發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在兩個(gè)二聚體單元之間具有雜芳族基團(tuán)的苯并二氮雜二聚體、由其衍生的二聚體-連接體化合物、其綴合物及其制備和使用方法。

技術(shù)背景

一些自然產(chǎn)生的細(xì)胞毒素，例如托馬霉素和安曲霉素，包含苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)。考慮到另外存在稠合到二氮雜環(huán)的吡咯烷環(huán)，這些化合物經(jīng)常被稱為吡咯并苯并二氮雜或pbd。

pbd具有抗菌和抗腫瘤活性，后面的特征導(dǎo)致對(duì)其作為抗癌藥物的關(guān)注。機(jī)制上，pbd以序列選擇性方式結(jié)合到dna的小溝，并使dna烷基化。已研究不同取代基的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(sar)(antonow等人，2010；thurston等人，1999)。

另外的研究顯示，pbd二聚體顯示特別有希望作為抗癌劑。一般pbd二聚體的核結(jié)構(gòu)可由式(a-1)表示，其中x為連接兩個(gè)二聚體半部的橋連基團(tuán)。

與單體pbd一樣，二聚體為dna小溝的結(jié)合劑-烷基化劑。由于為雙官能，由二聚體烷基化產(chǎn)生交聯(lián)dna，使dna修復(fù)更困難(dna烷基化通過(guò)亞胺基進(jìn)行。有一個(gè)還原的亞胺基的pdb仍可烷基化dna，但不能使其交聯(lián)。它們?nèi)詾樯锘钚裕m然一般較小，但它們的不同藥物動(dòng)力學(xué)曲線對(duì)一些應(yīng)用可能是優(yōu)選的)。關(guān)于從自然產(chǎn)生單體到合成單體到合成二聚體作為抗腫瘤劑pbd的演進(jìn)的綜述，見(jiàn)hartley2011。

已通過(guò)a/a’和c/c’環(huán)上的取代基、c/c’環(huán)中的不飽和度、橋連基團(tuán)x的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度、環(huán)b/b’中亞胺雙鍵的氧化或還原及這些特征的組合探索pbd二聚體的sar。參見(jiàn)bose等人，1992，gregson等人，1999，gregson等人，2001a和2001b，gregson等人，2004，gregson等人，2009，hartley等人，2012，howard等人，2007，howard等人，2009a.howard等人，2010，howard等人，2013a和2013b，liu等人，2007，thurston等人，1996，thurston等人，2006，和thurston等人，2008。大多數(shù)pbd二聚體通過(guò)8/8’橋連接，如上所示，但也已公開(kāi)7/7’橋(howard等人，2009b)。

產(chǎn)生強(qiáng)烈關(guān)注的抗癌劑的一個(gè)類型為抗體-藥物綴合物(adc，也稱為免疫綴合物)。在adc中，治療劑(也稱為藥物、有效載荷或彈頭)共價(jià)連接到其抗原由癌細(xì)胞表達(dá)(腫瘤相關(guān)的抗原)的抗體。通過(guò)結(jié)合到抗原，抗體將adc輸送到癌部位。在那里，共價(jià)鍵斷裂或抗體降解引起治療劑釋放。相反，當(dāng)adc在血液系統(tǒng)中循環(huán)時(shí)，由于共價(jià)連接到抗體，治療劑保持非活性。因此，由于其定位釋放，在adc中使用的治療劑可比普通化學(xué)治療劑有效得多(即，有細(xì)胞毒性)。關(guān)于對(duì)adc的綜述，見(jiàn)schrama等人，2006。

已提出pbd二聚體作為在adc中的藥物。連接體連結(jié)到抗體的連接可通過(guò)位于c/c’環(huán)中的官能團(tuán)、橋連基團(tuán)x或通過(guò)在b/b’環(huán)中跨亞胺基的加成來(lái)實(shí)現(xiàn)。見(jiàn)beau-larvor等人，2014，bouchard等人，2013，commercon等人，2013a和2013b，flygare等人，2013，gauzy等人，2012，howard2104a-2014e，howard等人，2011，howard等人，2013c和2013d，howard等人，2014a-2014h，jeffrey等人，2013，jeffrey等人，2014a和2014b，及zhao等人，2014。

也已提出另一種類型苯并二氮雜二聚體作為藥物用于adc。結(jié)構(gòu)上，這種類型可視作為進(jìn)一步具有稠合到各c/c’環(huán)的苯基環(huán)的pbd二聚體，如式(a-2)和(a-3)中所示。見(jiàn)chari等人，2013，li等人，2013，fishkin等人，2014，li等人，2014。

也已公開(kāi)具有其它環(huán)系統(tǒng)的苯并二氮雜化合物，例如四氫異喹啉并[2，1-c][1，4]苯并二氮雜。kothakonda等人，2004。

關(guān)于本文中以第一作者或發(fā)明人引用的文獻(xiàn)和年份的完全引用在本申請(qǐng)結(jié)尾列出。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供新的苯并二氮雜二聚體，其中至少一個(gè)苯并二氮雜單元具有稠合到苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)的四氫異喹啉(thiq)環(huán)系統(tǒng)，且進(jìn)一步在連接兩個(gè)二聚體單元的橋中具有亞雜芳基部分。可任選還原苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)中的亞胺鍵。

二聚體的兩個(gè)單元(半部)可具有thiq環(huán)系統(tǒng)(“thiq-thiq二聚體”或“thiq同型二聚體”)，或者一個(gè)單元可具有thiq環(huán)系統(tǒng)，另一個(gè)單元具有不同的苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)，例如pbd環(huán)系統(tǒng)(一般“thiq異質(zhì)二聚體”，或者在此具體實(shí)例中，“thiq-pbd二聚體”)。在thiq-thiq二聚體中，兩個(gè)單元可相同(“對(duì)稱thiq-thiq二聚體”)或不同(“不對(duì)稱thiq-thiq二聚體”)。

因此，本發(fā)明提供具有由式(i)表示的結(jié)構(gòu)的苯并二氮雜二聚體或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中

x選自

r¹符合式(ia)或式(ib)：

g和g’各自為c或n，其條件為不多于兩個(gè)g或兩個(gè)g’為n；

各r²獨(dú)立為h或c1-c5烷基；

r³和r⁴各自獨(dú)立為h、f、cl、br、oh、c1-c3烷基、o(c1-c3烷基)、氰基、(ch2)0-5nh2或no2；

二氮雜環(huán)系統(tǒng)中的各雙線獨(dú)立表示單鍵或雙鍵；

如果到與r⁵連接的n的雙線為單鍵，則各r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；

如果到與r⁶連接的c的雙線為單鍵，則各r⁶為h、oh、so3na或so3k，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在；

r⁷、r⁸、r⁹和r¹⁰各自獨(dú)立為h、c1-c5烷基、c≡c(ch2)1-5x²、oh、o(c1-c5烷基)、氰基、no2、f、cl、br、o(ch2ch2o)1-8(c1-3烷基)、(ch2)0-5x²、o(ch2)2-5x²、未取代或被(ch2)0-5x²或o(ch2)2-5x²取代的3-至7-元環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、未取代或被(ch2)0-5x²或o(ch2)2-5x²取代的5-至6-元芳基或雜芳基，

或者在r⁷、r⁸、r⁹或r¹⁰連接到為n的g或g’時(shí)，這些r⁷、r⁸、r⁹或r¹⁰不存在；

式(ib)的環(huán)c中的虛線表示任選存在c1-c2、c2-c3或c2-r¹¹雙鍵；

r¹¹為h、＝o、＝ch2、＝ch(c1-c5烷基)、ch＝ch(ch2)1-5x²、c≡c(ch2)1-5x²、c1-c5烷基、oh、o(c1-c5烷基)、氰基、no2、f、cl、br、o(ch2ch2o)1-8(c1-3烷基)、(ch2)0-5x²、未取代或被(ch2)0-5x²、o(ch2)2-5x²取代的4-至7-元芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、未取代或被(ch2)0-5x²或o(ch2)2-5x²取代的3-至7-元環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、未取代或被(ch2)0-5x²或o(ch2)2-5x²取代的5-至6-元芳基或雜芳基；

如果c1-c2、c2-c3或c2-r¹¹雙鍵存在，則r^11’不存在，否則r^11’為h；

各x²獨(dú)立為h、f、cl、br、oh、o(c1-c3烷基)、o(c1-c3亞烷基)、co2h、n3、cn、no2、co2(c1-c3烷基)、nh2、nh(c1-c5烷基)、n(c1-c5烷基)2、sh、cho、n(ch2ch2)2n(c1-c3烷基)、nhnh2或c(＝o)nhnh2；

各y獨(dú)立為ch2、c＝o或chr¹²，其中各r¹²獨(dú)立為f、cl、br或c1-c3烷基；并且

y’和y”獨(dú)立為ch2、c＝o或chr¹²，其中各r¹²獨(dú)立為f、cl、br或c1-c3烷基，其條件為存在y’和y”至少之一。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種綴合物，該綴合物包含共價(jià)結(jié)合到靶向部分的式(i)的二聚體，靶向部分特異或優(yōu)先結(jié)合到靶細(xì)胞上的化學(xué)實(shí)體，靶細(xì)胞優(yōu)選為癌細(xì)胞。靶向部分優(yōu)選為抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，甚至更優(yōu)選人單克隆抗體，且化學(xué)實(shí)體為腫瘤相關(guān)的抗原。腫瘤相關(guān)的抗原可以為在癌細(xì)胞表面顯示的抗原，或者由癌細(xì)胞分泌進(jìn)入周圍胞外空間的抗原。優(yōu)選腫瘤相關(guān)的抗原為與正常細(xì)胞比較由癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)的抗原，或者由癌細(xì)胞表達(dá)而非正常細(xì)胞表達(dá)的抗原。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種共價(jià)結(jié)合到連接體部分的式(i)的二聚體，連接體部分具有適合綴合到靶向部分的反應(yīng)性官能團(tuán)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療患癌的患者的癌癥的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的二聚體或其與靶向部分的綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中提供本發(fā)明的二聚體或其與靶向部分的綴合物用于制備治療患癌的患者的癌癥的藥物的用途。本發(fā)明的二聚體或其與靶向部分的綴合物也可用于體外、回體或體內(nèi)抑制癌細(xì)胞增殖。癌癥可尤其為肺或胃癌。

附圖簡(jiǎn)述

圖1、2、3、4、5、19a、19b和21顯示用于合成制備本發(fā)明二聚體所用不同中間體的方案。

圖6、8、9、11、14、16、18和22顯示用于合成本發(fā)明的不同二聚體的方案。

圖7a、7b、10、12a、12b、13、15、17和20顯示用于合成本發(fā)明的不同二聚體-連接體的方案。

實(shí)施方案詳述

定義

“抗體”指完整抗體和任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”)或其單鏈變體。完整抗體為包含由二硫鍵互連的至少兩個(gè)重(h)鏈和兩個(gè)輕(l)鏈的蛋白質(zhì)。各重鏈包括含三個(gè)域ch1、ch2和ch3的重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈不變區(qū)。各輕鏈包括含一個(gè)單域cl的輕鏈可變區(qū)(vl或vk)和輕鏈不變區(qū)。vh和vl區(qū)可進(jìn)一步分成高變性區(qū)，也稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，這些區(qū)散布有更保守的框架區(qū)(fr)。各vh和vl包括從氨基-到羧基-端按以下次序布置的3個(gè)cdr和4個(gè)fr：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4?？勺儏^(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合域。不變區(qū)可介導(dǎo)抗體結(jié)合到宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(clq)。如果抗體結(jié)合到抗原x的kd為5x10^-8m或更小，更優(yōu)選1x10^-8m或更小，更優(yōu)選6x10^-9m或更小，更優(yōu)選3x10^-9m或更小，甚至更優(yōu)選2x10^-9m或更小，則稱為抗體“特異結(jié)合”到抗原x?？贵w可以為嵌合、人源化或優(yōu)選人抗體?？晒こ淘O(shè)計(jì)重鏈不變區(qū)，以影響糖基化類型或程度，延長(zhǎng)抗體半衰期，增加或減小與效應(yīng)細(xì)胞或補(bǔ)體系統(tǒng)的相互作用，或者調(diào)節(jié)一些其它性質(zhì)。通過(guò)代替、增加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸或者通過(guò)用來(lái)自另一個(gè)免疫球蛋白類型的域代替一種域或者前述手段的組合，可實(shí)現(xiàn)工程設(shè)計(jì)。

抗體的“抗原結(jié)合片段”和“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)單為“抗體部分”或“抗體片段”)指保持特異結(jié)合到抗原的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已顯示，抗體的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段實(shí)現(xiàn)，例如(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1域組成的單價(jià)片段；(ii)f(ab′)2片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個(gè)fab片段的二價(jià)片段；(iii)fab’片段，基本為具有鉸鏈區(qū)的部分的fab(見(jiàn)，例如abbas等人，cellularandmolecularimmunology，第6版，saunderselsevier2007)；(iv)fd片段，由vh和ch1域組成；(v)fv片段，由抗體的單臂的vl和vh域組成；(vi)dab片段(ward等人，(1989)nature341：544-546)，由vh域組成；(vii)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)；和(viii)納米抗體，包含單一可變域和兩個(gè)不變域的重鏈可變區(qū)。優(yōu)選的抗原結(jié)合片段為fab、f(ab’)2、fab’、fv和fd片段。另外，雖然fv片段的兩個(gè)域vl和vh由單獨(dú)的基因編碼，但它們可用重組方法通過(guò)合成連接體連接，合成連接體使它們能夠作為單蛋白鏈產(chǎn)生，其中vl和vh區(qū)配對(duì)成單價(jià)分子(稱為單鏈fv或scfv)，見(jiàn)例如bird等人，(1988)science242：423-426；和huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883)。這些單鏈抗體也包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。

“分離的抗體”指基本不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(例如，特異結(jié)合抗原x的分離抗體基本不含特異結(jié)合抗原x以外的抗原的抗體)。然而，特異結(jié)合抗原x的分離抗體具有對(duì)其它抗原的交叉反應(yīng)性，例如，來(lái)自其它物類的抗原x分子。在某些實(shí)施方案中，分離抗體特異結(jié)合到人抗原x，且不與其它(非人)抗原x抗原交叉反應(yīng)。另外，分離抗體可基本不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。

“單克隆抗體”或“單克隆抗體組成”指單分子組成抗體分子的制備物，這顯示對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。

“人抗體”指具有可變區(qū)的抗體，其中框架和cdr區(qū)二者(及不變區(qū)，如果存在)均從人生殖系免疫球蛋白序列衍生。人抗體可包括后修飾，包括天然或合成修飾。人抗體可包括未由人生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，由隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變體外或由體細(xì)胞突變體內(nèi)引起的突變)。然而，“人抗體”不包括其中從另一種哺乳動(dòng)物物種(例如，小鼠)生殖系衍生的cdr序列已移植到人框架序列上的抗體。

“人單克隆抗體”指顯示單一結(jié)合特異性的具有可變區(qū)的抗體，其中框架和cdr區(qū)二者均從人生殖系免疫球蛋白序列衍生。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由包括從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物得到的b細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物例如轉(zhuǎn)基因小鼠，具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和融合到無(wú)限增殖化細(xì)胞的輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。

“脂族”指直鏈或支鏈、飽和或不飽和非芳族烴部分，該部分具有規(guī)定的碳原子數(shù)(例如，如在“c3脂族”、“c1-5脂族”、“c1-c5脂族”或“c1至c5脂族”中，對(duì)于具有1至5個(gè)碳原子的脂族部分，后三個(gè)短語(yǔ)同義)，或者，在未明確規(guī)定碳原子數(shù)時(shí)，1至4個(gè)碳原子(在不飽和脂族部分情況下，2至4個(gè)碳)。類似認(rèn)識(shí)適用于其它類型中的碳數(shù)，如在c2-4烯烴、c4-c7脂環(huán)族等中。類似地，術(shù)語(yǔ)例如“(ch2)1-3”應(yīng)理解為下標(biāo)為1、2或3的簡(jiǎn)寫(xiě)，因此，此術(shù)語(yǔ)表示ch2、ch2ch2和ch2ch2ch2等。

“烷基”指飽和脂族部分，指定碳原子數(shù)的相同規(guī)定也適用。作為實(shí)例，c1-c4烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等?！皝喭榛敝竿榛亩r(jià)對(duì)應(yīng)物，例如ch2ch2、ch2ch2ch2和ch2ch2ch2ch2。

“烯基”指具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的脂族部分，指定碳原子數(shù)的相同規(guī)定也適用。作為實(shí)例，c2-c4烯基部分包括但不限于乙烯基、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、順-1-丙烯基、反-1-丙烯基、e-(或z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1，3-丁二烯基(丁-1，3-二烯基)等。

“炔基”指具有至少一個(gè)碳-碳三鍵的脂族部分，指定碳原子數(shù)的相同規(guī)定也適用。作為實(shí)例，c2-c4炔基包括乙炔基、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。

“脂環(huán)族”指具有1至3個(gè)環(huán)的飽和或不飽和、非芳族烴部分，各環(huán)具有3至8個(gè)(優(yōu)選3至6個(gè))碳原子?！碍h(huán)烷基”指其中各環(huán)飽和的脂環(huán)族部分。“環(huán)烯基”指其中至少一個(gè)環(huán)具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的脂環(huán)族部分?！碍h(huán)炔基”指其中至少一個(gè)環(huán)具有至少一個(gè)碳-碳三鍵的脂環(huán)族部分。作為實(shí)例，脂環(huán)族部分包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基和金剛烷基。優(yōu)選的脂環(huán)族部分為環(huán)烷基，尤其環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基?！皝啳h(huán)烷基”指環(huán)烷基的二價(jià)對(duì)應(yīng)物。

“雜脂環(huán)族”指其中在其至少一個(gè)環(huán)中最多三個(gè)(優(yōu)選1至2個(gè))碳已用獨(dú)立選自n、o或s的雜原子代替的脂環(huán)族部分，其中n和s可任選經(jīng)氧化，且n可任選經(jīng)季銨化。類似地，“雜環(huán)烷基”、“雜環(huán)烯基”和“雜環(huán)炔基”分別指其中至少一個(gè)環(huán)已如此修飾的環(huán)烷基、環(huán)烯基或環(huán)炔基部分。示例性雜脂環(huán)族部分包括氮丙啶基、氮雜丁環(huán)基、1，3-二氧雜環(huán)己烷基、氧雜環(huán)丁烷基、四氫呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫噻喃基砜、嗎啉基、硫嗎啉基、硫嗎啉基亞砜、硫嗎啉基砜、1，3-二氧雜環(huán)戊烷基、四氫-1，1-二氧代-噻吩基、1，4-二氧雜環(huán)己烷基、硫雜丁環(huán)基等。“亞雜環(huán)烷基”指雜環(huán)烷基的二價(jià)對(duì)應(yīng)物。

“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分別指-o(烷基)、-o(芳基)、-s(烷基)和-s(芳基)。實(shí)例分別為甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。

“鹵素”或“鹵”指氟、氯、溴或碘。

“芳基”指具有單、雙或三環(huán)環(huán)系統(tǒng)的烴部分，其中各環(huán)具有3至7個(gè)碳原子，且至少一個(gè)環(huán)為芳族。環(huán)系統(tǒng)中的環(huán)可相互稠合(如在萘基)或相互連接(如在聯(lián)二苯基)，并且可稠合或連接到非芳族環(huán)(如在茚滿基或在環(huán)己基苯基)。進(jìn)一步作為實(shí)例，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、聯(lián)二苯基、菲基、蒽基和苊基。“亞芳基”指芳基的二價(jià)對(duì)應(yīng)物，例如1，2-亞苯基、1，3-亞苯基或1，4-亞苯基。

“雜芳基”指具有單、雙或三環(huán)環(huán)系統(tǒng)的部分，其中各環(huán)具有3至7個(gè)碳原子，且至少一個(gè)環(huán)為包含1至4個(gè)獨(dú)立選自n、o或s的雜原子的芳族環(huán)，其中n和s可任選經(jīng)氧化，且n可任選經(jīng)季銨化。這種包含至少一個(gè)雜原子的芳族環(huán)可稠合到其它類型環(huán)(如在苯并呋喃基或四氫異喹啉基)，或直接連接到其它類型環(huán)(如在苯基吡啶基或2-環(huán)戊基吡啶基)。進(jìn)一步作為實(shí)例，雜芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、n-氧代吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、噌啉基、喹唑啉基(quinozalinyl)、萘啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“亞雜芳基”指雜芳基的二價(jià)對(duì)應(yīng)物。

在指示一個(gè)部分可取代時(shí)，例如，使用“未取代或被取代”或“任選被取代”的用語(yǔ)，如在“未取代或被取代的c1-c5烷基”或“任選被取代的雜芳基”中，這個(gè)部分可具有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選擇的取代基，優(yōu)選1至5個(gè)，更優(yōu)選1至2個(gè)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可關(guān)于連接取代基的部分來(lái)選擇取代基和取代模式，以提供化學(xué)穩(wěn)定且能夠通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)和本文所述方法合成的化合物。在把一個(gè)部分認(rèn)作“未取代或被取代”或“任選被取代”時(shí)，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這個(gè)部分未取代。

“芳基烷基”、“(雜脂環(huán)族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“二芳基烷基”等指烷基、烯基或炔基部分可視情況用芳基、雜脂環(huán)族、二芳基等部分取代，可視情況在烷基、烯基或炔基部分具有開(kāi)放(未滿足的)化合價(jià)，例如在芐基、苯乙基、n-咪唑基乙基、n-嗎啉代乙基等。相反，“烷基芳基”、“烯基環(huán)烷基”等指芳基、環(huán)烷基等部分可視情況用烷基、烯基等部分取代，例如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基環(huán)己基中?！傲u基烷基”、“鹵代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等指烷基、芳基等部分可視情況用一個(gè)或多個(gè)已確定的取代基取代(可視情況為羥基、鹵代等)。

例如，容許的取代基包括但不限于烷基(尤其甲基或乙基)、烯基(尤其烯丙基)、炔基、芳基、雜芳基、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族、鹵代(尤其氟代)、鹵代烷基(尤其三氟甲基)、羥基、羥基烷基(尤其羥基乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-o(羥基烷基)、-o(鹵代烷基)(尤其-ocf3)、-o(環(huán)烷基)、-o(雜環(huán)烷基)、-o(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝o、＝nh、＝n(烷基)、＝noh、＝no(烷基)、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羥基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羥基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羥基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、疊氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羥基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(環(huán)烷基)、-s(＝o)烷基、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)、-so2n(烷基)2等。

在被取代的部分為脂族部分時(shí)，優(yōu)選的取代基為芳基、雜芳基、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族、鹵代、羥基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羥基烷基)、-o(鹵代烷基)、-o(環(huán)烷基)、-o(雜環(huán)烷基)、-o(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝o、＝nh、＝n(烷基)、＝noh、＝no(烷基)、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羥基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羥基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羥基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、疊氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羥基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(＝o)烷基、-s(環(huán)烷基)、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)和-so2n(烷基)2。更優(yōu)選的取代基為鹵代、羥基、氰基、硝基、烷氧基、-o(芳基)、＝o、＝noh、＝no(烷基)、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、疊氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2和-nhc(＝nh)nh2。尤其優(yōu)選為苯基、氰基、鹵代、羥基、硝基、c1-c4烷氧基、-o(c2-c4亞烷基)oh和-o(c2-c4亞烷基)鹵代。

在被取代的部分為脂環(huán)族、雜脂環(huán)族、芳基或雜芳基部分時(shí)，優(yōu)選的取代基為烷基、烯基、炔基、鹵代、鹵代烷基、羥基、羥基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羥基烷基)、-o(鹵代烷基)、-o(芳基)、-o(環(huán)烷基)、-o(雜環(huán)烷基)、烷硫基、芳硫基、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羥基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羥基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羥基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、疊氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羥基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(環(huán)烷基)、-s(＝o)烷基、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)和-so2n(烷基)2。更優(yōu)選的取代基為烷基、烯基、鹵代、鹵代烷基、羥基、羥基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羥基烷基)、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羥基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羥基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羥基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2和-nhc(＝nh)nh2。尤其優(yōu)選為c1-c4烷基、氰基、硝基、鹵代和c1-c4烷氧基。

在陳述一個(gè)范圍時(shí)，如在“c1-c5烷基”或“5至10％”時(shí)，此范圍包括范圍的端點(diǎn)，如在第一種情況下在c1和c5中，在第二種情況下在5％和10％中。

除非明確指明具體立體異構(gòu)體(例如，在結(jié)構(gòu)式中在相關(guān)立體中心通過(guò)加粗實(shí)鍵或虛鍵表示，在結(jié)構(gòu)式中將雙鍵描繪為e或z構(gòu)型，或者使用立體化學(xué)命名的名稱)，所有立體異構(gòu)體均作為純化合物及其混合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除非另外指明，各單獨(dú)的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體及其組合和混合物均為本發(fā)明所包含。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，化合物可具有等價(jià)于本文所用結(jié)構(gòu)式中描繪那些的互變異構(gòu)形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和兩性離子形式，且結(jié)構(gòu)式包括這些互變異構(gòu)、共振或兩性離子形式。

“藥學(xué)上可接受的酯”指體內(nèi)(例如，在人體中)水解產(chǎn)生母體化合物或其鹽或者本身具有類似于母體化合物的活性的酯。適合的酯包括c1-c5-烷基酯、c2-c5烯基酯或c2-c5炔基酯，尤其甲酯、乙酯或正丙酯。

“藥學(xué)上可接受的鹽”指適用于藥物制劑的化合物的鹽。在化合物具有一個(gè)或多個(gè)堿性基團(tuán)時(shí)，鹽可以為酸加成鹽，如硫酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、馬來(lái)酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、撲酸鹽(雙羥萘酸鹽)、氫碘酸鹽、硝酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽、甲基硫酸鹽、富馬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、甲磺酸鹽、乳糖酸鹽、辛二酸鹽、甲苯磺酸鹽等。在化合物具有一個(gè)或多個(gè)酸性基團(tuán)時(shí)，鹽可以為例如鈣鹽、鉀鹽、鎂鹽、甲基葡胺鹽、銨鹽、鋅鹽、哌嗪鹽、氨丁三醇鹽、鋰鹽、膽堿鹽、二乙胺鹽、4-苯基環(huán)己基胺鹽、雙芐基乙二胺鹽、鈉鹽、四甲基銨鹽等。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括多晶結(jié)晶型和溶劑合物。

在本說(shuō)明書(shū)的式中，與鍵成橫向的波形線或在鍵末端的星號(hào)(*)表示共價(jià)連接部位。例如，在式中聲明r為是指

在本說(shuō)明書(shū)的式中，在芳族環(huán)的兩個(gè)碳之間橫穿芳族環(huán)的鍵指連接到鍵的基團(tuán)可位于芳族環(huán)的任何可利用位置。例如，式表示

二聚體

式(i)的苯并二氮雜二聚體的優(yōu)選實(shí)施方案具有由式(i’)表示的結(jié)構(gòu)，其中式(i’)中變量的意義如式(i)中所限定：

即，式(i’)與式(i)的不同之處在于x為

在式(i)及其亞類和二聚體-連接體化合物和綴合物的相關(guān)式中，除非在特定式環(huán)境中指明更明確優(yōu)選，否則適用以下優(yōu)選項(xiàng)：

(a)在式包括具有雙線的兩個(gè)苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)時(shí)，不多于1個(gè)雙線表示單鍵。相反，優(yōu)選二者均為雙鍵，或者一個(gè)為單鍵，另一個(gè)為雙鍵。

(b)各r²，在式中存在時(shí)，為me，更優(yōu)選各r²為me，且各r³、r⁴、r⁷、r⁸和r¹⁰，在式中存在時(shí)，為h。

(c)各y，在式中存在時(shí)，為ch2。

(d)各r⁹，在式中存在時(shí)，獨(dú)立為h、oh、ome、nh2、nme2、o(ch2ch20)1-8me、och2ch20h或(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)。

(e)在式中存在時(shí)，各g’為c，且y’和y”二者均為ch2，或者一個(gè)g’為n，y’為ch2，而y”不存在。

(f)在式中存在時(shí)，r¹¹為h，＝ch2，ch＝chme，＝chme，c≡cch2nh2、(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)或

(h)橋連基團(tuán)

為更優(yōu)選為

(i)橋連基團(tuán)中的部分(ch2)0-5x²優(yōu)選為h、oh、ome、me或ch2oh。

本發(fā)明的二聚體可以為thiq-thiq二聚體，即，在式(i)中，r¹符合式(ia)。這種二聚體可由式(iia)表示：

其中

其中x、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、雙線和x²如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

式(iia)的優(yōu)選thiq-thiq二聚體具有由式(iia’)表示的結(jié)構(gòu)，其中式(iia’)中的變量如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定：

即，式(iia’)與式(iia)的不同之處在于x為

在根據(jù)式(iia)的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，thiq-thiq二聚體由式(iia”)表示：

其中

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在；

各r⁹獨(dú)立為h、oh、ome、nh2、nme2、o(ch2ch2o)1-8me、och2ch2oh或

(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)；并且

x³為h、oh、ome、me、ch2oh、o(烯丙基)、cl或co2me。

thiq-thiq二聚體的具體實(shí)例包括：

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體為thiq-pbd二聚體，即，在式(i)中，r¹符合式(ib)。這種二聚體可由式(iib)表示：

其中

x、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、r¹¹、r^11’、雙線環(huán)c中的虛線和x²如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

式(iib)的優(yōu)選thiq-pbd二聚體具有由式(iib’)表示的結(jié)構(gòu)，其中式(iib’)中的變量如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

即，式(iib’)與式(iib)的不同之處在于x為

根據(jù)式(iib)的另一種優(yōu)選thiq-pbd二聚體由式(iib”)表示：

其中

r⁹為h、oh、ome、nh2、nme2、o(ch2ch2o)1-8me、och2ch2oh或

(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)；

r¹¹為h、＝ch2、ch＝chme、＝chme、c≡cch2nh2、(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)或

如果c1-c2、c2-c3或c2-r¹¹雙鍵存在，則r^11’不存在，否則r^11’為h；

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；

苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)中的雙線至少之一為雙鍵；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；并且

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在。

優(yōu)選在式(iib)、(iib’)和(iib”)中，

為

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體包含具有thiq環(huán)系統(tǒng)的苯并二氮雜單元和具有氮雜二氫吲哚(azaindoline)(azi)環(huán)系統(tǒng)的苯并二氮雜單元(“thiq-azi二聚體”)。這種二聚體可由式(iic)表示：

其中

x、r²、r³、r⁴、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、雙線和x²如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定；

一個(gè)g’為n，其它為c；

苯并二氮雜環(huán)系統(tǒng)中的雙線至少之一為雙鍵；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；并且

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在。

式(iic)的優(yōu)選thiq-azi二聚體具有由式(iic’)表示的結(jié)構(gòu)，其中變量如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定

即，式(iic’)與式(iic)的不同之處在于x為

綴合物

總述

本發(fā)明的二聚體可本身作為治療劑使用，但優(yōu)選作為與特異或優(yōu)先結(jié)合到癌細(xì)胞上的化學(xué)實(shí)體的靶向部分的綴合物使用。靶向部分優(yōu)選為抗體或其抗原結(jié)合部分，且化學(xué)實(shí)體為腫瘤相關(guān)的抗原。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為包含本發(fā)明的二聚體和配體的綴合物，由式(ii)表示：

[d(x^d)a(c)c(x^z)b]mz(ii)

其中z為配體，d為本發(fā)明的二聚體，并且-(x^d)ac(x^z)b-共同稱為“連接體部分”或“連接體”，因?yàn)樗鼈冞B接z和d。在連接體內(nèi)，c為設(shè)計(jì)在二聚體d的預(yù)期生物作用部位或附近裂解的可裂解基團(tuán)；x^d和x^z被稱為間隔基部分(或“間隔基”)，因?yàn)樗鼈兎謩e使d和c及c和z隔開(kāi)；下標(biāo)a、b和c獨(dú)立為0或1(即，任選存在x^d、x^z和c)。下標(biāo)m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(優(yōu)選1、2、3或4)。以下更充分描述d、x^d、c、x^z和z。

配體z，例如抗體，起靶向作用。通過(guò)結(jié)合到其抗原或受體所處的靶組織或細(xì)胞，配體z指向那里的綴合物。(在配體z為抗體時(shí)，綴合物有時(shí)稱為抗體-藥物綴合物(adc)或免疫綴合物。優(yōu)選靶組織或細(xì)胞為癌組織或細(xì)胞，抗原或受體為腫瘤相關(guān)的抗原，即，僅由癌細(xì)胞表達(dá)或與非癌細(xì)胞比較由癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)的抗原。在靶組織或細(xì)胞的基團(tuán)c裂解釋放二聚體d，以局部發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。在某些情況下，綴合物通過(guò)胞吞內(nèi)化進(jìn)入靶細(xì)胞，并在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)生裂解。以此方式，在預(yù)期作用部位實(shí)現(xiàn)二聚體d精確輸送，從而減小需要的劑量。而且，二聚體d在其綴合態(tài)通常為生物非活性(或顯著較小活性)，從而減小對(duì)非靶組織或細(xì)胞的不需要毒性。由于抗癌藥物通常一般對(duì)細(xì)胞為高毒性，因此，這是一個(gè)重要考慮。

如下標(biāo)m反映，根據(jù)配體z可用于綴合的部位數(shù)和所用試驗(yàn)條件，各配體z分子可與多于一個(gè)二聚體d綴合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，雖然各單獨(dú)配體z分子綴合到整數(shù)個(gè)二聚體d，但可分析二聚體d與配體z非整數(shù)比的綴合物制備物，反映統(tǒng)計(jì)平均。將該比稱為取代比(sr)或同義稱為藥物-抗體比(dar)。

配體z

優(yōu)選配體z為抗體。為方便和簡(jiǎn)潔起見(jiàn)且不作為限制，隨后本文關(guān)于配體z綴合的詳細(xì)討論在其為抗體的環(huán)境條件下撰寫(xiě)，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，可綴合其它類型配體z，加上必要的變更。例如，用葉酸作為配體的綴合物可靶向其表面上具有葉酸鹽受體的細(xì)胞(leamon等人，cancerres.2008，68(23)，9839)。出于同樣原因，以下詳細(xì)討論主要根據(jù)1∶1的抗體z∶類似物d比(m＝1)撰寫(xiě)。

優(yōu)選配體z對(duì)腫瘤相關(guān)抗原為抗體，從而允許選擇性靶向癌細(xì)胞。此類抗原的實(shí)例包括間皮素、前列腺特異性膜抗原(psma)、cd19、cd22、cd30、cd70、b7h3、b7h4(也稱為o8e)、蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、rg1、巖藻糖基-gm1、ctla-4和cd44。抗體可以為動(dòng)物(例如，鼠)、嵌合、人源化或優(yōu)選人抗體?？贵w優(yōu)選為單克隆，尤其單克隆人抗體。對(duì)一些前述抗原的人單克隆抗體的制備公開(kāi)于korman等人，us8,609,816b2(2013；b7h4，也稱為08e；具體為抗體2a7，1g11和2f9)；rao-naik等人，8,097,703b2(2012；cd19；具體為抗體5g7，13f1，46e8，21d4，21d4a，47g4，27f3和3c10)；king等人，us8,481,683b2(2013；cd22；具體為抗體12c5，19a3，16f7和23c6)；keler等人，us7,387,776b2(2008；cd30；具體為抗體5f11，2h9和17g1)；terrett等人，us8,124,738b2(2012；cd70；具體為抗體2h5，10b4，8b5，18e7和69a7)；korman等人，us6,984,720b1(2006；ctla-4；具體為抗體10d1，4b6和1e2)；vistica等人，us8,383,118b2(2013，巖藻糖基-gm1，具體為抗體5b1，5b1a，7d4，7e4，13b8和18d5)korman等人，us8,008,449b2(2011；pd-1；具體為抗體17d8，2d3，4h1，5c4，4a11，7d3和5f4)；huang等人，us2009/0297438a1(2009；psma.具體為抗體1c3，2a10，2f5，2c6)；cardarelli等人，us7,875,278b2(2011；psma；具體為抗體4a3，7f12，8c12，8a11，16f9，2a10，2c6，2f5和1c3)；terrett等人，us8,222,375b2(2012；ptk7；具體為抗體3g8，4d5，12c6，12c6a和7c8)；terrett等人，us8,680,247b2(2014；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；具體為抗體4a6，11e7和16d10)；harkins等人，us7,335,748b2(2008；rg1；具體為抗體a，b，c和d)；terrett等人，us8,268,970b2(2012；間皮素；具體為抗體3c10，6a4和7b1)；xu等人，us2010/0092484a1(2010；cd44；具體為抗體14g9.b8.b4，2d1.a3.d12和1a9.a6.b9)；deshpande等人，us8,258,266b2(2012；ip10；具體為抗體1d4，1e1，2g1，3c4，6a5，6a8，7c10，8f6，10a12，10a12s和13c4)；kuhne等人，us8,450,464b2(2013；cxcr4；具體為抗體f7，f9，d1和e2)；和korman等人，us7,943,743b2(2011；pd-l1；具體為抗體3g10，12a4，10a5，5f8，10h10，1b12，7h1，11e6，12b7和13g4)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。各前述抗體可與本發(fā)明的二聚體用于adc中。

配體z也可以為抗體或抗體模擬物的抗原結(jié)合片段，例如親和抗體(affibody)、域抗體(dab)、納米抗體、單抗體(unibody)、darpin、anticalin、versabody、duocalin、脂籠蛋白(lipocalin)或avimer。

配體z上數(shù)個(gè)不同反應(yīng)性基團(tuán)中的任一個(gè)可以為綴合部位，包括賴氨酸殘基上的ε-氨基、懸垂糖類部分、羧酸基團(tuán)、二硫基和硫醇基。各類型反應(yīng)性基團(tuán)表現(xiàn)一種平衡，有一些優(yōu)點(diǎn)，也有一些缺點(diǎn)。關(guān)于適用于綴合的抗體反應(yīng)性基團(tuán)的綜述，見(jiàn)例如garnett，adv.drugdeliveryrev.53(2001)，171-216，與dubowchik和walker，pharmacology&therapeutics83(1999)，67-123，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，配體z通過(guò)賴氨酸ε-氨基綴合。大多數(shù)抗體具有多個(gè)賴氨酸ε-氨基，可用在本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過(guò)酰胺、脲、硫脲或氨基甲酸酯鍵綴合。然而，難以控制哪個(gè)ε-氨基反應(yīng)和有多少ε-氨基反應(yīng)，導(dǎo)致在綴合物制備中批與批的潛在可變性。綴合也可導(dǎo)致對(duì)保持抗體天然構(gòu)象重要的質(zhì)子化ε-氨基的中和，或者可在接近配體或抗原結(jié)合部位或在該部位的賴氨酸發(fā)生，這些都不是希望的情況。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于很多抗體糖基化，配體z可通過(guò)糖側(cè)鏈綴合。糖側(cè)鏈可用高碘酸鹽氧化產(chǎn)生醛基，它又可與胺反應(yīng)形成亞胺基，例如，在縮氨基脲、肟或腙中。如果需要，亞胺基可通過(guò)用nacnbh3還原轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定胺基。關(guān)于通過(guò)糖側(cè)鏈綴合的另外的公開(kāi)內(nèi)容，見(jiàn)例如rodwell等人，proc.nat’lacad.sci.usa83，2632-2636(1986)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。與賴氨酸ε-氨基一樣，有關(guān)于綴合部位位置和化學(xué)計(jì)量再現(xiàn)性的問(wèn)題。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，配體z可通過(guò)羧酸基團(tuán)綴合，例如谷氨酸或天冬氨酸的側(cè)鏈羧基。在一個(gè)實(shí)施方案中，使末端羧酸基團(tuán)官能化，以產(chǎn)生碳酰肼，碳酰肼然后與攜帶醛的綴合部分反應(yīng)。見(jiàn)fisch等人，bioconjugatechemistry1992，3，147-153。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體z可通過(guò)二硫基綴合，二硫基橋連抗體z上的半胱氨酸殘基和綴合物另一部分上的硫。一些抗體缺乏游離硫醇(硫氫)基，但具有二硫基，例如，在鉸鏈區(qū)。在這種情況下，可通過(guò)還原天然二硫基產(chǎn)生游離硫醇基。如此產(chǎn)生的硫醇基然后可用于綴合。見(jiàn)，例如packard等人，biochemistry1986，25，3548-3552；king等人，cancerres.54，6176-6185(1994)；和doronina等人，naturebiotechnol.21(7)，778-784(2003)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。同樣，也有關(guān)于綴合部位位置和化學(xué)計(jì)量及抗體天然構(gòu)象可能破壞的問(wèn)題。

已知一些方法將游離硫醇基引入抗體，而不破壞天然二硫鍵，這種方法可用本發(fā)明的配體z實(shí)施。根據(jù)所用方法，可在預(yù)定位置引入可預(yù)測(cè)數(shù)量的游離硫氫基。在一種方法中，制備突變的抗體，其中半胱氨酸被另一種氨基酸代替。見(jiàn)，例如，eigenbrot等人，us7,521,541b2(2009)；chilkoti等人，bioconjugatechem.1994，5，504-507；urnovitz等人，us4,698,420(1987)；stimmel等人，j.biol.chem.，275(39)，30445-30450(2000)；bam等人，us7,311,902b2(2007)；kuan等人，j.biol.chem.，269(10)，7610-7618(1994)；poon等人，j.biol.chem.，270(15)，8571-8577(1995)。在另一種方法中，將額外半胱氨酸加到c-末端。見(jiàn)，例如cumber等人，j.immunol.，149，120-126(1992)；kingetal，cancerres.，54，6176-6185(1994)；li等人，bioconjugatechem.，13，985-995(2002)；yang等人，proteinengineering，16，761-770(2003)；和olafson等人，proteinengineeringdesign&selection，17，21-27(2004)。引入游離半胱氨酸的一種優(yōu)選方法為liu等人，8,865,875b2(2014)教導(dǎo)的方法，其中將攜帶半胱氨酸的氨基酸序列加到抗體重鏈的c-末端。這種方法在遠(yuǎn)離抗原結(jié)合部位的已知位置引入已知數(shù)量的半胱氨酸殘基(1個(gè)/重鏈)。在本段落中引用文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容均通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可用試劑使賴氨酸ε-氨基修飾，例如2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷、2-亞氨基硫雜環(huán)己烷或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸n-琥珀酰亞胺酯(spdp)，從而使ε-氨基轉(zhuǎn)化成硫醇基或二硫基，在某種程度上產(chǎn)生半胱氨酸代替物。然而，這種方法受相同綴合位置和與合適ε-氨基有相關(guān)的化學(xué)計(jì)量限制。

連接體組分

如上提到，本發(fā)明的綴合物的連接體部分包含最多三個(gè)要素：可裂解基團(tuán)c和任選的間隔基x^z和x^d。

可裂解基團(tuán)c為在生理?xiàng)l件下可裂解的基團(tuán)，優(yōu)選選擇條件使其相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)綴合物處于血漿體循環(huán)中，但一旦綴合物達(dá)到其預(yù)期作用部位，即，接近靶細(xì)胞、在其上或處于其內(nèi)，就容易地裂解。優(yōu)選在抗體z結(jié)合到靶細(xì)胞表面上顯示的抗原時(shí)，綴合物通過(guò)靶細(xì)胞內(nèi)化。隨后，在靶細(xì)胞的囊泡體(早期細(xì)胞內(nèi)體、晚期細(xì)胞內(nèi)體或尤其溶酶體)中發(fā)生基團(tuán)c裂解。

在一個(gè)實(shí)施方案中，基團(tuán)c為ph敏感基團(tuán)。血漿中的ph略高于中性，而溶酶體內(nèi)的ph為酸性，約為5。因此，其裂解被酸催化的基團(tuán)c在溶酶體內(nèi)以比在血漿中快數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)的速率裂解。適合酸敏感性基團(tuán)的實(shí)例包括順-烏頭?；０泛碗?，例如描述于shen等人，us4,631,190(1986)；shen等人，us5,144,011(1992)；shen等人，biochem.biophys.res.commun.102，1048-1054(1981)和yang等人，proc.natlacad.sci(usa)，85，1189-1193(1988)；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，基團(tuán)c為二硫化物。二硫化物可通過(guò)硫醇-二硫化物交換機(jī)制以取決于環(huán)境硫醇濃度的速率裂解。由于谷胱甘肽和其它硫醇的胞內(nèi)濃度高于其血清濃度，二硫化物的裂解速率在胞內(nèi)更高。另外，通過(guò)調(diào)節(jié)二硫化物的空間和電子性質(zhì)(例如，烷基-芳基二硫化物與烷基-烷基二硫化物、芳基環(huán)上的取代等)，可調(diào)節(jié)硫醇-二硫化物交換速率，使得能夠設(shè)計(jì)具有提高血清穩(wěn)定性或特定裂解速率的二硫鍵。關(guān)于涉及綴合物中二硫可裂解基團(tuán)的另外的公開(kāi)內(nèi)容，見(jiàn)例如thorpe等人，cancerres.48，6396-6403(1988)；santi等人，us7,541,530b2(2009)；ng等人，us6,989,452b2(2006)；ng等人，wo2002/096910a1；boyd等人，us7,691,962b2；和sufi等人，us2010/0145036a1；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

與血清中的蛋白酶相反，優(yōu)選可裂解基團(tuán)為由靶細(xì)胞內(nèi)蛋白酶選擇性裂解的肽。一般可裂解肽基團(tuán)包含1至20個(gè)氨基酸，優(yōu)選1至6個(gè)氨基酸，更優(yōu)選1至3個(gè)氨基酸。氨基酸可以為天然和/或非天然α-氨基酸。天然氨基酸為由基因密碼編碼的氨基酸和由其衍生的氨基酸，例如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸和o-磷酸絲氨酸。就此而論，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”也包括氨基酸類似物和模擬物。類似物為具有天然氨基酸的相同一般h2n(r)chco2h結(jié)構(gòu)的化合物，不同之處在于r基團(tuán)不是在天然氨基酸中發(fā)現(xiàn)的。類似物的實(shí)例包括高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸-亞砜和蛋氨酸甲基硫鎓。氨基酸模擬物為具有不同于α-氨基酸一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)但以類似方式作用的化合物。該氨基酸可以為基因編碼氨基酸的“l(fā)”立體化學(xué)和對(duì)映異構(gòu)“d”立體化學(xué)。

優(yōu)選基團(tuán)c包含為蛋白酶的裂解識(shí)別序列的氨基酸序列。很多裂解識(shí)別序列在本領(lǐng)域熟知。見(jiàn)，例如matayoshi等人，science247：954(1990)；dunn等人，meth.enzymol.241：254(1994)；seidah等人，meth.enzymol.244：175(1994)；thornberry，meth.enzymol.244：615(1994)；weber等人，meth.enzymol.244：595(1994)；smith等人，meth.enzymol.244：412(1994)；和bouvier等人，meth.enzymol.248：614(1995)；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

對(duì)于不旨在由細(xì)胞內(nèi)化的綴合物，可選擇基團(tuán)c，使其被靶組織附近胞外基質(zhì)中存在的蛋白酶裂解，例如，由附近臨終細(xì)胞釋放的蛋白酶或腫瘤相關(guān)的蛋白酶。示例性胞外腫瘤相關(guān)的蛋白酶為基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)、甲拌磷寡肽酶(top)和cd10。

對(duì)于旨在由細(xì)胞內(nèi)化的綴合物，基團(tuán)c優(yōu)選包含為了由內(nèi)體或溶酶體蛋白酶(尤其后者)裂解而選擇的氨基酸序列。此類蛋白酶的非限制實(shí)例包括組織蛋白酶b、c、d、h、l和s，尤其組織蛋白酶b。組織蛋白酶b優(yōu)先裂解在序列-aa²-aa¹-的肽，其中aa¹為堿性或強(qiáng)氫鍵合氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸或瓜氨酸)，aa²為疏水氨基酸(例如，苯丙氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)，例如val-cit(其中cit表示瓜氨酸)或val-lys。(在本文中，除非上下文另外清楚地指明，氨基酸序列以n-至-c方向書(shū)寫(xiě)，如在h2n-aa²-aa¹-co2h中)。lys-val-ala、asp-val-ala、val-ala、lys-val-cit和asp-val-cit也是用于組織蛋白酶b的底物肽基序，雖然在一些情況下，裂解速率可能較慢。關(guān)于組織蛋白酶-可裂解基團(tuán)的另外的資料，見(jiàn)dubowchik等人，biorg.med.chem.lett.8，3341-3346(1998)；dubowchik等人，bioorg.med.chem.lett.，83347-3352(1998)；和dubowchik等人，bioconjugatechem.13，855-869(2002)；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本公開(kāi)?？捎糜诹呀怆幕B接體的另一種酶為豆莢蛋白(legumain)，一種優(yōu)先在ala-ala-asn裂解的溶酶體半胱氨酸蛋白酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，基團(tuán)c為包含二氨基酸序列-aa²-aa¹-的肽，其中aa¹為賴氨酸、精氨酸或瓜氨酸，aa²為苯丙氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，c由選自val-cit、ala-val、val-ala-val、lys-lys、ala-asn-val、val-leu-lys、cit-cit、val-lys、ala-ala-asn、lys、cit、ser和glu的1至3個(gè)氨基酸的序列組成。

制備和設(shè)計(jì)由單一氨基酸組成的可裂解基團(tuán)c公開(kāi)于chen等人，us8,664,407b2(2014)；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

基團(tuán)c也可以為光可裂解基團(tuán)，例如在曝露于光時(shí)裂解的硝基芐基醚。

基團(tuán)c可直接結(jié)合到抗體z或類似物d，即，可視情況不存在間隔基x^z和x^d。例如，如果基團(tuán)c為二硫化物，則兩個(gè)硫之一可以為半胱氨酸殘基或在抗體z上的代替物?；蛘撸鶊F(tuán)c可以為結(jié)合到抗體糖側(cè)鏈上的醛的腙?；蛘撸鶊F(tuán)c可以為與抗體z的賴氨酸ε-氨基形成的肽鍵。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，二聚體d通過(guò)到二聚體d中羧基或胺基的肽基鍵直接結(jié)合到基團(tuán)c。

存在時(shí)，間隔基x^z在基團(tuán)c和抗體z之間提供空間隔離，以免前者空間干擾后者抗原結(jié)合，或者后者空間干擾前者裂解?？蛇M(jìn)一步用間隔基x^z給予綴合物增加的溶解性或減小的聚集性。間隔基x^z可包含一個(gè)或多個(gè)可以任何幾種組合裝配的模塊片段。用于間隔基x^z的適合片段的實(shí)例為：

及其組合，

其中下標(biāo)g為0或1，下標(biāo)h為1至24，優(yōu)選2至4。這些片段可組合，如下所示：

存在時(shí)，間隔基x^d在基團(tuán)c和二聚體d之間提供空間隔離，以免后者空間或電子干擾前者裂解。間隔基x^d也可用于將另外的分子質(zhì)量和化學(xué)官能引入綴合物。一般另外的質(zhì)量和官能會(huì)影響綴合物的血清半衰期和其它性質(zhì)。因此，通過(guò)合理選擇間隔基，可調(diào)節(jié)綴合物的血清半衰期。間隔基x^d也可從模塊片段裝配，如以上間隔基x^z上下文中所述。

存在時(shí)，間隔基x^z和/或x^d分別在z和c或d和c之間優(yōu)選提供4至25個(gè)原子的線性隔離，更優(yōu)選4至20個(gè)原子。

除了共價(jià)連接抗體和藥物外，連接體也可完成其它功能。例如，連接體可包含聚(乙二醇)(peg)基團(tuán)，該基團(tuán)提高綴合化學(xué)進(jìn)行期間或在最終adc產(chǎn)物中的溶解性。存在peg基團(tuán)時(shí)，它可結(jié)合到間隔基x^z或x^d或二者。peg基團(tuán)中的重復(fù)單元數(shù)可以為2至20，優(yōu)選在4和10之間。

間隔基x^z或x^d或二者可包含自分解部分。自分解部分為這樣一種部分，該部分(1)結(jié)合到基團(tuán)c和抗體z或二聚體d，并且(2)具有一種結(jié)構(gòu)使從基團(tuán)c裂解引發(fā)反應(yīng)序列，視情況而使自分解部分自身與抗體z或二聚體d斷鍵。換句話講，在遠(yuǎn)離抗體z或二聚體d的部位反應(yīng)(從基團(tuán)c裂解)也使x^z-z或x^d-d鍵斷裂。在間隔基x^d的情況下，存在自分解部分合乎需要，因?yàn)槿绻诰Y合物裂解后，間隔基x^d或其部分若保持連接到二聚體d，后者的生物活性就可能被削弱。在可裂解基團(tuán)c為多肽時(shí)，使用自分解部分尤其合乎需要，在此情況下，自分解部分一般位于附近。

結(jié)合到配偶分子d上的羥基或氨基的示例性自分解部分(i)-(vii)顯示如下：

自分解部分為虛線a和b(或虛線b和c)之間的結(jié)構(gòu)，且具有顯示提供背景的相鄰結(jié)構(gòu)特征。自分解部分(i)和(v)結(jié)合到二聚體d-nh2(即，二聚體d通過(guò)氨基綴合)，而自分解部分(ii)、(iii)和(iv)結(jié)合到二聚體d-oh(即，二聚體d通過(guò)羥基或羧基綴合)。在虛線b酰胺鍵裂解(例如，通過(guò)肽酶)釋放酰胺氮作為胺氮，引發(fā)反應(yīng)序列，反應(yīng)序列導(dǎo)致在虛線a鍵裂解，隨之可視情況釋放d-oh或d-nh2?；蛘?，觸發(fā)自分解反應(yīng)的裂解可通過(guò)不同類型酶，例如通過(guò)β-葡糖醛酸糖苷酶，如在結(jié)構(gòu)(vi)的情況下。在某些情況下，可串聯(lián)使用自分解基團(tuán)，如結(jié)構(gòu)(vii)所示。在此情況下，在虛線c裂解通過(guò)1，6-消除反應(yīng)觸發(fā)虛線b和c之間部分的自分解，隨后通過(guò)環(huán)化-消除反應(yīng)進(jìn)行虛線a和b之間部分的自分解。關(guān)于自分解部分的另外的公開(kāi)內(nèi)容，見(jiàn)carl等人，j.med.chem.，24(3)，479-480(1981)；carl等人，wo81/01145(1981)；dubowchik等人，pharmacology&therapeutics，83，67-123(1999)；firestone等人，us6,214,345b1(2001)；toki等人，j.org.chem.67，1866-1872(2002)；doronina等人，naturebiotechnology21(7)，778-784(2003)(erratum，p.941)；boyd等人，us7,691,962b2；boyd等人，us2008/0279868a1；sufi等人，wo2008/083312a2；feng，us7,375,078b2；jeffrey等人，us8039,273；和senter等人，us2003/0096743a1；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。優(yōu)選的自分解基團(tuán)為對(duì)氨基芐基氧基羰基(pabc)，如結(jié)構(gòu)(i)中所示。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體靶向部分和二聚體d通過(guò)不可裂解連接體連接，即，不存在要素c?？贵w降解最終使連接體減小到不干擾二聚體d生物活性的小的附加部分。

綴合技術(shù)

本發(fā)明的綴合物優(yōu)選通過(guò)以下制成：首先制備包含本發(fā)明的類似物(由下式中d表示)和連接體(x^d)a(c)c(x^z)b(其中x^d、c、x^z、a、b和c如關(guān)于式(ii)所限定)的化合物，以生成由式(iii)表示的類似物-連接體組成：

d-(x^d)a(c)c(x^z)b-r³¹(iii)

其中r³¹為適合與抗體z上互補(bǔ)官能團(tuán)反應(yīng)形成綴合物的官能團(tuán)。適合基團(tuán)r³¹的實(shí)例包括氨基、疊氮、硫醇、環(huán)辛炔、

其中r³²為cl、br、f、甲磺酸基或甲苯磺酸基，r³³為cl、br、i、f、oh、-o-n-琥珀酰亞胺基、-o-(4-硝基苯基)、-o-五氟苯基或-o-四氟苯基。一般適用于制備適合部分d-(x^d)ac(x^z)b-r³¹的化學(xué)反應(yīng)公開(kāi)于ng等人，us7,087,600b2(2006)；ng等人，us6,989,452b2(2006)；ng等人，us7,129,261b2(2006)；ng等人，wo02/096910a1；boyd等人，us7,691,962b2；chen等人，us7,517,903b2(2009)；gangwar等人，us7,714,016b2(2010)；boyd等人，us2008/0279868a1；gangwar等人，us7,847,105b2(2010)；gangwar等人，us7,968,586b2(2011)；sufi等人，us2010/0145036a1；和chen等人，us2010/0113476a1；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

優(yōu)選反應(yīng)性官能團(tuán)-r³¹為-nh2、-oh、-co2h、-sh、馬來(lái)酰亞胺基、環(huán)辛炔、疊氮基(-n3)、羥氨基(-onh2)或n-羥基琥珀酰亞胺基。尤其優(yōu)選的官能團(tuán)-r³¹為：

-oh基團(tuán)可用抗體上的羧基酯化，例如，天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈上。

-co2h基團(tuán)可用-oh基酯化，或者用抗體上(例如，賴氨酸側(cè)鏈上)的氨基酰胺化。

n-羥基琥珀酰亞胺基在官能上為活化的羧基，并且可簡(jiǎn)便地通過(guò)與氨基(例如，來(lái)自賴氨酸)反應(yīng)酰胺化。

在邁克爾加成反應(yīng)中，馬來(lái)酰亞胺基可與抗體上的-sh基(例如，來(lái)自半胱氨酸或來(lái)自抗體化學(xué)修飾引入硫氫基官能)綴合?；蛘?，兩個(gè)基團(tuán)的位置可以反向，抗體修飾為具有連接的馬來(lái)酰亞胺基，藥物-連接體化合物具有-sh基。

多種技術(shù)可將-sh基引入抗體。在一種優(yōu)選的技術(shù)中，抗體中賴氨酸殘基側(cè)鏈中的ε-氨基與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷反應(yīng)，以引入游離硫醇(-sh)基。為了實(shí)現(xiàn)綴合，硫醇基可與馬來(lái)酰亞胺或其它親核受體基團(tuán)反應(yīng)：

一般達(dá)到每抗體2至3個(gè)硫醇的硫醇化水平。關(guān)于代表性方法，見(jiàn)cong等人，2014，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于綴合到本發(fā)明的二聚體的抗體具有一個(gè)或多個(gè)通過(guò)與亞氨基硫雜環(huán)戊烷反應(yīng)修飾的賴氨酸殘基(優(yōu)選2至3個(gè))。

在作為上述的“鏡像”的邁克爾加成反應(yīng)中，基團(tuán)-sh也可用于綴合，其中抗體已修飾，向其引入馬來(lái)酰亞胺基。利用4-(馬來(lái)酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷甲酸n-琥珀酰亞胺酯(smcc)或其磺化變體磺基-smcc，兩種試劑均購(gòu)自sigma-aldrich，可使抗體修飾為具有馬來(lái)酰亞胺基。

一種供選綴合技術(shù)利用無(wú)銅“點(diǎn)擊化學(xué)”，其中跨環(huán)辛炔的受張力的炔鍵加疊氮基，以生成1，2，3-三唑環(huán)。見(jiàn)例如，agard等人，j.amer.chem.soc.2004，126，15046；best，biochemistry2009，48，6571，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。疊氮化物可位于抗體上，而環(huán)辛炔位于藥物部分上，或者反之亦然。優(yōu)選的環(huán)辛炔基團(tuán)為二苯并環(huán)辛炔(dibo)。具有dibo基團(tuán)的各種試劑可得自invitrogen/molecularprobes，eugene，oregon。以下反應(yīng)顯示其中dibo基團(tuán)連接到抗體(ab)的情況的點(diǎn)擊化學(xué)綴合：

另一種綴合技術(shù)包括將非天然氨基酸引入抗體，非天然氨基酸提供與藥物部分中反應(yīng)性官能團(tuán)綴合的官能。例如，非天然氨基酸對(duì)乙?；奖彼峥山Y(jié)合到抗體或其它多肽，如tian等人，wo2008/030612a2(2008)中所教導(dǎo)。通過(guò)與連接體-藥物部分上的羥氨基生成肟，對(duì)乙?；奖彼嶂械耐梢詾榫Y合部位?；蛘?，可使非天然氨基酸對(duì)疊氮基苯丙氨酸結(jié)合到抗體，以提供用于通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)綴合的疊氮官能團(tuán)，如上討論。使用無(wú)細(xì)胞方法，非天然氨基酸也可結(jié)合到抗體或其它多肽，如goerke等人，us2010/0093024a1(2010)和goerke等人，biotechnol.bioeng.2009，102(2)，400-416中所教導(dǎo)。前述公開(kāi)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于與本發(fā)明的二聚體制備綴合物的抗體具有一個(gè)或多個(gè)由非天然氨基酸代替的氨基酸，優(yōu)選為對(duì)乙?；奖彼峄?qū)ΟB氮基苯丙氨酸，更優(yōu)選對(duì)乙?；奖彼帷?/p>

根據(jù)jeger等人，angew.chem.int.ed.2010，49，9995(“jeger”)，其它綴合技術(shù)使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(優(yōu)選細(xì)菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或btg)。btg在谷氨酰胺的側(cè)鏈酰胺(胺受體)和亞烷基氨基(胺給體)之間形成酰胺鍵，可例如為賴氨酸或5-氨基-正戊基的ε-氨基。在一種典型綴合反應(yīng)中，谷氨酰胺殘基位于抗體上，而亞烷基氨基位于連接體-藥物部分上，如下所示：

多肽鏈上谷氨酰胺殘基的定位對(duì)其對(duì)btg介導(dǎo)轉(zhuǎn)酰氨基作用的敏感性具有大的影響?？贵w上的谷氨酰胺殘基正常都不是btg底物。然而，jeger披露，如果抗體去糖基化，糖基化部位為天冬酰胺297(n297)，則附近的谷氨酰胺295(q295)去保護(hù)并呈現(xiàn)btg反應(yīng)性?？贵w可通過(guò)用pngasef(肽-n-糖苷酶f)處理酶催去糖基化?；蛘撸ㄟ^(guò)在不變區(qū)引入n297a突變以去除n297糖基化部位，可無(wú)糖苷合成抗體。jeger披露，在抗體中n297q取代不僅排除糖基化，而且引入第二谷氨酰胺殘基(在297位)，那也是胺受體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，使綴合到本發(fā)明的二聚體的抗體去糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體具有n297q取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，通過(guò)合成后修飾或通過(guò)引入n297a突變?nèi)ヌ腔a(chǎn)生每抗體2個(gè)btg反應(yīng)性谷氨酰胺殘基(1個(gè)/重鏈，在295位)，而具有n297q取代的抗體具有4個(gè)btg反應(yīng)性谷氨酰胺殘基(2個(gè)/重鏈，在295和297位)。(抗體中氨基酸位置的編號(hào)根據(jù)eu索引，如闡述于kabat等人，″sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(有免疫意義的蛋白序列)，第5版，pub.no.91-3242，u.s.dept.health&humanservices，nih，bethesda，md.，1991；以后稱為“kabat”)。

綴合也可用分選酶a實(shí)現(xiàn)，如教導(dǎo)于levary等人，plosone2011，6(4)，e18342；proft，biotechnol.lett.2010，32，1-10；ploegh等人，wo2010/087994a2(2010)；和mao等人，wo2005/051976a2(2005)。分選酶a識(shí)別基序(一般為lpxtg，其中x為任何天然氨基酸)可位于配體z上，親核受體基序(一般為ggg)可以為式(iii)中的基團(tuán)r³¹，或者反之亦然。

通過(guò)修飾其糖基以引入酮基，酮基由生成肟作為綴合部位，抗體也可適用于綴合，如zhu等人，mabs2014，6，1所教導(dǎo)。在另一種糖工程變化中，可修飾抗體的糖基，以引入疊氮基，用于通過(guò)“點(diǎn)擊化學(xué)”綴合。見(jiàn)huang等人，j.am.chem.soc.2012，134，12308和wang，us8,900,826b2(2014)和us7,807,405b2(2010)。

另一種綴合技術(shù)一般可稱為二硫化物橋連：抗體中的二硫鍵裂解，產(chǎn)生一對(duì)硫醇(-sh)基?？贵w然后用包含兩個(gè)硫醇反應(yīng)性部位的藥物-連接體化合物處理。硫醇基與兩個(gè)部位反應(yīng)實(shí)現(xiàn)再橋連，再橋連以一種方式再產(chǎn)生初始二硫橋，由此保持抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)，并連接藥物-連接體部分。見(jiàn)例如burt等人，wo2013/190292a2(2013)和jackson等人，us2013/0224228a1(2013)。

二聚體-連接體化合物

一般地，本發(fā)明的二聚體的adc包括連接到二聚體上官能團(tuán)的連接體，該連接體結(jié)合到抗體?？紤]到可利用的綴合技術(shù)的多樣性，本發(fā)明的二聚體可精細(xì)分成適用于綴合到抗體的很多不同二聚體-連接體化合物。

一般有三種不同模式用于連接體結(jié)合到本發(fā)明的二聚體，如下圖中所示(為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，環(huán)中的變量和任選取代基未顯示)：

在類型(a)二聚體-連接體化合物中，用于連接連接體的官能團(tuán)位于兩個(gè)二聚體半部之間的橋x中。在類型(b)二聚體-連接體化合物中，連接體作為跨亞胺雙鍵的加成產(chǎn)物連接。在類型(c)和(c’)二聚體-連接體化合物中，用于連接體的連接的官能團(tuán)位于thiq、azi或pbd的“外側(cè)”環(huán)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，類型(a)二聚體-連接體化合物可由式(iiia)表示：

其中

t為自分解基團(tuán)；

t為0或1；

aa^a和各aa^b獨(dú)立選自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；

u為0或1；

p為1、2、3或4；

q為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(優(yōu)選2、3、4或8)；

r為1、2、3、4或5；

s為0或1；

r³¹為

x⁴為s-s、o或nh；和

r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、g、y和雙線如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

根據(jù)式(iiia)的一種優(yōu)選類型(a)二聚體-連接體化合物由式(iiia’)表示：

其中

x⁴、t、t、aa^a、aa^b、p、q、r、s和r³¹如關(guān)于式(iiia)所限定；

各r⁹獨(dú)立為h、c1-c3烷基、o(ch2ch2o)1-4h、(ch2ch2o)1-4(c1-c3烷基)、oh、cl、f或br；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；并且

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在。

優(yōu)選在式(iiia)和(iiia’)中，r⁹為h，并且x⁴為nh。

在一個(gè)實(shí)施方案中，類型(b)二聚體-連接體化合物可由式(iiib)表示：

其中

t、t、aa^a、aa^b、u、p、q、s、r和r³如關(guān)于式(iiia)所限定；并且

x、r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、x²、y和g如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

根據(jù)式(iiib)的一種優(yōu)選類型(b)二聚體-連接體由式(iiib’)表示：

即，式(iiib’)與式(iiib)的不同之處在于下標(biāo)u為1，且x為

根據(jù)式(iiib)的另一種優(yōu)選類型(b)二聚體-連接體由式(iiib”)表示：

其中

t、t、aa^a、aa^b、p、q、r、s和r³¹如關(guān)于式(iiia)所限定；

各r⁹獨(dú)立為h、c1-c3烷基、o(ch2ch2o)1-4h、(ch2ch2o)1-4(c1-c3烷基)、oh、cl、f或br；

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；并且

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在。

優(yōu)選在式(iiib”)中，r⁹為h，并且x³為h。

優(yōu)選在式(iiib”)中，部分

為

類型(b)二聚體-連接體化合物的實(shí)例包括：

及

在一個(gè)實(shí)施方案中，類型(c)二聚體-連接體化合物可由式(iiic)表示：

其中

t、t、aa^a、aa^b、u、p、q、s、r和r³¹如關(guān)于式(iiia)所限定；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、y、x²和雙線如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

根據(jù)式(iiic)的一種優(yōu)選類型(c)二聚體-連接體化合物由式(iiic’)表示：

即，式(iiic’)與式(iiic)的不同之處在于下標(biāo)u為1，且x為

根據(jù)式(iiic)的另一種優(yōu)選類型(c)二聚體-連接體化合物由式(iiic”)表示：

其中

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；

二氮雜環(huán)系統(tǒng)中的雙線至少之一為雙鍵；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在；并且

r⁹為h、o(ch2ch2o)1-4h、(ch2ch2o)1-4(c1-c3烷基)、oh、cl、f或br。

優(yōu)選在式(iiic”)中，r⁹為h，并且x³為h。

優(yōu)選在式(iiic”)中，部分

為

類型(c)二聚體-連接體化合物的實(shí)例包括：

類型(c’)二聚體-連接體優(yōu)選符合式(iiic”’)：

其中

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；

t、t、aa^a、aa^b、u、p、q、s、r和r³如關(guān)于式(iiia)所限定；并且

各r⁵⁰獨(dú)立為h、o(c1-c3烷基)、o(c2-c3亞烷基)、o(c2-c3炔基)、f、cl、br或cn。

在其中下標(biāo)t和u二者均為0的式(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiic”’)中，連接體為不可裂解類型，如上討論。

式(iiia)、(iiia’)、(iiia”)、(iiib)、(iiib’)、(iiib”)、(iiic)、(iiic’)、(iiic”)和(iiic”’)中的r³¹為能夠與抗體上互補(bǔ)官能團(tuán)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)綴合的反應(yīng)性官能團(tuán)，如上所述。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式(iiia)、(iiia’)、(iiib)、(iiib’)、(iiib”)、(iiic)、(iiic”)、(iiic’)或(iiic”’)中，基團(tuán)r³¹為

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式(iiia)、(iiia’)、(iiia”)、(iiib)、(iiib’)、(iiib”)、(iiic)、(iiic’)或(iiic”’)中，基團(tuán)r³¹為

在式(iiia)、(iiia’)、(iiia”)、(iiib)、(iiib’)、(iiib”)、(iiic)、(iiic’)、(iiic”)和(iiic”’)中，-aa^a-[aa^b]p-表示其長(zhǎng)度由p值決定的多肽(如果p為1，為二肽，如果p為3，為四肽，等等)。aa^a在多肽的羧基端，其羧基與二聚體的胺氮(或者自分解基團(tuán)t，如果存在)形成肽(酰胺)鍵。相反，最后aa^b在多肽的氨基端，并且其α-氨基分別與形成肽鍵，

這取決于s為0還是1。優(yōu)選的多肽-aa^a-[aa^b]p-為val-cit、val-lys、lys-val-ala、asp-val-ala、val-ala、lys-val-cit、ala-val-cit、val-gly、val-gln和asp-val-cit，以常規(guī)n-至-c方向書(shū)寫(xiě)，如在h2n-val-cit-co2h中。更優(yōu)選多肽為val-cit、val-lys或val-ala。優(yōu)選多肽-aa^a-[aa^b]p-可通過(guò)在靶(癌)細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的酶裂解，例如組織蛋白酶，尤其組織蛋白酶b。

如下標(biāo)t等于0或1所示，任選在式(iiia)、(iiia’)、(iiia”)、(iiib)、(iiib’)、(iiib”)、(iiic)、(iiic’)和(iiic”)的二聚體-連接體化合物中存在自分解基團(tuán)t。存在時(shí)，自分解基團(tuán)t優(yōu)選為對(duì)氨基芐基氧基羰基(pabc)，其結(jié)構(gòu)以下顯示，星號(hào)(*)表示結(jié)合到二聚體的胺氮的pabc的末端，波形線表示結(jié)合到多肽-aa^a-[aa^b]p-的末端。

制備綴合物

該通用方法基于通過(guò)賴氨酸ε-氨基與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷反應(yīng)使游離硫醇基引入抗體，隨后與含馬來(lái)酰亞胺的藥物-連接體部分反應(yīng)，如上所述。最初，使抗體緩沖交換進(jìn)入含50mmnacl和2mm二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)的0.1m磷酸鹽緩沖液(ph8.0)，并濃縮到5-10mg/ml。通過(guò)2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷加到抗體實(shí)現(xiàn)硫醇化。要加的2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷的量可通過(guò)初步試驗(yàn)確定，并因抗體而異。在初步試驗(yàn)中，2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷增量滴定加到抗體，并在rt(室溫，約25℃)用抗體培養(yǎng)1h后，用sephadex^tmg-25柱使抗體脫鹽進(jìn)入50mmhepes、5mm甘氨酸、2mmdtpa，ph5.5，通過(guò)與二硫二吡啶(dtdp)反應(yīng)快速確定引入的硫醇基數(shù)。硫醇基與dtdp反應(yīng)引起釋放巰基吡啶，可在324nm光譜監(jiān)測(cè)。一般使用0.5-1.0mg/ml蛋白濃度的樣品?？捎迷?80nm的吸光度精確測(cè)定樣品中蛋白的濃度，然后將各樣品的等分試樣(0.9ml)用0.1mldtdp(5mm在乙醇中的儲(chǔ)備溶液)在rt培養(yǎng)10min。也在旁培養(yǎng)單獨(dú)緩沖液加上dtdp的空白樣品。10min后，測(cè)定在324nm的吸光度，并用關(guān)于19,800m^-1巰基吡啶的消光系數(shù)對(duì)硫醇基數(shù)目定量。

一般每抗體約2至3個(gè)硫醇基的硫醇化水平合乎需要。例如，可利用一些抗體，通過(guò)加入15倍的摩爾過(guò)量2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷，隨后在rt培養(yǎng)1h達(dá)到。然后用2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷以所需摩爾比培養(yǎng)抗體，然后脫鹽進(jìn)入綴合緩沖液(50mmhepes，5mm甘氨酸，2mmdtpa，ph5.5))。在冰上保持硫醇化物質(zhì)，同時(shí)如上所述對(duì)引入的硫醇數(shù)定量。

在驗(yàn)證引入的硫醇數(shù)后，以每硫醇2.5倍的摩爾過(guò)量加入藥物(二聚體)-連接體部分。使綴合反應(yīng)在包含25％丙二醇和5％海藻糖最終濃度的綴合緩沖液中進(jìn)行。一般使藥物-連接體儲(chǔ)備溶液溶于100％dmso。儲(chǔ)備溶液直接加到硫醇化抗體。

在輕輕攪拌下，在rt培養(yǎng)綴合反應(yīng)混合物2h。然后將10倍的摩爾過(guò)量n-乙基馬來(lái)酰亞胺(100mm在dmso中的儲(chǔ)備溶液)加到綴合混合物，并攪拌另外1小時(shí)，以封閉任何未反應(yīng)硫醇。

然后通過(guò)0.2μ濾器過(guò)濾樣品。使物質(zhì)通過(guò)tffvivaflow50sartorius30mwcopes膜緩沖交換進(jìn)入10mg/ml甘氨酸、20mg/ml山梨糖醇、15％乙腈ph5.0(5xtff緩沖交換體積)，以去除任何未反應(yīng)藥物。通過(guò)tff最終配制為20mg/ml山梨糖醇、10mg/ml甘氨酸，ph5.0。

可將以下方法用于二聚體-連接體化合物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)綴合，其中連接體具有可作為胺給體的胺基。抗體可以為具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-反應(yīng)性谷氨酰胺的抗體，例如，具有n297a或n297q取代的抗體。綴合通過(guò)重組細(xì)菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以5∶1抗體∶酶摩爾比進(jìn)行。綴合用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在50mmtris緩沖液ph8.0中進(jìn)行，在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。使得到綴合物在用50mmtris，ph8.0預(yù)平衡的proteina柱上純化。綴合物用0.1m檸檬酸鈉緩沖液ph3.5洗脫。洗脫的級(jí)分用1mtrisph9.0中和。綴合物可在20mg/ml山梨糖醇、10mg/ml甘氨酸ph5.0中配制。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，上述條件和方法為示例性而非限制性，用于綴合的其它方法在本領(lǐng)域已知，并可用于本發(fā)明。

綴合物

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物從類型(a)二聚體-連接體化合物得到，并且可由式(iva)表示：

其中

ab為抗體；

r⁴⁰為

其中結(jié)合到ab的r⁴⁰的開(kāi)放化合價(jià)由星號(hào)(*)表示，結(jié)合到(ch2)r的r⁴⁰的開(kāi)放化合價(jià)由波形線表示；

m為1、2、3或4；

t、t、aa^a、aa^b、u、p、q、s、r和x⁴如關(guān)于式(iiia)所限定；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、y、g和雙線如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

根據(jù)式(iva)的優(yōu)選綴合物由式(iva’)表示：

其中

ab、r⁴⁰、t、t、aa^a、aa^b、p、q、s、r和x⁴如關(guān)于式(iiia)所限定；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在；并且

r⁹為h、oh、ome、nh2、nme2、c1-c3烷基、o(ch2ch2o)1-8me、och2ch2oh、f、cl、br或

(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物從類型(b)二聚體-連接體化合物得到，并且可由式(ivb)表示：

其中

ab、r⁴⁰、m、t、t、aa^a、aa^b、u、p、q、s和r如關(guān)于式(iva)所限定；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、y、g和x如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

根據(jù)式(ivb)的優(yōu)選綴合物由式(ivb’)表示：

其中

t、t、aa^a、aa^b、m、p、q、s、r、r⁴⁰和ab如關(guān)于式(iva)所限定；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰、y、g和x²如關(guān)于式(iva)所限定。

即，綴合物(ivb’)與綴合物(ivb)的不同之處在于下標(biāo)u為1，且x為

根據(jù)式(ivb)的另一種優(yōu)選綴合物具有由式(ivb”)表示的結(jié)構(gòu)：

其中

t、t、aa^a、aa^b、m、p、q、s、r、r⁴⁰和ab如關(guān)于式(iva)所限定；

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在；并且

r⁹為h、oh、ome、nh2、nme2、c1-c3烷基、o(ch2ch2o)1-8me、och2ch2oh、f、br、cl或

(尤其是對(duì)位異構(gòu)體)。

優(yōu)選在式(ivb’)中，r⁹為h，并且x³為h。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物從類型(c)二聚體-連接體化合物得到，并且可由式(ivc)表示：

其中

ab、r⁴⁰、m、t、t、aa^a、aa^b、u、p、q、s和r如關(guān)于式(iva)所限定；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、y、x和雙線如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

根據(jù)式(ivc)的優(yōu)選綴合物由式(ivc’)表示：

其中

ab、r⁴⁰、m、t、t、aa^a、aa^b、p、q、s和r如關(guān)于式(iva)所限定；并且

r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、y、x²和雙線如以上發(fā)明概述部分中關(guān)于式(i)所限定。

即，綴合物(ivc’)與綴合物(ivc)的不同之處在于下標(biāo)u為1，且x為

根據(jù)式(ivc)的另一種優(yōu)選綴合物具有由式(ivc”)表示的結(jié)構(gòu)：

其中

ab、r⁴⁰、m、t、t、aa^a、aa^b、p、q、s和r如關(guān)于式(iva)所限定；

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；

二氮雜環(huán)系統(tǒng)中的雙線至少之一為雙鍵；

如果到與其結(jié)合的n的雙線為單鍵，則r⁵為h，如果雙線為雙鍵，則r⁵不存在；

如果到與其結(jié)合的c的雙線為單鍵，則r⁶為h，如果雙線為雙鍵，則r⁶不存在；并且

r⁹為h、oh、ome、c1-c3烷基、o(ch2ch2o)1-8me、f、cl或br。

優(yōu)選在式(ivc”)中，r⁹為h，并且x³為h。

基于類型(c’)二聚體-連接體的優(yōu)選綴合物符合式(ivc”’)：

其中

ab、r⁴⁰、m、t、t、aa^a、aa^b、p、q、s、u和r如關(guān)于式(iva)所限定；

x³為h、oh、ome、me或ch2oh；并且

各r⁵⁰獨(dú)立為h、o(c1-c3烷基)、o(c2-c3亞烷基)、o(c2-c3炔基)、f、cl、br或cn。

對(duì)于多肽-aa^a-[aa^b]p-和自分解基團(tuán)t，以上關(guān)于式(iiia)、(iiia’)、(iiib)、(iiib’)、(iiib”)、(iiic)、(iiic’)、(iiic”)和(iiic”’)的二聚體連接體陳述的優(yōu)選項(xiàng)也適用于式(iva)、(iva’)、(ivb)、(ivb’)、(ivc)、(ivc’)和(ivc”’)的綴合物。

在式(iva)、(ivb)、(ivc)和(ivc”’)中，如果下標(biāo)t和u二者均為0，則連接體為不可裂解類型，并依賴抗體ab降解釋放藥物。如果存在有利，例如，通過(guò)在綴合期間增加藥物-連接體化合物的溶解度，且不干擾藥物的生物活性，可任選存在聚乙二醇組分(即，s為1)。

藥物組合物

在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含用藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑一起配制的本發(fā)明的化合物或其綴合物。它可任選包含一種或多種另外的藥物活性成分，例如抗體或另一種藥物。藥物組合物可在聯(lián)合治療中與另一種治療劑一起給藥，尤其另一種抗癌劑。

藥物組合物可包含一種或多種賦形劑?？墒褂玫馁x形劑包括載體、表面活性劑、增稠或乳化劑、固體粘合劑、分散或懸浮助劑、增溶劑、著色劑、調(diào)味劑、包衣料、崩解劑、潤(rùn)滑劑、增甜劑、防腐劑、等滲劑及其組合。選擇和使用適合賦形劑教導(dǎo)于gennaro，ed.，remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第20版(lippincottwilliams&wilkins2003、)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

優(yōu)選藥物組合物適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊椎或表皮給藥(例如，通過(guò)注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，活性化合物可在材料中包衣，以保護(hù)化合物不受酸作用和可使其失活的其它自然條件侵害。短語(yǔ)“胃腸外給藥”指除經(jīng)腸和局部給藥以外的通常通過(guò)注射的給藥方式，包括而不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊椎內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注?；蛘撸幬锝M合物可通過(guò)非胃腸外途徑給藥，例如局部、表皮或粘膜給藥途徑，例如鼻內(nèi)、口服、陰道、直腸、舌下或局部。

藥物組合物可以采用無(wú)菌水溶液或分散體形式。它們也可在微乳液、脂質(zhì)體或適用于達(dá)到高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)中配制。組合物也可以凍干物形式提供，例如通過(guò)在給藥前在水中重組。

可與載體材料組合產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量取決于要治療的患者和具體給藥方式，一般為產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，基于100％，該量為約0.01％至約99％活性成分，優(yōu)選約0.1％至約70％，最優(yōu)選約1％至約30％活性成分與藥學(xué)上可接受的載體組合。

調(diào)節(jié)劑量方案，以提供治療響應(yīng)。例如，可給予單一推注，可隨時(shí)間給予數(shù)個(gè)分開(kāi)劑量，或者由情況緊急狀態(tài)而定成比例減小或增加劑量。為了容易給藥和劑量均勻性，尤其有利以劑量單位形式配制胃腸外組合物。“劑量單位形式”指適合作為單一劑量用于要治療患者的物理離散單位，各單位包含計(jì)算產(chǎn)生所需治療響應(yīng)的預(yù)定量活性化合物，與所需的藥物載體結(jié)合。

劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg的主體體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重，1mg/kg體重，3mg/kg體重，5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的范圍內(nèi)，或者0.1至5mg/kg。示例性治療方案是每周施用一次，每?jī)芍芤淮?，每三周一次，每四周一次，每月一次，每三個(gè)月一次，或每三至六個(gè)月一次。優(yōu)選的劑量方案包括通過(guò)靜脈內(nèi)給藥1mg/kg體重或3mg/kg體重，使用以下給藥計(jì)劃之一：(i)每四周給藥，六次劑量，然后每三個(gè)月給藥；(ii)每三周給藥；(iii)給予3mg/kg體重一次，隨后每三周給予1mg/kg體重。在一些方法中，調(diào)整劑量以獲得約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，并且在一些方法中約25-300μg/ml的血漿抗體濃度。

“治療有效量”的本發(fā)明化合物優(yōu)選導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性降低，疾病無(wú)癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加，或預(yù)防由于疾病的痛苦而導(dǎo)致的損傷或殘疾。例如，為了治療帶有腫瘤的患者，“治療有效量”優(yōu)選相對(duì)于未治療的患者抑制腫瘤生長(zhǎng)至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，甚至更優(yōu)選至少約60％，還更優(yōu)選至少約80％。治療有效量的治療性化合物可以降低腫瘤大小，或以其他方式改善患者的癥狀，所述患者通常是人，但可以是另一種哺乳動(dòng)物。

藥物組合物可以是受控或持續(xù)釋放制劑，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。參見(jiàn)例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems，j.r.robinson，ed.，marceldekker，inc.，newyork，1978。

治療組合物可以通過(guò)醫(yī)療器械給予，例如(1)無(wú)針皮下注射器械(例如us5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微型輸液泵(us4,487,603)；(3)透皮器械(us4,486,194)；(4)輸液裝置(us4,447,233和4,447,224)；和(5)滲透器械(us4,439,196和4,475,196)；其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

在某些實(shí)施方案中，可以配制藥物組合物以確保體內(nèi)適當(dāng)分布。例如，為了確保本發(fā)明的治療化合物穿過(guò)血腦屏障，它們可以配制在脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體可另外包含靶向部分以增強(qiáng)向特定細(xì)胞或器官的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)。參見(jiàn)例如us4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29：685；umezawa等人，(1988)biochem.biophys.res.commun.153：1038；bloeman等人，(1995)febslett.357：140；m.owais等人，(1995)antimicrob.agentschemother.39：180；briscoe等人，(1995)am.j.physiol.1233：134；schreier等人，(1994)j.biol.chem.269：9090；keinanen和laukkanen(1994)febslett.346：123；以及killion和fidler(1994)immunomethods4：273。

用途

本發(fā)明的化合物或其綴合物可用于治療疾病，例如但不限于過(guò)度增殖性疾病，包括：頭頸部癌，包括頭、頸、鼻腔、鼻旁竇、鼻咽、口腔、口咽、喉、下咽、唾液腺和副神經(jīng)節(jié)腫瘤；肝臟和膽道癌，特別是肝細(xì)胞癌；腸癌，特別是結(jié)腸直腸癌；卵巢癌；小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌(sclc和nsclc)；乳腺癌肉瘤，如纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、胚胎橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤(leiomysosarcoma)、神經(jīng)纖維肉瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤和泡狀軟組織肉瘤；白血病，如急性早幼粒細(xì)胞白血病(apl)、急性骨髓性白血病(aml)、急性淋巴細(xì)胞白血病(all)和慢性骨髓性白血病(cml)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，特別是腦癌；多發(fā)性骨髓瘤(mm)，淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、b系大細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和t細(xì)胞間變性大細(xì)胞淋巴瘤。臨床上，本文描述的方法的實(shí)踐和組合物的用途將導(dǎo)致癌性生長(zhǎng)的大小或數(shù)量的減少和/或相關(guān)癥狀的減少(如適用)。在病理學(xué)上，本文描述的方法的實(shí)踐和組合物的用途將產(chǎn)生病理相關(guān)的反應(yīng)，例如：抑制癌細(xì)胞增殖，減小癌或腫瘤的大小，預(yù)防進(jìn)一步轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤血管生成。治療這種疾病的方法包括向患者施用治療有效量的本發(fā)明組合?？梢愿鶕?jù)需要重復(fù)該方法。特別是癌癥可以是腎、肺、胃或卵巢癌。

本發(fā)明化合物或其綴合物可與其它治療劑組合給予，其它治療劑包括抗體、烷化劑、血管生成抑制劑、抗代謝物、dna裂解劑、dna交聯(lián)劑、dna嵌合劑、dna小溝結(jié)合劑、烯二炔、熱休克蛋白90抑制劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、微管穩(wěn)定劑、核苷(嘌呤或嘧啶)類似物、核出口抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶(i或ii)抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑。具體的治療劑包括阿達(dá)木單抗、安絲菌素p3、澳瑞他汀(auristatin)、苯達(dá)莫司汀、貝伐珠單抗、比卡魯胺、博來(lái)霉素、硼替佐米、白消安、callistatina、喜樹(shù)堿、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、西妥昔單抗、順鉑、克拉屈濱、阿糖胞苷、cryptophycins、達(dá)卡巴嗪、達(dá)沙替尼、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、倍癌霉素(duocarmycin)、dynemycina、埃博霉素(epothilones)、依托泊苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、5-氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他濱、易普利姆瑪(ipilimumab)、羥基脲、伊馬替尼、英夫利昔單抗、干擾素、白介素、β-拉帕醌(β-lapachone)、來(lái)那度胺、伊立替康、美登素、氮芥(mechlorethamine)、美法侖、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素c、尼羅替尼、奧沙利鉑、紫杉醇、丙卡巴肼、辛二酰苯胺異羥肟酸(saha)、6-硫代胍、噻替派、替尼泊苷、托泊替康、曲妥珠單抗、曲古抑菌素a、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春地辛。

實(shí)施例

可參考以下實(shí)施例進(jìn)一步了解本發(fā)明的實(shí)施，提供這些實(shí)施例作為說(shuō)明，而非限制。以下一般方法為說(shuō)明性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解可使用替代但等效的方法。

一些¹h-nmr譜在bruker600、500或400mhz儀器上進(jìn)行，且化學(xué)位移相對(duì)于四甲基硅烷(δ＝0.0)以ppm(δ)報(bào)告。一般在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)。

這兩種lc/ms分析方法為說(shuō)明性：

a柱：watersbehc18，2.0x50mm，1.7-μm顆粒；流動(dòng)相a：具有0.05％tfa(三氟乙酸)的水；流動(dòng)相b：具有0.05％tfa的乙腈；[2-98％，在1.5min內(nèi)，具有3min運(yùn)行時(shí)間]；溫度：40℃；流速：0.8ml/min.，且uv檢測(cè)器設(shè)定在220或254nm。

b柱：phenomenexluna，2.0x30mm，3-μm顆粒；流動(dòng)相a：10％乙腈/90％水，具有0.1％tfa；流動(dòng)相b：90％乙腈/10％水，具有0.1％tfa；[0-100％在2min內(nèi)，具有4min運(yùn)行時(shí)間]；溫度：40℃；流速：1.0ml/min.，且uv檢測(cè)器設(shè)定在220或254nm。

實(shí)施例1-中間體化合物6

本實(shí)施例和圖1涉及合成用于制備本發(fā)明二聚體的中間體化合物6。

如下從相應(yīng)甲酯制備4-(芐基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酰氯1：向四氫呋喃(thf，350ml)中4-(芐基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯(harvechem，15g，47.3mmol)加入naoh水溶液(56.7ml，142mmol，2.5m)。在50℃攪拌反應(yīng)5h。使反應(yīng)冷卻到室溫(rt)，然后在真空中濃縮去除thf。剩余水層用水性hcl(6n)酸化至ph2。過(guò)濾所得黃色沉淀，用水洗滌，在真空下干燥，得到4-(芐基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(14.32g，100％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝304.08.¹hnmr(400mhz，甲醇-d4)δ7.60(s，1h)，7.53-7.45(m，2h)，7.45-7.31(m，3h)，7.29(s，1h)，5.23(s，2h)，3.98(s，3h).

向thf(150ml)中以上硝基苯甲酸(3.5g，11.54mmol)的溶液滴加草酰氯(1.212ml，13.85mmol)，隨后加入n，n-二甲基甲酰胺(dmf，50ul)。將所得溶液在rt攪拌2h，隨后在真空中濃縮得到酰氯1，為黃色固體。

使酰氯1溶于thf(35ml)，并滴加到在0℃thf(80ml)中1，2，3，4-四氫異喹啉-3-甲酸(s)-芐酯對(duì)甲苯磺酸鹽2(accela，5.58g，12.70mmol)和三乙胺(4.83ml，34.6mmol)的溶液。將反應(yīng)混合物在rt攪拌4h，隨后用水猝滅反應(yīng)，并濃縮去除thf。用etoac(3x)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用飽和nahco3水溶液洗滌，然后用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(80g柱，梯度0％至100％etoac/二氯甲烷(dcm)，在15分鐘內(nèi))純化，得到酯3(6.25g，98％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝553.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.95-7.72(m，1h)，7.57-7.35(m，5h)，7.34-7.0(m，8h)，7.14-6.98(m，1h)，6.94-6.69(m，1h)，5.39-5.19(m，2h)，5.19-5.08(m，1h)，4.99(q，j＝12.4hz，1h)，4.75(d，j＝17.4hz，1h)，4.65-4.40(m，2h)，4.28(d，j＝15.6hz，1h)，3.86(br.s.，3h)，3.71(s，1h)，3.50-3.18(m，1h).

將meoh(50ml)中酯3(6.25g，11.31mmol)、鋅(4.44g，67.9mmol)和nh4cl(7.26g，136mmol)的懸浮體在50℃加熱16h。使反應(yīng)冷卻到rt，并用meoh稀釋。將所得混合物通過(guò)celite^tm墊過(guò)濾，依次用etoac、dcm和meoh洗滌。合并濾液，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(120g柱，梯度0％至100％etoac/dcm，在15分鐘內(nèi))純化，得到二酮4(4.5g，96％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝415.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.49-7.40(m，4h)，7.32(br.s.，6h)，，6.45(s，1h)，5.19(s，2h)，5.13(d，j＝15.4hz，1h)，4.47(d，j＝15.2hz，1h)，4.21(t，j＝6.7hz，1h)，3.93(s，3h)，3.52(dd，j＝15.4，7.0hz，1h)，3.02(dd，j＝15.4，6.4hz，1h).

使dmf(54.3ml)中二酮4(4.5g，10.86mmol)的溶液冷卻到0℃，隨后分批加入nah(60％在礦物油中的分散體，0.54g，13.57mmol)。將所得混合物攪拌30min，隨后加入(2-(氯甲氧基)乙基)三甲基硅烷(sem-cl，2.31ml，13.03mmol)。使反應(yīng)溫?zé)嶂羠t，并攪拌1h，隨后用水猝滅反應(yīng)。用etoac(3x)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層經(jīng)na2so4干燥，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(80g柱，梯度0％至50％etoac/dcm，在15分鐘內(nèi))純化，得到sem-二酮5(4.60g，78％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝545.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.59-7.41(m，2h)，7.40-7.21(m，9h)，5.43(d，j＝9.9hz，1h)，5.21(s，2h)，5.14(d，j＝15.2hz，1h)，4.50(d，j＝9.7hz，1h)，4.41(d，j＝15.2hz，1h)，4.33-4.16(m，1h)，4.13(d，j＝7.3hz，1h)，3.92(s，3h)，3.82-3.46(m，3h)，3.06-2.84(m，1h)，1.26(t，j＝7.2hz，1h)，0.97(ddd，j＝9.9，6.8，2.6hz，2h)，0.10-0.01(m，9h).

在rt在h2氣囊下將etoh(10ml)中sem-二酮5(4.68g，8.59mmol)和pd/c(10％，0.457g)的懸浮體攪拌3h。反應(yīng)通過(guò)celite^tm墊過(guò)濾，用etoh洗滌，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(120g柱，梯度0％至100％etoac/dcm，在15分鐘內(nèi))純化，得到化合物6(3.23g，83％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝455.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.40-7.21(m，5h)，5.97(s，1h)，5.46(d，j＝9.7hz，1h)，5.18(d，j＝15.4hz，1h)，4.72(d，j＝9.7hz，1h)，4.58-4.24(m，2h)，3.95(s，3h)，3.83-3.44(m，3h)，3.14-2.88(m，1h)，0.99(t，j＝8.0hz，2h)，0.14(s，9h).

實(shí)施例2-中間體化合物13

本實(shí)施例和圖2涉及合成用于制備本發(fā)明二聚體的另外的中間體化合物。

使酰氯1溶于thf(30ml)，并滴加到在0℃thf(20ml)中羧酸酯7(borzilleri等人，wo2014/047024a1(2014)，1.6g，6.39mmol)和net3(2.67ml，19.2mmol)的溶液。使反應(yīng)溶液緩慢溫?zé)嶂羠t，并攪拌30min。反應(yīng)用水猝滅，并濃縮去除thf。用etoac(3x)萃取所得混合物。合并的有機(jī)層用飽和nahco3水溶液洗滌，然后用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(80g柱，梯度0％至100％etoac/己烷，在15分鐘內(nèi))純化，得到乙酯8(2.66g，78％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝536.4.

將meoh(10ml)中乙酯8(1.75g，3.55mmol)、鋅(1.394g，21.32mmol)和nh4cl(2.281g，42.6mmol)的懸浮體在50℃加熱過(guò)夜。將反應(yīng)混合物通過(guò)celite^tm墊過(guò)濾，用大量dcm中的20％meoh洗滌。濃縮濾液，得到氨基-二酮9，為白色固體(1.25g，2.90mmol，82％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝430.3.¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ10.26(br.s.，1h)，7.53-7.31(m，6h)，7.24(s，1h)，6.92(d，j＝7.9hz，1h)，6.78(s，1h)，6.50-6.41(m，2h)，5.07(d，j＝4.6hz，2h)，5.00-4.88(m，2h)，4.84(d，j＝15.0hz，1h)，4.09(d，j＝15.0hz，1h)，4.01(t，j＝6.9hz，1h)，3.75(s，3h)，3.12(dd，j＝15.3，7.6hz，1h)，2.78(dd，j＝15.2，6.2hz，1h).

向dcm(10ml)中氨基-二酮9(1.6g，3.73mmol)和三苯甲基氯(1.246g，4.47mmol)的溶液加入net3(0.779ml，5.59mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物3h，并濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(80g柱，梯度0-50％etoac/己烷)純化，得到三苯甲基-二酮10，為白色固體(2.2g，3.27mmol，88％產(chǎn)率)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ8.01(s，1h)，7.50-7.12(m，22h)，6.77(d，j＝8.4hz，1h)，6.47-6.34(m，2h)，6.16(dd，j＝8.1，2.4hz，1h)，5.02(br.s.，1h)，4.91(d，j＝15.2hz，1h)，4.18-4.09(m，2h)，4.05(t，j＝6.9hz，1h)，3.92(s，3h)，3.28(dd，j＝15.4，7.7hz，1h)，2.75(dd，j＝15.4，6.4hz，1h).

向在0℃dmf(15ml)中三苯甲基-二酮10(2.2g，3.27mmol)的溶液加入nah(60％在礦物油中的分散體，0.236g，3.93mmol)。將混合物攪拌30min，隨后加入sem-cl(0.697ml，3.93mmol)。在0℃攪拌反應(yīng)混合物2h，隨后用鹽水猝滅反應(yīng)。用etoac(3x)萃取反應(yīng)混合物。合并的有機(jī)層經(jīng)na2so4干燥，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物混合物用isco硅膠層析(40g柱，0-50％etoac/己烷)純化，得到sem-二酮11(2.1g，2.62mmol，80％產(chǎn)率)。lcms(m-三苯甲基)＝560.4.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.48-7.42(m，2h)，7.41-7.32(m，9h)，7.31-7.18(m，11h)，6.77(d，j＝8.1hz，1h)，6.38(d，j＝2.2hz，1h)，6.19(dd，j＝8.3，2.3hz，1h)，5.45(d，j＝9.7hz，1h)，5.21(s，2h)，5.08-4.92(m，2h)，4.49(d，j＝9.7hz，1h)，4.13-4.08(m，1h)，4.02(d，j＝15.2hz，1h)，3.93(s，3h)，3.71(td，j＝9.6，7.0hz，1h)，3.61(td，j＝9.6，7.2hz，1h)，3.36(dd，j＝15.5，8.3hz，1h)，2.72(dd，j＝15.5，6.5hz，1h)，1.05-0.92(m，2h)，0.06(s，9h).

在h2氣囊下攪拌etoac(20ml)中sem-二酮11(950mg，1.18mmol)和pd/c(10％，200mg)的懸浮體2天。將反應(yīng)混合物通過(guò)celite^tm墊過(guò)濾，用etoac洗滌，然后用meoh洗滌。濃縮合并的濾液，用isco硅膠層析(40g柱，0-100％etoac/己烷)純化，得到化合物12(510mg，1.08mmol，90％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝470.2.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.33(s，1h)，7.27(s，1h)，7.09(d，j＝8.6hz，1h)，6.67-6.54(m，2h)，6.02(s，1h)，5.47(d，j＝9.7hz，1h)，5.11(d，j＝15.2hz，1h)，4.71(d，j＝9.7hz，1h)，4.29(d，j＝15.2hz，1h)，4.22(dd，j＝7.7，6.5hz，1h)，3.94(s，3h)，3.79-3.60(m，4h)，3.47(dd，j＝15.4，7.7hz，1h)，2.90(dd，j＝15.5，6.4hz，1h)，1.09-0.94(m，2h)，0.05(s，9h).

向在0℃thf(3ml)中化合物12(500mg，1.065mmol)的溶液加入net3(0.742ml，5.32mmol)。滴加氯甲酸烯丙酯12a(513mg，4.26mmol)。將所得溶液在0℃攪拌2h，并用meoh(5ml)和水性lioh(2ml，2n)稀釋。在rt攪拌所得混合物16h。反應(yīng)用etoac稀釋，并用鹽水洗滌。分離有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，并在真空中濃縮。粗產(chǎn)物通過(guò)isco硅膠層析(24g柱，0-10％meoh/dcm)純化，得到化合物13，為白色固體(440mg，0.795mmol，74.6％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝554.2.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.38-7.30(m，3h)，7.27-7.21(m，2h)，6.96(s，1h)，6.28(s，1h)，6.02-5.89(m，1h)，5.44(d，j＝9.8hz，1h)，5.35(dq，j＝17.2，1.5hz，1h)，5.26(dq，j＝10.4，1.3hz，1h)，5.10(d，j＝15.4hz，1h)，4.70(d，j＝9.8hz，1h)，4.66(d，j＝5.1hz，2h)，4.40(d，j＝15.4hz，1h)，4.31-4.23(m，1h)，3.91(s，3h)，3.79-3.58(m，2h)，3.51(dd，j＝15.6，7.3hz，1h)，2.96(dd，j＝15.5，6.4hz，1h)，1.07-0.95(m，2h)，0.03(s，9h).

實(shí)施例3-更多中間體

本實(shí)施例與圖3和4涉及制備用于合成本發(fā)明二聚體的另外的中間體。

向燒瓶加入在0℃dcm(100ml)中的5-甲氧基-2-硝基-4-((三異丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酸14(casreg.no.1430738-03-6，9.0g，24.36mmol)和n，n，n′，n′-四甲基-o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸鹽(hatu，10.19g，26.8mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌10min，并用n，n-二異丙基乙基胺(diea或dipea，4.68ml，26.8mmol)和異喹啉15(casreg.no.215928-81-7，7.43g，26.8mmol)處理。使反應(yīng)在0℃保持3h，然后在rt攪拌24h。將反應(yīng)混合物倒入飽和nh4cl和dcm。收集有機(jī)相，并濃縮成殘余物。通過(guò)用己烷中10％-30％etoac洗脫硅膠層析(biotage)進(jìn)一步純化殘余物。收集產(chǎn)物并濃縮得到酰胺16，為淺棕褐色油(10.15g，66％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝629.65.

使meoh(200ml)中酰胺16(10.1g，16.06mmol)的溶液冷卻到0℃，并加入nh4cl(4.29g，80mmol)和鋅粉(5.25g，80mmol)。將所得綠色懸浮體在0℃攪拌45min，然后溫?zé)嶂羠t過(guò)夜。通過(guò)celite^tm墊過(guò)濾反應(yīng)混合物(用meoh洗滌)，并濃縮濾液至殘余物。使殘余物吸收在dcm中，并裝到硅膠墊上。這用50％etoac和己烷清洗，得到苯胺17(8.02g，83％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝599.35.

使苯胺17(2500mg，4.17mmol)溶于dcm(50ml)，并加入吡啶(0.878ml，10.85mmol)。使混合物冷卻到-78℃，并加入氯甲酸烯丙酯12a(0.579ml，5.43mmol)。使反應(yīng)混合物在此溫度保持1h，然后溫?zé)嶂羠t。將反應(yīng)混合物倒入飽和nh4cl和dcm。用dcm萃取混合物，并通過(guò)用己烷中10％-50％etoac洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到氨基甲酸酯18(2.5g，88％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝683.40.

使氨基甲酸酯18(1.372g，2.009mmol)溶于meoh(20ml)。加入meoh中的10％濃hcl(2ml，6.58mmol)。使混合物老化20min，并用水中的nahco3(0.591g，7.03mmol)猝滅。用水稀釋混合物，并用dcm萃取4次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。通過(guò)用10-50％etoac/己烷洗脫的硅膠層析(biotage)純化得到醇19(963mg，84％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝569.25.

使草酰氯(2.0m，1.450ml，2.90mmol)溶于dcm(30ml)，然后使混合物在干冰/丙酮浴中冷卻到-78℃。向此加入dmso(0.515ml，7.25mmol，溶于～2mldcm，以防止在加入期間凍結(jié))，并使溫度保持在-78℃。20min后，向反應(yīng)加入溶于dcm(10ml)的醇19(1.65g，2.90mmol)。使此攪拌另外30min，隨后加入net3(2.022ml，14.50mmol)。10min后，使反應(yīng)溫?zé)嶂羠t。用飽和nh4cl猝滅此反應(yīng)，并用dcm(2x)萃取。合并有機(jī)相，經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并濃縮成殘余物。通過(guò)用己烷中30％-100％etoac洗脫硅膠層析(biotage)純化殘余物。收集產(chǎn)物并濃縮得到縮醛胺20，為白色固體(1.51g，92％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝567.30.¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.39-7.24(m，5h)，7.22(s，1h)，6.67(s，1h)，5.75(dd，j＝11.2，5.6hz，1h)，5.31(dd，j＝9.5，4.0hz，1h)，5.22-5.07(m，2h)，4.84(d，j＝15.8hz，1h)，4.64-4.49(m，2h)，4.44(d，j＝5.3hz，1h)，3.87(s，3h)，3.77-3.61(m，1h)，3.28-3.01(m，3h)，1.34-1.18(m，3h)，1.09(dd，j＝7.4，2.6hz，18h).

使縮醛胺20(776mg，1.369mmol)溶于dcm(12ml)，并加入2，6-二甲基吡啶(0.638ml，5.48mmol)。使混合物在冰浴上冷卻，并加入叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(tbsotf，0.943ml，4.11mmol)。使混合物老化30min，用dcm稀釋，用飽和nahco3溶液猝滅，并用dcm萃取2次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。殘余物通過(guò)用10-30％etoac/己烷洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到甲硅烷基醚21(907.6mg，1.333mmol，97％產(chǎn)率)。¹h-nmr顯示經(jīng)純化物質(zhì)被～0.25當(dāng)量2，6-二甲基吡啶(～4％重量)污染，但不經(jīng)任何進(jìn)一步純化繼續(xù)使用。lcmsm+h＝681.25.

使甲硅烷基醚21(907mg，1.332mmol)溶于dmf(5ml)和水(0.1ml)。加入乙酸鋰(88mg，1.332mmol)，并使混合物老化過(guò)夜。在氮流下蒸發(fā)大部分dmf。用etoac稀釋殘余物，用0.1m檸檬酸洗滌2次，然后用鹽水洗滌一次。有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至干。殘余物通過(guò)用30-70％etoac/己烷洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到包含一些etoac(約1.3equiv.；考慮etoac調(diào)節(jié)產(chǎn)率)的酚22(707.4mg，1.107mmol，83％產(chǎn)率)，通過(guò)¹h-nmr測(cè)得。lcmsm+h＝525.10.

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向圖4，使化合物17(2.1g，3.51mmol)溶于dcm(30ml)，并加入吡啶(0.3ml，3.71mmol)。使混合物冷卻到0℃。加入氯甲酸4-硝基苯酯23(0.707g，3.51mmol)，并使混合物在相同溫度老化7min。加入dmf(3ml)中化合物24(casreg.no.1343407-91-9，1.323g，3.51mmol)和diea(0.750ml，4.29mmol)的溶液。將混合物在rt置于旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器上，以去除dcm。20min后，在氮流下蒸發(fā)dmf，然后，殘余物通過(guò)用己烷中10-100％etoac洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到化合物25(1.579g，1.575mmol，44.9％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1002.50.

用在meoh中的10％濃hcl(1.6ml，5.27mmol)處理在meoh(14.4ml)中化合物25(1.579g，1.575mmol)的溶液。使混合物老化30min，用飽和nahco3猝滅，并用氯仿(3x)萃取。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)留下殘余物。使殘余物與相同反應(yīng)的另一批料(從0.816g化合物25開(kāi)始)合并，用于純化。合并的粗殘余物通過(guò)用20-100％etoac/己烷洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到氨基甲酸酯26(1.7412g，1.961mmol，82％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝888.30.

使10mldcm中草酰氯(2.0m，1.00ml，2.000mmol)的溶液冷卻到-78℃。滴加5mldcm中dmso(0.348ml，4.90mmol)的溶液，并使混合物在相同溫度老化10min。滴加5mldcm中氨基甲酸酯26(1741.2mg，1.961mmol)的溶液，并再使混合物老化15min。滴加net3(1.366ml，9.80mmol)，使混合物在相同溫度老化5min，然后去除冷浴，并使混合物溫?zé)嶂羠t?；旌衔镉胣h4cl溶液猝滅，并用dcm萃取兩次。合并的有機(jī)相用水和鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。殘余物通過(guò)用50-80％etoac/己烷洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到化合物27(1376.7mg，1.554mmol，79％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝886.30.

使化合物27(1045mg，1.179mmol)溶于dcm(10ml)，并加入2，6-二甲基吡啶(0.549ml，4.72mmol)。使混合物在冰浴上冷卻，并加入叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.813ml，3.54mmol)。1h后，用dcm稀釋混合物，用飽和nahco3和鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)。通過(guò)用20-100％etoac/己烷洗脫硅膠層析(biotage)純化殘余物。得到一些混合級(jí)分，這些級(jí)分通過(guò)用50％etoac/己烷(等度)洗脫硅膠層析(biotage)再純化。合并純級(jí)分，得到化合物28(676.9mg，0.677mmol，57.4％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1000.30.

用lioac(44.6mg，0.676mmol)處理dmf(5ml)和水(0.1ml)中化合物28(676mg，0.676mmol)的溶液。使混合物老化過(guò)夜，并在氮流下使溶劑蒸發(fā)。使殘余物在etoac和0.1m檸檬酸之間分配。使相分離，有機(jī)相用0.1m檸檬酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次，然后經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)。殘余物通過(guò)用50-100％etoac/己烷洗脫硅膠層析(biotage)純化，得到化合物29(543.6mg，0.644mmol，95％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝844.35.

實(shí)施例4-具有pabc基團(tuán)的連接體

本實(shí)施例和圖5涉及具有pabc自分解基團(tuán)的連接體。

向dmf(2ml)和thf(8ml)中化合物30(firestone等人us6,124,345b1(2001)，實(shí)施例57；0.75g，1.246mmol)的溶液加入二乙胺(2.81ml，26.9mmol)。在rt攪拌反應(yīng)1.5h，并濃縮。用dcm研磨粗產(chǎn)物，過(guò)濾并在真空下干燥，得到化合物31，為白色固體。lcms(m+h)＝380.2¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ10.06(s，1h)，8.15(d，j＝7.3hz，1h)，7.56(d，j＝8.5hz，2h)，7.26(d，j＝8.3hz，2h)，6.00(t，j＝5.4hz，1h)，5.43(s，2h)，5.13(t，j＝5.3hz，1h)，4.56-4.33(m，3h)，3.07-2.93(m，3h)，2.00-1.55(m，5h)，1.49-1.32(m，2h)，0.90(d，j＝6.8hz，3h)，0.80(d，j＝6.8hz，3h).

向dmso(2ml)中化合物31(79mg，0.209mmol)的溶液加入dmso(1ml)中酯32(quantabio，120mg，0.174mmol)的溶液，隨后加入2，6-二甲基吡啶(37.3mg，0.348mmol)。在rt攪拌反應(yīng)3h。加入dmf(2ml)中碳酸雙(4-硝基苯基)酯(63.5mg，0.209mmol)的溶液，隨后加入2，6-二甲基吡啶(37.3mg，0.348mmol)。然后在rt攪拌反應(yīng)12h。然后加入dipea(0.061ml，0.348mmol)，并在rt攪拌反應(yīng)3h。用dmf稀釋粗產(chǎn)物混合物，過(guò)濾，并用反相hplc(柱：phenomenexlunac1820x100mm；流動(dòng)相a：10∶90乙腈∶水，具有0.1％tfa；流動(dòng)相b：90∶10乙腈∶水，具有0.1％tfa；梯度：0-70％b經(jīng)15分鐘；流速：20ml/min；檢測(cè)：uv，在220nm)純化，得到化合物33(40mg，0.036mmol，20.54％產(chǎn)率)。lcms(m+h)＝1119.5.

實(shí)施例5-二聚體iia-01和iia-05

本實(shí)施例和圖6涉及合成二聚體iia-01。

使丙酮(0.4ml)中酚22(60mg，0.114mmol)、2，6-雙(溴甲基)吡啶34(15mg，0.057mmol，得自sigmaaldrich)和cs2co3(37mg，0.114mmol)的懸浮體溫?zé)嶂?0℃經(jīng)歷1h。混合物用0.1m檸檬酸猝滅，并用etoac萃取三次。合并的有機(jī)相用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)?；旌衔锿ㄟ^(guò)用己烷中30-80％etoac梯度洗脫硅膠層析純化，得到二聚體35(36.2mg，55％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1153.40.

使二聚體35(36mg，0.031mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，1.9ml，0.078mmol)的溶液，并加入四(三苯基膦)合鈀(pd(pph3)4，2.2mg，1.9μmol)。攪拌混合物30分鐘，在此時(shí)使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)成殘余物，然后，殘余物通過(guò)制備型hplc(sunfirec18prepobd柱19x100mm；溶劑a＝95％水，5％乙腈+0.1％tfa；溶劑b＝5％水，95％乙腈+0.1％tf；0-100％梯度，經(jīng)10min；以后稱為“hplc方法a”)純化。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-01，為白色粉末(13.4mg，56％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝720.10.hrms測(cè)定值：m+h＝720.2808，計(jì)算值：720.2817.

用2，4-雙(溴甲基)吡啶作為橋連部分，類似制備二聚體iia-05。

在25℃攪拌dmf(1.0ml)中酚22(170mg，0.414mmol)、2，4-雙(溴甲基)吡啶(50mg，0.189mmol)和cs2co3(170mg，0.522mmol)的懸浮體經(jīng)歷1h?；旌衔镉盟?0ml猝滅，并過(guò)濾。用乙醚洗滌沉淀，并經(jīng)空氣干燥。物質(zhì)通過(guò)用dcm中5-50％丙酮梯度洗脫硅膠層析純化，得到類似于二聚體35的alloc-tbs化合物(134mg，70％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1153.40.

使alloc-tbs化合物(36mg，0.031mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，1.9ml，0.078mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(2.2mg，1.9μmol)。攪拌混合物30min，并使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，然后通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-05，為白色粉末(16.0mg，65％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝720.10.

實(shí)施例6-二聚體-連接體iiib-01和iiib-02

本實(shí)施例和圖7a和7b組合涉及制備二聚體-連接體iiib-01和iiib-02。

將dmf(3.0ml)中酚22(480mg，0.823mmol)、2，6-雙(溴甲基)吡啶34(654mg，2.47mmol，購(gòu)自sigmaaldridge)和cs2co3(500mg，1.54mmol)的懸浮體在rt攪拌1h?；旌衔镉?.1m檸檬酸猝滅，并用etoac萃取三次。合并的有機(jī)相用鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)?；旌衔锿ㄟ^(guò)用己烷中30-80％etoac梯度洗脫硅膠層析純化，得到化合物36(465mg，80％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝708.05.

使甲硅烷基醚27(431mg，0.486mmol)溶于dmf(2.0ml)和水(0.04ml)，并用lioac(32mg，0.486mmol)處理。使混合物溫?zé)嶂?0℃經(jīng)歷2.5h，并在rt攪拌另外1小時(shí)。在n2流下去除溶劑3天。用0.1m檸檬酸處理殘余物，并用etoac萃取三次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。混合物通過(guò)用dcm中0-10％meoh梯度洗脫硅膠層析純化，得到酚37(297mg，84％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝730.40.

使酚37(178mg，0.244mmol)、化合物36(190mg，0.268mmol)和cs2co3(79mg，0.244mmol)懸浮于dmf(0.7ml)，并溫?zé)嶂?0℃經(jīng)歷3.5h。將混合物加到水、過(guò)濾，收集化合物38，為白色固體(320mg，97％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1357.30.

使化合物38(320mg，0.236mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，14ml，0.589mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(15mg，13μmol)。攪拌混合物2.5h，在此時(shí)使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，然后通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成10個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到胺39，為白色粉末(145mg，58％產(chǎn)率)。lcmsm+na＝1078.90.

使胺39(145mg，0.137mmol)溶于dmf中dipea(0.05m，3.3ml，0.165mmol)的溶液，并加入馬來(lái)酰亞胺40(85mg，0.274mmol，得自sigmaaldridge)。攪拌混合物20h，在此時(shí)用dmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成8個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體-連接體iiib-01，為白色粉末(68mg，38％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1251.10.

使二聚體-連接體iiib-01(20.0mg，0.016mmol)溶于thf(1ml)和acoh(0.1ml)，并加入meoh(1ml)中nacnbh3(2.0mg，0.032mmol)的溶液。攪拌混合物1h，在此時(shí)用乙腈稀釋，然后通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體-連接體iiib-02，為白色粉末(16mg，76％產(chǎn)率)。lcms(m+2h)/2＝627.10.

實(shí)施例7-二聚體iia-02

本實(shí)施例和圖8涉及制備二聚體iia-02。

使縮醛胺20(500mg，0.244mmol)溶于dcm(10ml)，并加入吡咯烷(0.18ml，2.21mmol)和pd(pph3)4(51mg，44μmol)。攪拌混合物45min，并使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，得到亞胺41(410mg，100％產(chǎn)率)，不經(jīng)進(jìn)一步純化使用胺41。lcmsm+h＝465.20.

使胺41(410mg，0.882mmol)溶于thf(8ml)和乙酸(0.8ml)，并加入nacnbh3(111mg，1.77mmol)的溶液。攪拌混合物2h，用nahco3猝滅，并用etoac萃取3次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，得到胺42(315mg，77％產(chǎn)率)，不經(jīng)進(jìn)一步純化使用胺42。lcmsm+h＝467.30.

使胺42(315mg，0.675mmol)溶于dcm(7ml)，并加入吡啶(0.15ml，1.86mmol)，混合物冷卻到-78℃。滴加氯甲酸烯丙酯12a(0.10ml，1.39mmol)，在相同溫度攪拌混合物30min，在此時(shí)用飽和nh4cl猝滅，并用dcm萃取3次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)至殘余物，得到殘余物，通過(guò)用己烷中20-50％etoac梯度洗脫硅膠層析純化，得到alloc-保護(hù)的胺43(372mg，100％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝551.50.

用關(guān)于制備酚37所用相同的方式處理胺43(372mg，0.675mmol)，不同之處在于反應(yīng)在rt保持過(guò)夜，而不溫?zé)?。這提供酚44(249mg，93％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝395.05.

使酚44(30mg，0.076mmol)、化合物36(30mg，0.042mmol)和cs2co3(30mg，0.092mmol)懸浮于dmf(0.25ml)，并溫?zé)嶂?0℃經(jīng)歷1h。用0.1m檸檬酸處理混合物，并用etoac萃取三次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)?；旌衔锿ㄟ^(guò)用己烷中30-100％etoac梯度洗脫硅膠層析純化，得到化合物45(32mg，74％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1022.10.

使化合物45(32mg，0.031mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，2.0ml，0.08mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(1.8mg，1.6μmol)。攪拌混合物2.5h，隨后使其蒸發(fā)，用dmf稀釋，然后通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成3個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-02，為白色粉末(12mg，53％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝722.30.

實(shí)施例8-二聚體iia-03

本實(shí)施例和圖9涉及合成二聚體iia-03。

在燒瓶中加入dmf(20ml)中的化合物6(1.830g，4.03mmol)。向此加入2，6-雙(溴甲基)吡啶34(3.2g，12.08mmol)，隨后加入k2co3(1.669g，12.08mmol)。使反應(yīng)在攪拌下在rt進(jìn)行過(guò)夜，然后通過(guò)倒入水猝滅。用etoac萃取反應(yīng)混合物，并用飽和nacl洗滌。有機(jī)相濃縮成殘余物，用在己烷中10-100％etoac梯度洗脫在combiflash^tm柱上純化，得到化合物46(2.3g，89％產(chǎn)率)，為白色固體。

在燒瓶中在dmf(5ml)中混合化合物46(1.0g，1.566mmol)和化合物13(1.084g，1.957mmol)。向此加入k2co3(0.649g，4.70mmol)。4h后，將反應(yīng)混合物倒入水中，并用etoac萃取。濃縮有機(jī)層，并用在己烷中10-100％etoac梯度洗脫在combiflash^tm柱上純化，得到化合物47(856mg，49.2％產(chǎn)率)，為白色固體。

向燒瓶加入dcm(10ml)中的化合物47(850mg，0.765mmol)。向此加入pd(pph3)4(88mg，0.076mmol)和吡咯烷(0.158ml，1.912mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h。將反應(yīng)混合物倒入水和dcm。收集有機(jī)相，并濃縮成殘余物。殘余物用在dcm中0-30％meoh洗脫在combiflash^tm柱上純化，得到化合物48(500mg，63.6％產(chǎn)率)，為白色固體。

在-76℃向thf(1ml)中化合物48(26mg，0.025mmol)的溶液加入superhydride^tm(0.127ml，0.127mmol)。攪拌反應(yīng)混合物1h。用冷水(1ml)猝滅反應(yīng)，并用dcm(3x10ml)萃取。濃縮有機(jī)層，并用dcm/etoh/水(1∶2∶1，4ml)和硅膠(1g)處理3天。通過(guò)燒結(jié)漏斗過(guò)濾此混合物，并用dcm-meoh(8∶2，100ml)洗滌硅膠。在高真空下濃縮濾液，并用0-10％meoh/dcm洗脫劑在12g硅膠柱上純化，提供二聚體iia-03(16mg，0.021mmol，82％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝735.2.

實(shí)施例9-二聚體-連接體iiic-01、iiic-03和iiic-04

本實(shí)施例和圖10涉及合成二聚體-連接體iiic-01、iiic-03和iiic-04。

向在0℃dmf(11ml)中化合物48(1.15g，1.119mmol)、酸49(0.667g；1.343mmol；firestone等人，us6,214,345b1(2001))和hatu(0.511g，1.343mmol)的溶液加入2，6-二甲基吡啶(0.261ml，2.239mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h。然后用etoac(200ml)稀釋反應(yīng)，用水洗滌，然后用鹽水洗滌。水相用etoac(2x100ml)萃取。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，濃縮，并吸收在thf(20ml)中。加入哌啶(2ml)，并在rt攪拌反應(yīng)混合物30min。濃縮反應(yīng)混合物，并在iscocombiflash^tm(40g柱，0-40％meoh/dcm)上經(jīng)32min純化，提供化合物50(0.997g，69.4％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝1284.6.¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ10.01(s，2h)，8.27(m，2h)，7.96(t，j＝8.0hz，2h)，7.55(m，4h)，7.42(dd，j＝8.0，1.6hz，2h)，7.20-7.31(m，12h)，5.98(t，j＝5.6hz，2h)，5.89(brs，1h)，5.43(brs，2h)，5.35(brs，1h)，5.25(m，8h)，5.10(d，j＝10.0hz，1h)，5.09(d，j＝10.4hz，1h)，4.95(d，j＝15.6hz，2h)，4.75(brs，1h)，4.50(brs，2h)，4.32(m，6h)，4.09(q，j＝5.2hz，4h)，3.83(s，3h)，3.82(s，3h)，3.40(q，j＝7.6hz，1h)，3.17(d，j＝5.2hz，8h)，3.00(m，10h)，2.68(t，j＝1.6hz，1h)，2.33(t，j＝1.6hz，2h)，1.97(m，3h)，1.63(m，10h)，1.42(m，6h)，0.91(d，j＝7.2hz，3h)，0.84(d，j＝6.8hz，3h)，0.75(m，4h)，0.08(s，18h).

向在-76℃thf(10ml)中化合物50(322mg，0.251mmol)的溶液加入superhydride^tm(1.254ml，1.254mmol)，并攪拌1h。用冷水(1ml)猝滅反應(yīng)，并濃縮。所得殘余物用dcm/etoh/水(1∶2∶1＝8ml)和硅膠(1g)處理2天。通過(guò)燒結(jié)漏斗過(guò)濾此混合物，并用dcm-meoh(8∶2，100ml)洗滌硅膠。在高真空下濃縮濾液，并用0-50％meoh/dcm洗脫劑在24g硅膠柱上經(jīng)15min純化，提供化合物51(248mg，90％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝991.4.

向dmso(6ml)中化合物51(88mg，0.089mmol)和化合物40(54.7mg，0.178mmol)的溶液加入dipea(0.031ml，0.178mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物45min。使用xbridgeprepobdc18，5μm柱(30x150mm)和5-60％乙腈/水(0.05％甲酸)洗脫梯度通過(guò)r-hplc經(jīng)30min純化反應(yīng)混合物。通過(guò)堿性樹(shù)脂(pl-hco3mp-resin1.8mmol/g；agilentpart#pl3540-#603)過(guò)濾在16.9min收集的級(jí)分，用乙腈(5ml)洗滌并凍干，以提供二聚體-連接體iiic-01(39.1mg，0.031mmol，35.0％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝1184.3

分別使用以下適合fmoc-保護(hù)的n-羥基琥珀酰亞胺，隨后用哌啶去除fmoc基團(tuán)，類似地從化合物51和二聚體iia-03制備二聚體-連接體iiic-03和iiic-04。

二聚體-連接體iiic-03具有用氨基封端的連接體，因此，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)的綴合中可以為胺給體成分。ms(m+1)＝1414.5.

二聚體-連接體iiic-04也具有用氨基封端的連接體，因此，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)的綴合中可以為胺給體成分。沒(méi)有肽基，二聚體-連接體iiic-04為不可裂解類型，依賴與其連接的抗體的降解釋放二聚體藥物。ms(m+1)＝982.53.

實(shí)施例10-二聚體iia-04

本實(shí)施例和圖11涉及合成二聚體iia-04。

在燒瓶中混合2，6-雙(溴甲基)吡啶34(4.31g，16.25mmol)、化合物13(1.8g，3.25mmol)和dmf(20ml)。向此加入k2co3(0.899g，6.50mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物2h，并倒入水(200ml)和etoac(200ml)。有機(jī)層用水(100ml)和鹽水(50ml)洗滌，并濃縮成殘余物。殘余物用在己烷中0-100％etoac梯度洗脫在combiflash^tm80g柱上經(jīng)30min純化，得到化合物52(1.409g，1.910mmol，58.8％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝737.1.¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.80(m，1h)，7.54(m，1h)，7.45(d，j＝7.2hz，1h)，7.37(s，2h)，7.28(m，4h)，6.62(s，1h)，5.98(m，1h)，5.42(d，j＝10.0hz，1h)，5.37(m，1h)，5.28(d，j＝7.2hz，1h)，5.12(d，j＝15.6hz，1h)，4.69(d，j＝6hz，1h)，4.65(d，j＝9.6hz，1h)，4.61(s，1h)，4.42(d，j＝15.6hz，1h)，4.27(t，j＝6.8hz，1h)，3.95(s，3h)，3.65(m，2h)，3.51(dd，j＝15.6，7.2hz，1h)，2.97(dd，j＝15.6，6.4hz，1h)，0.97(m，2h)，0.04(s，9h).

在-76℃向thf(20ml)中化合物6(2g，4.40mmol)的溶液加入superhydride^tm(22.00ml，22.00mmol)。在此溫度攪拌反應(yīng)混合物1h。用冷水(100ml)猝滅反應(yīng)，并用dcm(3x100ml)萃取。所得殘余物用dcm/etoh/水(1∶2∶1＝40ml)和硅膠(10g)處理3天。通過(guò)燒結(jié)漏斗過(guò)濾此混合物，并用dcm-meoh(8∶2，100ml)洗滌硅膠。在高真空下濃縮濾液，并用meoh/dcm在40g硅膠柱上經(jīng)15min純化。10％meoh/dcm級(jí)分在10min提供化合物53(1.35g，4.03mmol，92％產(chǎn)率)，為黃色固體。ms(m+1)＝309.0.

向dmso(10ml)中化合物52(1.265g，1.715mmol)和化合物53(0.582g，1.886mmol)的溶液加入k2co3(0.474g，3.43mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h，并倒入水和etoac(1∶1，300ml)。濃縮有機(jī)層，并用meoh/dcm洗脫在40g硅膠柱上經(jīng)15min純化，提供化合物54(1.78g，1.568mmol，91％產(chǎn)率)，為黃色固體。ms(m+1)＝965.3.

向dcm(30ml)中化合物54(1.78g，1.844mmol)和pd(pph3)4(0.107g，0.092mmol)的溶液加入吡咯烷(0.305ml，3.69mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物30min。濃縮并用meoh/dcm洗脫在40g硅膠柱上經(jīng)15min純化，得到化合物55(1.54g，1.748mmol，95％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝881.2

在0℃向thf(2ml)中化合物55(100mg，0.113mmol)的溶液加入一滴乙酸，隨后加入meoh(0.2ml)中的nacnbh3(14.27mg，0.227mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物20min，用etoac(50ml)稀釋，并用飽和nahco3溶液(10ml)和鹽水(10ml)洗滌。濃縮有機(jī)層，并用meoh/dcm在iscocombiflash^tm24g柱上經(jīng)15min純化，提供化合物56(37mg，0.042mmol，36.9％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝883.4.¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.73(t，j＝8.0hz，1h)，7.45(m，3h)，7.35(s，1h)，7.28(m，4h)，7.20(m，1h)，7.04(d，j＝8.4hz，1h)，6.61(m，2h)，6.13(s，1h)，5.44(d，j＝9.6hz，1h)，5.28(m，4h)，5.09(d，j＝15.2hz，1h)，4.81(q，j＝15.6hz，2h)，4.63(d，j＝10.0hz，1h)，4.25(d，j＝15.2hz，1h)，4.18(dd，j＝8.0，6.8hz，1h)，4.11(m，1h)，3.93(s，3h)，3.90(s，3h)，3.71(m，3h)，3.41(m，2h)，3.21(t，j＝10.4hz，1h)，3.09(dd，j＝15.2，5.6hz，1h)，2.83(m，2h)，0.98(m，2h)，0.03(s，9h).

在-76℃向thf(2ml)中化合物56(37mg，0.042mmol)的溶液加入superhydride^tm(0.209ml，0.209mmol)。攪拌反應(yīng)混合物1h，用冷水(1ml)猝滅反應(yīng)，并用dcm(3x10ml)萃取。濃縮有機(jī)層，并用dcm/etoh/水(1∶2∶1，4ml)和硅膠(1g)處理3天。通過(guò)燒結(jié)漏斗過(guò)濾此混合物，并用dcm-meoh(8∶2，50ml)洗滌硅膠。在高真空下濃縮濾液，并用0-10％meoh/dcm洗脫在12g硅膠柱上經(jīng)15min純化，提供二聚體iia-04，為白色固體(25.3mg，78％產(chǎn)率)。ms(m+1)＝737.2.¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.70(t，j＝8.0hz，1h)，7.55(s，1h)，7.43(m，3h)，7.28(m，3h)，7.23(m，1h)，7.12(d，j＝8.0hz，1h)，6.92(s，1h)，6.62(d，j＝7.2hz，1h)，6.45(s，1h)，6.05(s，1h)，5.32(m，3h)，4.80(m，2h)，4.40(d，j＝15.6hz，1h)，4.01(s，3h)，3.90(s，3h)，3.50(s，1h)，3.14(m，2h)，2.97(m，3h)，2.75(dd，j＝15.2，5.6hz，2h).

實(shí)施例11-二聚體連接體iiic-02

本實(shí)施例和圖12a和12b涉及合成二聚體-連接體iiic-02。

向在0℃dmf(20ml)中化合物55(1.22g，1.385mmol)、化合物49(0.825g，1.662mmol)和hatu(0.632g，1.662mmol)的溶液加入2，6-二甲基吡啶(0.323ml，2.77mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h，在此時(shí)lcms顯示完全轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物倒入包含etoac(300ml)和水(100ml)的分液漏斗。加入鹽水(50ml)，分離成兩層。濃縮有機(jī)層，并在iscocombiflash^tm120g柱，0-30％meoh/dcm洗脫經(jīng)25min純化，得到化合物56(1.13g，0.831mmol，60.0％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝1359.4.

在0。c向thf(30ml)中化合物56(1.13g，0.831mmol)的溶液加入乙酸(0.095ml，1.662mmol)，隨后加入meoh(3ml)中的nacnbh3(0.104g，1.662mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h，用etoac(200ml)稀釋，并用飽和nahco3溶液(50ml)和鹽水(50ml)洗滌。濃縮有機(jī)層，并在iscocombiflash^tm80g柱上，0-20％meoh/dcm洗脫劑經(jīng)25min純化，得到化合物57(1g，0.734mmol，88％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+na)＝1384.2

向thf(20ml)中化合物57(1g，0.734mmol)的溶液加入哌啶(2ml，20.20mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h。濃縮反應(yīng)混合物，并在iscocombiflash^tm40g柱上，0-50％meoh/dcm洗脫劑經(jīng)25min純化，提供化合物58(0.7g，0.614mmol，84％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝1139.4.

向在-76℃thf(10ml)中化合物58(0.5g，0.439mmol)的溶液加入superhydride^tm(4.39ml，4.39mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌45min。用冷水(1ml)猝滅反應(yīng)，并濃縮。所得殘余物用dcm/etoh/水(1∶2∶1，8ml)和硅膠(2g)處理2天。通過(guò)燒結(jié)漏斗過(guò)濾此混合物，并用dcm-meoh(8∶2，200ml)洗滌硅膠。在高真空下濃縮濾液，并用meoh/dcm在isco80g硅膠(gold)柱上經(jīng)40min純化，提供化合物59(0.4g，0.403mmol，92％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝993.4

向dmso(2ml)中化合物59(24mg，0.024mmol)和化合物84(14.90mg，0.048mmol)的溶液加入dipea(8.44μl，0.048mmol)。在rt攪拌反應(yīng)混合物1h。使用xbridgeprepobdc18，5μm柱(30x250mm)和5-60％乙腈/水(0.05％甲酸)通過(guò)r-hplc經(jīng)30min純化反應(yīng)混合物。通過(guò)堿性樹(shù)脂(pl-hco3mp-樹(shù)脂1.8mmol/g；agilentpart#pl3540-#603)過(guò)濾在20.3min收集的級(jí)分，并用乙腈(5ml)洗滌。凍干提供二聚體-連接體iiic-02(7.6mg，6.21μmol，25.7％產(chǎn)率)，為白色固體。ms(m+1)＝1186.5.

實(shí)施例12-二聚體-連接體iiib-03和iiib-03’

本實(shí)施例和圖13涉及合成二聚體-連接體iiib-03。

向thf(2ml)中的吡啶-2，4-二基二甲醇(80mg，0.572mmol)加入酚22(100mg，0.191mmol)、聚合物結(jié)合三苯膦(200mg，0.629mmol)和偶氮二甲酸二異丙酯(diad，0.122ml，0.629mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)12h，并過(guò)濾混合物。去除溶劑，物質(zhì)通過(guò)用dcm中20-100％丙酮梯度洗脫硅膠層析純化，得到化合物61(70mg，56.9％產(chǎn)率)lcmsm+h＝646.45和化合物62(50mg，40.6％產(chǎn)率)lcmsm+h＝646.40。

在0℃向dcm(2ml)中的化合物61(67mg，0.104mmol)和tea(0.036ml，0.259mmol)加入甲磺酰氯(mscl，0.019ml，0.239mmol)。在0℃攪拌反應(yīng)1h，并用水猝滅?；旌衔镉胐cm萃取，用冷hcl水溶液(0.05n)、鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，濃縮得到化合物63，為橙色油。物質(zhì)用己烷中20-100％乙酸乙酯梯度洗脫在硅膠層析上純化，得到經(jīng)純化化合物63(40mg，30％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝724.10.

向dmf(.1ml)中的化合物63(40mg，0.055mmol)加入cs2co3(40mg，0.123mmol)和化合物37(40.3mg，0.055mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)4h，并通過(guò)hplc方法a純化物質(zhì)。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到化合物64，為白色粉末(16.0mg，65％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1357.65.

使化合物64(15mg，0.011mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，0.658ml，0.028mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(0.766mg，0.663μmol)。在rt攪拌混合物2.5h，并在n2下去除反應(yīng)溶劑。剩余物質(zhì)用1.5mldmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到胺65，為白色粉末(11.5mg，98％產(chǎn)率)。lcmsm+na＝1080.

使胺65(11.5mg，10.88μmol)溶于dmf中dipea(0.261ml，0.013mmol)的溶液，并加入化合物40(6.71mg，0.022mmol)。攪拌混合物20h，用dmf稀釋，并通過(guò)以前段落中所述的制備型hplc純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體-連接體iiib-03，為白色粉末(3mg，2.231μmol，20.51％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1250.60.

可類似地從化合物62制備二聚體-連接體iiib-03’。

實(shí)施例13-二聚體iia-06

本實(shí)施例和圖14涉及制備二聚體iia-06。

向thf(2ml)中的吡啶-3，5-二基二甲醇66(26.5mg，0.191mmol)加入酚22(100mg，0.191mmol)、聚合物結(jié)合三苯膦(200mg，0.629mmol)和diad(0.122ml，0.629mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)12h，并過(guò)濾混合物。去除溶劑，物質(zhì)通過(guò)用dcm中20-100％丙酮梯度洗脫硅膠層析純化，得到二聚體67(55mg，15.02％產(chǎn)率)lcmsm+na＝1174.65和化合物68(38mg，31％產(chǎn)率)lcmsm+h＝646.30。

使二聚體67(15mg，0.013mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.775ml，0.033mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(1mg，0.865μmol)。攪拌混合物30min，并使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，殘余物通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-06，為白色粉末(2mg，20.28％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝721.30.

實(shí)施例14-二聚體-連接體iiib-04

本實(shí)施例和圖15涉及合成二聚體-連接體iiib-04。

在25℃攪拌dmf(1.0ml)中酚22(200mg，0.381mmol)、3，5-雙(氯甲基)吡啶鹽酸鹽(250mg，1.176mmol)和cs2co3(800mg，2.455mmol)的懸浮體經(jīng)歷16h。在氮下去除溶劑。殘余物干燥裝到celite^tm上，并通過(guò)用dcm中2-10％meoh梯度洗脫硅膠層析純化，得到酚69(120mg，47％產(chǎn)率)。lcmsm+na＝687.05.

向dmf(1.0ml)中的化合物37(150mg，0.206mmol)加入cs2co3(100mg，0.307mmol)和二聚體69(150mg，0.206mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)12h，并通過(guò)hplc方法a純化物質(zhì)。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到化合物70，為白色粉末(42mg，15.65％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1357.65.

使化合物70(40mg，0.029mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，1.8ml，0.074mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(2.0mg，1.768μmol)。在rt攪拌混合物2.5h，并在n2下去除反應(yīng)溶劑。物質(zhì)用1.5mldmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到胺71，為白色粉末(15mg，43％產(chǎn)率)。lcmsm+na＝1080.

使胺71(15mg，10.88μmol)溶于dmf中dipea(0.615ml，0.031mmol)的溶液，并加入化合物40(25mg，0.024mmol)。攪拌混合物20h，用dmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體-連接體iiib-04，為白色粉末(10mg，30％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1250.60.

實(shí)施例15-二聚體iia-08

本實(shí)施例和圖16涉及制備二聚體iia-08。

向dmf(0.888ml)中的4-(羥基甲基)吡啶-2，6-二甲酸二甲酯72(200mg，0.888mmol)加入咪唑(100mg，1.469mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(tbs-cl，4ml，1.149mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)過(guò)夜。在氮下去除溶劑，物質(zhì)用己烷中0-50％乙酸乙酯梯度洗脫在硅膠層析上純化，得到化合物73(290mg，91％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝340.50.

向乙醇(2ml)中的化合物73(14g，0.412mmol)加入libh4(0.054g，2.475mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)5h。用乙酸(0.189ml，3.30mmol)猝滅反應(yīng)，并攪拌10min。去除溶劑，并將物質(zhì)干燥裝到celite^tm上。物質(zhì)通過(guò)用dcm中2-10％甲醇梯度洗脫硅膠層析純化，得到化合物74(120mg，98％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝284.50.

在0℃向dcm(2ml)中化合物74(100mg，0.353mmol)、tea(0.123ml，0.882mmol)的懸浮體加入mscl(0.063ml，0.811mmol)。在0℃攪拌反應(yīng)1h。用水猝滅反應(yīng)，用dcm萃取，用冷hcl水溶液(0.05n)、鹽水洗滌，并經(jīng)na2so4干燥。去除溶劑，得到甲磺酸酯75，為橙色油。物質(zhì)用己烷中20-100％乙酸乙酯梯度洗脫在硅膠層析上純化，得到甲磺酸酯75(155mg，98％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝440.30.

向dmf(.3ml)中的甲磺酸酯75(25mg，0.057mmol)加入cs2co3(85mg，0.261mmol)和酚22(90mg，0.171mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)1h。物質(zhì)用dcm中30-100％丙酮梯度洗脫在硅膠層析上純化，得到二聚體76(70mg，93％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1296.65.

向thf(.3ml)中的二聚體76(40mg，0.031mmol)加入氟化四丁基銨(tbaf，0.037ml，0.037mmol)。反應(yīng)在30min內(nèi)完成，并用飽和(nh4)2so4猝滅。用乙酸乙酯萃取混合物，并經(jīng)na2so4干燥。去除溶劑，用dmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體77，為白色粉末(14mg，47％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝954.35.

使二聚體77(14mg，0.012mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，0.705ml，0.030mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(1.0mg，0.9μmol)。攪拌混合物1h，并使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，殘余物通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-08，為白色粉末(5.0mg，54％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝750.30.

實(shí)施例16-二聚體-連接體iiib-05

本實(shí)施例和圖17涉及制備二聚體-連接體iiib-05。

向dmf(.2ml)中的化合物75(113mg，0.257mmol)加入酚22(45mg，0.086mmol)和cs2co3(60mg，0.184mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)1h。物質(zhì)通過(guò)用dcm中30-100％乙酸乙酯梯度洗脫硅膠層析純化，得到二聚體78(40mg，30.6％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝868.60.

向dmf(.2ml)中的二聚體78(39mg，0.045mmol)加入cs2co3(40mg，0.123mmol)和化合物37(40mg，0.055mmol)。在25℃攪拌反應(yīng)4h，并通過(guò)hplc方法a純化物質(zhì)。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到化合物79，為白色粉末(60.0mg，89％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1501.85.

向thf(.4ml)中的二聚體79(60mg，0.040mmol)加入tbaf(0.04ml，0.040mmol)。反應(yīng)在30min內(nèi)完成，并用飽和nh4cl猝滅。用乙酸乙酯萃取混合物，并經(jīng)na2so4干燥。去除溶劑，用dmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體80，為白色粉末(13mg，20％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1273.55.

使化合物80(13mg，10.21μmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，0.608ml，0.026mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(0.708mg，0.613μmol)。在rt攪拌混合物2.5h。在n2下去除反應(yīng)溶劑。物質(zhì)用1.5mldmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到胺81，為白色粉末(11mg，90％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1087.50.

使胺81(11mg，10.12μmol)溶于dmf中dipea(0.243ml，0.012mmol)的溶液，并加入化合物40(6.24mg，0.020mmol)。攪拌混合物20h，用dmf稀釋，并通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成2個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體-連接體iiib-04，為白色粉末(6mg，42％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1281.60.

實(shí)施例17-二聚體iia-07和iia-09

本實(shí)施例和圖18涉及制備二聚體iia-07和iia-09。

在0℃向dcm(3ml)中(3-甲氧基吡啶-2，6-二基)二甲醇82(90mg，0.532mmol)、net3(0.185ml，1.330mmol)的懸浮體加入mscl(0.095ml，1.224mmol)。在0℃攪拌反應(yīng)1h。用水猝滅反應(yīng)，用dcm萃取，用冷hcl水溶液(0.05n)、鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，濃縮得到粗甲磺酸酯，為橙色油。物質(zhì)通過(guò)用己烷中20-100％乙酸乙酯梯度洗脫層析純化，得到化合物83(87mg，45％產(chǎn)率)。lcmsm+na＝347.75.

在25℃攪拌dmf(0.3ml)中酚22(97mg，0.184mmol)、化合物83(20mg，0.061mmol)和cs2co3(60mg，0.184mmol)的懸浮體經(jīng)歷3h。在氮下去除溶劑。物質(zhì)通過(guò)用dcm中2-10％甲醇梯度洗脫硅膠層析純化，得到二聚體84(67mg，77％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1183.02.

使二聚體84(20mg，0.017mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，1.0ml，0.042mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(1.0mg，1.0μmol)。攪拌混合物30min，并使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，殘余物通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-09，為白色粉末(3.0mg，22％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝750.30.

在0℃向dcm(3ml)中喹啉-2，4-二基二甲醇85(100mg，0.529mmol)、net3(0.185ml，1.330mmol)的懸浮體加入mscl(0.095ml，1.224mmol)。在0℃攪拌反應(yīng)1h。用水猝滅反應(yīng)，用dcm萃取，用冷hcl水溶液(0.05n)、鹽水洗滌，經(jīng)na2so4干燥，濃縮得到粗甲磺酸酯，為橙色油。物質(zhì)通過(guò)用己烷中20-100％乙酸乙酯梯度洗脫層析純化，得到化合物86(80mg，44％產(chǎn)率)。lcmsm+na＝345.80.

在25℃攪拌dmf(0.3ml)中酚22(182mg，0.347mmol)、化合物86(40mg，0.116mmol)和cs2co3(113mg，0.347mmol)的懸浮體經(jīng)歷3h。在氮下去除溶劑。物質(zhì)通過(guò)用dcm中30-100％丙酮梯度洗脫硅膠層析純化，得到二聚體87(95mg，68％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝1202.60.

使二聚體87(20mg，0.017mmol)溶于dcm中吡咯烷(0.042m，0.4ml，0.017mmol)的溶液，并加入pd(pph3)4(1.0mg，1.0μmol)。攪拌混合物30min，并使其在dcm和飽和nh4cl之間分配。使相分離，水性部分用dcm再萃取兩次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，過(guò)濾，并蒸發(fā)成殘余物，殘余物通過(guò)hplc方法a純化。將樣品分成兩個(gè)相等注射。將包含產(chǎn)物峰的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體iia-07，為白色粉末(8.0mg，59％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝770.30.

實(shí)施例18-另外的中間體

根據(jù)圖19a的方案合成用于合成本發(fā)明二聚體的二溴化物91a-d。如synth.commun.1999，3719中所述制備原料88a和88b。原料88c從arkpharma得到。原料89d如wo2012/153253中所述制備。

用于制備中間體88a的以下方法為代表。

使甲醚88a(0.45g，2.0mmol)懸浮于乙醇(20ml)，并加入硼氫化鋰。在環(huán)境溫度攪拌混合物5h，然后通過(guò)加入乙酸猝滅。使混合物蒸發(fā)，并通過(guò)用dcm中0-20％meoh梯度硅膠層析純化，得到二醇89a(210mg，62％產(chǎn)率)。¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ6.87(s，2h)，5.33(brt，j＝5.5hz，2h)，4.47(brd，j＝4.9hz，4h)，3.84(s，3h).

使二醇89a(0.21g，1.24mmol)和三乙胺(0.52ml，3.72mmol)懸浮于dcm(6.2ml)，并在冰/水浴上冷卻。向此混合物加入mscl(0.22ml，2.85mmol)。使反應(yīng)混合物在相同溫度進(jìn)行2h，然后通過(guò)加水猝滅，并用dcm萃取。有機(jī)相用0.1nhcl洗滌，隨后用鹽水洗滌，然后經(jīng)硫酸鈉干燥。過(guò)濾后，使溶劑在減壓下蒸發(fā)，得到粗甲磺酸酯90a(0.4g，推定100％產(chǎn)率)，粗甲磺酸酯用于隨后步驟，不經(jīng)進(jìn)一步純化。lcmsm+h＝325.85.

使甲磺酸酯90a(0.44g，1.35mmol)溶于dmf(2.7ml)，并加入溴化鈉(696mg，6.76mmol)。攪拌混合物3h，在此時(shí)用水稀釋，通過(guò)過(guò)濾收集所得固體，并在真空下干燥，得到二溴化物91a(0.155g，39％產(chǎn)率)。¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ6.92(s，2h)，4.51(s，4h)，3.91(s，3h).lcmsm+h＝293.70.

類似地合成二溴化物91b-d：

91b：lcmsm+h＝319.70.

91c：¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.42(s，2h)，4.51(s，4h).

91d：¹hnmr(400mhz，氯仿-d)δ7.95(s，2h)，4.61(s，4h)，4.06-3.94(m，3h).

實(shí)施例19-二聚體iia-10、iia-11、iia-12、iia-13和iia-14

如圖19b中所示，通過(guò)用lioac處理，使化合物20轉(zhuǎn)化成化合物92。類似按照實(shí)施例5的方法和圖6的方案，使化合物92與二溴化物91a-d偶聯(lián)，以提供受保護(hù)的二聚體，然后用pd(pph3)4去保護(hù)，得到二聚體iia-10至iia-14。

(iia-10)：lcmsm+h＝750.05.

(iia-11)：lcmsm+h＝736(通過(guò)在去保護(hù)步驟中失去會(huì)導(dǎo)致二聚體iia-12的烯丙基而得到)。

(iia-12)：lcmsm+h＝776.05.

(iia-13)：lcmsm+h＝754.00.

(iia-14)：lcmsm+h＝778.05.

二聚體(iia-10)至(iia-14)不同之處在于橋連部分的性質(zhì)，如下概括：

實(shí)施例20-二聚體-連接體iiib-06和iiib-07

類似按照實(shí)施例14的方法和圖15的方案，從化合物22和二溴化物91a和91b分別制備二聚體-連接體iiib-06和iiib-07。

(iiib-06)：lcmsm+na＝1302.05.

(iiib-07)：lcmsm+h＝1267.

實(shí)施例21-二聚體-連接體iiib-08、iiib-08a、iiib-08b和iiib-08c

本實(shí)施例涉及制備在連接體中具有聚(乙二醇)(peg)部分的二聚體-連接體。存在peg部分可改善在綴合期間水性介質(zhì)中二聚體-連接體的溶解度。

使馬來(lái)酰亞胺化合物32和32a-b(均購(gòu)自quantabiodesign)與胺39(實(shí)施例6和圖7b)偶聯(lián)，以分別制備二聚體-連接體iiib-08、iiib-08a、iiib-08b和iiib-08c：

iiib-08：lcms(m+2h)/2＝816.55.

iiib-08a：lcms(m+2h)/2＝772.50.

iiib-08b：lcms(m+2h)/2＝728.40.

iiib-08c：lcmsm+na＝1390.05.

實(shí)施例22-二聚體iia-15

本實(shí)施例涉及制備二聚體iia-15，其中二氮雜環(huán)中的兩個(gè)亞胺基均已還原。

類似按照實(shí)施例5中的方法和圖5中的方案，使二溴化物34偶聯(lián)到化合物44，以得到雙-alloc化合物。后者用pd(pph3)4去保護(hù)得到二聚體iia-15。lcmsm+h＝724.45.

實(shí)施例23-二聚體-連接體iiib-09

本實(shí)施例和圖20涉及制備二聚體-連接體iiib-09，其中連接體具有氨基作為反應(yīng)性官能團(tuán)。通過(guò)在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)的綴合中作為胺給體，氨基可參與綴合，如上文討論。

一般按照實(shí)施例6和14的方法和分別關(guān)聯(lián)圖7a-7b和15的方案，用alloc化合物44、二溴化物34和化合物37制備化合物93。

類似按照實(shí)施例6的方法和圖7b的方案，使化合物94(0.079g，0.086mmol，quantabiodesign)與化合物93(0.091g，0.095mmol)偶聯(lián)，得到化合物95(40mg，27％產(chǎn)率)。lcms(m+2h)/2＝853.45.

使化合物95(40mg，0.023mmol)溶于dmf(1.0ml)，并加入二乙胺(0.1ml，0.957mmol)。使混合物老化1h，用dmf稀釋，并通過(guò)biotagec18柱純化：溶劑a＝95％水、5％乙腈+0.05％甲酸；溶劑b＝5％水、95％乙腈+0.05％甲酸；梯度20-100％。將包含產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過(guò)pl-hco3-mpspe500mg/6ml柱體，用乙腈洗脫，得到作為游離堿的產(chǎn)物的溶液。大部分有機(jī)溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，并通過(guò)凍干去除水，得到二聚體-連接體iiib-09，為白色粉末(18.5mg，51％產(chǎn)率)。lcms(m+2h)/2＝742.35.

實(shí)施例24-另外的中間體

本實(shí)施例和圖21涉及合成適用于合成在芳族環(huán)上具有另一個(gè)氮的thiq-thiq二聚體的中間體。

使氫化鈉(60％，2.72g，56.8mmol)溶于dmf(50ml)，并在冰浴中冷卻。經(jīng)約3min分批加入乙酰氨基丙二酸二乙酯97(6.17g，28.4mmol)，并反應(yīng)另外10min，直至起泡消退。經(jīng)約1min過(guò)程加入吡啶96(5g，28.4mmol，根據(jù)wo2002/036555制備)。用水稀釋反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用飽和nacl水溶液洗滌，經(jīng)na2so4干燥，并在真空中濃縮。生成兩種區(qū)域異構(gòu)體98a/b，將其認(rèn)作為混合物，不經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步驟(7.2g，79％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝321.10(具有相同質(zhì)量的2個(gè)峰).

用6nhcl(50ml，1646mmol)處理化合物98a/b的混合物(7.2g，22.48mmol)。使所得混合物回流3h。在已冷卻到rt后，在真空中濃縮反應(yīng)混合物。濃縮生成的棕色固體與二氧雜環(huán)己烷，并用甲醇研磨。收集兩批化合物99a/b的混合物，第一批為2.4g棕褐色固體，第二批為1.0g深棕色固體。不經(jīng)進(jìn)一步純化使用這些。

在室溫向化合物99a/b的混合物(1810mg，7.21mmol)依次加入meoh(20ml)和亞硫酰氯(1.578ml，21.62mmol)，然后使所得混合物回流20h。使反應(yīng)混合物完全濃縮，生成的固體用二氧雜環(huán)己烷再濃縮，以去除過(guò)量亞硫酰氯，得到棕色固體。用meoh研磨混合物，得到固體，使固體在na2co3和dcm之間分配，并再萃取2次。合并的有機(jī)相經(jīng)na2so4干燥，蒸發(fā)溶劑，得到化合物100a/b的混合物(1.2g，6.24mmol，87％產(chǎn)率)。

使化合物100a/b的混合物(1.2g，6.24mmol)溶于meoh(50ml)，并用libh4(0.136g，6.24mmol)處理。使混合物回流2h，蒸發(fā)，并與乙醇和甲苯共沸，得到化合物101a/b的混合物(1g，98％產(chǎn)率)。

使化合物101a/b混合物(1.0g，6.09mmol)溶于dmf(1ml)和乙腈(5.8ml)，并用tbs-cl(3.15ml，2.9m，9.13mmol)和咪唑(0.62g，9.13mmol)處理。靜置混合物20min，并蒸發(fā)大部分溶劑。使殘余物在水和etoac之間分配。水相用etoac萃取3次。用水洗滌合并的有機(jī)相，并經(jīng)na2so4干燥。過(guò)濾混合物以去除固體，并蒸發(fā)溶劑。殘余物用0-10％meoh/dcm在24g硅膠柱上快速層析。在這些條件下，兩種組分大部分拆分，但重組為化合物102a/b的混合物用于進(jìn)一步轉(zhuǎn)換(967mg，57％產(chǎn)率)。

按照實(shí)施例3的方法，加上必要的變更，用化合物102a/b的混合物(917mg，3.29mmol)繼續(xù)得到化合物106a/b的混合物。

103a/b：(1.39g，67％產(chǎn)率).lcmsm+h＝630.20(具有相同質(zhì)量的2個(gè)峰).

104a/b：(0.52g，62％產(chǎn)率).lcmsm+h＝600.20(具有相同質(zhì)量的2個(gè)峰).

105a/b：(0.50g，84％產(chǎn)率).lcmsm+h＝684.75(具有相同質(zhì)量的2個(gè)峰).

106a：(158mg，38％產(chǎn)率)lcmsm+h＝570.25(通過(guò)50-100％etoac/己烷梯度硅膠層析從106b分離后).

106b：(179mg，43％產(chǎn)率)lcmsm+h＝570.30(分離后).

實(shí)施例25-二聚體iia-16

本實(shí)施例和圖22涉及制備二聚體iia-16，該二聚體在外苯環(huán)之一中具有氮，即，式(i)中的一個(gè)g或g’為n。

按照實(shí)施例3的方法，加上必要的變更，使化合物106b轉(zhuǎn)化成對(duì)映異構(gòu)體108a和108b的混合物，對(duì)映異構(gòu)體108a和108b通過(guò)手性sec層析在用co2中20％meoh洗脫在ie柱上分離。108a：lcmsm+h＝411.95；25mg，23％產(chǎn)率)。108b：lcmsm+h＝411.95；22mg，20％產(chǎn)率。

類似按照實(shí)施例6的方法，使對(duì)映異構(gòu)體108b與化合物36偶聯(lián)，得到雙-alloc化合物109，然后用pd(pph3)4處理，得到iia-16(4.3mg，45％產(chǎn)率)。lcmsm+h＝721.30.

類似地使對(duì)映異構(gòu)體108a轉(zhuǎn)化成二聚體110，二聚體110在二聚體單元之一中具有非自然立體化學(xué)：

也類似地使化合物106a轉(zhuǎn)化成對(duì)映異構(gòu)體111a(lcmsm+h＝411.95；18.6mg，18％產(chǎn)率)和111b(lcmsm+h＝411.95；19mg，18％產(chǎn)率)。根據(jù)以上方法，加上必要的變更，可用這些對(duì)映異構(gòu)體制備二聚體。

實(shí)施例26-二聚體的生物活性

可對(duì)不同癌細(xì)胞系檢驗(yàn)本發(fā)明二聚體的細(xì)胞毒素活性，例如h226肺癌、dms79肺癌、h187肺癌、n87胃癌、786-o腎癌和/或ovcar3卵巢癌細(xì)胞系。通過(guò)atp發(fā)光檢驗(yàn)或mts細(xì)胞增殖檢驗(yàn)，可檢測(cè)二聚體抑制細(xì)胞增殖的能力。一般這兩種方法得到可比較的結(jié)果。

這是用于atp發(fā)光檢驗(yàn)的一般方法：對(duì)于atpcelltiterglo^tm檢驗(yàn)，分別在96孔板中以1x103細(xì)胞/孔接種細(xì)胞。將連續(xù)稀釋(1∶3)化合物加到孔。培養(yǎng)板72h。按照制造商的說(shuō)明書(shū)，用購(gòu)自promega的celltiterglo^tm細(xì)胞活力試劑盒檢驗(yàn)用試驗(yàn)化合物處理的細(xì)胞的atp含量。atp含量減小是細(xì)胞活力減小的量度?？捎胮rism^tm軟件，5.0版(graphpadsoftware，lajolla，ca，usa)計(jì)算ec50值，ec50值為一種藥劑減少細(xì)胞活力最大效果50％時(shí)的濃度。

如下進(jìn)行mts細(xì)胞增殖檢驗(yàn)。在細(xì)胞增殖檢驗(yàn)中，用購(gòu)自promega(madison，wi)的celltiter96含水非放射性細(xì)胞增殖試劑盒測(cè)定活細(xì)胞數(shù)。將腫瘤細(xì)胞以一定接種密度在無(wú)菌384孔黑色透明底部matrix板中以40μl/孔平板接種，并在檢驗(yàn)前在37℃在5％co2中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，用一組細(xì)胞板(10個(gè)板)測(cè)定0時(shí)細(xì)胞密度，并將3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基-1)-2h-四唑鎓以4μl/孔加入10個(gè)板，隨后在37℃在5％co2中培養(yǎng)3小時(shí)。這種四唑鎓試劑由肝細(xì)胞生物還原成可溶于水溶液的甲產(chǎn)物。在envision讀數(shù)器(perkinelmer，boston，ma)上檢測(cè)在490nm的吸光度。同一天，將化合物加入到余下的細(xì)胞板(t72板)，并在37℃在5％co2中培養(yǎng)。72小時(shí)后，將4μlmts試劑加入到那些細(xì)胞板。板進(jìn)一步在37℃在5％co2中培養(yǎng)3小時(shí)，并在envision讀數(shù)器上檢測(cè)在a490的吸光度值。

結(jié)果顯示于表i中：

實(shí)施例27-綴合物的生物活性

按照以上所述一般方法，使二聚體-連接體化合物綴合到抗巖藻糖基gm1抗體。對(duì)n87胃癌、dms79和/或h187小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行檢驗(yàn)，第一種細(xì)胞系表達(dá)間皮素，后兩者在其細(xì)胞表面上表達(dá)fucos87ylgm1。用³h胸苷檢驗(yàn)檢測(cè)活性(cong等人2014)。結(jié)果顯示于表ii中。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的綴合物中，抗體為抗巖藻糖基gm1或抗間皮素抗體。

本發(fā)明的上述詳細(xì)描述包括主要或全部涉及本發(fā)明的特定部分或方面的段落。應(yīng)當(dāng)理解，這是為了清楚和方便，特定特征可能不僅僅在其被公開(kāi)的段落中相關(guān)，并且本文的公開(kāi)內(nèi)容包括在不同段落中發(fā)現(xiàn)的信息的所有合適組合。類似地，盡管這里的各種附圖和描述涉及本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解，在具體特征公開(kāi)于特定附圖或?qū)嵤┓桨傅纳舷挛闹械那闆r下，這樣的特征也可以在適當(dāng)?shù)那闆r下用于另一附圖或?qū)嵤┓桨傅纳舷挛闹校c另一特征組合，或用于本發(fā)明的整體。

此外，雖然已經(jīng)就某些優(yōu)選實(shí)施方案特別地描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些優(yōu)選實(shí)施方案。相反，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。

參考文獻(xiàn)

下面提供了本說(shuō)明書(shū)中此前通過(guò)第一作者(或發(fā)明人)和日期以縮略的方式引用的以下參考文獻(xiàn)的完整引用。為了所有目的，將這些參考文獻(xiàn)的每一篇通過(guò)引用并入本文。

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