鐘。然后使用磁珠捕獲展示結(jié)合fab變體的噬菌體。與珠子在室溫孵育15分鐘后，將珠子用1ml含有1.2mmcacl2和0.1％吐溫20的tbs洗滌三次，并且將珠子用1ml含有1.2mmcacl2的tbs洗滌兩次。通過用含有1mg/ml胰蛋白酶的tbs重懸珠子15分鐘，洗脫噬菌體。將洗脫的噬菌體用er2738感染并且通過輔助噬菌體拯救。將拯救的噬菌體用聚乙二醇沉淀，用補充有終濃度分別為4％和1.2mm的bsa和cacl2的tbs重懸，并且用于下一輪淘選。在第一輪篩選后，針對其鈣依賴性選擇噬菌體，其中在鈣離子的存在下抗體更強地結(jié)合c5。在第二和第三輪，以與第一輪相同的方式進行淘選，不同之處在于使用50nm(第二輪)或12.5nm(第三輪)的生物素化的抗原并且最終用0.1ml的洗脫緩沖液(50mmmes，2mmedta，150mmnacl，ph5.5)洗脫并且與1μl的100mg/ml胰蛋白酶接觸，以針對其鈣依賴性進行選擇。選擇后，將選擇的噬菌體克隆轉(zhuǎn)變?yōu)閕gg形式。在30℃使用octetred384系統(tǒng)(palllifesciences)，在兩個不同條件下評估轉(zhuǎn)變的igg抗體對人c5的結(jié)合能力：在1.2mmcacl2-ph7.4(20mmmes，150mmnacl，1.2mmcacl2)的結(jié)合和解離以及在1.2mmcacl2-ph7.4(20mmmes，150mmnacl，1.2mmcacl2)的結(jié)合和在3μmcacl2-ph5.8(20mmmes，150mmnacl，3μmcacl2)的解離。分離ph-鈣依賴性抗原結(jié)合的克隆中的25個克隆。這些抗體的傳感圖在圖38中顯示。(22-4)抗-c5雙特異性抗體的鑒定從實施例b-3中分離的克隆中，選擇九個ph或鈣依賴性抗-c5抗體克隆用于進一步分析(cfp0008，0011，0015，0016，0017，0018，0019，0020，0021)。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法將一些氨基酸置換引入cfp0016重鏈可變區(qū)以改善抗體的性質(zhì)如物理化學(xué)性質(zhì)。該cfp0016變體，cfp0016h019，替代cfp0016用于進一步分析。這九個抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列在表34中描述。在該表中，括號中描述的名稱表示縮寫的名稱。[表34]選擇的抗體的克隆名稱和氨基酸序列通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法合成和制備具有編碼抗體重鏈和輕鏈的核苷酸序列的全長基因。通過將獲得的質(zhì)粒片段插入用于在哺乳動物細(xì)胞中表達的載體來制備重鏈和輕鏈表達載體。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法將獲得的表達載體測序。為了表達抗體，將制備的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入freestyle293-f細(xì)胞系(thermofisherscientific)。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法，使用rproteina瓊脂糖凝膠fastflow(gehealthcare)，進行從表達抗體的條件培養(yǎng)基的純化。(22-5)ph依賴性抗-c5雙特異性抗體的產(chǎn)生和表征通過組合cfp0020和cfp0018產(chǎn)生雙特異性抗體(其識別c5的兩個不同表位)。以igg形式制備雙特異性抗體(其在抗體的每個結(jié)合位點中具有兩個不同fab克隆)并且使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法制備。在該雙特異性igg抗體中，兩條重鏈包含彼此不同的重鏈恒定區(qū)(g1dp1，seqidno：227和g1dn1，seqidno：228)，從而有效形成兩條重鏈的異源二聚體。包含抗-c5mab"x"和抗-c5mab"y"的結(jié)合位點的抗-c5雙特異性抗體表示為"x//y"。通過本領(lǐng)域技術(shù)普通人員通常已知的方法將一些氨基酸置換引入重鏈和輕鏈cdr，我們獲得20//18的輕鏈共有變體，其命名為'優(yōu)化的20//18'(由兩條重鏈：cfp0020h0261-g1dp1，seqidno：229和cfp0018h0012-g1dn1，seqidno：230和共有輕鏈：cfp0020l233-k0，seqidno：231組成)。在兩個不同條件(例如(a)在ph7.4結(jié)合和解離以及(b)在ph7.4結(jié)合和在ph5.8解離)，在37℃使用biacoret200儀器(gehealthcare)評估優(yōu)化的20//18對重組人c5的動力學(xué)參數(shù)。通過胺偶聯(lián)方法將蛋白a/g(pierce，目錄號#21186)或抗-人igg(fc)抗體(人抗體捕獲試劑盒內(nèi)；gehealthcare，catno.br-1008-39)固定在系列scm4(gehealthcare，catno.br-1005-34)上。將抗-c5抗體捕獲在固定化的分子上，并且隨后注射人c5。使用的運行緩沖液是acesph7.4和ph5.8(20mmaces，150mmnacl，1.2mmcacl2，0.05％吐溫20)。通過使用biacoret200評價軟件，2.0版(gehealthcare)，將傳感圖與1：1結(jié)合-ri(沒有體效應(yīng)(bulkeffect)調(diào)整)模型匹配來確定在兩個ph條件下的動力學(xué)參數(shù)。通過僅計算在每個ph條件下的解離相確定的在ph7.4下的動力學(xué)參數(shù)，結(jié)合速率(ka)，解離速率(kd)，和結(jié)合親和力(kd)，以及解離速率(kd)在表35中描述。優(yōu)化的20//18顯示與在ph7.4的解離速率相比在ph5.8的針對人c5的更快的解離。[表35]在兩個不同條件下20//18變體針對人c5的動力學(xué)參數(shù)(22-6)通過修飾可變區(qū)中的氨基酸產(chǎn)生具有提高的pi的抗體測試的抗體在表36和37中總結(jié)。通過將提高pi的置換p41r/g44r引入cfp0020h0261-g1dp1(seqidno：229)制備重鏈，cfp0020h0261-001-g1dp1(也稱為20h001，seqidno：232)。類似地，通過將提高pi的置換t77r/e85r引入cfp0018h0012-g1dn1(seqidno：230)制備重鏈，cfp0018h0012-002-g1dn1(也稱為18h002，seqidno：251)。也根據(jù)參照實施例1中所示的方法將表36中所示的各個置換分別引入cfp0020h0261-g1dp1和cfp0018h0012-g1dn1，制備其他重鏈變體。cfp0020h0261-g1dp1變體和cfp0018h0012-g1dn1變體兩者的重鏈變體與作為輕鏈的cfp0020l233-k0(seqidno：231)一起表達，獲得雙特異性抗體。類似地，我們還評價輕鏈中提高pi的置換。將提高pi的置換g16k引入cfp0020l233-k0來制備輕鏈，cfp0020l233-001-k0(也稱為20l233-001，seqidno：271)。還根據(jù)參照實施例1中所示的方法將表37中表示的各個置換引入cfp0020l233-k0，制備其他輕鏈變體。將所有輕鏈變體與作為重鏈的cfp0020h0261-g1dp1和cfp0018h0012-g1dn1一起表達，獲得雙特異性抗體。[表36]該實施例中評價的cfp0020h0261-001-g1dp1和cfp0018h0012-001-g1dn1的重鏈變體[表37]該實施例中評價的cfp0020l233的輕鏈變體(22-7)使用pi-提高的變體通過biacore測定人fcγriib-結(jié)合關(guān)于產(chǎn)生的含有fc區(qū)變體的抗體，使用biacoret200(gehealthcare)進行可溶性hfcγriib和抗原-抗體復(fù)合物之間的結(jié)合測定。通過本領(lǐng)域中已知的方法以his-標(biāo)簽標(biāo)記的分子的形式產(chǎn)生可溶性hfcγriib。使用his捕獲試劑盒(gehealthcare)，通過胺偶聯(lián)方法將適量的抗-his抗體固定在傳感芯片cm5(gehealthcare)以捕獲hfcγriib。接著，注射抗體-抗原復(fù)合物和運行緩沖液(作為參照溶液)，并且與捕獲在傳感芯片上的hfcγriib發(fā)生相互作用。將20mmn-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸，150mmnacl，1.2mmcacl2，和0.05％(w/v)吐溫20(ph7.4)用作運行緩沖液，并且各個緩沖液還用于稀釋可溶性hfcγriib。為了再生傳感芯片，使用10mmph1.5甘氨酸-hcl。所有測量在25℃進行?；谕ㄟ^測量獲得的傳感圖計算的結(jié)合(ru)進行分析，并且顯示當(dāng)cfp0020h0261-g1dp1/cfp0018h0012-g1dn1/cfp0020l233-k0(初始ab2)的結(jié)合量定義為1.00時的相對值。為了計算參數(shù)，使用biacoret100評價軟件(gehealthcare)。spr分析結(jié)果在表36和37中總結(jié)。顯示一些變體對固定在biacore傳感芯片上的hfcγriib具有增強的結(jié)合。本文中，與初始ab2對hfcγriib的結(jié)合相比，變體對hfcγriib的約1.2倍或更多倍的結(jié)合被認(rèn)為對抗體對傳感芯片上hfcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。在pi-提高的重鏈變體中，具有l(wèi)63r，f63r，l82k或s82br置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更高對hfcγriib的結(jié)合。推測重鏈中單個氨基酸置換或這些置換的組合對于傳感芯片上hfcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。因此，預(yù)期通過將提高pi的修飾引入抗體的重鏈可變區(qū)而顯示加速體內(nèi)攝入細(xì)胞的速度或速率的效果的位置的一個或多個可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置63，82或82b。引入該一個或多個位置的氨基酸置換可以是精氨酸或賴氨酸。在pi-提高的輕鏈變體中，具有g(shù)16k，q27r，g41r，s52r，s56r，s65r，t69r，t74k，s76r，s77r或q79k置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更高的對hfcγriib的結(jié)合。推測輕鏈中單個氨基酸置換或這些置換的組合對傳感芯片上人fcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。因此，預(yù)期通過將提高pi的修飾引入抗體的輕鏈可變區(qū)而顯示加速體內(nèi)攝入細(xì)胞的速度或速率的效果的位置的一個或多個可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置16，27，41，52，56，65，69，74，76，77或79。引入該一個或多個位置的氨基酸置換可以是精氨酸或賴氨酸。具有四個或更多個氨基酸置換的變體傾向于比具有較少氨基酸置換的那些變體顯示更強的電荷效應(yīng)。(22-8)含有pi-提高的fab區(qū)變體的抗體的細(xì)胞攝取為了使用產(chǎn)生的含有fab區(qū)變體的抗體評價細(xì)胞內(nèi)攝入表達hfcγriib的細(xì)胞系的速率，進行以下測定。通過已知方法產(chǎn)生組成型表達hfcγriib的mdck(madin-darby犬腎)細(xì)胞系。使用這些細(xì)胞，評價抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取。具體而言，根據(jù)已建立的方案將alexa555(lifetechnlogies)用于標(biāo)記人c5，并且在抗體濃度為10mg/ml并且抗原濃度為10mg/ml的培養(yǎng)溶液中形成抗原-抗體復(fù)合物。將含有抗原-抗體復(fù)合物的培養(yǎng)溶液加入至上述組成型表達hfcγriib的mdck細(xì)胞的培養(yǎng)板中并孵育一小時，并且隨后使用incellanalyzer6000(gehealthcare)定量攝入細(xì)胞中的抗原的熒光強度。以與取為1.00的初始ab2值的相對值提供攝入抗原的量。細(xì)胞攝取的定量結(jié)果在表36和37中總結(jié)。在數(shù)個重鏈和輕鏈變體中觀察到源自細(xì)胞中的抗原的強熒光。本文中，與初始ab2的熒光強度相比，變體的細(xì)胞中攝入的抗原的約1.5倍或更多倍的熒光強度被認(rèn)為對細(xì)胞中攝入的抗原具有強烈的電荷效應(yīng)。在pi-提高的重鏈變體中，具有g(shù)8r，l18r，q39k，p41r，g44r，l63r，f63r，q64k，q77r，t77r，l82k，s82an，s82br，t83r，a85r或e85g置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更強的細(xì)胞內(nèi)抗原攝取。推測重鏈中的單個氨基酸置換或這些置換的組合對細(xì)胞內(nèi)抗原抗體復(fù)合物攝取具有強的電荷效應(yīng)。因此，預(yù)期通過將提高pi的修飾引入抗體的重鏈可變區(qū)從而更快速或更高頻率地引起抗原-抗體復(fù)合物攝入細(xì)胞中的一個或多個位置可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置8，18，39，41，44，63，64，77，82，82a，82b，83，或85。引入所述一個或多個位置的氨基酸置換可以是天冬酰胺，甘氨酸，絲氨酸，精氨酸或賴氨酸，并且優(yōu)選精氨酸或賴氨酸。在pi-提高的輕鏈變體中，具有g(shù)16k，q27r，s27r，g41r，s52r，s56r，s65r，t69r，t74k，s76r，s77r或q79k置換(根據(jù)kabat編號)的抗體顯示更強的細(xì)胞內(nèi)抗原攝取。推測輕鏈中單個氨基酸置換或這些置換的組合對細(xì)胞內(nèi)抗原抗體復(fù)合物攝取具有強的電荷效應(yīng)。具有四個或更多個氨基酸置換的變體傾向于顯示比具有更少氨基酸置換的那些變體更強的電荷效應(yīng)。如實施例21，(21-3)中所示，42k和76r置換的組合在ige抗體中有效。然而，在c5抗體的情形中，kabat編號42的氨基酸已經(jīng)是賴氨酸，因此我們可以通過簡單置換76r來觀察42k/76r的電荷效應(yīng)。具有76r置換的變體在c5抗體中也顯示強的電荷效應(yīng)的事實顯示42k/76r的組合具有強的電荷效應(yīng)，而與抗原無關(guān)。因此，預(yù)期通過將提高pi的修飾引入抗體的輕鏈可變區(qū)從而更快速或更高頻率地引起抗原-抗體復(fù)合物攝入細(xì)胞中的一個或多個位置可以包括，例如，根據(jù)kabat編號位置16，27，41，52，56，65，69，74，76，77或79。引入所述一個或多個位置的氨基酸置換可以是精氨酸或賴氨酸。(22-9)小鼠共注射模型中清除c5的評價在小鼠共注射模型中測試一些抗-c5雙特異性抗體(初始ab2，20l233-005，20l233-006和20l233-009)以評價它們加速從血漿中清除c5的能力。在共注射模型中，分別通過單次靜脈內(nèi)注射與抗-c5雙特異性抗體預(yù)混合的c5，施用給c57bl6j小鼠(jacksonlaboratories)。所有組接受0.1mg/kgc5連同1.0mg/kg的抗-c5雙特異性抗體?？俢5血漿濃度通過抗-c5eclia確定。首先，將抗-人c5小鼠igg分散到ecl板中，并在5℃放置過夜以制備固定有抗-人c5小鼠igg的板。將用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品和樣品與抗-人c5兔igg混合。將這些樣品加入到固定有抗-人c5小鼠igg的板中，并且在室溫放置一小時。然后，將這些樣品與hrp-綴合的抗-兔igg(jacksonimmunoresearch)反應(yīng)。將板在室溫孵育一小時后，加入sulfo-標(biāo)簽綴合的抗-hrp。用sector成像儀2400(mesoscalediscovery)讀取ecl信號。從ecl信號，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中，使用softmaxpro(moleculardevices)計算人c5的濃度。圖39描述c57bl6j小鼠中的c5血漿濃度時間曲線。與初始ab2相比，本研究中測試的所有具有一個或多個提高pi的置換的雙特異性抗體表明從血漿中快速清除c5。因此，提示輕鏈中t74k/s77r，s76r/q79k和q37r的氨基酸置換加速體內(nèi)c5-抗體免疫復(fù)合物的去除。此外，20l233-005和20l233-006的c5去除比20l233-009快，這與體外成像和biacore分析一致。這些結(jié)果提示，甚至似乎不可能促進體內(nèi)抗原從血漿清除的一個或多個位置(在通過上述incellanalyzer6000使用熒光強度的體外系統(tǒng)或體外biacore系統(tǒng)下檢查)，通過使用更靈敏的體內(nèi)系統(tǒng)可以發(fā)現(xiàn)對其有促進。這些結(jié)果還提示，對于推測體內(nèi)從血漿清除抗原的評價，通過上述incellanalyzer6000使用熒光強度的體外系統(tǒng)的靈敏度可以比上述體外biacore系統(tǒng)更高。實施例23使用pi-提高的fc變體評價從血漿中清除ige為了增強人ige或人c5的清除，使用ph依賴性抗體評價抗體的fc部分中的提高pi的置換。不特別限制向抗體恒定區(qū)添加氨基酸置換以提高pi的方法，但例如，其可以通過wo2014/145159中所述的方法進行。(23-1)通過恒定區(qū)中的單個氨基酸修飾產(chǎn)生具有提高的pi的抗體測試的抗體在表38中概述。通過將提高pi的置換q311k引入ab1h來制備重鏈，ab1h-p1394m(seqidno：307)。其他重鏈變體也通過根據(jù)參照實施例1中所示的方法將表38中所示的各個置換引入ab1h來制備。所有重鏈變體與作為輕鏈的ab1l一起表達。[表38](23-2)通過biacore使用含有pi-提高的fc區(qū)變體的抗體測定人fcγriib-結(jié)合為了評價對由使用表38中所述的抗體形成的抗原-抗體復(fù)合物的fcrγriib-結(jié)合的電荷效應(yīng)，利用與實施例21，(21-2)中所述類似的方式進行fcrγriib-結(jié)合測定。測定結(jié)果顯示在表38中。本文中，與初始ab1對hfcγriib的結(jié)合相比約1.2倍或更多倍的變體對hfcγriib的結(jié)合被認(rèn)為對抗體與傳感芯片上的hfcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。在與初始ab1相比具有單個氨基酸置換的pi-提高的變體中，由數(shù)個變體如p1398m，p1466m，p1482m，p1512m，p1513m，和p1514m產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物顯示對hfcγriib的最高結(jié)合。推測關(guān)于d413k，q311r，p343r，d401r，d401k，g402r，q311k，n384r，n384k，或g402k的單個氨基酸置換對傳感芯片上hfcγriib的結(jié)合具有強的電荷效應(yīng)。因此，預(yù)期通過將提高pi的修飾引入抗體的恒定或fc區(qū)而顯示加速體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)攝入的速度或速率的效果的單個位置可以包括，例如，根據(jù)eu編號位置311，343，384，401，402，或413。引入所述位置的氨基酸置換可以是精氨酸或賴氨酸。(23-3)含有pi-提高的fc區(qū)變體的抗體的細(xì)胞攝取為了評價由表38中所述的抗體形成的抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)攝取，以與實施例21，(21-3)中所述的類似的方式進行細(xì)胞成像測定。測定結(jié)果顯示在表38中。本文中，與初始ab1的熒光強度相比約1.5倍或更多倍的變體的細(xì)胞中攝取的抗原的熒光強度被認(rèn)為對細(xì)胞內(nèi)攝入的抗原具有強的電荷效應(yīng)。在與初始ab1相比具有單個氨基酸置換的pi-提高的變體中，由數(shù)個變體如p1398m，p1466m，p1469m，p1470m，p1481m，p1482m，p1483m，p1512m，p1513m和p1653m產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物顯示更強的細(xì)胞內(nèi)抗原攝取。猜測關(guān)于d413k，q311r，n315k，n384r，q342k，p343r，p343k，d401r，d401k或d413r的單個氨基酸置換對細(xì)胞內(nèi)的抗原抗體復(fù)合物攝取具有強的電荷效應(yīng)。因此，預(yù)期通過將提高pi的修飾引入抗體的恒定或fc區(qū)而引起抗原-抗體復(fù)合物更快或更高頻率地攝入細(xì)胞的單個位置可以包括，例如，根據(jù)eu編號位置311，315，342，343，384，401，或413。在該位置引入的氨基酸置換可以是精氨酸或賴氨酸。(23-4)評價小鼠共注射模型中人ige的清除在小鼠共注射模型中測試一些具有ph-依賴性抗原結(jié)合的抗-ige抗體(初始ab1，p1466m，p1469m，p1470m，p1480m，p1482m，p1512m，p1653m)以評價它們加速從血漿中清除ige的能力。測定以與實施例21，(21-4)相似的方式進行。圖40描述c57bl6j小鼠中的血漿濃度時間曲線。在施用具有ph-依賴性抗原結(jié)合的高pi變體(僅單個氨基酸置換)后，血漿總ige濃度低于初始ab1的那個，除了p1480m以外。p1480m(顯示在體外研究中弱的功效)不加速ige的去除。此外，用沒有ph-依賴性抗原結(jié)合的高pi變體處理的小鼠中的血漿總ige濃度顯著高于具有ph-依賴性抗原結(jié)合的高pi變體的那個(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，通過引入提高pi的修飾而增加抗原-抗體免疫復(fù)合物的細(xì)胞攝取。攝入細(xì)胞中與ph-依賴性抗原結(jié)合抗體復(fù)合的抗原在內(nèi)體內(nèi)部能夠有效從抗體釋放，導(dǎo)致ige去除的加速。這些結(jié)果提示，甚至似乎不可能促進體內(nèi)從血漿中清除抗原的置換的位置(在上述體外biacore系統(tǒng)下檢查)，通過使用更靈敏的體內(nèi)系統(tǒng)可以發(fā)現(xiàn)對其有促進。這些結(jié)果還提示，對于推測體內(nèi)抗原從血漿的清除的評價，通過上述incellanalyzer6000使用熒光強度的體外系統(tǒng)的靈敏度可以高于上述體外biacore系統(tǒng)的靈敏度。參照實施例1氨基酸-置換的igg抗體的表達載體的構(gòu)建使用快速改變位點-定向誘變試劑盒(quikchangesite-directedmutagenesis)(stratagene)，通過所附說明書手冊中描述的方法制備突變體。將含有突變體的質(zhì)粒片段插入動物細(xì)胞表達載體中，構(gòu)建所需h-鏈和l-鏈表達載體。通過本領(lǐng)域中已知的方法確定獲得的表達載體的核苷酸序列。參照實施例2igg抗體的表達和純化使用以下方法表達抗體。將人胚腎癌細(xì)胞-來源的hek293h細(xì)胞系(invitrogen)懸浮在補充有10％胎牛血清(invitrogen)的dmem培養(yǎng)基(invitrogen)中。以5至6x105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將細(xì)胞以10ml/盤鋪板在盤中用于粘附細(xì)胞(10cm直徑；corning)并在co2溫箱(37℃，5％co2)中培養(yǎng)一天。然后，通過吸取去除培養(yǎng)基，并且加入6.9ml的cho-s-sfm-ii培養(yǎng)基(invitrogen)。將制備的質(zhì)粒通過脂轉(zhuǎn)染方法引入細(xì)胞。收集得到的培養(yǎng)上清，離心(大約2,000g，5分鐘，室溫)去除細(xì)胞，并且通過經(jīng)0.22-μm濾器millex(注冊商標(biāo))-gv(millipore)過濾除菌，獲得上清。通過本領(lǐng)域中已知的方法，使用rproteina瓊脂糖凝膠tmfastflow(amershambiosciences)從獲得的培養(yǎng)上清中純化抗體。為了確定純化的抗體的濃度，使用分光光度計在280nm測量吸光度。從使用通過pace等人，proteinscience4：2411-2423(1995)中所述的方法計算的消光系數(shù)確定的值，計算抗體濃度。參照實施例3可溶性人il-6受體的制備以下述方式制備重組可溶性人il-6受體(其是抗原)。使用本領(lǐng)域中已知的方法構(gòu)建如mullberg等人，j.immunol.152：4958-4968(1994)中所報道的組成型表達由n末端第1至357個氨基酸的氨基酸序列組成的可溶性人il-6受體的cho細(xì)胞系。通過培養(yǎng)該cho系表達可溶性人il-6受體?？扇苄匀薸l-6受體從在以下兩個步驟中獲得的cho系的培養(yǎng)上清中純化：bluesepharose6ff柱色譜和凝膠過濾柱色譜。在最后的步驟中作為主峰洗脫的級分用作最終純化的產(chǎn)物。序列表<110>中外制藥株式會社<120>包含離子濃度依賴性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，fc區(qū)變體，il-8-結(jié)合抗體，及其應(yīng)用<130>c1-a1502y1p<150>jp2015-021371<151>2015-02-05<150>jp2015-185254<151>2015-09-18<160>332<170>patentinversion3.5<210>1<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>vk1<400>1aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnserilesersertyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnsertyrserthrprophe859095thrpheglyproglythrlysvalaspilelys100105<210>2<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>vk2<400>2aspilevalmetthrglnserproleuserleuprovalthrprogly151015gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser202530asnglyaspasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser354045proglnleuleuiletyrleuglyserasnargalaserglyvalpro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnval859095leuargasnproleuthrpheglyglyglythrlysvalgluilegln100105110<210>3<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>vk3<400>3gluilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargserasntrppropro859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>4<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>vk4<400>4aspilevalmetthrglnserprogluserleuvalleuserleugly151015glythralathrileasncysargserserglnservalleutyrser202530serasnasnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045proprothrleuleuphesertrpalaserileargaspserglyval505560proaspargpheseralaserglyserglythrgluphethrleuthr65707580ileseraspleuglnalagluaspalaalavaltyrtyrcysglngln859095tyrtyrargalaproserpheglyglnglythrlysleuglnilelys100105110<210>5<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>6rl#9-igg1<400>5glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyileileasnproserglyglyserthrsertyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserthrserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargaspaspproglyglyglyglutyrtyrpheasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>6<211>126<212>prt<213>人工序列<220><223>6kc4-1#85-igg1<400>6gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530glumetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045sertyrileserserserglyserthriletyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargaspalaprotyrtyrtyraspserserglytyrth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