本發(fā)明基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，即抗原結(jié)合構(gòu)建體，特別是中和人過氧化氫酶或人sod1的單域vhh片段(納米抗體(nanobodies))引起比均由輕鏈和重鏈部分組成并且也都分別表現(xiàn)出對(duì)過氧化氫酶或sod1的中和效應(yīng)的經(jīng)典重組產(chǎn)生的fab片段或單克隆抗體在導(dǎo)致腫瘤凋亡的細(xì)胞內(nèi)ros強(qiáng)制信號(hào)通路(rosforcedsignalpaths)再活化中大超過100倍的效力。針對(duì)過氧化氫酶或sod的單域vhh片段的應(yīng)用再激活了細(xì)胞間ros信號(hào)傳導(dǎo)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。盡管過氧化氫酶和sod的保護(hù)作用部分是冗余的和相互關(guān)聯(lián)的，針對(duì)兩種保護(hù)性酶之一的單域vhh片段足以消除腫瘤細(xì)胞免受ros信號(hào)傳導(dǎo)的保護(hù)。這是基于這一事實(shí)，即sod僅實(shí)現(xiàn)部分保護(hù)作用，但是抑制sod導(dǎo)致間接對(duì)過氧化氫酶的抑制，這通過現(xiàn)在以增加的濃度存在的超氧化物陰離子實(shí)現(xiàn)。由抑制sod或過氧化氫酶引起的信號(hào)通路的質(zhì)量是不同的。過氧化氫酶的抑制允許no/過氧亞硝酸鹽(peroxynitrite)和hocl通路的順序激活，而抑制sod僅導(dǎo)致再激活no/過氧亞硝酸鹽路徑。下述發(fā)現(xiàn)是高度治療性意義的，即針對(duì)sod和過氧化氫酶的單域vhh片段協(xié)同合作，以及在優(yōu)選實(shí)施方案中的所述協(xié)同作用可以集中在雜合分子中。在此基礎(chǔ)上，公開了用結(jié)合sod或過氧化氫酶或這兩種抗原的抗原結(jié)合構(gòu)建體的腫瘤療法的有利形式。

發(fā)明背景

僅在幾年前才發(fā)現(xiàn)，活性氧和氮種類(氮類物質(zhì))(一起簡稱為活性氧種類＝“ros”)除了它們的非定向誘變作用之外也可以發(fā)揮特定的信號(hào)功能(baueretal.,chimica,62,1-9,2008)。所述發(fā)現(xiàn)的看法尤其由于下述實(shí)情而變得復(fù)雜，即通過某些ros，經(jīng)常可以引起相反的生物學(xué)效應(yīng)。

ep11170076.1公開了抑制腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性膜過氧化氫酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ros信號(hào)傳導(dǎo)的再激活，并因此導(dǎo)至腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞死亡。由于在sod的抑制之后，由相鄰的膜nadph氧化酶產(chǎn)生的超氧化物陰離子也不再轉(zhuǎn)化為h2o2，也可以通過抑制膜sod來間接實(shí)現(xiàn)對(duì)保護(hù)性過氧化氫酶的抑制。以這種方式，現(xiàn)在存在足夠高局部濃度的游離超氧化物陰離子，其將過氧化氫酶的活性中間體化合物i(catfe^iv＝o^.+)通過單電子轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)化為無活性中間體化合物ii(catfe^iv＝o)，并另外將活性過氧化氫酶(catfeⁱⁱⁱ)轉(zhuǎn)化為無活性化合物iii(catfeiiio2^.-)。通過這兩個(gè)反應(yīng)，有效地抑制了過氧化氫酶的活性(konoyandfridovichi:superoxideradicalinhibitscatalase.jbiolchem257:5751-5754,1982.shimizun,kobayashikandhayashik:thereactionofsuperoxideradicalwithcatalase.mechanismoftheinhibitionofcatalasebysuperoxideradical.jbiolchem259:4414-4418,1984)。

然而，對(duì)于ros在多階段腫瘤發(fā)生中的作用，現(xiàn)在可以畫出一個(gè)相當(dāng)清晰的圖畫，其知識(shí)可以顯示建立新的選擇性腫瘤治療方法的前進(jìn)之路(綜述于bauerg.tumorcellprotectivecatalaseasanoveltargetforrationaltherapeuticapproachesbasedonspecificintercellularrossignaling.anticancerres.32:2599–2624,2012；bauerg.targetingextracellularrossignalingoftumorcells.anticancerres.34:1467-1482,2014；bauerg.increasingtheendogenousnolevelcausescatalaseinactivationandreactivationofintercellularapoptosissignalingspecificallyintumorcells.redoxbiol.6:353-371.2015)：

1)ros的誘變作用有助于“腫瘤起始”的經(jīng)典步驟。

2)ros對(duì)“腫瘤促進(jìn)”的步驟至關(guān)重要，沒有詳細(xì)解釋根本的機(jī)制。因此，大多數(shù)已知的腫瘤促進(jìn)劑誘導(dǎo)增加的ros水平，并且ros的特異性清除抑制大多數(shù)腫瘤促進(jìn)劑的作用。

3)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化經(jīng)常導(dǎo)致膜nadph氧化酶(nox1)的表達(dá)。該酶的連續(xù)活性對(duì)于惡性細(xì)胞的增殖和維持轉(zhuǎn)化狀態(tài)至關(guān)重要。nox1產(chǎn)生細(xì)胞外超氧化物陰離子，其歧化產(chǎn)物h2o2代表細(xì)胞的自分泌增殖刺激劑。

4)然而，細(xì)胞外超氧化物陰離子的產(chǎn)生也代表了形成選擇性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)ros控制信號(hào)通路的基礎(chǔ)。這里，下面詳細(xì)說明的“hoc1信號(hào)路徑”和“no/過氧亞硝酸鹽信號(hào)路徑”是特別重要的。

因此，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞中特異性ros依賴性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作為惡性細(xì)胞的潛在消除機(jī)制加以討論。

5)腫瘤的成功發(fā)展需要產(chǎn)生ros的惡性細(xì)胞保護(hù)其自身免受ros信號(hào)傳導(dǎo)通路的破壞作用，從而并不影響其增殖所必需的自分泌ros產(chǎn)生。這導(dǎo)致了規(guī)律以及迄今為止所研究的所有腫瘤系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞的表型，并且其特征在于膜過氧化氫酶的組成型nox1活性和平行活性。另外，通過膜超氧化物歧化酶(sod)發(fā)生進(jìn)一步的ros信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。

6)這些膜保護(hù)酶的選擇性抑制允許在腫瘤細(xì)胞中的ros依賴性選擇性凋亡誘導(dǎo)，并因此具有很大的治療潛力。

考慮到由于相互作用而總體來說相當(dāng)復(fù)雜和難以預(yù)測的上面簡要概述并在下面進(jìn)一步解釋的機(jī)制，本發(fā)明公開了具有廣泛意義的抗原結(jié)合構(gòu)建體，其特別可用于腫瘤療法。因此，本發(fā)明的目的是抗原結(jié)合構(gòu)建體(即，單域vhh片段，還稱為納米抗體)，其特異性結(jié)合并優(yōu)選抑制超氧化物歧化酶或過氧化氫酶或前述兩種酶，即超氧化物歧化酶和過氧化氫酶。

wo2014/191493公開了針對(duì)sod1的單域抗體以及它們?cè)谥委焌ls(肌萎縮性側(cè)索硬化)中的用途。這里，als患者中致病性sod1的水平由針對(duì)sod1的單域抗體降低以達(dá)到積極效果。

根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體是針對(duì)過氧化氫酶或sod的單域vhh片段。這里，盡管由于vhh和fab片段的不同結(jié)構(gòu)(一條鏈對(duì)兩條鏈)(預(yù)期只有50％的濃度差異)，相同的凋亡引起效果是用相當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)fab片段濃度的不到百分之一來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于所有過氧化氫酶或sod中和單域vhh片段發(fā)現(xiàn)功效的此顯著差異，并因此代表其特征性特點(diǎn)。這指示常規(guī)fab片段和單域vhh片段的鍵動(dòng)力學(xué)與鍵可逆性之間在片段效果以及因此還在其極大改善的治療性采用可能性上一定存在到目前為止還未認(rèn)識(shí)到并且無法預(yù)測的基本差異以及深遠(yuǎn)的后果。作為解釋該發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)，可以使用通過經(jīng)典fab片段(由免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合部分組成)和通過單域抗體的vhh片段(其僅由重鏈的抗原結(jié)合部分組成)的表位鑒定之間的差異。雖然經(jīng)典的fab片段通過由fab片段的空間結(jié)構(gòu)和表面電荷定義的鍵結(jié)合特異性表位，并且在一定程度上包括它，單域vhh片段具有插入形狀結(jié)構(gòu)(plug-shapedstructure)，其適合于靶分子的就形狀和電荷而言互補(bǔ)的凹部(muyldermanss.nanobodies:naturalsingledomainantibodies.ann.rev.biochem.82:775-797,2013)。假設(shè)有效抑制過氧化氫酶或sod的本申請(qǐng)中公開的單域vhh片段結(jié)合到這些酶特征性的漏斗(funnel)中，并將底物分子傳遞到活性中心?？梢韵胂?，在此類結(jié)合之后，誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化，這有效地防止了逆反應(yīng)，即終止單域vhh片段與抗原之間的鍵。通過這種方式，由于沒有發(fā)生逆反應(yīng)，由直接和逆反應(yīng)的反應(yīng)常數(shù)確定的生物物理參數(shù)“親和力”大大增加。在應(yīng)用實(shí)踐中，通過這種方式，單域vhh片段比傳統(tǒng)的fab片段實(shí)現(xiàn)了更有效的中和效果，盡管它們的結(jié)合應(yīng)該以相同的效率進(jìn)行。單域vhh片段在抑制特異性酶中的這個(gè)基本優(yōu)勢尚未被描述，并且是令人驚奇的。

不能排除某些單域vhh片段通過它們的結(jié)合發(fā)生在酶中不同于活性中心的位置的事實(shí)來實(shí)現(xiàn)其對(duì)過氧化氫酶或sod的抑制作用，但是以這種方式通過蛋白質(zhì)中已知的變構(gòu)的遠(yuǎn)距離效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的抑制作用。由于根據(jù)本發(fā)明的結(jié)果，也對(duì)于一系列效果的這種變化，可以假設(shè)單域vhh片段對(duì)引起變構(gòu)抑制的酶上的區(qū)域的親和力必須顯著高于通過經(jīng)典fab片段可以實(shí)現(xiàn)的親和力。因此，本發(fā)明不限于直接結(jié)合酶的活性中心的單域vhh片段。

關(guān)于人造產(chǎn)生的抗體片段的結(jié)構(gòu)，應(yīng)該指出，同時(shí)存在著龐大的各種不同的結(jié)構(gòu)。在holligeretal.(2005),naturebiotechnology,vol.23,no.9,第1126-1136頁的文章中，已經(jīng)說明和解釋了抗原結(jié)合分子的各種結(jié)構(gòu)。除了根據(jù)本發(fā)明使用的vhh單域片段，還有許多其他的結(jié)構(gòu)，如fab片段、單鏈fv、雙價(jià)抗體(diabodies)、微型抗體(minibodies)、三價(jià)抗體(triabodies)等。

根據(jù)本發(fā)明使用的單域抗體片段衍生自駱駝科(駱駝,羊駝(llama),羊駝(alpaca))的抗體分子。天然表型中的這些抗體具有fc部分(具有ch2和ch3)，但由兩條重鏈組成，每條重鏈又具有含cdr的vhh部分。輕鏈不具有駱駝科的這些抗體。這些vhh部分被稱為單域vhh片段或還稱為納米抗體。

根據(jù)本發(fā)明的單域vhh片段可以原樣使用或也可以化學(xué)修飾以實(shí)現(xiàn)特定的目的。通過共價(jià)化學(xué)鍵或通過其它化學(xué)相互作用(例如離子相互作用或范德華力)的根據(jù)本發(fā)明的單域vhh片段可以與具有有利的作用的其他成分連接。這些可以是與可以結(jié)合特定細(xì)胞的生物活性分子如配體和/或受體的綴合物。根據(jù)本發(fā)明的單域vhh片段也可能與成像材料連接，如放射性核素、產(chǎn)生顏色的酶等。根據(jù)本發(fā)明的分子也可以與導(dǎo)致體內(nèi)延長的保留時(shí)間的分子相連接；這可以例如通過將它們連接到較大的聚合物(如例如聚乙二醇)來實(shí)現(xiàn)。在eyeretal.,veterinarnimedicina(2012),9,第439-531頁的綜述文章中公開了單域vhh片段的各種可能的應(yīng)用選項(xiàng)和修飾。明確引用該參考文獻(xiàn)。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，有代表性的雜合分子，其“自身濃縮”協(xié)同效應(yīng)，盡管由于結(jié)構(gòu)，可以排除同一個(gè)雜合分子同時(shí)結(jié)合過氧化氫酶和sod。這將這些雜合分子從經(jīng)典的雙特異性抗體的效應(yīng)分開，所述雙特異性抗體通常必須結(jié)合兩個(gè)靶結(jié)構(gòu)以達(dá)到預(yù)期的效果。

本發(fā)明的主要方面在于抗原結(jié)合構(gòu)建體不僅特異性地結(jié)合各自的靶分子(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)，而且還抑制它們。所述方面通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測試。在合適的測試模型中，例如在細(xì)胞表面表達(dá)期望的靶分子(過氧化氫酶或超氧化物歧化酶)的腫瘤細(xì)胞，或在加入了純化的sod或過氧化氫酶的測試系統(tǒng)中，添加用于各種酶的底物或由細(xì)胞產(chǎn)生。然后，通過適當(dāng)?shù)臏y量方法測量離析物(educts)的消耗或產(chǎn)物的產(chǎn)生。這里，還可以有使用生物過程(如例如腫瘤細(xì)胞的ros依賴性凋亡的誘導(dǎo))作為參數(shù)的應(yīng)用方法。所述一般相當(dāng)靈敏的生物學(xué)方法的意義的先決條件在于被測試酶降解的底物在可控和定量的情況下具有測量的生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)于sod和過氧化氫酶尤其如此。例如，sod將細(xì)胞內(nèi)ros信號(hào)傳導(dǎo)所需的超氧化物陰離子代謝為h2o2，并因此防止hocl依賴性凋亡誘導(dǎo)所需的超氧化物陰離子和hocl之間的相互作用。

因此，可以通過這一事實(shí)，即通過采用外源添加hocl的腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作為測試系統(tǒng)來確定單域vhh或fab片段(比較)介導(dǎo)的sod抑制。hocl以基于hocl和超氧化物陰離子之間的相互作用的濃度依賴性方式誘導(dǎo)凋亡，所述相互作用導(dǎo)致形成攻擊性羥基自由基(bauerg.hocl-dependentsingletoxygenandhydroxylradicalgenerationmodulateandinduceapoptosisofmalignantcells.anticancerres33:3589-3602,2013)。所述凋亡誘導(dǎo)被以適當(dāng)濃度外源性加入的sod完全抑制。即，可以通過檢查凋亡的抑制是否被待測單域vhh或fab片段再次消除來確定單域vhh或fab片段的中和作用。所述測試系統(tǒng)的定量使用需要連接技術(shù)人員熟悉的幾個(gè)簡單的步驟。在第一步中，確定在合理的試驗(yàn)時(shí)間(1-2小時(shí))內(nèi)產(chǎn)生顯著可定量的細(xì)胞凋亡信號(hào)的市售hocl(或在培養(yǎng)基中充分形成hocl的次氯酸鈉)的濃度。經(jīng)驗(yàn)顯示，0.1-1mm的hocl濃度是非常適合的。適當(dāng)?shù)?，參?shù)是凋亡細(xì)胞的百分比(通過相差顯微鏡直接測定)或(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)測試，該測試是市售的并且通過測量線粒體代謝活性來確定細(xì)胞活力。在第二步中，測定sod的濃度，所述濃度僅僅足以完全抑制所選擇的hocl濃度的影響。如經(jīng)驗(yàn)所示，對(duì)此，sod濃度在5至50u/ml之間是合適的。所述測定的準(zhǔn)確度是特別重要的，因?yàn)閏u/zn-sod的hocl效應(yīng)的抑制表示其自身作為最佳曲線，并且達(dá)到最佳抑制效果對(duì)測試的意義至關(guān)重要。一旦前兩步已經(jīng)令人滿意地進(jìn)行，就可以進(jìn)行單域vhh或fab片段的抑制作用的實(shí)際測試。對(duì)此，將待測試的片段的所選濃度與在步驟#2中預(yù)先測定的sod的最佳濃度預(yù)孵育20分鐘。隨后，將所述混合物加入到測試細(xì)胞中。此后，加入hocl并測定凋亡誘導(dǎo)。如果將對(duì)sod的抑制效果消除了至少90％，則獲得sod的最佳抑制，從而獲得中和效果的明確結(jié)果，即實(shí)現(xiàn)了沒有添加sod的凋亡誘導(dǎo)僅僅低10％的凋亡誘導(dǎo)。如果實(shí)現(xiàn)了特征在于實(shí)現(xiàn)無sod的比較值的凋亡誘導(dǎo)的至少50％的對(duì)sod的抑制作用，則對(duì)sod有顯著的抑制作用。通過在隨后的試驗(yàn)中增加單域vhh或fab片段濃度可以進(jìn)一步檢查此類發(fā)現(xiàn)的含義，因?yàn)樵趩斡騰hh或fab片段的濃度增加時(shí)sod顯著抑制的情況下，預(yù)期增加凋亡誘導(dǎo)的恢復(fù)。

用于確定針對(duì)過氧化氫酶的單域vhh或fab片段的中和作用，基于h2o2的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用和過氧化氫酶h2o2降解的試驗(yàn)系統(tǒng)是合適的。這里，可以使用非惡性和惡性細(xì)胞兩者作為細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)。僅需要在選擇的細(xì)胞系統(tǒng)中凋亡誘導(dǎo)是可定量測定的。作為h2o2源，h2o2生成性葡萄糖氧化酶(gox)優(yōu)于直接加入h2o2，因?yàn)橥ㄟ^gox連續(xù)產(chǎn)生h2o2(通過使用來自細(xì)胞的培養(yǎng)基的葡萄糖)允許非常精確調(diào)節(jié)h2o2通量。測試系統(tǒng)基于抑制通過由過氧化氫酶介導(dǎo)的gox的凋亡誘導(dǎo)以及通過過氧化氫酶-中和單域vhh或fab片段恢復(fù)凋亡誘導(dǎo)。在第一步中，測定了在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(1-2小時(shí))內(nèi)顯著抑制凋亡的gox的濃度。對(duì)此，一般取決于細(xì)胞系統(tǒng)，需要0.1至40mu/ml的gox濃度。在第二步中，測定了人過氧化氫酶的濃度，所述濃度僅僅足以消除gox實(shí)現(xiàn)的效果。經(jīng)驗(yàn)顯示，其所需的濃度范圍在小于20u/ml的過氧化氫酶的范圍內(nèi)。成功測定合適濃度的gox和過氧化氫酶后，然后可以進(jìn)行用于測定單域vhh或fab片段的過氧化氫酶-中和效應(yīng)的實(shí)際實(shí)驗(yàn)。對(duì)此，將所選擇的過氧化氫濃度與所測試的單域vhh或fab片段的選定濃度預(yù)孵育20分鐘。隨后，將所述混合物與確定為合適的gox濃度一起加入到細(xì)胞中，并測量凋亡誘導(dǎo)。如果過氧化氫酶對(duì)gox介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)的抑制作用被消除至少90％(即，如果實(shí)現(xiàn)不加入過氧化氫酶的對(duì)照制劑所示的凋亡誘導(dǎo)值的90％)，則獲得單區(qū)vhh或fab片段的可靠的中和作用。如果消除了過氧化氫酶的抑制作用至少50％，則可假設(shè)測試的單域vhh或fab片段具有顯著的抑制作用。通過在隨后的試驗(yàn)中增加所述片段的濃度，可以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步檢查這一發(fā)現(xiàn)。

作為此處列出的測試方法的對(duì)照，采用了結(jié)合完全不同抗原的抗原結(jié)合構(gòu)建體。然后，在實(shí)際測試中，如上述詳細(xì)所述，將每個(gè)待研究的構(gòu)建體添加到反應(yīng)混合物中，并且測定過氧化氫酶或超氧化物歧化酶的酶活性是否被抑制。以此目的，可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易熟悉的各種測試模型。該發(fā)現(xiàn)對(duì)于能夠確定抗原結(jié)合構(gòu)建體以何種方式結(jié)合靶酶(分別為過氧化物酶或sod)是重要的。

假設(shè)在大多數(shù)情況下，其中抗原結(jié)合構(gòu)建體不結(jié)合催化中心或在其附近結(jié)合，酶活性不被或基本上不被抑制。然而，如果抗原結(jié)合構(gòu)建體直接結(jié)合催化中心或在其空間附近結(jié)合，或者盡管結(jié)合遠(yuǎn)離催化中心，但的確通過變構(gòu)效應(yīng)改變靶酶的構(gòu)象，使得酶的正常反應(yīng)不能再自由順其自然進(jìn)行，反應(yīng)物不能再與酶反應(yīng)，并且不能再自由發(fā)生轉(zhuǎn)化。由于生化系統(tǒng)絕對(duì)值的確定總是有差異的，優(yōu)選在一個(gè)測試制劑中進(jìn)行此類測試，其中處于相同狀態(tài)和相同量的細(xì)胞經(jīng)受不同的測試條件以能做出敘述(statement)。在本發(fā)明的含義中，如果通過加入適量的抗原結(jié)合構(gòu)建體，相應(yīng)酶的催化活性(或相應(yīng)酶群體的總活性)降低至少50％，優(yōu)選降低至少70％，和特別地優(yōu)選降低至少90％，則獲得超氧化物歧化酶和/或過氧化氫酶的抑制作用。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了抗原結(jié)合構(gòu)建體(優(yōu)選納米抗體)，其結(jié)合過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶并且其不抑制或僅部分抑制這些酶。此外，可以有利地使用這些抗原結(jié)合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體例如被配置為使得它們可以連接到或連接到用作標(biāo)志物的部件。通過這種方式，例如可以標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，如果這是在合適的檢測系統(tǒng)中提供相應(yīng)信號(hào)的標(biāo)志物的話?；蛘?，這些構(gòu)建體也可以與細(xì)胞毒劑連接或配置為使得它們可以與所述細(xì)胞毒劑連接或者任選地在目標(biāo)生物體內(nèi)將其自身與所述細(xì)胞毒性效應(yīng)物連接。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了混合物，其中一些抗原結(jié)合構(gòu)建體抑制過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶并且其他構(gòu)建體不抑制或僅部分抑制超氧化物歧化酶和/或過氧化氫酶。這些也可以是包含兩種不同抗原結(jié)合構(gòu)建體的雜合分子。

根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合單域vhh片段優(yōu)選通過基因工程生產(chǎn)，并且不具有像完全抗體一樣的fc部分。它們不同于經(jīng)典的fab片段之處在于缺少輕鏈。即，它們僅是抗體重鏈的抗原結(jié)合部分。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，通過遺傳工程制備并測序了各種優(yōu)選的抗原結(jié)合片段。序列在本申請(qǐng)中公開。對(duì)于抗原結(jié)合序列特別重要的是構(gòu)建體的cdr區(qū)。所謂的“互補(bǔ)決定區(qū)”(以下簡稱cdr)是免疫球蛋白可變鏈的非常特定的部分。所述cdr區(qū)嵌入免疫球蛋白的框架序列內(nèi)，決定其特異性，并建立與免疫球蛋白結(jié)合的特異性抗原的接觸。cdr區(qū)域是免疫球蛋白最可變的部分并且基本上有助于這些分子的種類。在具有重鏈和輕鏈的免疫球蛋白中有六個(gè)cdr區(qū)。然而，如果免疫球蛋白僅由一條鏈組成(如在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的單域vhh片段的情況下)，則有三個(gè)cdr區(qū)域。

通常，重要的是如果要保持結(jié)合特異性，則cdr區(qū)幾乎不變存在。然而，可能的是，輕微的突變不會(huì)不利地影響抗體結(jié)合構(gòu)建體的功能。如果cdr的結(jié)構(gòu)不受氨基酸交換的不利影響，則尤其如此。如果新插入的氨基酸與替代的氨基酸非常相似，則可以進(jìn)行此類氨基酸交換。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段具有在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)公開的cdr區(qū)或者它們最多在來自分別公開的cdr序列的較少數(shù)量的氨基酸上不同，其不顯著改變或降低可結(jié)合性和結(jié)合特異性。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，公開了來源于此類構(gòu)建體的抗原結(jié)合單域vhh片段的cdr區(qū)，所述構(gòu)建體抑制或不抑制過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶，但的確結(jié)合它們。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單域vhh片段(納米抗體)含有至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)并最優(yōu)選至少三個(gè)cdr區(qū)，其中特別優(yōu)選那些來自抑制過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶的構(gòu)建體的cdr區(qū)。

當(dāng)它們傾向于治療應(yīng)用時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可優(yōu)選是人源化的。這里，框架序列由人框架物質(zhì)代替或者將非人序列通過突變變成人序列，但保持結(jié)合特性。

對(duì)于開發(fā)治療上可用的生物分子(這里指納米抗體)，修飾氨基酸序列經(jīng)常是不可避免的。由于分子不來源于人而源自駱駝科，有可能或可能的是，產(chǎn)生針對(duì)外源表位的抗體。此類抗體反應(yīng)將中和用于療法中的抗體片段的效果。為避免這些困難，治療上應(yīng)用的分子是人源化的?？贵w或抗體片段的人源化是在這一特殊領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)。通常，尋找與原始分子具有最高可能相似性的人框架序列(主鏈)。然后，從原始納米抗體上切出cdr區(qū)并移植入人序列中。這里，不排除必須進(jìn)行氨基酸序列的某些改變。

重要的方面是，抗原上的與抗體的結(jié)合部分結(jié)合的位點(diǎn)由cdr序列定義。人源化過程中，可能需要稍微修飾三個(gè)cdr序列中的一個(gè)或兩個(gè)以維持抗原結(jié)合部分的有利性質(zhì)。因此，根據(jù)本發(fā)明的單域vhh片段的特征在于它們含有如本申請(qǐng)中公開的至少一個(gè)cdr序列，優(yōu)選地兩個(gè)和特別優(yōu)選地三個(gè)cdr序列。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)是單域vhh片段，其具有至少一個(gè)，優(yōu)選地至少兩個(gè)和特別優(yōu)選地至少三個(gè)以下以seqid編號(hào)為特征的cdr區(qū)。這些是具有seqid編號(hào)19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，以及30的序列。進(jìn)一步優(yōu)選的源自結(jié)合sod的克隆的cdr序列是具有seqid編號(hào)31、32、33、34、35、36、37、38，和39的cdr。還優(yōu)先的是具有seqid編號(hào)40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，和51的cdr序列。

在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體還可以提供有標(biāo)志物。對(duì)于該應(yīng)用，不必要的是構(gòu)建體在其功能上抑制靶酶。相反，具有足夠親和力的特定鍵就足夠了。此類結(jié)合可以在經(jīng)典的elisa系統(tǒng)中測量，其中人過氧化氫酶或sod與合適的載體結(jié)合，并且通過常用檢測方法檢測酶和單域vhh片段的復(fù)合物。一方面，標(biāo)志物可用于標(biāo)記所需的腫瘤細(xì)胞，以便在此處得到診斷報(bào)告。另一方面，標(biāo)志物也可以用于標(biāo)記其他效應(yīng)物的腫瘤細(xì)胞。例如，作為標(biāo)志物，可以使用此類構(gòu)建體，所述構(gòu)建體將其它們自身與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)物連接。此類標(biāo)志物的一個(gè)例子是與細(xì)胞毒性t細(xì)胞的cd3受體反應(yīng)的抗cd3部分。例如此類抗cd3部分可以是針對(duì)cd3受體的抗體的抗原結(jié)合部分。

在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，還可以配置本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體使得其可以連接細(xì)胞毒劑。作為細(xì)胞毒劑，已知例如源自各種來源的各種毒素，例如細(xì)菌、真菌，或植物。優(yōu)選地，這可以是霍亂毒素、肉毒毒素，或鏈球菌溶血素等。

在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體可以通過鍵合的不同類型和可能性與細(xì)胞毒劑連接。這些還可以是化學(xué)鍵，如共價(jià)鍵以及離子相互作用或范德華力。

在另外的實(shí)施方案中，也可能的是，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體可以是放射性同位素或與放射性同位素緊密地連接。放射性同位素可用于腫瘤細(xì)胞的診斷檢測或增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體的細(xì)胞毒性作用，通過使放射性同位素與腫瘤細(xì)胞接近來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，在治療應(yīng)用中，使用此類同位素，其僅相對(duì)較短輻射，以保持副作用盡可能低。此外，同位素的半衰期應(yīng)相對(duì)較短以將身體和環(huán)境的負(fù)擔(dān)保持在可接受的范圍內(nèi)。優(yōu)選使用的是釔-90、錸-186或鉺-169。

在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體可以通過鍵合的不同類型和可能性與著色劑連接。這些可以是固體化學(xué)鍵如共價(jià)鍵以及離子相互作用或范德華力?？梢酝ㄟ^不同的常用方法檢測著色劑。此類構(gòu)建體對(duì)于診斷目的應(yīng)當(dāng)是可用的。

在另外的實(shí)施方案中，公開了藥物組合物，其含有根據(jù)本發(fā)明的至少一個(gè)抗原結(jié)合構(gòu)建體。這些藥物制備物優(yōu)選用于治療腫瘤疾病，特別是治療胃癌(gastriccarcinoma)。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物含有至少一個(gè)特異性結(jié)合并抑制過氧化氫酶的抗原結(jié)合構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物含有至少一個(gè)特異性結(jié)合并抑制超氧化物歧化酶的抗原結(jié)合構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物含有結(jié)合過氧化氫酶和超氧化物歧化酶并抑制這兩種靶酶的雜合分子。

令人驚訝并預(yù)測不到的是，雜合分子的協(xié)同效應(yīng)專門再激活no/過氧亞硝酸鹽通路，而單獨(dú)的抗sod也再激活該通路，但抗過氧化氫酶誘導(dǎo)hocl通路。通過雜合分子的no/過氧亞硝酸鹽通路的專門再激活代表未來應(yīng)用的優(yōu)勢，因?yàn)閼?yīng)當(dāng)通過額外的no代謝修飾來進(jìn)一步優(yōu)化不太復(fù)雜的no/過氧亞硝酸鹽通路，特別是鑒于劑量效應(yīng)關(guān)系的平臺(tái)期的期望寬度。

通過抗sod或來自抗sod和抗cat的雜合分子的no/過氧亞硝酸鹽通路的專門再激活的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，由于在no/過氧亞硝酸鹽通路過程中的信號(hào)化學(xué)(圖1-4)，不應(yīng)存在游離h2o2。這是期望的，因?yàn)閔2o2對(duì)存活的腫瘤細(xì)胞具有不利于治療效果的增殖刺激作用。ep11170076.1中沒有公開這里公開的抗sod或來自抗過氧化氫酶和抗sod的雜合分子的治療用途的優(yōu)點(diǎn)的原理，并且具有令人驚訝的效果。該效果表示存在創(chuàng)造性。

在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一個(gè)抗原結(jié)合構(gòu)建體與具有抗腫瘤活性的活性成分一起使用。已知具有抗腫瘤作用的各種活性成分。特別是，作為也可以存在于本發(fā)明組合物中的化學(xué)治療劑，可以提到物質(zhì)諸如泰素(taxol)、順鉑、內(nèi)皮抑素、奧沙利鉑、依托泊苷或秋水仙堿，僅舉幾例活性成分為例。優(yōu)選使用泰素。

根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體是可以通過遺傳工程制備的單域vhh片段。

抗原結(jié)合構(gòu)建體中個(gè)體片段的精確分子排列具有次要的意義，只要期望的功能(即結(jié)合和抑制過氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶)得到保留即可。

用分子生物學(xué)手段制備根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體。這些不是天然存在的抗體或通過簡單(酶促)切割從中制備的fab片段。為了更好地了解，可以簡要概述抗體的結(jié)構(gòu)。例如igg型的抗體由兩個(gè)fab片段和一個(gè)fc片段組成。每個(gè)fab片段由重鏈和輕鏈組成，其中重鏈可以分為可變部分(vh)和恒定部分(ch1)并且輕鏈可以分為可變部分(vl)和恒定部分(cl)。特別感興趣的是可變部分vh和vl，其又含有與抗原結(jié)合有關(guān)的cdr(互補(bǔ)決定區(qū))1-6。fab片段的結(jié)合特性由嵌入在空間上排列個(gè)體cdr區(qū)的框架結(jié)構(gòu)中的cdr區(qū)決定。

抗原結(jié)合構(gòu)建體是單域vhh片段(納米抗體)。納米抗體僅含有與結(jié)合相關(guān)的抗體的重鏈的部分，并且可以在細(xì)菌細(xì)胞中非常好地表達(dá)(muyldermanss.nanobodies:naturalsingle-domainantibodies.ann.rev.biochem.82:775-797,2013)。

在各種遺傳工程方法的幫助下，可以制備一些抗原結(jié)合構(gòu)建體。用于此的方法是相當(dāng)多樣的并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。通常，這里，進(jìn)行以使得用所需的抗原免疫實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(小鼠、大鼠、兔、雞或駱駝、羊駝等)。由于除常規(guī)抗體外，駱駝和羊駝天然還具有專門由重鏈構(gòu)成的igg，這些動(dòng)物與已建立的選擇性篩選方法結(jié)合使用導(dǎo)致獲得編碼單域抗體的核酸序列。然后，從合適的免疫細(xì)胞(如b細(xì)胞)，可以分離使用適當(dāng)方法(例如用所謂的噬菌體展示)進(jìn)一步優(yōu)化的核酸序列。然后，用這些方法獲得特異性結(jié)合所需抗原的抗原結(jié)合構(gòu)建體分子。在該語境中，特異性意指構(gòu)建體盡可能地僅所尋求的結(jié)合分子，更優(yōu)選地僅結(jié)合所述分子(sod或過氧化氫酶)的表位。非特異性交叉反應(yīng)通常是不期望的。

所述抗原結(jié)合構(gòu)建體的另一重要特性在于它們靈敏地結(jié)合所需的抗原。靈敏地意指已經(jīng)在抗原結(jié)合構(gòu)建體的非常低的濃度下，發(fā)生特異性結(jié)合所需抗原或所需表位。簡言之，抗原結(jié)合構(gòu)建體與目標(biāo)抗原結(jié)合的越好則它越靈敏。由于單域vhh片段不包含像fab片段那樣的某些表位，但由于它們的分子結(jié)構(gòu)結(jié)合抗原的空間凹槽，這導(dǎo)致關(guān)于通過這些兩個(gè)類型的單域vhh片段的某些表位的可檢測性的實(shí)質(zhì)差異。

根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體特異性結(jié)合超氧化物歧化酶并抑制該酶。靶分子超氧化物歧化酶的抑制受到以下事實(shí)的影響：抗原結(jié)合構(gòu)建體結(jié)合超氧化物歧化酶(sod)的催化活性中心或該催化中心的附近結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)酶的空間抑制。然后，超氧化物陰離子(sod的典型和特異性底物)不再能與酶結(jié)合且不能通過它被酶促轉(zhuǎn)化為h2o2。

這適用于過氧化氫酶。根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合構(gòu)建體特異性地并靈敏地結(jié)合過氧化氫酶并抑制它，使得h2o2向h2o+1/2o2，或者過氧化亞硝酸鹽向no2^-和1/2o2的酶促轉(zhuǎn)化被抑制，并且防止了通過過氧化氫酶的活性中間體“化合物i”的no氧化。

在本申請(qǐng)中，使用以下列表中給出的縮寫：

aebsf4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟、

(nadph氧化酶的抑制劑)

3-at3-氨基三唑

(過氧化氫酶抑制劑)

抗cat針對(duì)抗過氧化氫酶的抗體

抗sod針對(duì)sod的抗體

(為了圖片中的空間，用acat和asod替代抗cat和抗sod的名稱)

cat過氧化氫酶

化合物i公式catfe^iv＝o^+.的過氧化氫酶和公式podfe^iv＝o^.+的過氧化物酶兩者的活化中間階段。化合物i是在過氧化氫酶或過氧化物酶與一分子過氧化氫的反應(yīng)中形成的。過氧化氫酶也可以與一分子過氧亞硝酸鹽形成化合物i。

duox雙重氧化酶

(由nadph氧化酶和過氧化物酶結(jié)構(gòu)域組成的膜酶。過氧化物酶結(jié)構(gòu)域在蛋白酶的幫助下被切除。)

fbs胎牛血清

fetpps5-,10-,15-,20-四(4-磺酸基苯基)卟啉鐵(iii)氯化物

(過氧亞硝酸鹽分解催化劑)

no一氧化氮

nod一氧化氮雙加氧酶(將no氧化成硝酸鹽)

nosno合酶

noxnadph氧化酶(這里，特別是膜nox-1)

pod過氧化物酶

(在本文中特別是某些過氧化物酶的能力發(fā)揮作用，其在過氧化氫存在下，它們能夠?qū)⒙然镅趸蒱ocl)

pon過氧化亞硝酸鹽

por細(xì)胞色素p450氧化還原酶

ras,rac癌基因

ros活性氧和氮種類

(自由基種類和非自由基種類，諸如超氧化物陰離子、羥基自由基、一氧化氮、過氧化氫、hocl、過氧亞硝酸鹽等)

sirna小干擾rna

(特異性下調(diào)定義的基因產(chǎn)物合成的試劑)

sod超氧化物歧化酶

(這里，特別是sod-1(腫瘤細(xì)胞的活性中心中的cu⁺⁺和來自細(xì)菌的mnsod，用于分析目的)

tgf-beta轉(zhuǎn)化生長因子beta型

以下圖解表示首先將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)的ros信號(hào)傳導(dǎo)通路聯(lián)合起來(方案1：hocl通路；方案2：no/過氧化亞硝酸鹽通路)然后，顯示膜過氧化氫酶和sod對(duì)這些信號(hào)通路的腫瘤細(xì)胞的特異性作用(方案3和4)。

附圖簡述

圖1：方案1(hocl信號(hào)通路)顯示惡性轉(zhuǎn)化的以nox1和duox(由nox1相關(guān)nox結(jié)構(gòu)域和過氧化物酶結(jié)構(gòu)域組成)表達(dá)為特征的細(xì)胞的膜。這里，nox1的表達(dá)代表惡性細(xì)胞的特定特征，而duox也可以在正常細(xì)胞中檢測到。通過基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)的作用，釋放了過氧化物酶結(jié)構(gòu)域①。由nox1生成的超氧化物陰離子②歧化為h2o2③，其由過氧化物酶用作底物④。這里從天然過氧化物酶(podfeⁱⁱⁱ)形成了能夠?qū)⒙入x子氧化成hocl⑤的反應(yīng)性中間物“化合物i”(podfe^iv＝o⁺)。存在于微摩爾濃度范圍內(nèi)的hocl在它與超氧化物陰離子反應(yīng)形成凋亡誘導(dǎo)的羥基自由基時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性作用⑥。這里，決定性的步驟是通過羥基自由基的脂質(zhì)過氧化⑦，其經(jīng)由形成神經(jīng)酰胺，導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體通路(未示出)。如果相對(duì)于過氧化物酶有相對(duì)過量的h2o2，通過消耗hocl⑧或阻止其合成⑨的示于⑧和⑨中的反應(yīng)可能導(dǎo)致hocl信號(hào)通路的終止。

圖2：方案2顯示了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的no/過氧亞硝酸鹽信號(hào)通路。no合酶(nos)產(chǎn)生一氧化氮(no)①。相當(dāng)大的一部分的no由no雙加氧酶(nod)轉(zhuǎn)化為硝酸鹽②。這里通過細(xì)胞色素p450依賴的氧化還原酶(por)來控制nod。no展示出高膜滲透性③并能夠與轉(zhuǎn)化細(xì)胞外部產(chǎn)生的超氧化物陰離子反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽(onoo^-)④。由過氧亞硝酸鹽質(zhì)子化形成的過氧亞硝酸(onooh)⑤極快地分解為no2和凋亡誘導(dǎo)羥基自由基⑥。反應(yīng)順序⑦-顯示no的替代反應(yīng)選項(xiàng)，其共同代表消耗反應(yīng)并能夠弱化或終止no/過氧亞硝酸鹽通路。然而，該消耗反應(yīng)代表通過增加no濃度來調(diào)節(jié)h2o2依賴性過程的選項(xiàng)。

圖3：方案3顯示了腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)膜過氧化氫酶(cat)，通過抑制hocl合成，通過破壞h2o2③來有效抑制hocl信號(hào)通路①，②，④-⑥。當(dāng)然，膜sod促進(jìn)超氧化物陰離子對(duì)h2o2的歧化，這可以影響hocl通路，但該效應(yīng)不會(huì)帶來由降解所述h2o2的過氧化氫酶的效果得到的結(jié)果。然而，sod介導(dǎo)的超氧化物陰離子濃度的降低抑制hocl和超氧化物陰離子之間的相互作用⑤，其對(duì)于信號(hào)通路是必不可少的，并且通過這種方式增強(qiáng)針對(duì)ros信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)。抑制作用的分析表明，腫瘤細(xì)胞膜上的過氧化氫酶足以完全且明顯抑制hocl合成，而當(dāng)然單獨(dú)的sod效果提供了明顯的可測量的、但僅僅部分的保護(hù)。

圖4：方案4總結(jié)了在保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受no/過氧亞硝酸鹽信號(hào)通路中膜過氧化氫酶和sod的復(fù)雜相互作用。過氧化氫酶通過將no氧化成no2來防止過氧亞硝酸鹽的形成⑤并且通過降解來破壞可能形成的過氧亞硝酸鹽⑥。sod通過清除超氧化物陰離子來防止過氧亞硝酸鹽的形成④并且還能夠?qū)⑦^氧化亞硝酸鹽破壞到限制的程度。也可以推測，在反應(yīng)⑩中，通過示于方案2中的消耗反應(yīng)，由sod形成的h2o2有助于no濃度的進(jìn)一步降低。該方案令人印象深刻地顯示了腫瘤細(xì)胞以協(xié)調(diào)的方式能夠重復(fù)控制no/過氧亞硝酸鹽通路。

在下面的概略圖(diagrammaticrepresentations)5(圖5)和6(圖6)中，總結(jié)了了解保護(hù)性酶過氧化氫酶和sod的多重作用所需的酶學(xué)細(xì)節(jié)。

圖5：方案5顯示了通過過氧化氫酶的hocl信號(hào)通路①的抑制由兩階段機(jī)制②，③實(shí)現(xiàn)，其中過氧化氫酶中間體“化合物i”(catfe^iv＝o⁺)是至關(guān)重要的，并重新形成為天然酶。一方面，no/過氧亞硝酸鹽通路④的抑制通過經(jīng)由在化合物i的參與下的兩階段機(jī)制的過氧亞硝酸鹽的降解而發(fā)生，另一方面通過no的氧化⑧而發(fā)生。no的氧化與過氧化氫酶的no依賴性抑制相平衡，然而其僅在較高的no濃度下才起作用。

圖6：方案6顯示了sod介導(dǎo)的超氧化物陰離子對(duì)h2o2的歧化①，②由兩階段機(jī)制實(shí)現(xiàn)，其中酶結(jié)合的cu⁺⁺的還原以及cu⁺的氧化起關(guān)鍵作用。超氧化物陰離子的反應(yīng)抵消了hocl和超氧化物陰離子之間的相互作用③，其是hocl通路和過氧亞硝酸鹽形成④所必需的。此外，sod具有通過通過反應(yīng)步驟⑦-⑨來破壞過氧亞硝酸鹽的潛力。

方案5和6顯示了過氧化氫酶和sod(與教科書的知識(shí)相悖)不以高選擇性反應(yīng)為特征，而是能夠執(zhí)行多個(gè)、部分重疊的功能。總而言之，這導(dǎo)致出色的可塑性和復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。

圖7：方案7呈現(xiàn)了作用于腫瘤細(xì)胞外部的酶之間的總體背景。膜nadph氧化酶(nox)產(chǎn)生對(duì)這兩個(gè)信號(hào)通路至關(guān)重要的超氧化物陰離子。膜sod將大部分超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為h2o2①，②。這導(dǎo)致過氧亞硝酸鹽形成的部分抑制③以及對(duì)超氧化物陰離子和hocl之間的相互作用的部分抑制④，其中hocl通過過氧化物酶(pod)形成⑤。此外，sod還分解過氧亞硝酸鹽(反應(yīng)⑥-⑧的順序)。過氧化氫酶通過h2o2降解⑨來阻止hocl合成，降解過氧化亞硝酸鹽⑩，并通過no的氧化阻止過氧亞硝酸鹽的形成

總結(jié)在概略圖7中的事實(shí)得出了在概略圖8(圖8)中呈現(xiàn)的結(jié)論，根據(jù)概略圖8，僅抑制膜過氧化氫酶⑨，⑩能夠?qū)е耯ocl信號(hào)通路和no/過氧亞硝酸鹽通路的再激活，因?yàn)閟od僅實(shí)現(xiàn)了步驟③和④的部分保護(hù)。

另一方面，首先不會(huì)假設(shè)sod的抑制應(yīng)當(dāng)對(duì)于凋亡誘導(dǎo)信號(hào)通路的再激活是足夠的，因?yàn)檫^氧化氫酶的主要抑制作用應(yīng)與之相反。然而，如方案9(圖9)中所揭示的，這是不正確的。理解這一初步意料不到的發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵是超氧化物陰離子對(duì)過氧化氫酶的抑制作用。由于在sod的抑制之后，觀察到超氧化物陰離子的濃度局部增加(這僅被自發(fā)的歧化反應(yīng)所抵消)，如果僅直接抑制sod，則實(shí)現(xiàn)對(duì)過氧化氫酶的間接抑制作用。

在方案10(圖10)中闡述了由超氧化物陰離子介導(dǎo)的過氧化氫酶抑制的酶學(xué)基礎(chǔ)。一方面，超氧化物陰離子能夠?qū)⑻烊贿^氧化氫轉(zhuǎn)化成無活性化合物iii(catfeⁱⁱⁱo2^.–)①，另一方面，超氧化物陰離子能夠通過單電子躍遷將化合物i(catfe^iv＝o^.+)轉(zhuǎn)化為無活性化合物ii(catfe^iv＝o)并且以這種方式基本上抑制酶的作用。因此，應(yīng)理解，sod介導(dǎo)的超氧化物陰離子濃度的降低低于抑制作用所需的濃度有助于建立過氧化氫酶活性(參見圖11，方案11)。另一方面，立即認(rèn)識(shí)到，sod的直接抑制必然涉及過氧化氫酶的間接抑制(圖12，方案12)。

通過以下實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常在圖中示出。公開了特別優(yōu)選實(shí)施方案中的序列。

實(shí)施例1：構(gòu)建體和材料的提供

使用以下抗體，fab片段或單域vhh片段進(jìn)行以下實(shí)施例：

1)針對(duì)人sod-1的單克隆抗體(小鼠，igg1)(克隆sd-g6)(收費(fèi)號(hào)碼035k4823)。制造商sigmaaldrich，schnelldorf，德國(作為對(duì)照)。

2)針對(duì)人過氧化氫酶的重組人fab片段，形式fab-v5sx2，自文庫由abdserotec制備(詳細(xì)描述于ep859841和us6,300,064中)。采用具有過氧化氫酶抑制作用的構(gòu)建體#abd15562(比較)。

3)針對(duì)人sod的重組人fab片段，形式fab-v5sx2，自文庫由abdserotec制備。采用具有sod抑制作用的構(gòu)建體#abd15660(比較)。

4)針對(duì)人過氧化氫酶的重組單域vhh片段(根據(jù)本發(fā)明)，與商業(yè)供應(yīng)商合作準(zhǔn)備。

通過如下獲得制備物：用人過氧化氫酶(過氧化氫酶[ec1.11.16]，其純化自人紅細(xì)胞，獲得自sigma(schnelldorf)，目錄號(hào)c3556)在獸醫(yī)監(jiān)督下免疫羊駝，獲得來自動(dòng)物b細(xì)胞的rna，反轉(zhuǎn)錄，克隆進(jìn)大腸桿菌并經(jīng)由噬菌體展示技術(shù)分離。通過在合適的elisa中檢測上清液來選擇編碼結(jié)合人過氧化氫酶的單域vhh片段的克隆。在第二次運(yùn)行中，通過采用heinzelmann和bauer(heinzelmanns.andbauerg.multipleprotectivefunctionsofcatalaseagainstintercellularapoptosis-inducingrossignalingofhumantumorcells,biol.chem.391,675-693,2010)描述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，檢查結(jié)合過氧化氫酶的單域vhh片段中的哪一個(gè)實(shí)際上導(dǎo)致過氧化氫酶的抑制，這在細(xì)胞中表示為ros依賴性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。使用單域vhh片段acatcb0972，acatcb0974(兩者均結(jié)合人過氧化氫酶并中和它)，以及acatcb0973和acatcb0975(結(jié)合人過氧化氫酶，但不中和它)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)作為單域vhh片段的基礎(chǔ)的克隆測序，并且由此確定氨基酸序列。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案具有以下序列。

針對(duì)dna和蛋白質(zhì)水平分析抗原結(jié)合片段的序列，并且測定了抗原結(jié)合區(qū)(cdr)。在下文中僅描述了氨基酸序列。這些抗原結(jié)合區(qū)域?qū)τ诳乖Y(jié)合片段的特異性是重要的。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合構(gòu)建體，特別是單域vhh片段或者納米抗體，含有至少一個(gè)cdr序列，優(yōu)選至少兩個(gè)和更優(yōu)選三個(gè)cdr序列。

下面，描述了蛋白質(zhì)水平的cdr序列。在完整的序列中，各個(gè)位置由下劃線給出。

cb0972(結(jié)合并中和過氧化氫酶):

蛋白質(zhì)序列(seqidno:10):

maqvqlvesggglvqaggslrlscaasertfntygmgwfrqapgkerefvatiswsgdstyyadsvkgrftisrdnakntmylqmnslkpedtavyycnanseygdsywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:rtfntygmg(seqidno:19)

cdr2:tiswsgdstyyadsvkg(seqidno:20)

cdr3:nseygdsy(seqidno:21)

cb0973(結(jié)合過氧化氫酶,但不中和)：

蛋白質(zhì)序列(seqidno:11):

maevqlvesggglvqpggslrlscavsgfifntysmrwgrqapgkglewvssistggystyadsvkgrftisrdnaknlvylqmnslkpedtavyycgwgafvrgerpqgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:fifntysmr(seqidno:22)

cdr2:sistggystyadsvkg(seqidno:23)

cdr3:gafvrgerp(seqidno:24)

cb0974(結(jié)合并中和過氧化氫酶):

蛋白質(zhì)序列(seqidno:12):

maqvqlvesggglvqpggslrlscaasgsifsiasmgwyrqapgkqrdlvatitsdgstkyadsvkgrftisrdnakntmylqmnsvkpedaavyycnadaddlepgsydydywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:sifsiasmg(seqidno:25)

cdr2:titsdgstkyadsvkg(seqidno:26)

cdr3:daddlepgsydydy(seqidno:27)

cb0975(結(jié)合過氧化氫酶,但不中和):

蛋白質(zhì)序列(seqidno:13):

maqvqlvesggglvqpggslrlscaasasifsiyvmawyrqapgkqrelvatvtsggatnyansvkgrftisrdnakntmdlqmnslkpedtavyycnaedyydyglsrskiywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:sifsiyvma(seqidno:28)

cdr2:tvtsggatnyansvkg(seqidno:29)

cdr3:edyydyglsrskiy(seqidno:30)

5)針對(duì)人sod1的重組單域vhh片段，與商業(yè)供應(yīng)商合作準(zhǔn)備。

通過以下獲得制備物：用人sod1(sod1＝cu/znsod[ec1.15.1.1]，其純化自人紅細(xì)胞，獲得自sigma(schnelldorf)，目錄號(hào)s9636)在獸醫(yī)監(jiān)督下，免疫羊駝，獲得來自動(dòng)物b細(xì)胞的rna，反轉(zhuǎn)錄，克隆進(jìn)大腸桿菌并經(jīng)由噬菌體展示技術(shù)分離。通過在合適的elisa中檢測上清液來選擇編碼結(jié)合人sod1的單域vhh片段的克隆。在第二次運(yùn)行中，通過采用heinzelmann和bauer(heinzelmanns.andbauerg.multipleprotectivefunctionsofcatalaseagainstintercellularapoptosis-inducingrossignalingofhumantumorcells,biol.chem.391,675-693,2010)描述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，檢查結(jié)合sod的單域vhh片段中的哪一個(gè)實(shí)際上導(dǎo)致sod的抑制，這在使用的腫瘤系統(tǒng)中表示為ros依賴性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，因?yàn)橥ㄟ^抑制sod，游離超氧化物陰離子的濃度顯著增加(由于缺乏酶促歧化)，并導(dǎo)致過氧化氫酶的平行間接抑制。以下，這表示為ros依賴性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。在進(jìn)一步的對(duì)照試驗(yàn)中，如bauer2013(hocl-dependentsingletoxygenandhydroxylradicalgenerationmodulateandinduceapoptosisofmalignantcells.anticancerres33:3589-3602,2013)中描述的，通過以下事實(shí)驗(yàn)證了通過重組單域vhh片段的sod的特異性抑制：檢查了這些片段對(duì)通過外源性添加的hocl的凋亡誘導(dǎo)的增加作用。使用結(jié)合并中和人sod1的單域vhh片段asodcb0989，以及結(jié)合人sod1但不中和它的片段asodcb0987和asodcb0991

通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)作為單域vhh片段基礎(chǔ)的克隆測序，并且由此確定氨基酸序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案具有以下序列：

抗sodvhh：

cb0987(結(jié)合sod,但不中和):

蛋白質(zhì)序列(seqidno:14):

maqvqlvesgggivqpggslrlscvasesiseidamywhrqapgkerelvagitndgtryyadsvkgrftisrdnakstlylqmnslkfedtamyycaalpnpppgywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:siseidamy(seqidno:31)

cdr2:gitndgtryyadsvkg(seqidno:32)

cdr3:lpnpppgy(seqidno:33)

cb0989(結(jié)合并中和sod):

蛋白質(zhì)序列(seqidno:15):

maqvqlvesggglvqsggsltlsctasgftisnypmtwvrqapgkglewvsrinsggdrtlyadsvkgrftvsrdnarntmylqmnnlkpedtglyfcadsgagwrywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:ftisnypmt(seqidno:34)

cdr2:rinsggdrtlyadsvkg(seqidno:35)

cdr3:sgagwry(seqidno:36)

cb0991(結(jié)合sod,但不中和):

蛋白質(zhì)序列(seqidno:16):

maqvqlvesgggivqpggslrlscvasesisdidamywhrqapgkrrelvagitndgteyfadsvkgrfaisrdntksslylqmnslkledtamyycatlpnpppgywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

cdr1:sisdidamy(seqidno:37)

cdr2:gitndgteyfadsvkg(seqidno:38)

cdr3:lpnpppgy(seqidno:39)

通過經(jīng)由接頭來連接克隆cb0972(中和過氧化氫酶)和cb0989(中和sod)，通過遺傳工程化制備了雙特異性雜合單域vhh片段cb1081(抗cat抗sod)和cb1082(抗sod抗cat)。

雙特異性抗過氧化氫酶-sodvhh

cb1081:

蛋白質(zhì)序列(seqidno:17):

maqvqlvesggglvqaggslrlscaasertfntygmgwfrqapgkerefvatiswsgdstyyadsvkgrftisrdnakntmylqmnslkpedtavyycnanseygdsywgqgtqvtvssggggsggggsggggsaqvqlvesggglvqsggsltlsctasgftisnypmtwvrqapgkglewvsrinsggdrtlyadsvkgrftvsrdnarntmylqmnnlkpedtglyfcadsgagwrywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

catcdr1:rtfntygmg(seqidno:40)

catcdr2:tiswsgdstyyadsvkg(seqidno:41)

catcdr3:nseygdsy(seqidno:42)

sodcdr1:ftisnypmt(seqidno:43)

sodcdr2:rinsggdrtlyadsvkg(seqidno:44)

sodcdr3:sgagwry(seqidno:45)

雙特異性抗sod-過氧化氫酶vhh

cb1082

蛋白質(zhì)序列(seqidno:18):

maqvqlvesggglvqsggsltlsctasgftisnypmtwvrqapgkglewvsrinsggdrtlyadsvkgrftvsrdnarntmylqmnnlkpedtglyfcadsgagwrywgqgtqvtvssggggsggggsggggsaqvqlvesggglvqaggslrlscaasertfntygmgwfrqapgkerefvatiswsgdstyyadsvkgrftisrdnakntmylqmnslkpedtavyycnanseygdsywgqgtqvtvsskkkhhhhhh

蛋白質(zhì)水平的cdr序列：

sodcdr1:ftisnypmt(seqidno:46)

sodcdr2:rinsggdrtlyadsvkg(seqidno:47)

sodcdr3:sgagwry(seqidno:48)

catcdr1:rtfntygmg(seqidno:49)

catcdr2:tiswsgdstyyadsvkg(seqidno:50)

catcdr3:nseygdsy(seqidno:51)

nadph氧化酶抑制劑4-(2-氨乙基-苯磺酰氟(aebsf)、過氧化氫酶抑制劑3-氨基三唑(3-at)、hocl清除劑?；撬帷尉€態(tài)氧清除劑組氨酸、葡萄糖氧化酶(gox)獲得自sigma(schnelldorf,德國)。

過氧亞硝酸鹽和“過氧亞硝酸鹽分解催化劑”(功能性過氧化亞硝酸鹽清除劑)5-,10-,15-,20-四(4-磺酰基苯基)卟啉鐵(iii)氯化物(5-,10-,15-,20-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrinatoiron(iii)chloride，fetpps)獲得自calbiochem(merckbiosciencesgmbh,schwalbach/ts,德國)。

這些活性成分的精確描述見出版物heinzelmann和bauer(2010,multipleprotectivefunctionsofcatalaseagainstintercellularapoptosis-inducingrossignalingofhumantumorcells,biol.chem.391,675-693),以及bechtel和bauer(2009,catalaseprotectstumorcellsagainstapoptosisinductionbyintercellularrossignaling,anticancerres29:4541-4557)。

實(shí)施例2：用sirna的基因敲除

對(duì)于通過利用通過sirna技術(shù)的基因的特異性敲除的描述于圖22中的分析，使用以下sirna(獲得自qiagen,hilden,德國)：

a.對(duì)照sirna(“sico”),(目錄號(hào)1022076；序列:

r(uucuccgaacgugucacgu)dtdt(正義)(seqidno:1)

acgugacacguucggagaa)dtdt(反義)(seqidno:2)。

制造商發(fā)現(xiàn)sico不影響任何已知基因的表達(dá)。

b.對(duì)于以下敲除的“高性能驗(yàn)證的sirna(high-performancevalidatedsirna)”

fas受體(“sirnafasr.”)(hs_fas_7_hp驗(yàn)證的sirna，目錄號(hào)si02654463；目標(biāo)序列:aaggagtacacagacaaagcc)(seqidno:3)；

caspase-8(“sirnacasp8”)(hs_casp8_11_hp驗(yàn)證的sirna；目錄號(hào)si02661946,目標(biāo)序列:aagagtctgtgcccaaatcaa)(seqidno:4)；

caspase-9(“sirnacasp-9”)(hs_casp9_7_hp驗(yàn)證的sirna,目錄號(hào)si02654610,目標(biāo)序列:cagtgacatctttgtgtccta)(seqidno:5)；

c:針對(duì)人nox1的hpsirna(“sirnanox1”)；

目標(biāo)序列:ccgacaaatactactacacaa(seqidno:6)

d:針對(duì)人inos2的sirna(siinos)

目標(biāo)序列:ctgggccgtgcaaaccttcaa(seqidno:7)

對(duì)于示于圖27中的對(duì)照測試，除了對(duì)照sirna以外，還使用了針對(duì)人過氧化氫酶的sirna(對(duì)于mkn-45細(xì)胞)

hs_cat_4_hpsirna,目錄no.si00027713

目標(biāo)序列:ccggatctcacttggcggcaa(seqidno:8)

和針對(duì)鼠過氧化氫酶的sirna(對(duì)于208f和208fsrc3細(xì)胞)

hpmm_cat_4_hpsirna,目錄號(hào)si00941976

目標(biāo)序列:cccaataggagataaacttaa(seqidno:9)。

heinzelmann和bauer(同上)，2010中詳細(xì)描述了通過sirna的轉(zhuǎn)染技術(shù)。轉(zhuǎn)染效率超過95％。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，進(jìn)行各基因功能的對(duì)照檢查以確保完成“功能性敲除”。這意味著特定的sirna有效地抑制了分析的基因產(chǎn)物的從頭合成，以及意味著在施用sirna之前基因產(chǎn)物的濃度的自然降解發(fā)生，直至低于檢測限。

將人胃癌細(xì)胞系mkn-45保持在補(bǔ)充有10％滅活的胎牛血清和40u/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml新霉素、10u/mlmoronal(抗真菌抗生素)和280μg/ml谷氨酰胺的rpmi1640培養(yǎng)基中。將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系shep以及正常大鼠成纖維細(xì)胞(208f)及它們由src癌基因(208fsrc3)轉(zhuǎn)化的后代保持在補(bǔ)充有5％滅活的胎牛血清和40u/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml新霉素、10u/mlmoronal和280μg/ml谷氨酰胺的eagle最低必需培養(yǎng)基(emem)中。有關(guān)細(xì)胞系及它們的培養(yǎng)基的細(xì)節(jié)見于heinzelmann和bauer，2010以及的bechtel和bauer，2009的工作。

實(shí)施例3：用于分析腫瘤細(xì)胞中自分泌ros控制的凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)制備

用基于在heinzelmann和bauer2010中進(jìn)行的方法的凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)制備來進(jìn)行示于圖13-24中的實(shí)驗(yàn)。使用的腫瘤細(xì)胞取自最佳生長的半密封培養(yǎng)物，離心并置于新鮮培養(yǎng)基中。該試驗(yàn)在具有12500個(gè)mkn-45細(xì)胞/100μl培養(yǎng)基或10000個(gè)shep細(xì)胞/100μl的培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。mkn-45細(xì)胞在懸浮液中生長，shep細(xì)胞是粘附的。一旦細(xì)胞生長，shep細(xì)胞的測試就開始了。通過添加增加濃度的抑制過氧化氫酶或sod的單域vhh片段，使腫瘤細(xì)胞免于其自身的ros信號(hào)傳導(dǎo)的保護(hù)被消除，使得基于細(xì)胞擁有的細(xì)胞外超氧化物陰離子生成，no/過氧亞硝酸鹽信號(hào)通路和hocl通路(用mkn-45細(xì)胞)或者在shep細(xì)胞的情況下僅no/過氧亞硝酸鹽通路可以當(dāng)細(xì)胞在37℃下溫育時(shí)開始。信號(hào)通路的分析是通過應(yīng)用nadph氧化酶抑制劑(aebsf)、hocl清除劑?；撬帷⑦^氧化亞硝酸鹽清除劑fetpps以及單線態(tài)氧清除劑組氨酸來實(shí)施的。在一些用于比較的實(shí)驗(yàn)中，代替單域vhh片段，應(yīng)用了重組fab片段或單克隆抗體。這在相應(yīng)的圖示中指出。

在本文所示的時(shí)間，通過用于凋亡細(xì)胞百分比的相差倒置顯微術(shù)來檢測雙重制備物。這里，使用了heinzelmann和bauer2010中描述和記錄了經(jīng)典凋亡標(biāo)準(zhǔn)，如細(xì)胞核凝聚，細(xì)胞核的片段化，以及質(zhì)膜出泡(membraneblebbing)。每一個(gè)制備物，檢測了至少250個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)胞的凋亡特征的存在。

平行對(duì)照檢測，例如如bauer等人的工作(bauerg,bereswills,aichelepandglockere.helicobacterpyloriprotectsoncogenicallytransformedcellsfromreactiveoxygenspecies-mediatedintercellularinductionofapoptosis,carcinogenesis35:1582-1591,2014,增刊)中記錄的，確保應(yīng)用的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)與凋亡標(biāo)準(zhǔn)(如dna片段化(通過tunel反應(yīng)測量))或?qū)δぢ?lián)蛋白v結(jié)合的陽性相關(guān)。

實(shí)施例4：用于通過針對(duì)過氧化氫酶的單域vhh片段的凋亡誘導(dǎo)ros信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞特異性致敏

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，已經(jīng)進(jìn)行了許多試驗(yàn)，其中試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)在圖13至圖30中進(jìn)行了總結(jié)。

圖13顯示了mkn-45胃癌細(xì)胞中通過針對(duì)過氧化氫酶的單域vhh片段的特異性凋亡誘導(dǎo)。

將在用于自分泌凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)條件下mkn-45細(xì)胞與給定濃度的結(jié)合但不抑制人過氧化氫酶的單域vhh片段(acatcb0973,acatcb0975)以及結(jié)合并抑制人過氧化氫酶的單域vhh片段(acatcb0972；acatcb9074)混合，并進(jìn)一步在37℃,5％co2下溫育3.5小時(shí)。在相同條件下的平行中，應(yīng)用了針對(duì)并中和人過氧化氫酶的重組fab片段(由輕鏈和重鏈組成)(abdacat15562)。此后，根據(jù)上述經(jīng)典凋亡標(biāo)準(zhǔn)測定凋亡細(xì)胞(雙重制備物)的百分比。

圖13a顯示了僅抑制過氧化氫酶，而非使得結(jié)合酶而不抑制它的單域vhh片段誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的凋亡。這里，效果以最佳曲線的形式表示，正如heinzelmann和bauer，2010，對(duì)于過氧化氫酶抑制劑3-氨基三唑的工作所描述的。最佳曲線下降后，凋亡誘導(dǎo)第二次增加。由輕鏈和重鏈組成的重組fab片段abdacat15562的添加也導(dǎo)致最佳曲線形式的凋亡誘導(dǎo)及隨后第二次增加，但是為了實(shí)現(xiàn)作用最佳值，需要與過氧化氫酶抑制單域vhh片段相比高約250倍的abdacat15562的摩爾濃度。這通過根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體的優(yōu)異功效而明顯。

胃癌細(xì)胞系mkn-45中抑制人過氧化氫酶的單域vhh片段和經(jīng)典fab片段的添加導(dǎo)致相對(duì)于抗體濃度的最佳曲線形式的誘導(dǎo)凋亡。誘導(dǎo)過程的特異性由這一事實(shí)而明顯，即結(jié)合過氧化氫酶但不中和它的單域vhh片段不導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)(圖13)。即，對(duì)于致敏，抗體僅與過氧化氫酶結(jié)合是不夠的。對(duì)過氧化氫酶的功能的特異性抑制似乎對(duì)致敏作用至關(guān)重要。值得注意的是和意想不到的是發(fā)現(xiàn)單域vhh片段比經(jīng)典的fab片段具有更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。由于這兩組片段的結(jié)構(gòu)不同，可以預(yù)期為了達(dá)到類似的效果，與單域vhh片段相比，經(jīng)典的fab片段將以兩倍濃度來應(yīng)用。然而，該差異構(gòu)成了約500倍(以摩爾計(jì)為250)。

實(shí)施例5：結(jié)合過氧化氫酶并抑制的單域vhh片段對(duì)胃癌細(xì)胞的影響

圖14顯示了mkn-45系的胃癌細(xì)胞中過氧化氫酶中和單域vhh片段acatcb0972經(jīng)由no/過氧化亞硝酸鹽和hocl通路誘導(dǎo)特異性ros信號(hào)傳導(dǎo)。

對(duì)用于誘導(dǎo)凋亡的標(biāo)準(zhǔn)制備物，在100μmnox1抑制劑aebsf、50mmhocl清除劑?；撬?tau)、25μm過氧化亞硝酸鹽清除劑fetpps或者2mm單線態(tài)氧清除劑組氨酸(his)的存在下，添加給定濃度的單域vhh片段acatcb0972。在沒有抑制劑的情況下平行進(jìn)行對(duì)照制備物。在37℃,5％co23.5小時(shí)后，測定了凋亡細(xì)胞的百分比。

圖14顯示了單域vhh片段acatcb0972(結(jié)合并抑制過氧化氫酶)以最佳曲線及隨后第二次增加的形式誘導(dǎo)凋亡。這里，在單域vhh片段的整個(gè)濃度范圍內(nèi)，凋亡誘導(dǎo)被nox1抑制劑aebsf所抑制。hocl清除劑?；撬岵粫?huì)在最佳曲線左側(cè)的濃度范圍內(nèi)抑制，但然后導(dǎo)致在最佳曲線的整個(gè)進(jìn)一步范圍內(nèi)的凋亡的強(qiáng)烈抑制。在單域vhh片段的6.2pg/ml濃度范圍內(nèi)的凋亡的第二次增加不被?；撬嵋种?。過氧亞硝酸鹽清除劑fetpps僅在左側(cè)部分的最佳曲線中導(dǎo)致強(qiáng)烈的抑制作用，然后將凋亡誘導(dǎo)的最佳曲線變?yōu)槠脚_(tái)曲線。單線態(tài)氧清除劑組氨酸不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的抑制，但將最佳曲線變?yōu)槠脚_(tái)曲線。

即，圖14證明了單域vhh片段acatcb0972的凋亡誘導(dǎo)效果實(shí)際上由ros信號(hào)傳導(dǎo)的再激活引起，因?yàn)樵谒袘?yīng)用濃度下，當(dāng)通過aebsf抑制超氧化物陰離子產(chǎn)生時(shí)，發(fā)生凋亡誘導(dǎo)的完全抑制。此外，圖14中證明的結(jié)果顯示了凋亡誘導(dǎo)的最佳范圍(0-6.2pg/ml)的特征在于一系列no/過氧亞硝酸鹽通路和hocl通路。在acatcb0972的0.09和0.18pg/ml的范圍內(nèi)，存在由過氧亞硝酸鹽清除劑fetpps的抑制，而非被hocl清除劑牛磺酸的抑制，這說明no/過氧亞硝酸鹽通路的過程。從0.75pg/ml的fab片段，沒有fetpps的實(shí)質(zhì)抑制，但是?；撬岬囊种品浅?qiáng)烈，這證明了hocl通路的過程。如預(yù)期的，這兩種信號(hào)通路在0.37pg/ml重疊。單域vhh片段在更高濃度的凋亡誘導(dǎo)的新的增加依賴于

i)超氧化物陰離子的產(chǎn)生，

ii)過氧化氫酶抑制程度以及不受hocl清除劑和過氧亞硝酸鹽清除劑的影響。

因此，它是h2o2的唯一影響，而不是特定ros信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。

通過單線態(tài)氧清除劑組氨酸和過氧亞硝酸鹽清除劑fetpps將凋亡誘導(dǎo)的最佳曲線改變?yōu)槠脚_(tái)曲線說明在單域vhh片段acatcb0872>0.75pg/ml的濃度下，單線態(tài)氧似乎也起作用。單線態(tài)氧可以由h2o2與過氧亞硝酸鹽的反應(yīng)產(chǎn)生。也已知單線態(tài)氧可以使過氧化氫酶無活性。然后，由此引起的h2o2的增加的可用性可以引起示于圖1中的副反應(yīng)⑧和⑨，其中hocl被消耗或較少的hocl被合成。以這種方式，引起最佳曲線右側(cè)的凋亡誘導(dǎo)下降。

實(shí)施例6：用于通過針對(duì)sod的單域vhh片段的凋亡誘導(dǎo)ros信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的特異性致敏

圖15中示出了mkn-45胃癌細(xì)胞中通過針對(duì)sod的單域vhh片段的特異性凋亡誘導(dǎo)。凋亡細(xì)胞的百分比繪制在x軸上。

將在用于自分泌凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)條件下的mkn-45細(xì)胞與給定濃度的結(jié)合但不抑制人sod1的單域vhh片段(asodcb0987,asodcb0991)以及結(jié)合并抑制人sod的單域vhh片段(asodcb0989)混合，并進(jìn)一步在37℃,5％co2下溫育3.5小時(shí)。在相同條件下的平行中，應(yīng)用了針對(duì)并中和人過氧化氫酶的重組fab片段(由輕鏈和重鏈組成)(abdasod15660)。此后，根據(jù)上述經(jīng)典凋亡標(biāo)準(zhǔn)測定凋亡細(xì)胞(雙重制備物)的百分比。

圖15a顯示了抑制sod，而非使得僅與酶結(jié)合的單域vhh片段在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。這里，該效果以寬泛的最佳曲線的形式表示。凋亡誘導(dǎo)的最佳曲線也通過經(jīng)典fab片段abdasod15660實(shí)現(xiàn)(圖15b)，然而，對(duì)此，為了達(dá)到同樣的效果，與單域vhh片段的濃度相比，需要高250倍的濃度。

即，圖15顯示了抗體結(jié)合sod不足以致敏。對(duì)sod的功能的特異性抑制似乎對(duì)致敏是至關(guān)重要的。值得注意的是，膜sod的特異性抑制足以再激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的ros信號(hào)傳導(dǎo)。值得注意和意想不到的是這一發(fā)現(xiàn)，即中和單域vhh片段具有比經(jīng)典中和fab片段更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。由于這兩組片段的結(jié)構(gòu)不同，可以預(yù)期的是，為了達(dá)到同樣的效果，與單域vhh片段相比，將應(yīng)用兩倍濃度的經(jīng)典fab。然而，差異是約250倍。

圖16顯示了mkn-45系胃癌細(xì)胞中sod中和單域vhh片段asodcb0989通過no/過氧亞硝酸鹽通路僅誘導(dǎo)特定的ros信號(hào)傳導(dǎo)。

對(duì)用于誘導(dǎo)凋亡的標(biāo)準(zhǔn)制備物，在100μmnox1抑制劑aebsf、25μm過氧化亞硝酸鹽清除劑fetpps、50mmhocl清除劑?；撬?tau)或者2mm單線態(tài)氧清除劑組氨酸(his)的存在下，添加給定濃度的單域vhh片段asodcb0989。在沒有抑制劑的情況下平行進(jìn)行對(duì)照制備物。在37℃,5％co23.5小時(shí)后，測定了凋亡細(xì)胞的百分比。

圖16顯示了在mkn-45系胃癌細(xì)胞中，sod中和單域vhh片段以寬泛最佳曲線的形式誘導(dǎo)凋亡，然后是指定的第二次增加。aebsf在整個(gè)濃度范圍內(nèi)抑制凋亡誘導(dǎo)。整個(gè)最佳范圍由fetpps抑制，但不被?；撬嵋种?。組氨酸導(dǎo)致最佳曲線右側(cè)下降的可察覺的部分消除。

即，圖16證明了腫瘤細(xì)胞中由asodcb0989誘導(dǎo)的凋亡確實(shí)經(jīng)由超氧化物陰離子依賴性過程連續(xù)誘導(dǎo)，但這(與acatcb0972相反)僅是no/過氧亞硝酸鹽通路且hocl信號(hào)沒有明顯的影響。通過fetpps方式的完全抑制和牛磺酸抑制的消失也證明了這一點(diǎn)。這一結(jié)果表明，鑒于缺乏sod效應(yīng)，顯然沒有足夠可用于hocl通路的h2o2。由于no/過氧亞硝酸鹽通路被膜過氧化氫酶非常有效地抑制，可以從圖16所示的結(jié)果得出結(jié)論，即通過單域vhh片段抑制sod也必然導(dǎo)致過氧化氫酶的間接抑制。由asodcb0989和acatcb0972再激活的信號(hào)通路的不同質(zhì)量允許排除asodcb0989的作用可以是與過氧化氫酶的交叉反應(yīng)的理論假設(shè)并因此也證實(shí)了asodcb0989的作用的特異性。

實(shí)施例7：單域vhh片段與目標(biāo)細(xì)胞之間的關(guān)系

圖17顯示了針對(duì)過氧化氫酶或者sod的單域vhh片段對(duì)靶細(xì)胞的密度做出不同的要求。

除了標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞密度(12500細(xì)胞/100μl)外，還在低細(xì)胞密度(4000細(xì)胞/100μl)和增加濃度的單域vhh片段acatcb0972或者asodcb0989的情況下制備用于誘導(dǎo)凋亡的制備物，并且在37℃,5％co2溫育4小時(shí)。此后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖17顯示了在最佳方式中由僅具有更高濃度運(yùn)行的針對(duì)過氧化氫酶的單域vhh片段誘導(dǎo)的凋亡，其中在針對(duì)sod的單域vhh片段的應(yīng)用中，當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞以較低的密度存在時(shí)，效果的減弱要小得多。這種差異為再激活信號(hào)通路的不同質(zhì)量提供了證據(jù)并且特別是與sod的抑制優(yōu)選再激活no/過氧亞硝酸鹽通路的事實(shí)相一致，因?yàn)檫@與hocl信號(hào)通路在相同程度上不依賴于高細(xì)胞密度。

實(shí)施例8：針對(duì)過氧化氫酶和sod的單域vhh片段的協(xié)同效應(yīng)

圖18顯示了同時(shí)應(yīng)用針對(duì)過氧化氫酶和sod的單域vhh片段的顯著的協(xié)同效應(yīng)。

將用于用mkn-45細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)制備物與單獨(dú)的以及與0.005pg/m的結(jié)合sod但不中和它的sod中和性單域vhh片段asodcb0989或者單域vhh片段asodcb0987組合的增加濃度的過氧化氫酶中和性單域vhh片段acatcb0972相混合(a)。在互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(b)中，用單獨(dú)的或者與0.005pg/ml的過氧化氫酶中和性單域vhh片段acatcb0972組合的增加濃度的asodcb0989實(shí)現(xiàn)混合。所有制備物在37℃,5％co2下溫育3.5小時(shí)。然后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖18顯示了可以通過acatcb0972和asodcb0989兩者來確定已經(jīng)在初步實(shí)驗(yàn)中測量的濃度依賴凋亡誘導(dǎo)效果。與單獨(dú)不足以誘導(dǎo)凋亡的分別互補(bǔ)的單域vhh片段的微小(minor)濃度的組合(即asod在增加濃度的acat中以及acat在增加濃度的asod中)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)中的顯著協(xié)同作用。所述協(xié)同效應(yīng)的特異性由以下事實(shí)證明，即它在結(jié)合但不中和sod的單域vhh片段的施用的情況下尚未出現(xiàn)(圖18a)。

即，圖18顯示了針對(duì)過氧化氫酶或者sod的單域vhh片段的組合導(dǎo)致非常強(qiáng)烈的協(xié)同作用，當(dāng)最佳地使用這種效應(yīng)時(shí)，單域vhh片段的所需濃度可以大大降低。

實(shí)施例9：與化學(xué)治療劑的協(xié)同作用

圖19顯示了分別中和過氧化氫酶或者sod的單域vhh片段與建立的化學(xué)治療劑泰素引起強(qiáng)烈的協(xié)同作用。

將用于用mkn-45細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)制備物與單獨(dú)的或者與過氧化氫酶中和性acatcb0972，sod中和性asodcb0989以及sod結(jié)合而非中和性asodcb0987組合的增加濃度的泰素混合并在37℃,5％co2溫育4小時(shí)。然后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖19顯示了在腫瘤細(xì)胞中泰素以濃度依賴方式誘導(dǎo)凋亡。

這里，在1100ng/ml濃度范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)了最佳效果。這種效果是預(yù)期的。與可以抑制過氧化氫酶或者sod的單域vhh片段相組合，泰素依賴性最佳曲線出人意料地被迅速置換到較低的濃度范圍。現(xiàn)在，效果最佳值為0.17ng/ml至0.5ng/ml之間。所需濃度至小于千分之一的這種令人印象深刻的置換只能通過還中和各自目標(biāo)結(jié)構(gòu)(過氧化氫酶或者sod)的單域vhh片段實(shí)現(xiàn)，而純粹的結(jié)合沒有引起任何增強(qiáng)的效果。

示于圖19中的效果起初是非常感興趣的，因?yàn)槠渥C明了泰素對(duì)腫瘤細(xì)胞和ros信號(hào)傳導(dǎo)的作用之間的以前未知的功能聯(lián)系。與針對(duì)sod或者過氧化氫酶的單域vhh片段的協(xié)同效應(yīng)的出現(xiàn)提供了通過適當(dāng)?shù)亟M合活性成分來保存總共資源的機(jī)會(huì)，從而獲得治療成本的降低，并且還開啟減少或甚至避免由泰素引起的副作用并且避免了單域vhh片段可能的副作用的機(jī)會(huì)。

實(shí)施例10：通過來自過氧化氫酶或sod中和性單域vhh片段的雜合分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性致敏以實(shí)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)ros信號(hào)傳導(dǎo)

圖20顯示了單域vhh片段acat和asod之間的協(xié)同效應(yīng)，acat和asod可以濃縮為一個(gè)雜合分子。

將用于用mkn-45細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)制備物與增加濃度的過氧化氫酶中和性acatcb0972、sod中和性asodcb0989、以兩種可能排列的來自acatcb0972和asodcb0989的雜合分子以及作為對(duì)照的針對(duì)過氧化氫酶的中和性常規(guī)單克隆抗體(sigma)相混合，并在37℃,5％co2溫育3.5小時(shí)。然后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖20顯示了用單獨(dú)添加的單域vhh片段acatcb0972和asodcb0989的組合觀察到的協(xié)同效應(yīng)可以實(shí)際上濃縮為雜合分子。這里，排列acatasod似乎逐漸優(yōu)于反向排列。雖然單獨(dú)施用的單域vhh片段的最佳效果在約170fg/ml的濃度范圍內(nèi)，雜合分子的最佳效果已經(jīng)在0.24fg/ml實(shí)現(xiàn)。這些值得注意的活性與在111ng/ml時(shí)形成最佳效果的常規(guī)單克隆抗體的顯著降低的功效相沖突。在例示中，為了清楚起見，沒有包括中和sod或過氧化氫酶的經(jīng)典重組fab片段的數(shù)據(jù)。它們的最佳效果在0.1-0.3ng/ml的范圍內(nèi)。

即，圖20證實(shí)了

i)單區(qū)vhh片段的效果出乎意料地遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于常規(guī)單克隆抗體或常規(guī)重組fab片段的效果，以及

ii)當(dāng)從單域vhh片段產(chǎn)生雜合分子時(shí)，可以獲得效果上進(jìn)一步非常清晰的增加。

實(shí)施例11：

圖21顯示了在mkn-45系的胃癌細(xì)胞中來自單域vhh片段acatcb0972和asodcb0989的雜合分子經(jīng)由no/過氧亞硝酸鹽通路僅誘導(dǎo)特異性ros信號(hào)傳導(dǎo)。

對(duì)用于凋亡誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)制備物，在100μm的nox1抑制劑aebsf、25μm的過氧化亞硝酸鹽清除劑fetpps、50mm的hocl清除劑?；撬?tau)或者2mm的單線態(tài)氧清除劑組氨酸(his)的存在下添加給定濃度的雜合分子acatasod。在不含抑制劑的情況下平行進(jìn)行對(duì)照制備物。在37℃,5％co2下3小時(shí)后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖21證實(shí)了腫瘤細(xì)胞中雜合分子acatasod經(jīng)由ros信號(hào)傳導(dǎo)的再激活來誘導(dǎo)凋亡，因?yàn)橥ㄟ^抑制超氧化物陰離子的合成(通過aebsf的方式)完全阻止了該過程。此外，明顯的是通過雜合分子再激活的凋亡誘導(dǎo)僅是no/過氧亞硝酸鹽通路，因?yàn)榇嬖谟型ㄟ^fetpps的完全抑制作用，但無受?；撬岬囊种啤尉€態(tài)氧清除劑繼而對(duì)最佳曲線的右側(cè)下降具有減弱作用。no/過氧亞硝酸鹽通路的主導(dǎo)性是從以前的結(jié)果看出人意料的和不可預(yù)測的。

實(shí)施例12：

圖22通過基于sirna的分析確認(rèn)了由雜合分子誘導(dǎo)的ros信號(hào)傳導(dǎo)的特異性并導(dǎo)致凋亡。

用24nm針對(duì)nox1、inos2、caspase-9、fas受體或者caspase-8的sirna轉(zhuǎn)染mkn-45細(xì)胞。用不相關(guān)的對(duì)照sirna轉(zhuǎn)染對(duì)照制備物。37℃24小時(shí)后，將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)并與給定濃度的雜合分子acatasod相混合。4小時(shí)后測定凋亡細(xì)胞的百分比。

圖22顯示了僅當(dāng)通過線粒體通路對(duì)凋亡過程至關(guān)重要的完整的nadph氧化酶(nox1)、no合酶(inos2)和caspase-9可用時(shí)才能發(fā)生以由雜合分子acatasod引起的最佳曲線形式的凋亡誘導(dǎo)。sirna介導(dǎo)的對(duì)這些酶的敲低各自完全阻止由雜合分子誘導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)，并因此證明了經(jīng)由no/過氧亞硝酸鹽通路的根本的ros信號(hào)傳導(dǎo)及隨后的線粒體凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。另一方面，由雜合分子誘導(dǎo)的凋亡不需要fas受體和其下游caspase-8，強(qiáng)調(diào)了線粒體凋亡通路的專門作用并且排除了通過用于在選擇的條件下凋亡誘導(dǎo)的死亡受體apo/fas的凋亡通路發(fā)揮作用。然而，fas受體和caspase-8的敲低防止細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)曲線的超最佳(supra-optimum)下降。這可以通過如bauer,2012中所述的fas受體和caspase-8和單線態(tài)氧相關(guān)過程的參與來解釋，并且與圖21中建立的關(guān)于組氨酸的發(fā)現(xiàn)一致。

從圖13、圖15和圖20，確定了腫瘤細(xì)胞中最適凋亡誘導(dǎo)所必需的抗體和單域vhh片段的濃度(表1)。該表解釋了與經(jīng)典的重組fab片段和單克隆抗體相比，單域vhh片段的優(yōu)異功效。表2強(qiáng)調(diào)通過使用雜合分子可以實(shí)現(xiàn)令人印象深刻的協(xié)同效應(yīng)。單域vhh片段對(duì)經(jīng)典重組fab片段的優(yōu)越作用是不可預(yù)測的，并因此是預(yù)料不到的。相反，由于目前的知識(shí)狀況，預(yù)期中和性經(jīng)典fab片段和中和性單域vhh片段當(dāng)考慮摩爾濃度時(shí)應(yīng)當(dāng)對(duì)凋亡誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)相同的效果，在考慮濃度(pg/ml)時(shí)，從而僅應(yīng)當(dāng)必須實(shí)現(xiàn)2倍的差異。這種不可預(yù)測的顯著的效力差異是令人驚訝的。這種效果最適合治療用途。

表1

表2

數(shù)值取自圖13、圖15和圖20。首先，確定常規(guī)重組fab片段和單克隆抗體的哪個(gè)濃度量是更高的，以實(shí)現(xiàn)與重組單域vhh片段相同的效果。通過包括各種fab片段和抗體的摩爾質(zhì)量，然后在摩爾濃度(molarity)的基礎(chǔ)上確定關(guān)系。在該校正中，采用了有效的假設(shè)，即經(jīng)典的fab片段占完整igg分子摩爾質(zhì)量的三分之一，并且單域vhh片段的摩爾質(zhì)量占經(jīng)典fab片段的摩爾質(zhì)量的大約一半。

實(shí)施例13：具有過氧化氫酶中和效果或者sod中和效果的單域vhh片段對(duì)僅能夠建立no/過氧亞硝酸鹽通路的人腫瘤細(xì)胞的效果

雖然用于之前實(shí)施例中的胃癌系mkn-45的特征在于當(dāng)其膜過氧化氫酶被抑制時(shí)，其能夠表達(dá)已知的細(xì)胞內(nèi)ros信號(hào)傳導(dǎo)(hocl和no/過氧亞硝酸鹽通路作為主要通路，硝酰氯(nitrylchloride)通路作為次要通路)的整個(gè)譜(spectrum)，在一系列其他人腫瘤細(xì)胞系中，顯示出對(duì)no/過氧亞硝酸鹽通路的限制(heinzelmann和bauer,2010；bauer,2012)。因此，在之前的檢查中，發(fā)現(xiàn)特定類型的腫瘤各自顯示一致的ros信號(hào)系統(tǒng)。迄今為止，我們僅對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤、尤因氏肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和小細(xì)胞肺癌觀察到對(duì)no/過氧亞硝酸鹽信號(hào)傳導(dǎo)的限制。

圖23顯示了單域vhh片段也能夠在僅可以形成no/過氧亞硝酸信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中再激活凋亡。

將每100μl培養(yǎng)基10000個(gè)人成神經(jīng)母細(xì)胞瘤系shep細(xì)胞與給定濃度的過氧化氫酶中和性單域vhh片段acatcb0972、sod中和性單域vhh片段asod0989、sod結(jié)合性而非中和性單域vhh片段asodcb991以及雜合分子acatasod相混合，在37℃,5％co2溫育5小時(shí)，之后測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖23顯示了過氧化氫酶中和性單域vhh片段和sod中和性單域vhh片段以及雜合分子acatasod能夠在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系shep中誘導(dǎo)濃度依賴性凋亡。如所預(yù)期的，這里，雜合分子證明比每個(gè)僅針對(duì)一個(gè)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的單域vhh片段有效得多。高濃度的sod結(jié)合性但非中和性單域vhh片段asodcb0991也實(shí)現(xiàn)了凋亡誘導(dǎo)效果，但對(duì)此，需要比中和性單域vhh片段高10⁶倍的濃度。

即，圖23也確認(rèn)了過氧化氫酶抑制后僅有no/過氧亞硝酸鹽信號(hào)傳導(dǎo)能力的細(xì)胞系可以通過針對(duì)過氧化氫酶或sod的單域vhh片段引起細(xì)胞凋亡。此外，這里出現(xiàn)了acat和asos之間的協(xié)同效應(yīng)。值得注意的是用該細(xì)胞系觀察到的濃度-效應(yīng)曲線，所述細(xì)胞系與mkn-45系相比，僅在右側(cè)具有非常平坦的持久的超級(jí)最佳下降。

可以用以下事實(shí)最佳解釋由僅能結(jié)合但不能中和的單域vhh片段asodcb0991實(shí)現(xiàn)的弱但顯著的凋亡誘導(dǎo)：在單域vhh片段結(jié)合后，有sod的內(nèi)化，并因此其在表面上的濃度是減少的，這將導(dǎo)致與抑制類似的效果。

圖24顯示了當(dāng)另外使用no供體snp時(shí)，可以進(jìn)一步優(yōu)化asodcb0989對(duì)shep細(xì)胞的效果。

將每100μl培養(yǎng)基10000個(gè)人成神經(jīng)母細(xì)胞瘤系shep細(xì)胞與給定濃度的sod中和性單域vhh片段asod0989相混合。在沒有其他添加劑的情況下溫育接受20μm或者100μmno供體硝普鈉的平行制備物。37℃,5％co25小時(shí)后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

圖24顯示了額外施用no供體(單獨(dú)不能誘導(dǎo)凋亡)導(dǎo)致關(guān)于凋亡誘導(dǎo)再激活的致敏并有效地抵消最佳曲線的超最佳右側(cè)下降。從這之中，應(yīng)當(dāng)建立將凋亡誘導(dǎo)的最佳曲線轉(zhuǎn)化為平臺(tái)曲線的調(diào)節(jié)方法，這應(yīng)該導(dǎo)致更大的治療用途的確定性。

實(shí)施例14：單域vhh片段僅抑制膜過氧化氫酶(其對(duì)腫瘤細(xì)胞是特征性的和至關(guān)重要的)并且未到達(dá)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(在正常細(xì)胞中也起作用)。

圖25和圖26顯示了過氧化氫酶中和性單域vhh片段僅中和腫瘤細(xì)胞的膜過氧化氫酶并不影響正常細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶。

分別將6000個(gè)未轉(zhuǎn)化的208f細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的208fsrc3細(xì)胞，以及mkn-45腫瘤細(xì)胞接種在100μl培養(yǎng)基中，并與0.1或1pg/ml過氧化氫酶中和性acatcb0972或者僅過氧化氫酶結(jié)合性acatcb0973相混合。使對(duì)照制備物不添加單域vhh片段。隨后，加入指定濃度的葡萄糖氧化酶并且在1.5小時(shí)后測量凋亡誘導(dǎo)。葡萄糖氧化酶(gox)產(chǎn)生h2o2，其是細(xì)胞可滲透的并因此可以通過細(xì)胞內(nèi)和膜過氧化氫酶降解。在足夠的濃度下，就細(xì)胞的惡性狀態(tài)而言，h2o2非選擇性地誘導(dǎo)凋亡(ivanovasetal.,selectiveandnonselectiveapoptosisinductionintransformedandnontransformedfibroblastsbyexogenousreactiveoxygenandnitrogenspecies.anticancerresearch,anticancerres.22:841-856,2002)。

圖25a顯示了與正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系相比，好得多地保護(hù)腫瘤細(xì)胞系mkn-45免于h2o2。在過氧化氫酶中和性單域vhh片段的存在下，對(duì)h2o2的效果而言非常清楚地敏化腫瘤細(xì)胞，而僅結(jié)合過氧化氫酶的單域vhh片段不導(dǎo)致致敏。圖26顯示了中和性單域vhh片段導(dǎo)致對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的致敏作用，但不能影響正常細(xì)胞。

圖25和26確認(rèn)了單域vhh片段對(duì)惡性細(xì)胞的具體效果，而正常細(xì)胞不受影響。這里，用腫瘤細(xì)胞觀察到最大的效果，因?yàn)檫@些(首先)受膜過氧化氫酶保護(hù)。已知轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在表面上攜帶可檢測量的過氧化氫酶，然而，比在腫瘤細(xì)胞中以更低的局部濃度存在，并因此不足以提供保護(hù)而免受ros信號(hào)傳導(dǎo)。正常細(xì)胞中反應(yīng)的缺乏證明了單域vhh片段不穿過細(xì)胞并且不能影響存在于那里的過氧化氫酶。即，它們特異性地對(duì)膜過氧化氫酶(其尤其對(duì)于腫瘤細(xì)胞是特征性的)起作用。然而，關(guān)于單域vhh片段的反應(yīng)位點(diǎn)的這個(gè)非常重要的陳述僅當(dāng)同時(shí)能夠證明正常細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的抑制實(shí)際上將影響它們針對(duì)h2o2的靈敏性時(shí)是有意義的。

在圖27中處理該對(duì)照方面。

圖27顯示了正常細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的sirna介導(dǎo)的敲低增加了它們對(duì)h2o2的靈敏性。

用對(duì)照sirna(sico)和針對(duì)過氧化氫酶的sirna(sicat)轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞(208f)、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(208fsrc3)以及腫瘤細(xì)胞(mkn-45)，并在37℃和5％co2維持24小時(shí)。此后，將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)，并且以6000個(gè)細(xì)胞/100μl培養(yǎng)基的細(xì)胞密度繼續(xù)。隨后，用增加濃度的gox(a-c)或者過氧化亞硝酸鹽(pon)處理制備物(d-f)。37℃和5％co2溫育1.5小時(shí)后，測定凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。為了評(píng)估該實(shí)驗(yàn)，概括了gox產(chǎn)生h2o2，其具有非常好的細(xì)胞滲透性，并因此可被膜過氧化氫酶和細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶兩者降解。另一方面，當(dāng)外源添加的過氧化亞硝酸鹽與細(xì)胞接觸時(shí)，其與細(xì)胞膜反應(yīng)。因此，針對(duì)過氧化亞硝酸鹽的保護(hù)僅可以通過位于膜外部的過氧化氫酶實(shí)現(xiàn)。

首先，圖27確認(rèn)了與正?；蜣D(zhuǎn)化細(xì)胞相比，好得多地保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于h2o2和過氧亞硝酸鹽。此外，該圖顯示了sirna介導(dǎo)的過氧化氫酶的降解導(dǎo)致針對(duì)h2o2的影響非常強(qiáng)烈地致敏正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以及腫瘤細(xì)胞。用過氧亞硝酸鹽處理后，出現(xiàn)了完全不同的畫面：現(xiàn)在，正常細(xì)胞中sirna介導(dǎo)的過氧化氫酶降解不導(dǎo)致致敏，而在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)強(qiáng)烈的致敏。這顯示出僅在惡性細(xì)胞(即轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)表面上，存在有過氧化氫酶，其針對(duì)外源過氧化亞硝酸鹽提供保護(hù)。在正常細(xì)胞中不能檢測出保護(hù)性膜過氧化氫酶作用。通過h2o2生成性gox做出的發(fā)現(xiàn)表明，正常細(xì)胞具有功能性保護(hù)性過氧化氫酶，該酶的作用可以例如通過sirna介導(dǎo)的敲低檢測。然而由于在示于圖26中的實(shí)驗(yàn)中，不能通過過氧化氫酶中和性單域vhh片段方式檢測針對(duì)h2o2致敏正常細(xì)胞，證明它們不能在細(xì)胞內(nèi)起作用。

實(shí)施例15：對(duì)單域vhh片段所顯示的體外效應(yīng)與腫瘤生長的體內(nèi)抑制相關(guān)。

圖28和圖29顯示了免疫受損小鼠的人結(jié)腸癌異種移植物的生長受單域vhh片段asodcb0989重復(fù)施用所抑制。

圖28和圖29中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)由商業(yè)認(rèn)證供應(yīng)商(oncotestgmbh,freiburg)進(jìn)行。這里，將人結(jié)腸癌的異種移植物植入合適的小鼠中。腫瘤生長并達(dá)到一定的最小尺寸后，開始治療試驗(yàn)。每周兩次靜脈施用指定劑量(mg/kg體重)的asodcb0989或緩沖液。此外，依靠卡尺測徑(caliber)每周兩次測量腫瘤大小。

首先，圖28顯示了在對(duì)照動(dòng)物中的腫瘤生長以非常清晰的擴(kuò)散為特征。當(dāng)施用0.03mg/kg的asodcb0989時(shí)，不產(chǎn)生與對(duì)照的可識(shí)別的差異(圖28a)。當(dāng)施用0.3mg/kg的asodcb0989時(shí)，單域vhh片段處理組非常清晰地區(qū)別于對(duì)照組，盡管這兩組受到非常強(qiáng)烈的擴(kuò)散。所說明的對(duì)照組和處理組之間腫瘤體積上的差異是由asodcb0989的清晰增殖抑制的表達(dá)。當(dāng)進(jìn)一步將asodcb0989的劑量增加到0.9mg/kg(圖29)時(shí)，在一些動(dòng)物中，增強(qiáng)了生長抑制，而在其他動(dòng)物中導(dǎo)致相反結(jié)果。這顯示，還呈現(xiàn)了最佳值形式的體內(nèi)劑量效應(yīng)曲線，并且示于圖29中的實(shí)驗(yàn)條件已達(dá)到超最佳值抑制的濃度限。

<110>喬治.鮑爾

曼弗萊德.莫茲

<120>抗原結(jié)合構(gòu)建體

<130>pwo00251bau

<160>51

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>對(duì)照sirna

<400>1

uucuccgaacgugucacgu19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>對(duì)照sirna反義

<400>2

acgugacacguucggagaa19

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirnafasr

<400>3

aaggagtacacagacaaagcc21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirnacasp8

<400>4

aagagtctgtgcccaaatcaa21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirnacasp9

<400>5

cagtgacatctttgtgtccta21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirnanox

<400>6

ccgacaaatactactacacaa21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirnanos2

<400>7

ctgggccgtgcaaaccttcaa21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirna過氧化氫酶

<400>8

ccggatctcacttggcggcaa21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sirna小鼠過氧化氫酶

<400>9

cccaataggagataaacttaa21

<210>10

<211>128

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>過氧化氫酶結(jié)合

<400>10

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnala

151015

glyglyserleuargleusercysalaalasergluargthrpheasn

202530

thrtyrglymetglytrppheargglnalaproglylysgluargglu

354045

phevalalathrilesertrpserglyaspserthrtyrtyralaasp

505560

servallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthr

65707580

mettyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyr

859095

tyrcysasnalaasnserglutyrglyaspsertyrtrpglyglngly

100105110

thrglnvalthrvalserserlyslyslyshishishishishishis

115120125

<210>11

<211>128

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>過氧化氫酶結(jié)合

<400>11

metalagluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnpro

151015

glyglyserleuargleusercysalavalserglypheilepheasn

202530

thrtyrsermetargtrpglyargglnalaproglylysglyleuglu

354045

trpvalserserileserthrglyglytyrserthrtyralaaspser

505560

vallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnleuval

65707580

tyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyrtyr

859095

cysglytrpglyalaphevalargglygluargproglnglyglngly

100105110

thrglnvalthrvalserserlyslyslyshishishishishishis

115120125

<210>12

<211>133

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>過氧化氫酶結(jié)合

<400>12

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnpro

151015

glyglyserleuargleusercysalaalaserglyserilepheser

202530

ilealasermetglytrptyrargglnalaproglylysglnargasp

354045

leuvalalathrilethrseraspglyserthrlystyralaaspser

505560

vallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrmet

65707580

tyrleuglnmetasnservallysprogluaspalaalavaltyrtyr

859095

cysasnalaaspalaaspaspleugluproglysertyrasptyrasp

100105110

tyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserserlyslyslyshis

115120125

hishishishishis

130

<210>13

<211>133

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>過氧化氫酶結(jié)合

<400>13

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnpro

151015

glyglyserleuargleusercysalaalaseralaserilepheser

202530

iletyrvalmetalatrptyrargglnalaproglylysglnargglu

354045

leuvalalathrvalthrserglyglyalathrasntyralaasnser

505560

vallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrmet

65707580

aspleuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyrtyr

859095

cysasnalagluasptyrtyrasptyrglyleuserargserlysile

100105110

tyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserserlyslyslyshis

115120125

hishishishishis

130

<210>14

<211>127

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sod結(jié)合

<400>14

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyilevalglnpro

151015

glyglyserleuargleusercysvalalasergluserileserglu

202530

ileaspalamettyrtrphisargglnalaproglylysgluargglu

354045

leuvalalaglyilethrasnaspglythrargtyrtyralaaspser

505560

vallysglyargphethrileserargaspasnalalysserthrleu

65707580

tyrleuglnmetasnserleulysphegluaspthralamettyrtyr

859095

cysalaalaleuproasnproproproglytyrtrpglyglnglythr

100105110

glnvalthrvalserserlyslyslyshishishishishishis

115120125

<210>15

<211>127

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sod結(jié)合

<400>15

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnser

151015

glyglyserleuthrleusercysthralaserglyphethrileser

202530

asntyrprometthrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglu

354045

trpvalserargileasnserglyglyaspargthrleutyralaasp

505560

servallysglyargphethrvalserargaspasnalaargasnthr

65707580

mettyrleuglnmetasnasnleulysprogluaspthrglyleutyr

859095

phecysalaaspserglyalaglytrpargtyrtrpglyglnglythr

100105110

glnvalthrvalserserlyslyslyshishishishishishis

115120125

<210>16

<211>127

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>sod結(jié)合

<400>16

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyilevalglnpro

151015

glyglyserleuargleusercysvalalasergluserileserasp

202530

ileaspalamettyrtrphisargglnalaproglylysargargglu

354045

leuvalalaglyilethrasnaspglythrglutyrphealaaspser

505560

vallysglyargphealaileserargaspasnthrlysserserleu

65707580

tyrleuglnmetasnserleulysleugluaspthralamettyrtyr

859095

cysalathrleuproasnproproproglytyrtrpglyglnglythr

100105110

glnvalthrvalserserlyslyslyshishishishishishis

115120125

<210>17

<211>260

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>雙特異性

<400>17

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnala

151015

glyglyserleuargleusercysalaalasergluargthrpheasn

202530

thrtyrglymetglytrppheargglnalaproglylysgluargglu

354045

phevalalathrilesertrpserglyaspserthrtyrtyralaasp

505560

servallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthr

65707580

mettyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyr

859095

tyrcysasnalaasnserglutyrglyaspsertyrtrpglyglngly

100105110

thrglnvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serglyglyglyglyseralaglnvalglnleuvalgluserglygly

130135140

glyleuvalglnserglyglyserleuthrleusercysthralaser

145150155160

glyphethrileserasntyrprometthrtrpvalargglnalapro

165170175

glylysglyleuglutrpvalserargileasnserglyglyasparg

180185190

thrleutyralaaspservallysglyargphethrvalserargasp

195200205

asnalaargasnthrmettyrleuglnmetasnasnleulysproglu

210215220

aspthrglyleutyrphecysalaaspserglyalaglytrpargtyr

225230235240

trpglyglnglythrglnvalthrvalserserlyslyslyshishis

245250255

hishishishis

260

<210>18

<211>260

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>雙特異性

<400>18

metalaglnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnser

151015

glyglyserleuthrleusercysthralaserglyphethrileser

202530

asntyrprometthrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglu

354045

trpvalserargileasnserglyglyaspargthrleutyralaasp

505560

servallysglyargphethrvalserargaspasnalaargasnthr

65707580

mettyrleuglnmetasnasnleulysprogluaspthrglyleutyr

859095

phecysalaaspserglyalaglytrpargtyrtrpglyglnglythr

100105110

glnvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

115120125

glyglyglyglyseralaglnvalglnleuvalgluserglyglygly

130135140

leuvalglnalaglyglyserleuargleusercysalaalaserglu

145150155160

argthrpheasnthrtyrglymetglytrppheargglnalaprogly

165170175

lysgluarggluphevalalathrilesertrpserglyaspserthr

180185190

tyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasn

195200205

alalysasnthrmettyrleuglnmetasnserleulysprogluasp

210215220

thralavaltyrtyrcysasnalaasnserglutyrglyaspsertyr

225230235240

trpglyglnglythrglnvalthrvalserserlyslyslyshishis

245250255

hishishishis

260

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

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argthrpheasnthrtyrglymetgly

15

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<213>人工序列

<220>

<223>cdr

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thrilesertrpserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>21

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>21

asnserglutyrglyaspsertyr

15

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<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>22

pheilepheasnthrtyrsermetarg

15

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<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>23

serileserthrglyglytyrserthrtyralaaspservallysgly

151015

<210>24

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>24

glyalaphevalargglygluargpro

15

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>25

serilepheserilealasermetgly

15

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<211>16

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<213>人工序列

<220>

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thrilethrseraspglyserthrlystyralaaspservallysgly

151015

<210>27

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<213>人工序列

<220>

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aspalaaspaspleugluproglysertyrasptyrasptyr

1510

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<213>人工序列

<220>

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serilepheseriletyrvalmetala

15

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<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>29

thrvalthrserglyglyalathrasntyralaasnservallysgly

151015

<210>30

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>30

gluasptyrtyrasptyrglyleuserargserlysiletyr

1510

<210>31

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>31

serilesergluileaspalamettyr

15

<210>32

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>32

glyilethrasnaspglythrargtyrtyralaaspservallysgly

151015

<210>33

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>33

leuproasnproproproglytyr

15

<210>34

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>34

phethrileserasntyrprometthr

15

<210>35

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>35

argileasnserglyglyaspargthrleutyralaaspservallys

151015

gly

<210>36

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>36

serglyalaglytrpargtyr

15

<210>37

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>37

serileseraspileaspalamettyr

15

<210>38

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>38

glyilethrasnaspglythrglutyrphealaaspservallysgly

151015

<210>39

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>39

leuproasnproproproglytyr

15

<210>40

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>40

argthrpheasnthrtyrglymetgly

15

<210>41

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>41

thrilesertrpserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>42

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>42

asnserglutyrglyaspsertyr

15

<210>43

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>43

phethrileserasntyrprometthr

15

<210>44

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>44

argileasnserglyglyaspargthrleutyralaaspservallys

151015

gly

<210>45

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>45

serglyalaglytrpargtyr

15

<210>46

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>46

phethrileserasntyrprometthr

15

<210>47

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>47

argileasnserglyglyaspargthrleutyralaaspservallys

151015

gly

<210>48

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>48

serglyalaglytrpargtyr

15

<210>49

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>49

argthrpheasnthrtyrglymetgly

15

<210>50

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>50

thrilesertrpserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

<210>51

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cdr

<400>51

asnserglutyrglyaspsertyr

15