相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求2015年2月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/118412的優(yōu)先權(quán)。此相關(guān)申請(qǐng)的內(nèi)容明確地通過引用以其整體結(jié)合在此。

背景技術(shù)：

本披露總體上涉及分子生物學(xué)的領(lǐng)域，并且更具體地涉及高通量單細(xì)胞分析。

相關(guān)技術(shù)的說明

用于流式細(xì)胞術(shù)的方法和技術(shù)適用于細(xì)胞分析，具體地是解密細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)譜以確定細(xì)胞的狀態(tài)。用于mrna測(cè)序的方法和技術(shù)適用于細(xì)胞分析，具體地是解密基因表達(dá)譜，以使用例如下一代測(cè)序(“ngs”)確定細(xì)胞的狀態(tài)。當(dāng)對(duì)感興趣的細(xì)胞和不感興趣的細(xì)胞兩者的樣品進(jìn)行時(shí)，這些方法和技術(shù)確定這些細(xì)胞在這些樣品中的平均狀態(tài)。然而，細(xì)胞至細(xì)胞的變化可能存在于不同細(xì)胞中，因此這些方法和技術(shù)對(duì)于感興趣的細(xì)胞具有差的信噪比。而且，細(xì)胞的基因表達(dá)譜可能不是細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的準(zhǔn)確代理。因此，需要改進(jìn)的分離和測(cè)序單細(xì)胞(包括感興趣的細(xì)胞)的低成本方法以及能夠高效且有效地結(jié)合基因組信息和蛋白質(zhì)組信息以進(jìn)行細(xì)胞分析的方法。

概述

本披露提供了用于單細(xì)胞測(cè)序的方法。在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品；分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息，其中獲得序列信息包括生成來自該一種或多種分離的細(xì)胞的分子索引的多核苷酸文庫。在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品，其中富集該樣品包括使用聲聚焦來聚集樣品中感興趣的細(xì)胞；分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息。

在一些實(shí)施例中，富集該樣品包括以下各項(xiàng)中的一種或多種：聚集樣品中感興趣的細(xì)胞和消除樣品中不感興趣的細(xì)胞。聚集感興趣的細(xì)胞可以包括使用例如聲聚焦將樣品中感興趣的細(xì)胞聚集到細(xì)胞核心流中。聚集樣品中感興趣的細(xì)胞可以包括基于細(xì)胞大小聚集樣品中感興趣的細(xì)胞。例如，聚集感興趣的細(xì)胞包括聚集各自具有預(yù)定范圍內(nèi)的大小的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，消除樣品中不感興趣的細(xì)胞包括消除具有不屬于預(yù)定范圍內(nèi)的大小的細(xì)胞。聲聚焦可以包括：將樣品中的多個(gè)細(xì)胞懸浮在細(xì)長(zhǎng)流體填充通道中；并且將所述通道暴露于平行于流動(dòng)方向的軸向聲駐波場(chǎng)，其中所述軸向聲駐波場(chǎng)將多個(gè)細(xì)胞沿著所述通道的中心軸驅(qū)動(dòng)到潛在力最小值的位置，以產(chǎn)生均勻間隔的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，聚集感興趣的細(xì)胞包括流體動(dòng)力學(xué)聚焦、磁場(chǎng)聚焦、電場(chǎng)聚焦、重力場(chǎng)聚焦、光學(xué)場(chǎng)聚焦或其組合。在一些實(shí)施例中，該方法可以包括消除樣品中的干擾細(xì)胞和碎片中的一種或多種。

在一些實(shí)施例中，從富集的細(xì)胞樣品中分離一種或多種感興趣的細(xì)胞包括使用流式細(xì)胞儀分選富集的細(xì)胞樣品中的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀可以利用熒光激活細(xì)胞分選。分離樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞可以包括將樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞沉積到一個(gè)或多個(gè)微量滴定板中。一個(gè)或多個(gè)微量滴定板中的每一個(gè)可以具有例如至少96個(gè)孔。

在一些實(shí)施例中，該一種或多種多核苷酸包括rna，諸如mrna，并且可以從外來體中獲得。序列信息可以例如包括至少10種基因的轉(zhuǎn)錄物計(jì)數(shù)，例如cd4、fox01、cd45ro、myc、il1r2、prf1、gzmk、lgals1、il17f、il23r、lynx1、prdm1、sell、smad4、icos、ikzf5、rorc、ahrr、ctla4、itgb7、entpd1、ccr8、tshr、tgfb2、il12a、il7r、hla-dma、ccr5、tiaf1、bcl6、bhlhe40、cxcr4、cd307c、cd3d、gstp1、tcf7、cd3e、rnb6、rb1、myb、cd3g、krt8、cdh1、erbb3、erbb2、tctn1、esr1、cdkn1a、tff3、abcb1、abcg2、adam23、aktl、apc、ar、atm、bad、bcl2、birc5、brca1、brca2、c4a、ca12、ccna1、ccnd1、ccnd2、ccne1、cdh1、cdh13、cdk2、cd326、cdkn1a、cdkn1c、cdkn2a、csf1、cst6、ctnnbl、ctsd、egf、egfr、emap-2、erbb2、erbb3、esr1、esr2、foxa1、gata3、gli1、gpi、grb7、gstp1、hic1、hprtl、id1、igf1、igf1r、igfbp3、il6、jun、krt18、krt19、krt5、krt8、lampl、mapk1、mapk3、mapk8、mgmt、mki67、mlh1、mmp2、mmp9、muc1、myb、myc、nme1、notch1、nr3c1、pgr、plau、prdm2、psmb2、psmb4、pten、ptgs2、pycard、rab7a、rara、rarb、rassf1、rb1、reep5、rnb6、serpine1、sfn、sfrp1、slc39a6、slit2、snai2、src、tbc1d9、tctn1、tff3、tgfb1、thbs1、tp73、twist1、vegfa、xbp1、cd3e、cd3g、cd3g、tcf7、alcam、cd25、itga6、thy1、prom1以及cxcr4。在一些實(shí)施例中，不超過500個(gè)細(xì)胞可以從富集的細(xì)胞樣品中分離。

在一些實(shí)施例中，獲得序列信息包括對(duì)分子索引的多核苷酸文庫進(jìn)行測(cè)序并且可能對(duì)由文庫測(cè)序獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去卷積。在一些實(shí)施例中，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去卷積包括使用軟件即服務(wù)平臺(tái)。

在一些實(shí)施例中，樣品可以包括或者可以是生物樣品、臨床樣品、環(huán)境樣品或其組合。在一些實(shí)施例中，該樣品可以包括來自患者的生物流體、組織和細(xì)胞中的一種或多種。在一些實(shí)施例中，該樣品可以包括血液、尿液、腦脊液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髓、活檢樣品或其組合。

在一些實(shí)施例中，樣品中感興趣的細(xì)胞包括干細(xì)胞、癌細(xì)胞、血細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、處于預(yù)期細(xì)胞周期階段的細(xì)胞或其組合。在一些實(shí)施例中，這些方法包括以下各項(xiàng)中的一種或多種：基于所獲得的序列信息確定患者的基因型；基于所獲得的序列信息確定患者的表型；基于所獲得的序列信息確定患者的一種或多種遺傳突變；并且預(yù)測(cè)患者對(duì)一種或多種疾病的易感性。一種或多種疾病中的至少一種可以是例如癌癥或遺傳性疾病。在一些實(shí)施例中，樣品中細(xì)胞總數(shù)目的小于10％、1％、0.1％或0.01％是感興趣的細(xì)胞。

附圖簡(jiǎn)要說明

圖1a-圖1b是示出細(xì)胞分析的非限制性示例性工作流程的流程圖，這些工作流程包括例如細(xì)胞富集和分選、分子索引、文庫制備、測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析。

圖2是示出用于生成來自一種或多種細(xì)胞的分子索引的多核苷酸文庫的非限制性示例性方法的非限制性示意圖。

圖3是通過與支持物結(jié)合探針的陣列雜交進(jìn)行的隨機(jī)標(biāo)記和計(jì)數(shù)的非限制性實(shí)施例的示意圖。

圖4a-圖4b是標(biāo)記靶標(biāo)分子并檢測(cè)標(biāo)記的靶標(biāo)的非限制性示意圖。圖4a示出使用標(biāo)記庫標(biāo)記靶標(biāo)分子的示意圖。圖4b示出在具有標(biāo)記特異性和靶標(biāo)特異性的特征的陣列上檢測(cè)標(biāo)記的靶標(biāo)的示意圖。

圖5是聲聚焦的非限制性示意圖。

圖6a-圖6c是聲聚焦的非限制性示意圖。

圖7是聲聚焦的非限制性示意圖。

圖8是結(jié)合聲聚焦和流體動(dòng)力學(xué)聚焦的非限制性示意圖。

圖9是細(xì)胞分選儀系統(tǒng)的非限制性示意圖。

圖10是示出數(shù)據(jù)分析的非限制性示例性步驟的流程圖。

圖11a-圖11f示出用于下一代測(cè)序的單細(xì)胞的門控。

圖12a-圖12b是示出從單細(xì)胞獲得的讀取和轉(zhuǎn)錄物數(shù)目的柱狀圖。

圖13是示出分子索引測(cè)定校正了pcr偏移的計(jì)數(shù)讀取相對(duì)于分子的圖。

圖14a-圖14b是調(diào)節(jié)t細(xì)胞(treg)相對(duì)于非調(diào)節(jié)t細(xì)胞和原初調(diào)節(jié)t細(xì)胞相對(duì)于效應(yīng)調(diào)節(jié)t細(xì)胞的主要組分分析(“pca”)圖，這些圖顯示表面標(biāo)記物表型與分子譜相關(guān)。

圖15a-圖15c是cd45ra^-cd15s⁺、cd161^-非抑制性調(diào)節(jié)t細(xì)胞和cd45ra⁺cd15s^-效應(yīng)調(diào)節(jié)t細(xì)胞穿過時(shí)間點(diǎn)的pca單細(xì)胞圖。

圖16a-圖16c是示出單細(xì)胞的細(xì)胞周期分析的圖。

圖17a-圖17b是示出單細(xì)胞和少量細(xì)胞的準(zhǔn)確遞送的圖。

圖18a-圖18b是示出通過細(xì)胞分選儀進(jìn)行的單細(xì)胞分離的圖。

圖19a-圖19c示出jurkat細(xì)胞和t47d細(xì)胞的pca群集和基因表達(dá)譜。圖19a是示出jurkat細(xì)胞和t47d細(xì)胞到兩個(gè)簇中的群集的pca圖。圖19b-圖19c是示出jurkat細(xì)胞簇1和t47d細(xì)胞簇2的基因表達(dá)譜的柱形圖。

圖20a-圖20b是示出cd44和her2/neu的相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的圖。

圖21a-圖21d是示出由jurkat、hela、t47d以及skbr3中的her2/neu蛋白質(zhì)表達(dá)限定的三個(gè)群體的圖。

圖22是示出使用分子索引分析的乳腺癌基因的表格

圖23是示出所表達(dá)的靶基因的分析的熱圖，該熱圖證明了四種不同細(xì)胞類型之間的明顯不同。

圖24a-圖24b是示出由具有支持熱圖結(jié)果的隨機(jī)her2/neu表達(dá)的細(xì)胞類型進(jìn)行的群集的pca圖。

圖25a-圖25g是示出erbb2、brca1、cdk2、muc1、cdh1、ctsd以及ctsd的逐步增加的表達(dá)圖。

詳細(xì)說明

在以下詳細(xì)說明中參考了形成本說明的一部分的附圖。在圖中，相似的符號(hào)典型地標(biāo)識(shí)相似的部件，除非上下文另外規(guī)定。在詳細(xì)說明、附圖以及權(quán)利要求書中所描述的說明性實(shí)施例并不意在進(jìn)行限制。在不脫離在此呈現(xiàn)的主題精神或范圍的情況下，可以采用其他實(shí)施例，并且可以做出其他改動(dòng)。易于理解的是，如在此總體所述的和在附圖中示出的本披露的方面可以各種的不同構(gòu)造方式進(jìn)行布置、取代、組合、分隔和設(shè)計(jì)，所有這些明顯是涵蓋的并且組成在此的披露內(nèi)容的一部分。

定義

除非另有定義，否則在此所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本披露所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。參見例如辛格爾頓(singleton)等人，微生物學(xué)和分子生物學(xué)字典(dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology)第2版，約翰·威利父子公司(j.wiley&sons)(紐約州紐約市(newyork,ny)1994)；薩姆布魯克(sambrook)等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(molecularcloning,alaboratorymanual)，冷泉港出版社(coldspringsharborpress)(紐約冷泉港(coldspringsharbor,ny)1989)。出于本披露的目的，以下術(shù)語定義如下。

如在此所用，術(shù)語“銜接子”可以意指有利于相締合的核酸的擴(kuò)增或測(cè)序的序列。相締合的核酸可以包括靶核酸。相締合的核酸可以包括樣品標(biāo)記和分子標(biāo)記中的一種或多種。銜接子可以是線性的。銜接子可以是預(yù)腺苷酸化的銜接子。銜接子可以是雙鏈或單鏈的。一個(gè)或多個(gè)銜接子可以位于核酸的5’或3’端上。當(dāng)銜接子包含在5’和3’端上的已知序列時(shí)，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’和/或3’端上的銜接子可以能夠與固定在表面上的一種或多種寡核苷酸雜交。銜接子可以包含通用序列。通用序列可以是兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子共有的核苷酸序列區(qū)域。兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子還可以具有序列不同的區(qū)域。因此，例如，5’銜接子可以包含相同或通用核酸序列并且3’銜接子可以包含相同或通用序列?？梢源嬖谟诙鄠€(gè)核酸分子的不同成員中的通用序列可以允許使用與通用序列互補(bǔ)的單一通用引物復(fù)制或擴(kuò)增多種不同的序列。類似地，可以存在于一批核酸分子的不同成員中的兩種(例如一對(duì))或更多種通用序列可以允許使用與通用序列互補(bǔ)的至少一種、兩種(例如一對(duì))或更多種單一通用引物復(fù)制或擴(kuò)增多種不同的序列。因此，通用引物包含可與這種通用序列雜交的序列。攜帶靶核酸序列的分子可以被修飾成將通用銜接子(例如，非靶核酸序列)連接到不同的靶核酸序列的一端或兩端，這些銜接子提供用于通用引物雜交的位點(diǎn)。在銜接子-靶標(biāo)-銜接子的5’端和3’端處的銜接子可以是相同或不同的。

如在此所用，術(shù)語“相締合的”或“與...相締合的”可以意指兩種或更多種物質(zhì)在某一時(shí)間點(diǎn)可識(shí)別為共定位。締合可以意指兩種或更多種物質(zhì)在或曾經(jīng)在類似容器內(nèi)。締合可以是信息學(xué)關(guān)聯(lián)，其中例如關(guān)于兩種或更多種物質(zhì)的數(shù)字信息被存儲(chǔ)并且可以用于確定一種或多種物質(zhì)在某一時(shí)間點(diǎn)共定位。締合還可以是物理締合。在一些實(shí)施例中，兩種或更多種相締合的物質(zhì)彼此“系接”、“連接”或“固定”，或“系接”、“連接”或“固定”至共同的固體或半固體表面。締合可以是指用于將標(biāo)記連接至固體或半固體支持物諸如珠的共價(jià)或非共價(jià)方式。締合可以是靶標(biāo)與標(biāo)記之間的共價(jià)鍵。

如在此所使用，術(shù)語“互補(bǔ)”可以是指兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果核酸的指定位置處的核苷酸能夠與另一個(gè)核酸的核苷酸氫鍵結(jié)合，則認(rèn)為兩個(gè)核酸在那一位置是彼此互補(bǔ)的。兩個(gè)單鏈核酸分子之間的互補(bǔ)性可以是“部分的”，其中僅一些核苷酸結(jié)合，或者當(dāng)單鏈分子之間存在總體互補(bǔ)性時(shí)該結(jié)合可以是完全的。如果第一核苷酸序列與第二核苷酸序列互補(bǔ)，則可以稱為第一核苷酸序列是第二序列的“補(bǔ)體”。如果第一核苷酸序列與反向(即核苷酸的順序是相反的)于第二序列的序列互補(bǔ)，則可以稱為第一核苷酸序列是第二序列的“反向補(bǔ)體”。如在此所用，術(shù)語“補(bǔ)體”、“互補(bǔ)性”和“反向補(bǔ)體”可以互換使用。從本披露中理解的是，如果分子可以與另一分子雜交，則該分子可以是雜交分子的補(bǔ)體。

如在此所用，術(shù)語“數(shù)字計(jì)數(shù)”可以是指用于估計(jì)樣品中靶分子的數(shù)目的方法。數(shù)字計(jì)數(shù)可以包括確定已與樣品中的靶標(biāo)相締合的獨(dú)特標(biāo)記數(shù)目的步驟。這種隨機(jī)方法將計(jì)數(shù)分子的問題從定位并識(shí)別相同分子的一個(gè)問題轉(zhuǎn)變成關(guān)于檢測(cè)一組預(yù)定義的標(biāo)記的一系列是/否數(shù)字問題。

如在此所用，術(shù)語“一個(gè)標(biāo)記”或“多個(gè)標(biāo)記”可以是指與樣品內(nèi)的靶標(biāo)締合的核酸編碼。標(biāo)記可以是例如核酸標(biāo)記。標(biāo)記可以是整體或部分可擴(kuò)增的標(biāo)記。標(biāo)記可以是整體或部分可測(cè)序的標(biāo)記。標(biāo)記可以是天然核酸中可識(shí)別為不同的一部分。標(biāo)記可以是已知序列。標(biāo)記可包括核酸序列的接點(diǎn)，例如天然序列和非天然序列的接點(diǎn)。如在此所用，術(shù)語“標(biāo)記”可以與術(shù)語“索引”、“標(biāo)簽”或“標(biāo)記-標(biāo)簽”互換使用。標(biāo)記可以傳達(dá)信息。例如，在不同的實(shí)施例中，標(biāo)記可用于確定樣品身份、樣品來源、細(xì)胞身份和/或靶標(biāo)。

如在此所用，術(shù)語“mrna”或有時(shí)提及的“mrna轉(zhuǎn)錄物”包括但不限于一種或多種前-mrna轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄物加工中間體、準(zhǔn)備用于翻譯的一種或多種成熟mrna和這種或這些基因的轉(zhuǎn)錄物或者衍生自一種或多種mrna轉(zhuǎn)錄物的核酸。轉(zhuǎn)錄物加工可以包括剪接、編輯和降解。如在此所用，衍生自mrna轉(zhuǎn)錄物的核酸是指最后以mrna轉(zhuǎn)錄物或其子序列充當(dāng)模板來合成的核酸。因此，由mrna逆轉(zhuǎn)錄的cdna、由cdna轉(zhuǎn)錄的rna、由cdna擴(kuò)增的dna、由擴(kuò)增的dna轉(zhuǎn)錄的rna等等全部是衍生自mrna轉(zhuǎn)錄物并且此類衍生的產(chǎn)物的檢測(cè)指示初始轉(zhuǎn)錄物在樣品中的存在和/或豐度。因此，mrna衍生的樣品包括但不限于這種或這些基因的mrna轉(zhuǎn)錄物、由mrna逆轉(zhuǎn)錄的cdna、由cdna轉(zhuǎn)錄的crna、由這些基因擴(kuò)增的dna、由擴(kuò)增的dna轉(zhuǎn)錄的rna等等。

如在此所用，術(shù)語“下一代測(cè)序”是指與傳統(tǒng)基于桑格(sanger)電泳和毛細(xì)管電泳的方法相比具有增加的通量的測(cè)序技術(shù)，例如具有一次生成數(shù)百上千或數(shù)百萬的相對(duì)短的序列讀取的能力。下一代測(cè)序技術(shù)的實(shí)例包括但不限于通過合成進(jìn)行的測(cè)序、通過連接進(jìn)行的測(cè)序和通過雜交進(jìn)行的測(cè)序。下一代測(cè)序方法的實(shí)例包括但不限于焦磷酸測(cè)序，如通過gsjunior和gsflx系統(tǒng)(454生命科學(xué)公司(lifesciences)，康乃狄克州布蘭福德(bradford,ct))使用的；通過合成進(jìn)行的測(cè)序，如通過miseq和solexa系統(tǒng)(依諾米那有限公司(illumina,inc.)，加利福尼亞州圣地亞哥(sandiego,ca))使用的；solid^tm(通過寡核苷酸連接和檢測(cè)進(jìn)行測(cè)序)系統(tǒng)和離子半導(dǎo)體測(cè)序(iontorrentsequencing)系統(tǒng)諸如個(gè)人染色體檢測(cè)儀或質(zhì)子測(cè)序儀(賽默飛世爾科技公司(thermofisherscientific)，馬薩諸塞州沃爾瑟姆(waltham,ma))，以及納米孔測(cè)序系統(tǒng)(牛津納米孔技術(shù)公司(oxfordnanoporetechnologies)，英國(guó)牛津(oxford,unitedkingdom))。

如在此所用，術(shù)語“非消耗貯存池(non-depletingreservoirs)”可以是指由許多不同的標(biāo)記組成的隨機(jī)條形碼庫。非消耗貯存池可以包含大量的不同隨機(jī)條形碼，使得當(dāng)非消耗貯存池與靶標(biāo)庫締合時(shí)，每個(gè)靶標(biāo)很可能與獨(dú)特的隨機(jī)條形碼締合。每個(gè)標(biāo)記的靶分子的獨(dú)特性可以通過隨機(jī)選擇的統(tǒng)計(jì)學(xué)確定，并且取決于與標(biāo)記的多樣性相比集合體中相同靶分子的拷貝數(shù)。所得到的標(biāo)記的靶分子組的大小可以通過條形編碼過程的隨機(jī)性質(zhì)和檢測(cè)到的隨機(jī)條形碼的數(shù)目分析確定，然后允許計(jì)算原始集合體或樣品中存在的靶分子的數(shù)目。當(dāng)存在的靶分子的拷貝數(shù)與獨(dú)特的隨機(jī)條形碼的數(shù)目之比較低時(shí)，標(biāo)記的靶分子是高度獨(dú)特的(即一個(gè)給定的標(biāo)記將對(duì)一個(gè)以上的靶分子加標(biāo)記的概率非常低)。

如在此所用，“核酸”可以通常是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸對(duì)細(xì)胞可以是外源性或內(nèi)源性的。核酸可以存在于無細(xì)胞環(huán)境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是dna。核酸可以是rna。核酸可以包括一種或多種類似物(例如改變的骨架、糖或核堿基)。類似物的一些非限制性實(shí)例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、xeno核酸、嗎啉化合物、鎖核酸、乙二醇核酸、蘇糖核酸、雙脫氧核苷酸、蛹蟲草菌素、7-脫氮-gtp、熒光團(tuán)(例如，連接至糖的羅丹明或熒光素)、含硫醇的核苷酸、生物素連接的核苷酸、熒光堿基類似物、cpg島、甲基-7-鳥苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氫尿苷、辮苷以及懷俄苷?！昂怂帷?、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互換使用。

核酸可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾(例如，堿基修飾、骨架修飾)以提供具有新的或增強(qiáng)的特征(例如，改善的穩(wěn)定性)的核酸。核酸可以包含核酸親和標(biāo)簽。核苷可以是堿基-糖組合。核苷的堿基可以雜環(huán)堿基。此類雜環(huán)堿基的兩種最常見的種類是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是進(jìn)一步包含共價(jià)連接至核苷的糖部分的磷酸酯基團(tuán)的核苷。對(duì)于包含戊呋喃糖的那些核苷，磷酸酯基團(tuán)可以連接至糖的2’、3’或5’羥基部分。在形成核酸時(shí)，磷酸酯基團(tuán)可以共價(jià)連接彼此相鄰的核苷以形成線性聚合化合物。進(jìn)而，該線性聚合化合物的對(duì)應(yīng)末端可以進(jìn)一步連接以形成環(huán)狀化合物；然而，線性化合物通常是適合的。此外，線性化合物可以具有內(nèi)部的核苷酸堿基互補(bǔ)性并且因此可以便于產(chǎn)生完全或部分雙鏈化合物的方式折疊。在核酸內(nèi)，磷酸酯基團(tuán)可以通常涉及形成核酸的核苷間骨架。鍵聯(lián)或骨架可以是3’至5’磷酸二酯鍵。

核酸可以包含修飾的骨架和/或修飾的核苷間鍵聯(lián)。修飾的骨架可以包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。其中含有磷原子的適合的修飾的核酸骨架可以包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(諸如3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯、手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯、硒代磷酸酯以及具有正常3'-5'鍵聯(lián)、2'-5’鍵聯(lián)類似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵聯(lián)是3’至3'、5’至5'或2'至2’鍵聯(lián)的反向極性的那些。

核酸可以包含這樣的多核苷酸骨架，這些多核苷酸骨架通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵聯(lián)、混合雜原子以及烷基或環(huán)烷基核苷間鍵聯(lián)、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵聯(lián)形成。這些骨架可以包括具有以下各項(xiàng)的那些：?jiǎn)徇I聯(lián)(部分地從核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；羌?；亞甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙?；羌?；核乙?；?riboacetyl)骨架；含烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的n、o、s和ch2組分。

核酸可以包括核酸模擬物。術(shù)語“模擬物”可以旨在包括這樣的多核苷酸，其中僅呋喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)和核苷酸間鍵聯(lián)兩者被非呋喃糖基團(tuán)置換，僅呋喃糖環(huán)的置換也可以稱之為糖替代物。雜環(huán)堿基部分和修飾的雜環(huán)堿基部分可以被保持以用于與適當(dāng)?shù)陌泻怂岬碾s交。一種這樣的核酸可以是肽核酸(pna)。在pna中，多核苷酸的糖骨架被含酰胺骨架，具體地氨基乙基甘氨酸骨架置換。核苷酸可以被保留并且直接或間接地結(jié)合至骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。pna化合物中的骨架可以包含給予pna含酰胺骨架的兩個(gè)或更多個(gè)連接的氨基乙基甘氨酸單元。雜環(huán)堿基部分可以直接或間接地結(jié)合至該骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。

核酸可以包含嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)。例如，核酸可以包含6元嗎啉代環(huán)以取代核糖環(huán)。在這些實(shí)施例中的一些中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷酸間鍵聯(lián)可以置換磷酸二酯鍵。

核酸可以具有連接的嗎啉代單元(即嗎啉代核酸)，這些嗎啉代單元具有連接至嗎啉代環(huán)的雜環(huán)堿基。連接基團(tuán)可以連接嗎啉代核酸中的嗎啉代單體單元?；诜请x子嗎啉代的寡聚化合物可以與細(xì)胞蛋白質(zhì)具有不太希望的相互作用?；趩徇亩嗪塑账峥梢允呛怂岬姆请x子模擬物。嗎啉代種類內(nèi)的多種化合物可以使用不同的連接基團(tuán)連接。另一種類的多核苷酸模擬物可以稱之為環(huán)己烯基核酸(cena)。核酸分子中正常地存在的呋喃糖環(huán)可以被環(huán)己烯基環(huán)置換。可以制備cenadmt保護(hù)的亞磷酰胺單體并且將其用于使用亞磷酰胺化學(xué)的寡聚化合物合成。將cena單體摻入到核酸鏈可以增加dna/rna雜合體的穩(wěn)定性。cena寡腺苷酸可以與核酸補(bǔ)體形成復(fù)合體，這些復(fù)合體具有與天然復(fù)合體類似的穩(wěn)定性。另一修飾可以包括鎖核酸(lna)，其中2’-羥基基團(tuán)連接至4’糖環(huán)的碳原子，從而形成2’-c、4’-c-氧基亞甲基鍵，從而形成二環(huán)糖部分。鍵可以是橋接2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(-ch2-)基團(tuán)，其中n是1或2。lna和lna類似物可以表現(xiàn)出與互補(bǔ)核酸相當(dāng)高的雙鏈體熱穩(wěn)定性(tm＝+3至+10℃)、3’核酸外切降解穩(wěn)定性和良好的溶解特性。

核酸還可以包含核堿基(經(jīng)常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或取代。如在此所用，“非修飾”或“天然”核堿基可以包括嘌呤堿基(例如腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g))，以及嘧啶堿基(例如胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)以及尿嘧啶(u))。修飾的核堿基可以包括其他合成以及天然的核堿基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基(-c＝c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-鹵基、8-氨基、8-氫硫基、8-硫烷基、8-羥基以及其他8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵基具體地5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤、以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。修飾的核堿基可以包括三環(huán)嘧啶諸如吩噁嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、酚噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)、g夾環(huán)(g-clamp)諸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、酚噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)、g夾環(huán)諸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并(3’,’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。

如在此所使用，術(shù)語“固體支持物”可以是指多種分子標(biāo)記或隨機(jī)條形碼可以連接到其上的離散固體或半固體表面。固體支持物可以涵蓋由核酸可固定(例如共價(jià)地或非共價(jià)地)在其上的塑料、陶瓷、金屬或聚合物材料(例如水凝膠)組成的任何類型的固體、多孔或中空球體、球、軸承、圓柱或其他類似的構(gòu)造。固體支持物可以包括離散顆粒，該離散顆?？梢允乔蛐?例如微球)或具有非球形或不規(guī)則形狀諸如立方體、長(zhǎng)方體、錐形、圓柱形、圓錐形、橢圓形或圓盤形等等。固體支持物可以與術(shù)語“珠”互換使用。

如在此所用，術(shù)語“隨機(jī)條形碼”可以是指包含標(biāo)記的多核苷酸序列。隨機(jī)條形碼可以是可用于隨機(jī)標(biāo)記的多核苷酸序列。隨機(jī)條形碼可以用于定量樣品內(nèi)的靶標(biāo)。與靶標(biāo)相締合的隨機(jī)條形碼可以稱為隨機(jī)條形碼-靶標(biāo)或隨機(jī)條形碼-標(biāo)簽-靶標(biāo)。

如在此所用，術(shù)語“隨機(jī)條形編碼”可以是指核酸的隨機(jī)標(biāo)記(例如條形編碼)。隨機(jī)條形編碼可以利用遞歸泊松策略來相關(guān)聯(lián)和定量與靶標(biāo)締合的標(biāo)記。

如在此所用，術(shù)語“靶標(biāo)”可以是指可以與隨機(jī)條形碼或分子鑒定物標(biāo)記相締合的成分。適合用于由本披露方法、裝置和系統(tǒng)進(jìn)行的分析的示例性靶標(biāo)包括寡核苷酸、dna、rna、mrna、微小rna、trna等等。靶標(biāo)可以是單鏈或雙鏈的。在一些實(shí)施例中，靶標(biāo)可以是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，靶標(biāo)是脂質(zhì)。

術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄酶”可以是指具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性(即催化由rna模板對(duì)dna的合成)的一組酶。一般來講，此類酶包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄子逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)菌逆轉(zhuǎn)錄酶、ii組內(nèi)含子衍生的逆轉(zhuǎn)錄酶以及其突變體、變體或衍生物。非逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶包括非ltr逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄子逆轉(zhuǎn)錄酶以及ii組內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄酶。ii組內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄酶的實(shí)例包括乳酸乳球菌(lactococcslactis)ll.ltrb內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄酶、嗜熱細(xì)長(zhǎng)聚球藻(thermosynechococcuselongates)tei4c內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄酶或嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)gsi-iic內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄酶。其他種類的逆轉(zhuǎn)錄酶可以包括許多種類的非逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(即轉(zhuǎn)錄子、ii組內(nèi)含子以及多樣性產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄因子等等)。

在本披露中，披露了用于成本有效的、高通量的細(xì)胞分析(諸如單細(xì)胞分析)的方法。這些方法適用于高分辨率基因組研究，包括ngs、qpcr和微陣列分析。在一些實(shí)施例中，在此披露的方法將細(xì)胞分選與分子索引相結(jié)合。在一些實(shí)施例中，這些方法也可以包括細(xì)胞分選之前的富集步驟并且進(jìn)行分子索引。在一些實(shí)施例中，這些方法包括使用流式細(xì)胞術(shù)諸如熒光激活細(xì)胞分選(“facs”)來分離感興趣的細(xì)胞。能夠分離單細(xì)胞的流式細(xì)胞儀包括但不限于bd(新澤西州富蘭克林湖(franklinlakes,nj))facsjazz^tm細(xì)胞分選儀和bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀。分子索引技術(shù)包括例如來自細(xì)胞研究有限公司(cellularresearch,inc.)(加利福尼亞州帕洛阿爾托(paloalto,ca))的precise^tmmolecularindexing^tm技術(shù)。如在此所披露的蛋白質(zhì)組分析和基因組分析的結(jié)合允許對(duì)細(xì)胞進(jìn)行綜合研究。例如，分子索引技術(shù)可以用于研究在轉(zhuǎn)錄水平下的細(xì)胞活性，例如定量感興趣的細(xì)胞中的mrna轉(zhuǎn)錄物，并且細(xì)胞分選方法可以用于研究在翻譯水平下的細(xì)胞活性，例如測(cè)定由細(xì)胞進(jìn)行的蛋白質(zhì)表達(dá)。在多個(gè)水平下的細(xì)胞活性的知識(shí)可以提供細(xì)胞生物學(xué)的不同方面并且檢測(cè)細(xì)胞中的異常，例如在轉(zhuǎn)錄與翻譯之間的相關(guān)性的缺乏。

在此披露的一些實(shí)施例提供了多核苷酸測(cè)序(諸如單細(xì)胞多核苷酸測(cè)序)的方法。在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品；從富集的細(xì)胞樣品中分離一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息。在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品；從富集的細(xì)胞樣品中分離一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息，其中獲得序列信息包括生成來自該一種或多種分離的細(xì)胞的分子索引的多核苷酸文庫。在一些實(shí)施例中，富集樣品可以包括例如聚集樣品中感興趣的細(xì)胞。感興趣的細(xì)胞可以使用例如聲聚焦來聚集到細(xì)胞核心流中。

圖1a是示出非限制性示例性方法100a的流程圖，該方法結(jié)合細(xì)胞富集、細(xì)胞分選的步驟并且獲得關(guān)于樣品分析的序列信息。該方法在104a處開始。在110a處，該方法可以通過例如磁力地去除不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞以及碎片并且聲聚集樣品中感興趣的細(xì)胞來富集樣品中感興趣的細(xì)胞。在116a處，感興趣的細(xì)胞從富集的細(xì)胞樣品中分離。分離可以通過例如細(xì)胞分選(包括單細(xì)胞分選)來進(jìn)行。分離的細(xì)胞的序列信息可以在120a處通過例如分子索引和測(cè)序諸如ngs來獲得。從步驟120a中獲得的序列信息可以任選地在124a處進(jìn)行分析，之后該方法在128a處完成。在該方法中，富集步驟110a和細(xì)胞分選步驟116a中的一個(gè)或多個(gè)可以利用聚焦技術(shù)。聚焦技術(shù)的非限制性實(shí)例包括但不限于聲聚焦、流體動(dòng)力學(xué)聚焦、磁場(chǎng)聚焦、電場(chǎng)聚焦、重力場(chǎng)聚焦、光學(xué)場(chǎng)聚焦或其任何組合。在一些實(shí)施例中，富集步驟110a可以利用磁力地消除干擾細(xì)胞和碎片的技術(shù)。

圖1b是示出非限制性示例性方法100b的流程圖，該方法是從細(xì)胞富集和分選、分子索引、文庫制備、測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析。該方法在104b處開始。一種或多種在線富集系統(tǒng)可以包括例如在108b處從樣品中磁力地去除不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片。在線富集系統(tǒng)可以利用結(jié)合不感興趣的細(xì)胞的bdimag^tm磁力分離珠。細(xì)胞可以在112b處聲聚集以增加感興趣的細(xì)胞的濃度，之后在116b處進(jìn)行細(xì)胞分選。樣品中感興趣的細(xì)胞可以被染色，以在116b處使用細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選。細(xì)胞分選儀的實(shí)例包括但不限于bdfacsjazz^tm細(xì)胞分選儀、bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀、伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司(bio-radlaboratories,inc.)(加利福尼亞州赫拉克勒斯(hercules,ca))s3e^tm細(xì)胞分選儀、索尼生物技術(shù)有限公司(sonybiotechnologyinc.)(加利福尼亞州圣何塞(sanjose,ca))sh800細(xì)胞分選儀、貝克曼庫爾特有限公司(beckmancoulterinc.)(加利福尼亞州布雷亞(brea,ca))moflo^tmxdp細(xì)胞分選儀。在116b處分選細(xì)胞之后，可以將細(xì)胞裂解以在120b處進(jìn)行分子索引和文庫制備并在122b處進(jìn)行測(cè)序。從步驟122b中獲得的序列信息可以任選地在124b處進(jìn)行分析，之后該方法在128b處完成。

在一些實(shí)施例中，可以有利的是，于在此所披露的方法中具有一個(gè)富集步驟，因?yàn)樵摬襟E可以允許更迅速地進(jìn)行細(xì)胞分選而較少受到不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片的干擾。在一些實(shí)施例中，在細(xì)胞分選之前利用聲聚焦使得能夠有效且快速地富集感興趣的細(xì)胞。這可以提供分選時(shí)間的減少，例如從數(shù)小時(shí)至數(shù)分鐘和數(shù)秒。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的，快速分選方法可以防止細(xì)胞死亡的惡化、生理?xiàng)l件和細(xì)胞狀態(tài)的變化和/或由于長(zhǎng)加工時(shí)間而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。在一些實(shí)施例中，活細(xì)胞群可以在其生命周期的同一點(diǎn)處或者在其正常生理?xiàng)l件和狀態(tài)下進(jìn)行分析。

分子索引和文庫生成

在此披露的單細(xì)胞測(cè)序方法可以包括通過對(duì)來自樣品中的一種或多種分離的細(xì)胞的靶標(biāo)進(jìn)行分子索引來獲得序列信息。靶標(biāo)可以例如是多核苷酸。多核苷酸可以是例如dna或rna(例如，mrna)。分子索引(有時(shí)稱為分子條形編碼或分子加標(biāo)簽)可以用于例如高選擇性單分子計(jì)數(shù)。例如，來自一種或多種分離的細(xì)胞的相同的多核苷酸分子集合體可以連接至一組不同的標(biāo)記，以用于分子索引。這些標(biāo)記各自可以包含例如分子標(biāo)記(也稱為分子索引)。在一些實(shí)施例中，這些方法包括對(duì)來自1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、800、1000、2000、5000、10000個(gè)細(xì)胞或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的細(xì)胞的多核苷酸進(jìn)行分子索引。

分子索引可以例如用于鑒定所索引的多核苷酸的起源(例如，指示所索引的多核苷酸是來自組織、細(xì)胞和/或容器)和/或告知所索引的多核苷酸的身份。該容器可以是板、孔、微滴、分隔件、管或類似容器。所索引的多核苷酸可以包括例如有待索引的多核苷酸(例如，mrna、基因組dna或cdna)和含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的標(biāo)記區(qū)。在一些實(shí)施例中，所索引的多核苷酸可以進(jìn)一步包含通用pcr區(qū)和銜接子區(qū)中的一種或多種。作為實(shí)例，所索引的多核苷酸可以位于容器(例如，微量滴定板)中，并且所索引的多核苷酸可以進(jìn)一步包括用于鑒定索引多核苷酸所位于的板的獨(dú)特標(biāo)記(例如，樣品條形碼)。用于鑒定該板的區(qū)域的實(shí)例是板索引。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記區(qū)可以包含兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記。例如，標(biāo)記區(qū)可以包含分子標(biāo)記(也稱為分子索引)和樣品標(biāo)記(也稱為樣品條形碼)。標(biāo)記的長(zhǎng)度可以發(fā)生改變。例如，標(biāo)記(例如，分子標(biāo)記或樣品標(biāo)記)的長(zhǎng)度可以是或者是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的。在一些實(shí)施例中，分子標(biāo)記的長(zhǎng)度是或者是約5個(gè)核苷酸，并且樣品標(biāo)記的長(zhǎng)度是或者是約5個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，分子標(biāo)記的長(zhǎng)度是或者是約10個(gè)核苷酸，并且樣品標(biāo)記的長(zhǎng)度是或者是約10個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施例中，對(duì)多核苷酸進(jìn)行分子索引包括生成來自一種或多種分離的細(xì)胞的分子索引的多核苷酸文庫。生成分子索引的多核苷酸文庫包括生成來自一種或多種分離的細(xì)胞的多個(gè)索引的多核苷酸。例如，對(duì)于包含第一索引的多核苷酸和第二索引的多核苷酸的分子索引的多核苷酸文庫，第一索引的多核苷酸的標(biāo)記區(qū)與第二索引的多核苷酸的標(biāo)記區(qū)的不同之處可以是至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，生成分子索引的多核苷酸文庫包括將多個(gè)mrna分子與多種寡核苷酸(包括聚(t)區(qū)和標(biāo)記區(qū))接觸；并且使用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈合成，以產(chǎn)生單鏈標(biāo)記的cdna分子，每個(gè)cdna分子包含cdna區(qū)和標(biāo)記區(qū)，其中該多個(gè)mrna分子包括具有不同序列的至少兩個(gè)mrna分子并且該多種寡核苷酸包括具有不同序列的至少兩種寡核苷酸。生成分子索引的多核苷酸文庫可以進(jìn)一步包括擴(kuò)增單鏈標(biāo)記的cdna分子，以產(chǎn)生雙鏈標(biāo)記的cdna分子；并且對(duì)雙鏈標(biāo)記的cdna分子進(jìn)行嵌套式pcr，以產(chǎn)生標(biāo)記的擴(kuò)增子。在一些實(shí)施例中，該方法可以包括生成銜接子標(biāo)記的擴(kuò)增子。

分子索引使用核酸條形碼或標(biāo)簽來標(biāo)記個(gè)別dna或rna分子。在一些實(shí)施例中，當(dāng)cdna分子由mrna生成時(shí)，分子索引涉及將dna條形碼或標(biāo)簽添加到cdna分子中。嵌套式pcr可以被進(jìn)行來使pcr擴(kuò)增偏移最小化。銜接子可以被添加來使用例如ngs進(jìn)行測(cè)序。

圖2是示出生成來自一種或多種細(xì)胞的分子索引的多核苷酸文庫的非限制性示例性方法的示意圖。如步驟1所示，逆轉(zhuǎn)錄過程可以編碼具有具有獨(dú)特分子標(biāo)記、樣品標(biāo)記和通用pcr位點(diǎn)的每個(gè)mrna分子。分子標(biāo)記也稱為分子條形碼和分子索引。樣品標(biāo)記也稱為樣品條形碼和樣品索引。標(biāo)記使得例如96孔形式的一個(gè)或多個(gè)多層滴定板中的所有樣品合并在一起以用于隨后的步驟。具體地，通過將一組分子鑒定物標(biāo)記210與rna分子202的聚(a)尾部區(qū)208隨機(jī)雜交，rna分子202可以被逆轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生標(biāo)記的cdna分子204(包括cdna區(qū)206)。每個(gè)分子鑒定物標(biāo)記210可以包含聚(dt)區(qū)212、標(biāo)記區(qū)214和通用pcr區(qū)216。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記區(qū)214可以包含分子標(biāo)記218和樣品標(biāo)記220。分子標(biāo)記218的長(zhǎng)度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的核苷酸。樣品標(biāo)記220的長(zhǎng)度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的核苷酸。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記區(qū)214可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000個(gè)或這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的不同標(biāo)記，諸如分子標(biāo)記218和樣品標(biāo)記220。每個(gè)標(biāo)記的長(zhǎng)度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的核苷酸。一組分子鑒定物標(biāo)記210可以含有10、20、40、50、70、80、90、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10²⁰個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的分子鑒定物標(biāo)記210。并且該組分子鑒定物標(biāo)記210可以例如各自含有獨(dú)特標(biāo)記區(qū)214。標(biāo)記的cdna分子204可以被純化來去除過量的分子鑒定物標(biāo)記210。純化可以包括ampure珠純化。

如步驟2所示，來自步驟1的逆轉(zhuǎn)錄過程的產(chǎn)物可以合并到管1中并且使用第1pcr引物庫和第1通用pcr引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。由于獨(dú)特的標(biāo)記區(qū)214，合并是可能的。具體地，標(biāo)記的cdna分子204可以被擴(kuò)增來產(chǎn)生嵌套式pcr標(biāo)記的擴(kuò)增子222。擴(kuò)增可以包括多重pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增可以包括在單一反應(yīng)體積中使用96種多重引物進(jìn)行的多重pcr擴(kuò)增。在一些實(shí)施例中，多重pcr擴(kuò)增可以在單一反應(yīng)體積中利用10、20、40、50、70、80、90、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10²⁰個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的多重引物。擴(kuò)增可以包括靶向特定基因的定制引物226a-226c的第1pcr引物庫224和通用引物228。定制引物226可以與標(biāo)記的cdna分子204的cdna部分206’內(nèi)的區(qū)域雜交。通用引物228可以與標(biāo)記的cdna分子204的通用pcr區(qū)216雜交。

如步驟3所示，來自步驟2的pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物可以使用嵌套式pcr引物庫和第2通用pcr引物進(jìn)行擴(kuò)增。嵌套式pcr可以使pcr擴(kuò)增偏移最小化。具體地，嵌套式pcr標(biāo)記的擴(kuò)增子222可以通過嵌套式pcr進(jìn)一步擴(kuò)增。嵌套式pcr可以包括在單一反應(yīng)體積中使用嵌套式pcr引物232a-c的嵌套式pcr引物庫230和第2通用pcr引物228’進(jìn)行多重pcr。嵌套式pcr引物庫228可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000種或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的不同嵌套式pcr引物230。嵌套式pcr引物232可以含有銜接子234并且與標(biāo)記的擴(kuò)增子222的cdna部分206”內(nèi)的區(qū)域雜交。通用引物228’可以含有銜接子236并且與標(biāo)記的擴(kuò)增子222的通用pcr區(qū)216雜交。因此，步驟3產(chǎn)生銜接子標(biāo)記的擴(kuò)增子238。在一些實(shí)施例中，嵌套式pcr引物232和第2通用pcr引物228’不能含有銜接子234和236。銜接子234和236反而可以連接至嵌套式pcr的產(chǎn)物，以產(chǎn)生銜接子標(biāo)記的擴(kuò)增子238。

如步驟4所示，來自步驟3的pcr產(chǎn)物可以使用文庫擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增以用于測(cè)序。具體地，銜接子234和236可以用于對(duì)銜接子標(biāo)記的擴(kuò)增子238進(jìn)行一種或多種另外的測(cè)定。銜接子234和236可以與引物240和242雜交。一個(gè)或多個(gè)引物240和242可以是pcr擴(kuò)增引物。一個(gè)或多個(gè)引物240和242可以是測(cè)序引物。一個(gè)或多個(gè)銜接子234和236可以用于進(jìn)一步擴(kuò)增銜接子標(biāo)記的擴(kuò)增子238。一個(gè)或多個(gè)銜接子234和236可以用于對(duì)銜接子標(biāo)記的擴(kuò)增子238進(jìn)行測(cè)序。引物242可以含有板索引244，這樣使得使用同一組分子鑒定物標(biāo)記208生成的擴(kuò)增子可以在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中使用ngs進(jìn)行測(cè)序。

于在此披露的方法中，隨機(jī)條形編碼可以用于分子索引。用于隨機(jī)條形編碼的方法和技術(shù)已描述于例如美國(guó)專利公開號(hào)20150299784、美國(guó)專利號(hào)8,835,358和付(fu)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(pnas),2001108(22):9026-9031中，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合在此。在圖3和圖4a-圖4b中示出了用于通過隨機(jī)標(biāo)記相同分子集合體來進(jìn)行單分子數(shù)字計(jì)數(shù)的非限制性示例性方法。

在圖3中示意性地示出了隨機(jī)條形編碼的一些實(shí)施例。不同標(biāo)記-標(biāo)簽序列301的文庫與包含未知數(shù)目的感興趣的靶標(biāo)303的樣品組合。示出了三種不同種類的靶標(biāo)303a、303b和303c，它們分別以4、6和3個(gè)拷貝存在。來自文庫301的個(gè)別標(biāo)記-標(biāo)簽寡核苷酸共價(jià)連接至不同的靶標(biāo)，以形成靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子305。每個(gè)靶標(biāo)具有不同標(biāo)記-標(biāo)簽分子305a、305b和305c的集合體，并且在每個(gè)靶標(biāo)特異性集合體內(nèi)各成員在連接的標(biāo)記-標(biāo)簽寡聚物方面是不同的。在陣列307上，每個(gè)靶標(biāo)與所有可能的標(biāo)記-標(biāo)簽組合相結(jié)合來拼接，這些標(biāo)記-標(biāo)簽組合以存在于陣列上的不同已知或可確定位置處的每個(gè)不同組合表示。在圖中，靶標(biāo)和標(biāo)記-標(biāo)簽的每個(gè)不同的組合出于說明目的由單一探針表示，但是在陣列上每個(gè)不同的探針優(yōu)選地以具有同一探針序列的多個(gè)拷貝的特征存在。出于說明目的，陣列被分成子陣列307a、307b和307c。探針的上部部分309在根據(jù)不同標(biāo)記-標(biāo)簽的每個(gè)特征處變化。下部部分313對(duì)于每個(gè)子陣列的所有特征而言是相同的并且與靶標(biāo)互補(bǔ)。在雜交之后，陣列的個(gè)別特征通過將互補(bǔ)的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子與特征雜交來標(biāo)記。附圖顯示可檢測(cè)標(biāo)記311可以用于檢測(cè)其中雜交靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽的特征。

標(biāo)記或計(jì)數(shù)物301與測(cè)定靶標(biāo)303組合，這樣使得每個(gè)靶標(biāo)與一個(gè)標(biāo)記組合以形成標(biāo)記-靶標(biāo)305。將個(gè)別靶標(biāo)與個(gè)別標(biāo)記分子組合的過程是隨機(jī)過程。與每個(gè)靶標(biāo)類型組合的標(biāo)記的數(shù)目與該靶標(biāo)類型的個(gè)別靶標(biāo)的數(shù)目或靶標(biāo)的拷貝數(shù)目直接成比例。標(biāo)記的數(shù)目通過與其中個(gè)別標(biāo)記-靶標(biāo)在不同特征處檢測(cè)的陣列雜交來計(jì)數(shù)。

分子(來自相同靶標(biāo)分子303的集合體)的每個(gè)拷貝通過選自不同標(biāo)記301的大的非消除貯存池來隨機(jī)捕獲標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)記的分子的獨(dú)特性通過隨機(jī)選擇的統(tǒng)計(jì)學(xué)控制，并且取決于與標(biāo)記的多樣性相比集合體中相同分子的拷貝數(shù)目。一旦分子被標(biāo)記，每個(gè)分子給出獨(dú)特的身份并且現(xiàn)在可以單獨(dú)地進(jìn)行檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選的是首先擴(kuò)增標(biāo)記的靶標(biāo)，之后進(jìn)行檢測(cè)，這樣使得可以使用簡(jiǎn)單存在/不存在閾值檢測(cè)方法。對(duì)標(biāo)記的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定溶液中分子的初始數(shù)目。在一些實(shí)施例中，有待計(jì)數(shù)的分子各自是共享一些共同特征的類別的成員，例如它們各自是特定基因序列或核酸序列的單一拷貝。計(jì)數(shù)可以例如應(yīng)用于mrna靶標(biāo)、拼接產(chǎn)物(可替代地是拼接的產(chǎn)物)、結(jié)構(gòu)性rna、trna、mirna、sirna、微rna等等。類似地，計(jì)數(shù)可以應(yīng)用于dna，例如基因拷貝數(shù)目、染色體數(shù)目、線粒體dna、細(xì)菌基因組、病原體核酸、病毒核酸等等。計(jì)數(shù)可以應(yīng)用于人類或其他哺乳動(dòng)物或農(nóng)業(yè)生物體例如牛、雞、小麥、稻米、魚等的疾病研究中。計(jì)數(shù)也可以應(yīng)用于微生物的計(jì)數(shù)方面，諸如環(huán)境測(cè)量，例如水品質(zhì)測(cè)試。在小數(shù)目的條目有待計(jì)數(shù)并且準(zhǔn)確計(jì)數(shù)而非相對(duì)估值是希望的時(shí)，這些方法可以是特別有用的。

靶標(biāo)與標(biāo)記-標(biāo)簽序列集合體混合，每個(gè)標(biāo)記-標(biāo)簽是不同的序列并且該集合體具有優(yōu)選為有待計(jì)數(shù)的最豐富靶標(biāo)的拷貝數(shù)目的10倍的數(shù)目。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記-標(biāo)簽是已知序列的集合體，諸如所有可能的6聚體(n6)的集合體。標(biāo)記-標(biāo)簽序列各自以多個(gè)拷貝存在于混合物，但是所有序列均以大約相等的量存在。標(biāo)記-標(biāo)簽序列連接至靶標(biāo)。連接是隨機(jī)的，這樣使得任何給定的標(biāo)記-標(biāo)簽具有大約相同的連接至任一個(gè)靶標(biāo)出現(xiàn)物的概率。因此如果存在1000個(gè)不同的靶標(biāo)，則每個(gè)靶標(biāo)可以連接至不同的標(biāo)記-標(biāo)簽序列，并且任何兩個(gè)靶標(biāo)出現(xiàn)物將具有相同標(biāo)記-標(biāo)簽連接的概率較低。因?yàn)檫B接是一個(gè)隨機(jī)過程，因此有一個(gè)已知的概率，如果給定靶標(biāo)的c拷貝和n不同標(biāo)記-標(biāo)簽，靶標(biāo)t的任何兩個(gè)拷貝將具有相同的標(biāo)記。

t1、t2、...tn，c1、c2、...cx，l1、l2、...ly，其中t是不同靶標(biāo)并且存在n個(gè)不同靶標(biāo)，c是靶標(biāo)的不同拷貝并且該靶標(biāo)存在x個(gè)拷貝，并且l是不同標(biāo)記的標(biāo)記-標(biāo)簽并且存在y個(gè)標(biāo)記標(biāo)簽。對(duì)于每個(gè)靶標(biāo)x可變并且確定x是本發(fā)明的目標(biāo)之一。在x與y之間的關(guān)系決定了兩個(gè)c將具有相同l的概率。在一些實(shí)施例中，對(duì)于有待計(jì)數(shù)的每個(gè)靶標(biāo)，y大于x。這降低了由于雙重標(biāo)記而導(dǎo)致不足計(jì)數(shù)的概率。如果t1的c1和c2二者均用l3標(biāo)記，則兩個(gè)拷貝將被計(jì)數(shù)為單次出現(xiàn)，從而導(dǎo)致不足計(jì)數(shù)。不足計(jì)數(shù)也可以通過評(píng)估可能多次標(biāo)記的拷貝數(shù)目并且向上調(diào)節(jié)最終計(jì)數(shù)以將它們考慮在內(nèi)來進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，如果有可能1000個(gè)拷貝中的5個(gè)將被同一標(biāo)記標(biāo)簽標(biāo)記，那么最終數(shù)目應(yīng)向上調(diào)節(jié)0.5％。

在一些實(shí)施例中，檢測(cè)是通過與探針陣列雜交來進(jìn)行的。該陣列具有每個(gè)靶標(biāo)的特征集合體，該靶標(biāo)包含每個(gè)標(biāo)記標(biāo)簽的不同特征。例如，如果存在x標(biāo)記標(biāo)簽，則對(duì)于每個(gè)靶標(biāo)存在x個(gè)特征，t1l1、t1l2、...t1lx，并且對(duì)于靶標(biāo)2同樣如此，t2l1、t2l2、...t2lx，直到tnl1、tnl2、...tnlx。陣列的特征的數(shù)目是大約x乘以n。每個(gè)探針具有靶標(biāo)互補(bǔ)序列和標(biāo)記標(biāo)簽互補(bǔ)序列。在給定靶標(biāo)的一組探針內(nèi)，探針的靶標(biāo)區(qū)段將保持恒定并且標(biāo)記標(biāo)簽部分在特征至特征之間變化，這樣使得每個(gè)標(biāo)記標(biāo)簽序列由每個(gè)靶標(biāo)的至少一個(gè)特征表示。

在一些實(shí)施例中，這些方法可以用于計(jì)數(shù)樣品中多種靶標(biāo)各自的拷貝數(shù)目。與標(biāo)記標(biāo)簽混合的含有靶標(biāo)的樣品的量可以被稀釋來使得有待計(jì)數(shù)的每個(gè)靶標(biāo)的拷貝數(shù)目小于標(biāo)記標(biāo)簽的數(shù)目。例如，如果有待計(jì)數(shù)的靶標(biāo)以約1000個(gè)拷貝/細(xì)胞存在并且存在10000個(gè)標(biāo)記標(biāo)簽，則需要使得混合物中樣品的量大約是一個(gè)細(xì)胞的rna價(jià)值的等同量?？梢詫⑺c每種標(biāo)記-標(biāo)簽的多個(gè)拷貝混合，但是需要將靶標(biāo)的拷貝的絕對(duì)數(shù)目保持低于標(biāo)記標(biāo)簽序列的類型的數(shù)目?？梢允褂脴悠返南♂尯拖鄬?duì)少量的起始材料的使用。如果靶序列以低拷貝數(shù)目/細(xì)胞存在，則可以使用來自更大數(shù)目的細(xì)胞的核酸。例如，為了測(cè)量染色體區(qū)域相對(duì)于其他染色體區(qū)域的dna拷貝數(shù)目，預(yù)期的拷貝數(shù)目是較低的(例如，對(duì)于正常情況是2)，因此如果存在10000個(gè)不同的標(biāo)記標(biāo)簽，則可以添加到樣品中以連接標(biāo)記標(biāo)簽的基因組數(shù)目可以是較高的，例如500至1000個(gè)。

在一些實(shí)施例中，這些方法用于鑒定基因組擴(kuò)增和染色體異常的區(qū)域。例如，這些方法可以用于檢測(cè)三體性。大部分染色體區(qū)域?qū)⒁?個(gè)拷貝/細(xì)胞存在并且三體性區(qū)域?qū)⒁?個(gè)拷貝/細(xì)胞存在。預(yù)期在計(jì)數(shù)中觀察到3:2比率。例如，如果具有500個(gè)基因組，則將具有1000個(gè)大部分區(qū)域的拷貝和1500個(gè)三體性區(qū)域的拷貝。在計(jì)數(shù)中由不足計(jì)數(shù)引起的小誤差將對(duì)計(jì)數(shù)幾乎不具有或不具有影響。在一些實(shí)施例中，已知拷貝數(shù)目的對(duì)照可以添加到樣品中，以確定準(zhǔn)確性。

t1,n(靶標(biāo)1的拷貝1、2...n的必需相同分子的集合體)乘以l1,m(當(dāng)m遠(yuǎn)大于n時(shí)有效地是多樣性的無限貯存池)的隨機(jī)標(biāo)記。這允許通過賦予t1,n集合體的成員單獨(dú)的身份來完全或近乎完全地分辨t1,n的成員(條件是在標(biāo)記中m足夠小于n)。這提供了t1,n到l1,m上的隨機(jī)或無規(guī)投射。在一些實(shí)施例中，l1,m是文庫并且文庫中與t1,n相締合的成員可以被計(jì)數(shù)來確定靶標(biāo)的拷貝的數(shù)目。在一些實(shí)施例中，這些方法可以被描述為索引靶標(biāo)的成員。這提供了一種追蹤個(gè)別分子的方法，這些分子是不能以其他方式彼此區(qū)分的分子類型的成員。

因?yàn)殡S機(jī)標(biāo)記可以賦予其他不可鑒定分子可鑒定性，它可以賦予任何兩個(gè)可能非常類似但是不同的分子可鑒定性?？梢愿叨阮愋偷强梢允褂盟兜姆椒▎为?dú)計(jì)數(shù)的靶標(biāo)的實(shí)例包括例如基因的替代性剪接形式以及具有一種或多種變化的序列，該一種或多種變化包括單個(gè)堿基的變化(例如snp或插入缺失(短區(qū)域的插入或缺失，例如1-5個(gè)堿基))。在一些實(shí)施例中，這些方法可以賦予克隆標(biāo)記，這允許單拷貝單獨(dú)地檢測(cè)并且從溶液中單獨(dú)地分離。

一些核酸測(cè)序反應(yīng)使用將靶標(biāo)隨機(jī)連接至固體支持物接著擴(kuò)增所連接靶標(biāo)并進(jìn)行分析的方法。靶標(biāo)連接至未知的位置中并且該位置可以通過對(duì)特定位置處的擴(kuò)增的靶標(biāo)進(jìn)行測(cè)序來確定。相比之下，所披露的方法提供了已知靶標(biāo)在已知位置中的克隆擴(kuò)增。靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子的形式的隨機(jī)性質(zhì)提供了用于分離所選靶標(biāo)的單次出現(xiàn)物的機(jī)制，這些單次出現(xiàn)物隨后可以進(jìn)行擴(kuò)增和分析。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記可以用作用于分離靶標(biāo)的克隆群體的柄狀物。標(biāo)記步驟生成具有多種應(yīng)用的索引的文庫。例如，索引的文庫可以用于測(cè)序應(yīng)用。該方法增加了任一組分子的可區(qū)分性，甚至是因?yàn)樗鼈兛梢怨蚕砉餐瑓^(qū)域或者甚至是相同的而通過其他機(jī)制不可區(qū)分的分子也如此。所索引的文庫可以保存并且使用多次，以生成用于分析的樣品。一些應(yīng)用包括例如對(duì)多態(tài)性進(jìn)行基因型分型、研究rna加工以及選擇克隆代表物進(jìn)行測(cè)序。

這些方法可以用于將陣列上的雜交信號(hào)強(qiáng)度的模擬讀出轉(zhuǎn)化成可以對(duì)陣列進(jìn)行數(shù)字評(píng)分的可測(cè)量方法。該方法利用一種隨機(jī)過程，其中對(duì)測(cè)定的分子加標(biāo)簽是通過隨機(jī)行為控制的。在一個(gè)隨機(jī)過程中，給定的靶標(biāo)的拷貝越多，被多個(gè)標(biāo)記加標(biāo)簽的概率越大。每個(gè)靶標(biāo)結(jié)合的標(biāo)記的數(shù)目計(jì)數(shù)可以接近于給定的感興趣的靶標(biāo)的豐度水平。對(duì)微陣列上的標(biāo)記進(jìn)行計(jì)數(shù)的能力相對(duì)于其他存在的技術(shù)將是明顯的成本優(yōu)點(diǎn)。

如在此所述的隨機(jī)計(jì)數(shù)測(cè)定也可以是大得多的生物分析系統(tǒng)內(nèi)的子系統(tǒng)。該生物分析系統(tǒng)可以包括以下所有方面：在例如光學(xué)檢測(cè)之前的樣品制備、在光學(xué)檢測(cè)階段中收集的數(shù)據(jù)的后加工和最終基于這些結(jié)果做出的決策。樣品制備可以包括諸如以下步驟：從測(cè)試的受試者(人類、動(dòng)物、植物環(huán)境等)中提取樣品；分離樣品的不同部分以在研究下獲得更高濃度和純度的分子；樣品擴(kuò)增(例如，通過pcr)；將熒光標(biāo)簽或標(biāo)志物連接至樣品的不同部分；并且將樣品或樣品的一部分轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器或基質(zhì)上的位點(diǎn)中。所收集數(shù)據(jù)的后處理可以包括：歸一化；背景和噪聲降低；以及統(tǒng)計(jì)分析，諸如對(duì)重復(fù)測(cè)試取平均值或不同測(cè)試之間的相關(guān)性。決策可以包括：針對(duì)一組預(yù)定義的規(guī)則進(jìn)行測(cè)試并且與外部數(shù)據(jù)庫中保存的信息進(jìn)行比較。

在此所述的隨機(jī)標(biāo)記和計(jì)數(shù)方法和系統(tǒng)的應(yīng)用和使用可以產(chǎn)生適用于診斷個(gè)體例如患者的疾病狀態(tài)的一種或多種結(jié)果。在一些實(shí)施例中，診斷疾病的方法包括檢查或分析與靶標(biāo)在樣品中的存在和/或濃度水平相關(guān)的數(shù)據(jù)?？梢詾榛颊?、健康護(hù)理提供者或健康護(hù)理管理者提供基于數(shù)據(jù)的檢查或分析的結(jié)論。在一些實(shí)施例中，該結(jié)論是基于關(guān)于疾病診斷的數(shù)據(jù)的檢查或分析?？梢栽O(shè)想的是，在另一個(gè)實(shí)施例中為患者、健康護(hù)理提供者或健康護(hù)理管理者提供結(jié)論包括通過網(wǎng)絡(luò)傳輸數(shù)據(jù)。

所披露的方法的應(yīng)用包括診斷癌性病狀或者診斷病毒、細(xì)菌和其他致病性或非致病性感染。所披露的方法和系統(tǒng)的另外的應(yīng)用包括病原體檢測(cè)和分類；化學(xué)戰(zhàn)/生物戰(zhàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)；化學(xué)品濃度控制；危險(xiǎn)物質(zhì)(例如氣體、液體)檢測(cè)和報(bào)警；在糖尿病患者中的糖和胰島素水平檢測(cè)；妊娠測(cè)試；病毒和細(xì)菌感染疾病(例如，aids、禽流感、sars、西尼羅河病毒)的檢測(cè)；環(huán)境污染監(jiān)測(cè)(例如，水、空氣)；以及食品加工中的質(zhì)量控制。

可以使用用于檢測(cè)標(biāo)記的任何可用的機(jī)制。雖然以上所討論的許多實(shí)施例使用陣列讀出形式，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將明顯的是可以使用其他用于讀出的方法。例如，在一些實(shí)施例中，測(cè)序可以用于檢測(cè)標(biāo)記。

在一些實(shí)施例中，讀出是在陣列上。該陣列可以是在有序排列中具有連接至表面上的固定的核酸探針的固體支持物。探針可以是例如在支持物的已知位置中使用光刻法原位合成的，或者探針可以按陣列形式點(diǎn)到支持物上。如上所討論的，在一些實(shí)施例中，陣列包含每個(gè)可能的標(biāo)記-靶標(biāo)組合的探針特征。特征優(yōu)選地包含單一探針序列的許多拷貝。該特征也可以具有一些探針，這些探針不是全長(zhǎng)的，由合成的截短物產(chǎn)生。光激活過程可能不是100％有效的，這樣使得一些探針在每個(gè)步驟中被封端而沒有添加的子序列堿基。這些截短的探針具有全長(zhǎng)探針的一部分的序列。

測(cè)序讀出。在標(biāo)記以隨機(jī)方式連接至靶標(biāo)之后，靶標(biāo)可以根據(jù)在此披露的任何方法進(jìn)行擴(kuò)增并且擴(kuò)增產(chǎn)物可以經(jīng)歷任何可用的測(cè)序方法。

已開發(fā)了許多替代性測(cè)序技術(shù)并且許多技術(shù)是商業(yè)上可獲得的。這些技術(shù)包括使用遺傳物質(zhì)的微陣列，這些微陣列可以被操縱來允許平行檢測(cè)核苷酸在遺傳物質(zhì)的許多片段中的順序。這些陣列典型地包括在基底上形成或布置的許多位點(diǎn)。引入另外的物質(zhì)，典型地是單一核苷酸或核苷酸鏈(寡核苷酸)，并且允許或促進(jìn)這些物質(zhì)結(jié)合至有待測(cè)序的遺傳物質(zhì)的模板，從而以序列依賴性方式選擇性地標(biāo)記模板。序列信息然后可以通過對(duì)位點(diǎn)成像來集中。在某些當(dāng)前技術(shù)中，例如，每個(gè)核苷酸類型用熒光標(biāo)簽或染料加標(biāo)簽，這允許分析連接在特定位點(diǎn)處的核苷酸，該特定位點(diǎn)有待通過分析圖像數(shù)據(jù)來確定。

在一些實(shí)施例中，質(zhì)譜分析可以用于檢測(cè)標(biāo)記并計(jì)數(shù)靶標(biāo)。標(biāo)記可以是基于可以檢測(cè)的大小或其他特性可區(qū)分的。在此提供的許多實(shí)例基于獨(dú)特核酸序列來鑒定標(biāo)記，但是可以使用任何可區(qū)分標(biāo)記，例如標(biāo)記庫可以是基于在獨(dú)特波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射可不同地鑒定的標(biāo)記。

圖4a示出了來自庫301的不同標(biāo)記與同一靶標(biāo)“t”的4個(gè)不同拷貝中的每一個(gè)的連接。標(biāo)記20連接至t1，標(biāo)記107連接至t2，標(biāo)記477連接至t3，并且標(biāo)記9連接至t4。標(biāo)記的靶標(biāo)然后被擴(kuò)增，以生成四種獨(dú)特的群體，每個(gè)群體代表該靶標(biāo)在起始樣品中的單次出現(xiàn)物。

圖4b示出用于比較兩種樣品(樣品1和樣品2)的方法。靶標(biāo)401基因a以2個(gè)拷貝存在于樣品1中并且以9個(gè)拷貝存在于樣品2中。兩種樣品具有非靶標(biāo)分子403。標(biāo)記405與這些樣品組合并且靶標(biāo)分子以隨機(jī)方式連接至個(gè)別標(biāo)記-標(biāo)簽分子。具有連接的標(biāo)記-標(biāo)簽的靶標(biāo)與具有許多特征的陣列411雜交，每個(gè)可能的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽組合存在一個(gè)特征。一些特征被標(biāo)記，例如409，并且其他特征未被標(biāo)記，例如407。標(biāo)記的特征指示特異性靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽組合的存在并且這些特征各自對(duì)應(yīng)于一個(gè)計(jì)數(shù)。如對(duì)于樣品1中的基因a所示的，存在兩個(gè)標(biāo)記的特征，因此計(jì)數(shù)是2。對(duì)于樣品2中的基因a而言，存在9個(gè)標(biāo)記的特征，因此計(jì)數(shù)是9。

在一些實(shí)施例中，在此披露的方法可以將不可區(qū)分的分子群體隨機(jī)地?cái)U(kuò)張至獨(dú)特可鑒定且可計(jì)數(shù)的分子群體。證實(shí)了單分子的高敏感性閾值檢測(cè)，并且該過程可以用于對(duì)樣品中分子的絕對(duì)數(shù)目和相對(duì)數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法應(yīng)十分適于測(cè)定指定容器中多個(gè)靶分子的絕對(duì)數(shù)目，例如在高敏感性臨床測(cè)定中，或者適于測(cè)定單細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目。該方法也應(yīng)與其他分子測(cè)定系統(tǒng)相容。例如，抗體可以用dna片段隨機(jī)地標(biāo)記并且收獲結(jié)合抗原的那些抗體。在擴(kuò)增之后，所檢測(cè)的標(biāo)記的數(shù)目將反映溶液中抗原的初始數(shù)目。于在此所示的實(shí)例中，dna由于可用序列的多樣性較大而被使用，并且因?yàn)樗侨菀卓蓹z測(cè)的。原則上，可以使用任何分子標(biāo)記，例如熒光基團(tuán)或質(zhì)譜標(biāo)簽，只要它們?nèi)菀讬z測(cè)并且它們具有用于所需應(yīng)用的足夠多樣性。盡管許多實(shí)例是指群體

在此披露了用于采用隨機(jī)標(biāo)記的用途進(jìn)行單分子計(jì)數(shù)的方法和組合物。在一些實(shí)施例中，一組不同的標(biāo)記被隨機(jī)地連接到相同分子的群體，從而轉(zhuǎn)化為適用于閾值檢測(cè)的不同分子的群體。如在此所用的隨機(jī)連接是指一個(gè)過程，通過該過程任何標(biāo)記可以相同的概率連接到給定的分子。為了驗(yàn)證隨機(jī)標(biāo)記方法，在隨機(jī)標(biāo)記基因組諸如人類基因組的約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000、200000、300000、400000、500000、600000以及750000個(gè)不同片段和超過1000000個(gè)片段之后，以實(shí)驗(yàn)方式測(cè)定所選基因的絕對(duì)數(shù)目和相對(duì)數(shù)目。該方法不要求物理分離分子并且可以利用高度平行的方法諸如微陣列和測(cè)序技術(shù)，以同時(shí)計(jì)數(shù)多個(gè)靶標(biāo)的絕對(duì)數(shù)目。在一些實(shí)施例中，隨機(jī)標(biāo)記可以用于測(cè)定rna或dna分子在單細(xì)胞內(nèi)的絕對(duì)數(shù)目。

在此所披露的方法可以用于通過將信息轉(zhuǎn)化到用于檢測(cè)不同標(biāo)記的存在的數(shù)字過程中來對(duì)溶液中相同分子的拷貝進(jìn)行定量測(cè)量。已測(cè)量該方法的隨機(jī)特性，并且證實(shí)了核酸分子的相對(duì)數(shù)字計(jì)數(shù)和絕對(duì)數(shù)字計(jì)數(shù)。該方法是極端靈敏的、定量的，并且可以被復(fù)用至高水平。在一些實(shí)施例中，使用基于微陣列的檢測(cè)，但是該方法可以擴(kuò)展到許多其他檢測(cè)形式。

在一些實(shí)施例中，這些方法是基于概率理論，其中在一組標(biāo)記分子與一組靶標(biāo)分子之間發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果被建模并測(cè)試。當(dāng)固定體積的均勻混合物中的所有分子隨機(jī)碰撞和反應(yīng)時(shí)，化學(xué)事件遵循部分由每種種類的分子濃度控制的隨機(jī)過程。

用于分析基因組信息的方法常常利用與一個(gè)位置相締合的物質(zhì)的量的測(cè)量值之間的相關(guān)性。該位置可以是例如含有已知的或者可以測(cè)定的特異序列的陣列的特征或者任何類型的固體支持物諸如珠、顆粒、膜等。這些方法的常見方面往往是有待測(cè)量的靶標(biāo)與連接至固體支持物的互補(bǔ)探針的雜交。該探針可以是例如已知或可測(cè)定序列的寡核苷酸，但是也可以是bac、pac或pcr擴(kuò)增子。

由于使用合成方法諸如光刻法可以獲得的不同特征的密度，微陣列可以應(yīng)用于高密度應(yīng)用。例如，在1平方微米的特征大小下，陣列可以具有約10⁸個(gè)特征/cm²。在特征內(nèi)，根據(jù)用于合成的化學(xué)，探針典型地以約10nm間隔來間隔開，從而產(chǎn)生每微米²約10⁴個(gè)分子。在大約完全飽和下，這些探針的約10％與靶標(biāo)雜交。然后在特征之間具有1微米²的陣列中存在約640個(gè)功能性分子(～800nm²功能性區(qū)域)。在特征中的此相對(duì)小數(shù)目的功能性分子限制了用于由雜交信號(hào)強(qiáng)度評(píng)估相對(duì)濃度的動(dòng)態(tài)范圍。

例如，在1平方微米的特征大小下，陣列可以每cm²具有約10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷、10¹⁸和10¹⁹個(gè)特征以及超過10²⁰個(gè)特征。在一個(gè)特征內(nèi)，根據(jù)用于合成的化學(xué)，探針以約0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、75nm間隔以及超過100nm間隔來間隔開?？梢栽谝晃⒚?sup>2中存在約10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹個(gè)分子以及超過10¹⁰個(gè)分子。

在此披露了克服在陣列表面上的小特征大小和少數(shù)分子的情況下觀察到的動(dòng)態(tài)范圍限制的方法，這些方法是通過使用計(jì)數(shù)或數(shù)字讀出作為由陣列雜交引起的典型模擬信號(hào)的替代物。

使用信號(hào)強(qiáng)度評(píng)估靶標(biāo)的相對(duì)濃度的方法典型地用可檢測(cè)標(biāo)記標(biāo)記靶標(biāo)，這通常在擴(kuò)增步驟之后，并且通過標(biāo)記的靶標(biāo)與探針雜交，探針和因此的特征也被標(biāo)記。標(biāo)記的量被檢測(cè)并且與樣品中靶標(biāo)的量的測(cè)量值相關(guān)聯(lián)。給定靶標(biāo)在樣品中的量的評(píng)估值典型地是相對(duì)于樣品中的其他靶標(biāo)或者先前獲得的測(cè)量值并且可以是基于與樣品中存在的已知或預(yù)期水平的靶標(biāo)或樣品內(nèi)的對(duì)照的比較。這種類型的分析可以并且已成功用于例如評(píng)估基因組拷貝數(shù)目，以檢測(cè)個(gè)體或細(xì)胞群中的拷貝數(shù)目變化。

使雜交信號(hào)的強(qiáng)度或信號(hào)強(qiáng)度與靶標(biāo)分子的濃度相關(guān)聯(lián)具有限制并且可以典型地僅提供靶標(biāo)的絕對(duì)量的評(píng)估值，并且可能不是存在的靶標(biāo)的實(shí)際量的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。評(píng)估值可以是低估或高估的，特別是當(dāng)比較不同靶標(biāo)或不同樣品時(shí)。這是許多不同因素的結(jié)果，這些因素包括但不限于探針之間的差異、特征特異性作用、樣品特異性作用、特征大小(當(dāng)它降低時(shí)，準(zhǔn)確相關(guān)聯(lián)的能力也降低)以及實(shí)驗(yàn)變化。許多這種變化可以通過數(shù)據(jù)分析方法來解決，但是這些方法并不提供個(gè)別分子或事件的計(jì)數(shù)并且因此經(jīng)歷評(píng)估誤差。

在一些實(shí)施例中，披露了用于將不同標(biāo)記-標(biāo)簽序列連接至特定靶序列的每個(gè)分子或更優(yōu)選地連接至感興趣的靶序列的集合體的方法。例如，將具有1型靶標(biāo)的100個(gè)分子的樣品與過量的例如1000個(gè)不同標(biāo)記-標(biāo)簽序列混合，從而在連接條件下形成標(biāo)記-標(biāo)簽序列的文庫。添加標(biāo)記-標(biāo)簽序列的文庫的多個(gè)拷貝，因此每個(gè)標(biāo)記-標(biāo)簽優(yōu)選地存在許多拷貝。將來自該文庫的不同標(biāo)記-標(biāo)簽序列附加到100個(gè)靶標(biāo)分子中的每個(gè)分子中，這樣使得第一靶序列的100個(gè)分子各自具有附加至其上的獨(dú)特標(biāo)記-標(biāo)簽序列。這產(chǎn)生100個(gè)不同的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽組合。靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子然后可以被擴(kuò)增，以相對(duì)于其他非靶標(biāo)富集靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽產(chǎn)物。在標(biāo)記之后擴(kuò)增改變了靶標(biāo)的絕對(duì)量，但是因?yàn)樵诔跏紭悠分械拿總€(gè)出現(xiàn)物已被獨(dú)特地標(biāo)記，所以這將不會(huì)改變計(jì)數(shù)。擴(kuò)增的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽產(chǎn)物無論是否擴(kuò)增，然后可以用可檢測(cè)標(biāo)記加標(biāo)記，并且與探針的陣列雜交。具有與其雜交的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽的陣列的特征可以例如通過用熒光標(biāo)記對(duì)雜交復(fù)合物加標(biāo)記并且檢測(cè)信號(hào)在特征處的存在來檢測(cè)。在此實(shí)例中，因?yàn)榇嬖?000種可能的不同的標(biāo)記和正在分析的單個(gè)靶標(biāo)，所以存在1000種可以生成的不同的可能的標(biāo)記-靶標(biāo)序列，因此可以使用對(duì)于100種不同的可能性各自具有不同特征的陣列。確保每個(gè)靶標(biāo)均被標(biāo)記并且沒有標(biāo)記使用兩次，1000種不同的特征中的100種應(yīng)是可檢測(cè)的，這表明已使用相應(yīng)標(biāo)記。

一旦靶標(biāo)分子通過計(jì)數(shù)器標(biāo)記，則它們可以自由地?cái)U(kuò)增而不會(huì)影響計(jì)數(shù)，因?yàn)樽x出是指示檢測(cè)的是(yes)或指示未檢測(cè)的否(no)。在一些實(shí)施例中，構(gòu)造對(duì)于每個(gè)靶序列具有m個(gè)元件的單探測(cè)器。該檢測(cè)器可以是陣列。例如，具有10⁸個(gè)特征或元件的陣列可以使用10³個(gè)不同標(biāo)記測(cè)定10⁵個(gè)不同靶標(biāo)。其他檢測(cè)方法對(duì)于每個(gè)計(jì)數(shù)器不需要個(gè)別元件，例如測(cè)序。

在一些實(shí)施例中，“計(jì)數(shù)器文庫”或“標(biāo)記-標(biāo)簽文庫”在文庫中具有大約相同數(shù)目的每個(gè)標(biāo)記-標(biāo)簽的拷貝。標(biāo)記-標(biāo)簽序列不是靶標(biāo)特異性的，而是像已用于其他加標(biāo)簽應(yīng)用的標(biāo)簽例如昂飛公司(affymetrix)genflex標(biāo)簽陣列一樣。在一組標(biāo)記-標(biāo)簽中所有可能的標(biāo)記-標(biāo)簽將具有類似的雜交特征，這樣使得該組的標(biāo)記-標(biāo)簽可以在類似條件下進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)于每個(gè)靶標(biāo)，在陣列上存在一系列特征，優(yōu)選地每個(gè)標(biāo)記-標(biāo)簽的一個(gè)特征。在這些特征的每個(gè)特征中，該探針與靶標(biāo)(或靶標(biāo)補(bǔ)體)雜交的部分是相同的，但是標(biāo)記-標(biāo)簽部分在每個(gè)特征中是不同的。例如，為了檢測(cè)第一靶rna“rna1”，將存在一系列特征，每個(gè)特征具有不同的探針(rna1-標(biāo)簽1、rna1-標(biāo)簽2、...rna1-標(biāo)簽n)。對(duì)于每個(gè)有待檢測(cè)的靶標(biāo)，存在類似的一組特征，例如rna2-標(biāo)簽1、rna2-標(biāo)簽2、...rna2-標(biāo)簽n。該組標(biāo)記-標(biāo)簽是n個(gè)標(biāo)簽并且它是標(biāo)記-標(biāo)簽與靶序列的獨(dú)特組合，該組合形成有待例如通過雜交進(jìn)行檢測(cè)的新型序列。

與個(gè)別靶標(biāo)的標(biāo)記-標(biāo)簽連接是一個(gè)隨機(jī)過程，通過該過程任何給定標(biāo)記-標(biāo)簽連接至任何靶標(biāo)的概率是隨機(jī)的。標(biāo)記-標(biāo)簽存在隨機(jī)選擇，這是通過將標(biāo)記-標(biāo)簽以序列獨(dú)立性方式連接至已知靶序列端來進(jìn)行的。標(biāo)記-標(biāo)簽被連接，而不需要它與靶標(biāo)的任何部分雜交，因此不存在或存在最少關(guān)于標(biāo)記-標(biāo)簽序列所連接的偏移。出于連接標(biāo)記-標(biāo)簽的目的，個(gè)別分子全部看起來相同。

標(biāo)記-標(biāo)簽可以通過任何可用的方法連接至靶標(biāo)。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記-標(biāo)簽通過將標(biāo)記-標(biāo)簽連接至靶標(biāo)的一端來連接。在一些實(shí)施例中，陣列的探針是與在靶標(biāo)與標(biāo)記之間預(yù)測(cè)的接點(diǎn)互補(bǔ)的，因此優(yōu)選的是這些標(biāo)記在同一位置連接至靶標(biāo)的所有出現(xiàn)物。如果所選靶標(biāo)的每個(gè)出現(xiàn)物的末端是相同的并且已知的，則有助于這種情況。在一些實(shí)施例中，靶標(biāo)出現(xiàn)物被限制性內(nèi)切酶切割成片段，這樣使得已知序列的限定端得以形成。

在一些實(shí)施例中，在標(biāo)記-標(biāo)簽連接之后，擴(kuò)增靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽區(qū)段。將通用引物連接至任一端接著進(jìn)行pcr擴(kuò)增是一種用于擴(kuò)增的方法。通用引物可以與標(biāo)記一起添加或者在隨后的連接步驟處添加。

對(duì)于rna靶標(biāo)，可以使用rna連接酶，諸如t4rna連接酶。t4rna連接酶1催化了5’膦?；┒说暮怂峁w與3’羥基末端的核酸受體的連接。底物包括單鏈rna和dna。rna靶標(biāo)也可以是環(huán)化的并且用作用于使用具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的模板。t4rna連接酶1可以用于通過將分子的各端連接在一起來對(duì)rna進(jìn)行環(huán)化。t4rna連接酶1也可以用于將rna連接至dna。

全長(zhǎng)mrna可以通過用小牛腸磷酸酶(cip)處理總體或聚(a)rna來進(jìn)行選擇，以從含有游離5’磷酸酯的所有分子中去除5’磷酸酯(例如，核糖體rna、片段化mrna、trna以及基因組dna)。全長(zhǎng)mrna不受影響。該rna然后可以用煙草酸焦磷酸酶(tap)進(jìn)行處理，以從全長(zhǎng)mrna中去除帽子結(jié)構(gòu)，從而留下5’-單磷酸酯。合成的rna銜接子可以連接至rna群體。僅含有5’-磷酸酯的分子(即未封端的全長(zhǎng)mrna)將連接至銜接子。優(yōu)選地，銜接子具有可變標(biāo)記序列，并且也可以具有用于引發(fā)的恒定序列。優(yōu)選地，恒定序列是可變序列的5’。在一些實(shí)施例中，銜接子連接的mrna然后可以被拷貝，以通過例如隨機(jī)引發(fā)或使用寡聚dt引發(fā)來形成第一鏈cdna。cdna可以隨后通過例如pcr進(jìn)行擴(kuò)增。t4rna連接酶也可以用于將dna寡聚物連接至單鏈dna。

在一些實(shí)施例中，連接的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子在樣品中可以相對(duì)于其他核酸或其他分子富集。此富集可以是例如通過優(yōu)選地使用例如dna或rna聚合酶的擴(kuò)增靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽方法或者通過優(yōu)選地降解非靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子來進(jìn)行的。

在一些實(shí)施例中，靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子可以是核酸酶耐受的，而未連接的靶標(biāo)和未連接的標(biāo)記分子可以是核酸酶敏感的。核酸酶可以在連接之后添加到樣品中，這樣使得連接的靶標(biāo)-標(biāo)記-標(biāo)簽分子未被消化，但是未連接的分子被消化。例如，靶標(biāo)可以是抵抗5’外切核酸酶(而不抵抗3’外切核酸酶)的，而標(biāo)記是抵抗3’外切核酸酶而不抵抗5’外切核酸酶的。將靶標(biāo)連接至標(biāo)記生成了抵抗5’外切核酸酶活性和3’外切核酸酶活性的分子。在連接之后，樣品可以用5’外切核酸酶活性、3’外切核酸酶活性或5’外切核酸酶活性和3’外切核酸酶活性處理。例如，exovii從5’端和3’端降解單鏈dna，因此該樣品在連接之后可以用exovii處理，以降解非連接產(chǎn)物的分子。

在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增可以包括滾環(huán)擴(kuò)增(rca)步驟。靶標(biāo)可以是連接的，這樣使得它們具有標(biāo)記和連接至靶標(biāo)的5’端的通用引物(up)序列。up-標(biāo)記-靶標(biāo)然后被連接，以形成環(huán)狀物。與up互補(bǔ)的引物然后與這些環(huán)狀物雜交并且使用鏈置換聚合物酶來延長(zhǎng)。所得擴(kuò)增產(chǎn)物含有環(huán)狀物up-靶標(biāo)-l的補(bǔ)體的多個(gè)拷貝。

在一些實(shí)施例中，靶標(biāo)可以在拷貝步驟中標(biāo)記。例如，具有3’靶標(biāo)特異性區(qū)和5’可變標(biāo)記區(qū)的引物可以與靶標(biāo)rna或dna雜交，并且延長(zhǎng)來形成靶標(biāo)的單一互補(bǔ)拷貝。每個(gè)延長(zhǎng)產(chǎn)物將具有不同的標(biāo)記并且該標(biāo)記與靶標(biāo)特異性區(qū)之間的接點(diǎn)是已知的。延長(zhǎng)可以在核酸酶抗性核苷酸存在下進(jìn)行，這樣使得延長(zhǎng)產(chǎn)物抵抗核酸酶，而未延長(zhǎng)引物則不會(huì)。在延長(zhǎng)之后，用3’-5’外切核酸酶活性處理反應(yīng)物，以消化未延長(zhǎng)的引物。例如，外切核酸酶i在3’至5’方向上從單鏈dna中去除核苷酸，并且exoiii從雙螺旋dna的3’末端去除核苷酸。外切核酸酶t(或rna酶t)是單鏈rna或dna特異性核酸酶，它需要游離的3’末端并且在3’至5’方向上去除核苷酸。延長(zhǎng)產(chǎn)物然后可以通過與和引物互補(bǔ)的探針雜交來檢測(cè)并且包含獨(dú)特標(biāo)記部分和恒定靶標(biāo)特異性部分。如果靶標(biāo)是rna，則在延長(zhǎng)置換，它可以用rna酶h消化。延長(zhǎng)產(chǎn)物也可以在雜交之前擴(kuò)增。

在一些實(shí)施例中，任何兩種靶標(biāo)被同一標(biāo)記加標(biāo)記的概率可以通過使用兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記步驟來增加。例如，其中每個(gè)靶標(biāo)具有選自一組標(biāo)記的標(biāo)記的第一標(biāo)記步驟接著使用同一組標(biāo)記進(jìn)行的第二標(biāo)記組。第一標(biāo)記事件將獨(dú)立于第二標(biāo)記事件，因此第一標(biāo)記事件和第二標(biāo)記事件在兩個(gè)獨(dú)立靶標(biāo)中將是相同的概率是兩個(gè)靶標(biāo)在任一步驟中具有相同標(biāo)記的概率的乘積。如果存在n個(gè)可能的標(biāo)記，并且第一靶標(biāo)首先被標(biāo)記n1標(biāo)記并且然后被標(biāo)記n4標(biāo)記，則第二靶標(biāo)也將被n1標(biāo)記并且然后被n4標(biāo)記的概率是1/n²。因此如果存在100個(gè)標(biāo)記，則兩個(gè)靶標(biāo)將在第一輪中被同一標(biāo)記加標(biāo)記并且在第二輪中被同一標(biāo)記加標(biāo)記的概括是1/10000。

在一些實(shí)施例中，第一輪標(biāo)記可以使用16種探針(例如，全部可能的2堿基組合)來進(jìn)行，并且然后第二輪標(biāo)記使用相同的16種探針進(jìn)行。任一種探針在第一輪中連接至給定靶標(biāo)出現(xiàn)物的機(jī)會(huì)是16分之一，同一探針將連接至第二靶標(biāo)的機(jī)會(huì)是1/16并且相同的兩個(gè)探針將連接的機(jī)會(huì)是1/16×1/16或1/256。

在一些實(shí)施例中，可逆性終止子用于將序列添加到正在計(jì)數(shù)的每個(gè)靶標(biāo)的末端。例如，可以添加6堿基序列并且兩者相同的機(jī)會(huì)是4⁶之一或4096之一。

在此披露的方法可以用于測(cè)量同基因細(xì)胞群內(nèi)的基因表達(dá)中的隨機(jī)細(xì)胞至細(xì)胞的變化。此類變化可以導(dǎo)致個(gè)別細(xì)胞的可替代狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。例如，comk在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)中的細(xì)胞至細(xì)胞的變化已顯示選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)換成補(bǔ)體狀態(tài)，在該細(xì)胞中編碼dna攝取蛋白的基因被表達(dá)。

聚焦方法

在一些實(shí)施例中，在此披露的方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品，其中富集該樣品包括聚集樣品中感興趣的細(xì)胞；使用流式細(xì)胞儀分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息。可以使用不同的聚焦方法和技術(shù)，例如流體動(dòng)力學(xué)聚焦、磁場(chǎng)聚焦、電場(chǎng)聚焦、重力場(chǎng)聚焦、光學(xué)場(chǎng)聚焦及其任何組合。

在一些實(shí)施例中，富集樣品包括將樣品中感興趣的細(xì)胞聚集到例如細(xì)胞核心流中。在一些實(shí)施例中，聚集感興趣的細(xì)胞包括聲聚焦。聲聚焦在分析過程中使用聲波控制顆粒(例如，細(xì)胞)的移動(dòng)，例如使用超聲輻射壓力(例如，>2mhz)來將顆粒運(yùn)輸?shù)綐悠妨鞯闹行?。在一些?shí)施例中，有利的是將聲聚焦與流體動(dòng)力學(xué)聚焦結(jié)合，以使核心流變窄并使激光照明均勻。在一些實(shí)施例中，聲聚焦包括：將樣品中的多種細(xì)胞懸浮在細(xì)長(zhǎng)流體填充通道中；并且將所述通道暴露于平行于流動(dòng)方向的軸向聲駐波場(chǎng)，其中所述軸向聲駐波場(chǎng)將多個(gè)細(xì)胞沿著所述通道的中心軸驅(qū)動(dòng)到力最小值的位置，以產(chǎn)生均勻間隔的細(xì)胞。

聲輻射壓力可以操縱細(xì)胞。施加聲波場(chǎng)生成了聚集細(xì)胞(例如，感興趣的細(xì)胞)的準(zhǔn)一維力場(chǎng)。單獨(dú)的或者與流體動(dòng)力學(xué)聚焦結(jié)合的聲聚焦可以將細(xì)胞聚集到細(xì)胞核心流中，例如沿著細(xì)長(zhǎng)流體填充通道的中心軸在力潛在最小值的位置處。聲聚焦因此增加核心流內(nèi)的細(xì)胞濃度。在丟棄一些或所有不在核心流內(nèi)的流體之后，細(xì)胞的濃度增加。因此，聲聚焦通過增加感興趣的細(xì)胞的濃度來增加具有低濃度的感興趣的細(xì)胞的稀樣品的樣品通量。

圖5和圖6a-圖6c示出了本披露的非限制性實(shí)施例，這些實(shí)施例將樣品中的顆粒諸如感興趣的細(xì)胞聚集到核心流中，之后分離一種或多種感興趣的細(xì)胞?？梢杂糜诰奂w粒的方法包括聲聚焦。如圖5和圖6a所示的，通過向通道508的第一部分506中感興趣的細(xì)胞504施加由聲學(xué)力生成器諸如超聲波換能器502a-b生成的聲學(xué)力500a-b，將感興趣的細(xì)胞504聚集到核心流510中。通道508可以是細(xì)長(zhǎng)的且流體填充的。

感興趣的細(xì)胞504可以聚集到核心流510中，沿著通道的中心軸在力潛在最小值位置處，以形成均勻間隔的細(xì)胞。聲學(xué)力可以包括與通道508內(nèi)的流動(dòng)510方向平行的軸向聲駐波場(chǎng)。超聲波換能器502a-b在通道508中形成駐波場(chǎng)。超聲輻射壓力將感興趣的細(xì)胞504壓迫到核心流512中。在將感興趣的細(xì)胞504聚集到核心流512中之后，可以通過出口514a-b丟棄一些或所有不在核心流512內(nèi)的流體。因此通道508的第二部分516中的細(xì)胞濃度高于通道508的第一部分506中的細(xì)胞濃度。在本披露的一些實(shí)施例中，有利的是將這些細(xì)胞聚集到核心流512中。在本披露的其他實(shí)施例中，有利的是將細(xì)胞聚集到核心流510中沿著通道的中心軸的力潛在最小值的位置，以產(chǎn)生均勻間隔的細(xì)胞。

圖7示出了本披露的實(shí)施例中，這些實(shí)施例將樣品中各自具有預(yù)定范圍內(nèi)的大小的顆粒(諸如樣品中各自具有預(yù)定范圍內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞)聚集到核心流中，之后分離一種或多種感興趣的細(xì)胞?？梢杂糜诰奂哂蓄A(yù)定范圍內(nèi)的大小的顆粒的方法包括聲聚焦。如結(jié)合圖5和圖6a所描述的，通過向通道508的第一部分506中各自具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞施加由聲學(xué)力生成器諸如超聲波換能器502a-b生成的聲學(xué)力500a-b，將各自具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞聚集到核心流510中。通過調(diào)整聲學(xué)力500a-b的參數(shù)，例如聲學(xué)力500a-b的頻率、幅度和波形，僅將各自具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞聚集到核心流512中。各自具有不在預(yù)定范圍705內(nèi)的大小的不感興趣的細(xì)胞并不聚集到核心流512中。通道508可以是細(xì)長(zhǎng)的且流體填充的。

各自具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞可以聚集到核心流510中，沿著通道的中心軸在力潛在最小值位置處，以形成均勻間隔的細(xì)胞。聲學(xué)力可以包括與通道508內(nèi)的流動(dòng)510方向平行的軸向聲駐波場(chǎng)。超聲波換能器502a-b在通道508中形成駐波場(chǎng)。超聲輻射壓力將各自具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞壓迫到核心流512中。在將具有一定大小704的感興趣的細(xì)胞聚集到核心流512中之后，可以通過出口514a-b丟棄一些或所有不在核心流512內(nèi)的流體和具有不在預(yù)定范圍705內(nèi)的大小的不感興趣的細(xì)胞。因此在通道508的第二部分516中具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞的濃度高于在通道508的第一部分506中具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞的濃度。在本披露的一些實(shí)施例中，有利的是將具有預(yù)定范圍704內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞聚集到核心流512中。在本披露的其他實(shí)施例中，有利的是將具有預(yù)定范圍內(nèi)的大小的感興趣的細(xì)胞聚集到核心流510中沿著通道的中心軸的力潛在最小值的位置，以產(chǎn)生均勻間隔的細(xì)胞。

存在許多不同的排列，其中聲聚焦可以是有利的。參考圖5和圖7，聲場(chǎng)可以用于通道508中，該通道可以是圓形、正方形或任何其他幾何結(jié)構(gòu)。在圖6b中示出了一種示例性換能器。在圖6b中，聲學(xué)力500通過通道508的壁反射，示出為聲學(xué)力500’。在圖5、圖6a和圖7中示出了彼此相對(duì)的兩個(gè)換能器。在圖6c中示出了彼此正交的兩個(gè)換能器。聲學(xué)力500a通過通道508的壁反射，示出為聲學(xué)力500a’。聲學(xué)力500b通過通道508的壁反射，示出為聲學(xué)力500b’?？梢源嬖?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的換能器500。使用彼此相對(duì)的兩個(gè)換能器可以提供反饋，以監(jiān)控細(xì)長(zhǎng)流體填充通道506內(nèi)的聲場(chǎng)。另外的換能器可以在正交方向上連接，以形成力場(chǎng)，例如軸向聲駐波場(chǎng)，該力場(chǎng)被優(yōu)化用于聚集具有不同類型、大小和形狀的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，在一個(gè)或多個(gè)通道508中的系列聲聚焦將感興趣的細(xì)胞504聚集到更窄的核心流512中。

在圖5和圖7中示出的出口數(shù)目是兩個(gè)，包括出口514a和514b。可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個(gè)或者在這些值中的任何值之間的數(shù)值或范圍的出口。在圖5和圖7中示出的第二部分516比第一部分506窄。在一些實(shí)施例中，第二部分516可以比第一部分506寬，或者兩個(gè)部分可以具有相同的大小。兩個(gè)部分506和516可以具有相同的形狀或者具有不同的形狀。兩個(gè)部分506和516可以由相同的材料或者不同的材料制成。

圖8示出了本披露的實(shí)施例，這些實(shí)施例能夠?qū)⒙暰劢古c流體動(dòng)力學(xué)聚焦結(jié)合以根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例濃縮細(xì)胞。細(xì)胞504的樣品流過可以是細(xì)長(zhǎng)的且流場(chǎng)的通道508。鞘液800最初將細(xì)胞504流體動(dòng)力學(xué)地聚集到核心流512中。換能器500a和500b利用聲聚焦來進(jìn)一步聚集中心核心流512內(nèi)的細(xì)胞504。在通過流體動(dòng)力學(xué)聚焦和聲聚焦將細(xì)胞504聚集到核心流512中之后，可以通過出口514a-b丟棄一些或所有不在核心流512內(nèi)的流體。因此，通道508的第二部分516中的細(xì)胞濃度高于通道508的第一部分506中的細(xì)胞濃度。

在一些實(shí)施例中，感興趣的細(xì)胞在112b處單獨(dú)的或者與流體動(dòng)力學(xué)聚焦結(jié)合的聲聚焦將感興趣的細(xì)胞的濃度增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、10²％、10³％、10⁴％、10⁵％、10⁶％、10⁷％、10⁸％、10⁹％、10¹⁰％、10¹¹％、10¹²％、10¹³％、10¹⁵％、10²⁰％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。感興趣的細(xì)胞在112b處單獨(dú)的或者與流體動(dòng)力學(xué)聚焦結(jié)合的聲聚焦將在116b處的分選速度增加了至少10-倍、20-倍、30-倍、40-倍、50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、10²-倍、10³-倍、10⁴-倍、10⁵-倍、10⁶-倍、10⁷-倍、10⁸-倍、10⁹-倍、10¹⁰-倍、10¹¹-倍、10¹²-倍、10¹³-倍、10¹⁵-倍、10²⁰-倍或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。

不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片的消除

在一些實(shí)施例中，富集樣品可以包括消除樣品中不感興趣的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，富集樣品可以包括聲聚焦和消除樣品中不感興趣的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，可以例如使用磁力消除來消除樣品中不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片中的一種或多種。根據(jù)一些實(shí)施例，消除不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片(例如，使用圖1b的108b處的磁力消除)可以去除至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的樣品中最初存在的不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和/或碎片。在一些實(shí)施例中，在消除之后，樣品中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％、99.999％或者在這些值中的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的固體物質(zhì)是感興趣的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，在消除之后，樣品中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％、99.999％或者在這些值中的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的固體物質(zhì)是感興趣的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，在消除之后，樣品中感興趣的細(xì)胞的濃度增加了至少約2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、50-倍、100-倍、250-倍、500-倍、750-倍、1000-倍、5000-倍、10000-倍、50000-倍、100000-倍、500000-倍、1000000-倍或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。在一些實(shí)施例中，在消除之后，樣品中感興趣的細(xì)胞的濃度增加了或增加約2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、50-倍、100-倍、250-倍、500-倍、750-倍、1000-倍、5000-倍、10000-倍、50000-倍、100000-倍、500000-倍、1000000-倍或者在任何這些兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。

感興趣的細(xì)胞可以在消除樣品中不感興趣的細(xì)胞之前或之后進(jìn)行聲聚集。在一些實(shí)施例中，消除通過磁力消除來進(jìn)行。磁力消除可以例如利用具有抗體例如單克隆抗體和多克隆抗體的磁珠，這些抗體綴合至磁珠的表面。抗體靶標(biāo)可檢測(cè)標(biāo)志物例如細(xì)胞表面標(biāo)志物是在不感興趣的細(xì)胞和干擾細(xì)胞上。此類磁珠的實(shí)例包括bdimag^tm顆粒。當(dāng)將含有用這些磁珠標(biāo)記的細(xì)胞的樣品放置于由磁力例如bdimagnet^tm形成的磁場(chǎng)中時(shí)，磁場(chǎng)吸引磁鐵標(biāo)記的不感興趣的細(xì)胞，從而允許未標(biāo)記的感興趣的細(xì)胞穿過。磁力消除允許對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行快速且有效的陰性選擇。已標(biāo)記的不感興趣的細(xì)胞朝向磁鐵形成的磁場(chǎng)遷移，從而允許懸浮液中未標(biāo)記的感興趣的細(xì)胞穿過。磁力消除可以重復(fù)多次，以增加感興趣的細(xì)胞的純度和濃度。磁力消除可以利用靶向不同可檢測(cè)標(biāo)志物的不同類型的磁珠，以去除不同類型的不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片。

為了去除白細(xì)胞，可以使用具有綴合至磁珠表面的單克隆抗體的磁珠。這些磁珠被優(yōu)化用于消除攜帶cd4的白細(xì)胞。cd4(l3t4)分化抗原可以在大部分胸腺細(xì)胞、成熟t淋巴細(xì)胞子群(即，mhcii類限制性t細(xì)胞，包括大部分輔助t細(xì)胞)和成熟殺傷性t(nk-t)細(xì)胞亞型上表達(dá)。另外，cd4可以在多能造血干細(xì)胞、骨髓的髓細(xì)胞和b-淋巴細(xì)胞前體、胸腺內(nèi)淋巴樣前體以及脾樹突細(xì)胞亞型上表達(dá)。

流式細(xì)胞術(shù)

在一些實(shí)施例中，可以使用流式細(xì)胞儀分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，流式細(xì)胞儀利用熒光激活細(xì)胞分選法。

流式細(xì)胞術(shù)是一種用于分析和分離細(xì)胞的有價(jià)值方法。這樣，它具有廣泛范圍的診斷和治療應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)利用一個(gè)流體流來線性分離細(xì)胞，這樣使得它們可以成一列縱隊(duì)穿過檢測(cè)設(shè)備。個(gè)別細(xì)胞可以根據(jù)其在流體流中的位置和可檢測(cè)標(biāo)志物的存在來區(qū)分。細(xì)胞流過聚集的查詢點(diǎn)(interrogationpoint)，其中至少一個(gè)激光將激光束引導(dǎo)到通道內(nèi)的聚集點(diǎn)。通過使鞘液以非常高的容積流率環(huán)繞樣品流流動(dòng)，含有細(xì)胞的樣品流體流體動(dòng)力學(xué)聚集到非常小的核心直徑。小核心直徑可以小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200微米或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。鞘液的容積流率可以是樣品的容積流率的大約至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。這對(duì)于聚集的細(xì)胞產(chǎn)生大約米/秒的非?？斓木€速度。因此每個(gè)細(xì)胞在激發(fā)點(diǎn)處花費(fèi)了非常有限的時(shí)間，例如少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100微秒或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。一旦這些細(xì)胞穿過查詢點(diǎn)，這些細(xì)胞就不能再次重定向至查詢點(diǎn)，因?yàn)榫€性流速不能逆轉(zhuǎn)。

流式細(xì)胞儀是使得能夠基于光學(xué)參數(shù)諸如光散射和熒光表征細(xì)胞的分析工具。在流式細(xì)胞儀中，流體懸浮液中的細(xì)胞通過檢測(cè)區(qū)域，其中這些細(xì)胞暴露于激發(fā)光，典型地來自一個(gè)或多個(gè)激光，并且測(cè)量這些細(xì)胞的光散射和熒光特性。細(xì)胞或其組分典型地被熒光染料標(biāo)記，以有助于檢測(cè)。多種不同細(xì)胞或組分可以通過使用光譜上不同的熒光染料標(biāo)記這些不同的細(xì)胞或組分來同時(shí)檢測(cè)。在一些實(shí)現(xiàn)方式中，在分析器中包括多種光電檢測(cè)器，一種用于每個(gè)有待測(cè)量的散射參數(shù)并且抑制用于每個(gè)有待檢測(cè)的不同染料。所獲得的數(shù)據(jù)包括對(duì)于每個(gè)光散射參數(shù)和熒光發(fā)射所測(cè)量的信號(hào)。

生物細(xì)胞的分離已通過向流式細(xì)胞儀添加分選或收集能力來實(shí)現(xiàn)。通過機(jī)械移除或電移除來將分離流中被檢測(cè)為具有一個(gè)或多個(gè)期望特征的細(xì)胞與樣品流分離。這種流分選方法已用于分選不同類型的細(xì)胞，分開攜帶x染色體和y染色體的用于生殖的精子，分選用于遺傳分析的染色體，并且從復(fù)雜生物群體中分離特定生物體。

常見的流式分選技術(shù)利用液滴分選，在液滴分選中，將含有線性分離的細(xì)胞的液流分解成液滴，并且使含有感興趣的細(xì)胞的液滴帶電并通過穿過電場(chǎng)的通道將其偏轉(zhuǎn)到收集管中。液滴分選系統(tǒng)能夠在流體流中以約100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、750000、1000000滴/秒或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的速率形成液滴，該流體流穿過具有小于1000、750、600、500、400、300、200、100、75、60、50、40、30、20、10、5、2、1微米或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的直徑的噴嘴。液滴分選需要液滴以距離噴嘴尖固定的距離從該流中脫離。該距離通常是約距離噴嘴尖幾毫米并且可以通過以預(yù)定義的頻率震蕩噴嘴尖來為未擾動(dòng)的流體流維持該距離。

該流中線性分離的細(xì)胞可以被表征為它們穿過恰好位于噴嘴尖下方的觀察點(diǎn)。一旦細(xì)胞被鑒定為滿足約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、75、100、200、300、400、500、600、750種標(biāo)準(zhǔn)或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍或者超過1000種標(biāo)準(zhǔn)，可以預(yù)測(cè)它將到達(dá)液滴脫離點(diǎn)和在液滴中從流中離開的時(shí)間?？赡艿氖?，就在含有所選細(xì)胞的液滴從流中脫離之前向流體流施加簡(jiǎn)短的電荷并且在液滴破裂之后立即研磨。在有待分選的液滴從液體流中分離時(shí)該液滴維持電荷，并且所有其他液滴均不帶電荷。帶電液滴通過電場(chǎng)向側(cè)面偏離其他液滴的向下軌道并且被收集在樣品管中。不帶電荷液滴直接落入到排水器。

細(xì)胞儀可以進(jìn)一步包括用于記錄所測(cè)量的數(shù)據(jù)并分析該數(shù)據(jù)的裝置。例如，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和分析可以使用連接至檢測(cè)電子產(chǎn)品的計(jì)算機(jī)來進(jìn)行。例如，數(shù)據(jù)可以列表形式儲(chǔ)存，在該列表中每一行對(duì)應(yīng)于一個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，并且列對(duì)應(yīng)于每個(gè)測(cè)量的參數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)文件諸如“fcs”文件格式來儲(chǔ)存來自流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)促使能使用單獨(dú)的程序和/或機(jī)器來分析數(shù)據(jù)。使用目前的分析方法，數(shù)據(jù)典型地呈現(xiàn)在2維(“2d”)圖中以便于可視化，但是其他方法也可以用于可視化多維數(shù)據(jù)。

使用流式細(xì)胞儀測(cè)量的參數(shù)典型地包括由細(xì)胞沿著主要的正向方向散射(稱為前向散射(“fsc”))的激發(fā)光、由細(xì)胞在主要的側(cè)向方向上散射的激發(fā)光(稱為側(cè)向散射(“ssc”))以及由熒光分子在光譜的一個(gè)或多個(gè)通道(頻率的范圍)中發(fā)射的光(稱為fl1、fl2等)或者由主要在該通道中檢測(cè)的熒光染料發(fā)射的光。不同的細(xì)胞類型可以通過經(jīng)由用染料標(biāo)記的抗體標(biāo)記不同細(xì)胞蛋白質(zhì)產(chǎn)生的散射參數(shù)和熒光發(fā)射來鑒定。

熒光激活細(xì)胞分選術(shù)或者是流式細(xì)胞術(shù)的特化類型。它提供了用于基于每個(gè)細(xì)胞的特異性光散射和熒光特征將細(xì)胞的異質(zhì)混合物分選到兩個(gè)或更多個(gè)容器或微量滴定板的孔中的方法，一次一個(gè)細(xì)胞。它記錄了來自個(gè)別細(xì)胞的熒光信號(hào)，并且物理地分離特別感興趣的細(xì)胞。首字母縮略字facs是由貝迪醫(yī)療公司(bectondickinson)注冊(cè)商標(biāo)并擁有的。

細(xì)胞懸浮液被放置在窄的快速流動(dòng)的液體流的中心附近。該流被排列來使得平均而言(泊松分布)在細(xì)胞之間存在相對(duì)于其直徑的大間隔。震動(dòng)的機(jī)構(gòu)使得細(xì)胞流分裂成單個(gè)液滴。該系統(tǒng)被調(diào)節(jié)來使得超過一個(gè)細(xì)胞處于液滴中的概率較低。就在該流分裂成液滴之前，該流穿過一個(gè)或多個(gè)激光相交處，在該相交處測(cè)量每個(gè)細(xì)胞感興趣的熒光性狀。如果收集細(xì)胞，在一個(gè)或多個(gè)液滴形成并從流中脫離的時(shí)間段過程中向流動(dòng)細(xì)胞施加電荷。這些帶電荷液滴然后下落通過靜電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于施加于液滴的電荷將液滴轉(zhuǎn)移到目標(biāo)容器中。

圖9示出了適于用于例如在圖1b的116b處進(jìn)行細(xì)胞分選的分選裝置(例如流式細(xì)胞儀)的一個(gè)實(shí)例的功能性框圖。在圖9中示出的分選裝置可以被稱為空氣中流(stream-in-air)分選系統(tǒng)。示出了樣品流902中的細(xì)胞。樣品流902穿過噴嘴906的孔口904。樣品流902在排出噴嘴906時(shí)形成噴射流908。激光束910由激光911生成，以照射噴射流908中可以包含的細(xì)胞。光通過檢測(cè)站912進(jìn)行檢測(cè)，以生成多個(gè)信號(hào)，這些信號(hào)被處理來生成多參數(shù)事件數(shù)據(jù)點(diǎn)。所生成的事件數(shù)據(jù)可以被提供給樣品行為分析器。該提供可以經(jīng)由通信媒介(例如，網(wǎng)絡(luò)/云)、經(jīng)由存儲(chǔ)器或者經(jīng)由混合配置來引導(dǎo)。

基于多個(gè)信號(hào)的值，在液滴離開噴射流908之前，它們是帶正電荷的、帶負(fù)電荷的或者中性的。一些液滴將包含樣品的細(xì)胞，如液滴930所示的，而其他液滴將不包含樣品的細(xì)胞，如由液滴940所示的。液滴穿過偏轉(zhuǎn)場(chǎng)914。偏轉(zhuǎn)場(chǎng)914包括兩個(gè)帶相反電荷的偏轉(zhuǎn)板916a和916b。偏轉(zhuǎn)板916a和916b被配置來將噴射流908中的帶電荷液滴引導(dǎo)到期相應(yīng)收集容器918a、918b或918c。正如所示，容器918b收集帶負(fù)電荷液滴，因?yàn)檎D(zhuǎn)板916a將吸引帶負(fù)電荷液滴。類似地，容器918c將收集帶正電荷液滴，因?yàn)閹ж?fù)電荷偏轉(zhuǎn)板916b將吸引帶正電荷液滴。每個(gè)收集容器可以是微量滴定板或微量滴定板的孔。

在一個(gè)收集方案中，流動(dòng)系統(tǒng)在它們經(jīng)過檢測(cè)站912時(shí)基于其信號(hào)的值來鑒定所有感興趣的細(xì)胞，并且然后使得噴射流908在感興趣的細(xì)胞作為液滴離開噴射流908的瞬間帶電荷或處于中性。以這種方式，使得感興趣的細(xì)胞具有相同的電荷。這允許細(xì)胞收集在同一收集容器中，該容器包括多層滴定板的相同或不同的孔。

在圖9中所示的適于用于例如在圖1b的116b處進(jìn)行細(xì)胞分選的分選裝置的非限制性實(shí)例包括但不限于bdfacsjazztm細(xì)胞分選儀、bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀或任何其他細(xì)胞分選儀，包括伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司(加利福尼亞州赫拉克勒斯)s3e^tm細(xì)胞分選儀、索尼生物技術(shù)有限公司(加利福尼亞州圣何塞)sh800細(xì)胞分選儀、貝克曼庫爾特有限公司(加利福尼亞州布雷亞)moflo^tmxdp細(xì)胞分選儀。

分選速度

在一些實(shí)施例中，感興趣的細(xì)胞可以在小于約15分鐘內(nèi)分選到一個(gè)或多個(gè)微量滴定板(即，從細(xì)胞樣品中分離)(例如，在圖1b的116b處)，從而允許收集時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)。樣品中感興趣的細(xì)胞也可以在小于0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400、500、600、750、1000分鐘或者在任何這些兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的時(shí)間內(nèi)分選。

在此披露的低成本、高通量、單細(xì)胞基因組測(cè)序方法是快速的并且具有高成功率。例如，該方法可以分選細(xì)胞，以在小于0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400、500、600、750、1000分鐘或者在任何這些兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的時(shí)間內(nèi)獲得96、324、946或更多個(gè)感興趣的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，每秒可以分選10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷、10¹⁸、10¹⁹、10²⁰個(gè)細(xì)胞或者在任何這些兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的細(xì)胞。

細(xì)胞表面標(biāo)志物

在一些實(shí)施例中，這些方法利用細(xì)胞表面標(biāo)志物的加標(biāo)簽和染色進(jìn)行細(xì)胞分選。在一些實(shí)施例中，這些細(xì)胞利用對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的加標(biāo)簽來磁力消除不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和碎片。在一些實(shí)施例中，這些方法包括以下各項(xiàng)中的一種或多種：基于所獲得的序列信息確定患者的基因型；基于所獲得的序列信息確定患者的表型；基于序列信息確定患者的一種或多種遺傳突變；并且預(yù)測(cè)患者對(duì)一種或多種疾病的易感性。一種或多種疾病中的至少一種是癌癥或遺傳性疾病。

facs可以基于使用靶向可檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物的抗體對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行的加標(biāo)簽和染色來分選細(xì)胞。這些抗體包括偶聯(lián)至熒光團(tuán)的單克隆抗體和多克隆抗體?？蓹z測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物包括感興趣的細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)志物。在一些實(shí)施例中，磁力消除可以是基于使用具有抗體的磁珠對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行的加標(biāo)簽，這些抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，它們綴合至靶向不感興趣的細(xì)胞、干擾細(xì)胞和/或碎片的表面。細(xì)胞表面標(biāo)志物的非限制性示例包括cd表面標(biāo)志物、生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子、趨化因子受體、核受體以及其他受體。細(xì)胞表面標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于alcam；cd166；asgr1；bcam；bsg；cd147；cd14；cd19；cd2；cd200；cd127bv421；cd25bb515；cd161pe；cd45rapercp-cy^tm5.5；cd15saf647；cd4apc-h；cd4；cd25；cd127；cd45ra；cd15s；cd161；cd3；epcam；cd44；以及her2/neu。生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子、趨化因子受體的實(shí)例包括acvr1b；alk4；acvr2a；acvr2b；bmpr1a；bmpr2；csf1r；mcsfr；csf2rb；egfr；epha2；epha4；ephb2；ephb4；以及erbb2。核受體的實(shí)例包括雄激素受體；car；erα；erβ；esrra；esrrb；esrrg；fxr；糖皮質(zhì)激素受體；lxr-a；lxr-b；ppara；ppard；pparg；pxr；sxr；雌激素受體β；黃體酮受體；rara；rarb；rarg；rora；rxra；rxrb；thra；thrb；以及維生素d3受體。其他受體的實(shí)例包括ager；app；clec12a；micl；ctla4；folr1；fzd1；frizzled-1；klrb1a；lrpap1；ncr3；nkp30；olr1；procr；ptpn1；sox9；scarb2；tacstd2；trem1；trem2；treml1；以及vdr。

微量滴定板

在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品，其中富集該樣品包括聚集樣品中感興趣的細(xì)胞；使用流式細(xì)胞儀分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞并且將該一種或多種感興趣的細(xì)胞沉積到一個(gè)或多個(gè)微量滴定板中；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息。在一些實(shí)施例中，微量滴定板可以具有至少96個(gè)孔。

在一些實(shí)施例中，從富集的細(xì)胞樣品中分析感興趣的細(xì)胞(例如，在圖1b的116b處)包括將一種或多種感興趣的細(xì)胞沉積到一個(gè)或多個(gè)微量滴定板中。當(dāng)細(xì)胞處于一個(gè)或多個(gè)微量滴定板中時(shí)，可以收集時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)。微量滴定板的大小可以發(fā)生改變。例如，微量滴定板可以具有至少96個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，微量滴定板具有或者具有約96個(gè)孔、384個(gè)孔、1536個(gè)孔、3456個(gè)細(xì)胞、9600個(gè)孔或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。在一些實(shí)施例中，感興趣的細(xì)胞可以分選到384-孔微量滴定板和1536-孔微量滴定板以及具有更高孔密度的微量滴定板中，該孔密度例如是每個(gè)微量滴定板約2000、2500、3000、3500、4000、5000、6000、7500、10000、12500、15000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000個(gè)孔。

細(xì)胞裂解

該一個(gè)或多個(gè)微量滴定板的每個(gè)孔可以含有細(xì)胞裂解緩沖液，例如基于洗滌劑的單細(xì)胞裂解緩沖液。每個(gè)孔也可以含有rna穩(wěn)定劑、分子標(biāo)記、細(xì)胞特異性標(biāo)記或其組合。具有分選的細(xì)胞的板可以在-80℃下保持冷凍，之后進(jìn)一步處理。

在某些實(shí)施例中，優(yōu)選的裂解導(dǎo)致至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的感興趣的細(xì)胞(例如，紅細(xì)胞或胎兒有核紅細(xì)胞)裂解，以及少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的不感興趣的細(xì)胞(例如，母體白細(xì)胞或母體有核紅細(xì)胞)裂解。

每個(gè)細(xì)胞都可以裂解，并且在逆轉(zhuǎn)錄步驟過程中對(duì)mrna內(nèi)容物使用獨(dú)特樣品和分子索引進(jìn)行索引。細(xì)胞組合物的鑒定可以利用10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000個(gè)或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的基因?？梢陨梢粋€(gè)測(cè)序文庫并且該文庫在測(cè)序儀器上運(yùn)行。在一些實(shí)施例中，在生成測(cè)序文庫之前，產(chǎn)物可以從約2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、75、100、200、300、400、500、600、760、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000個(gè)或者在這些值中的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的微量滴定板或者這些值中的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值的微量滴定板中合并?？梢陨沙^一種測(cè)序文庫。例如，可以生成約2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、76、100、200、300、400、500、600、760、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000個(gè)或者在這些值中的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的測(cè)序文庫?？梢陨稍谶@些值中的任何兩個(gè)值之間的任何數(shù)值的測(cè)序文庫。

多核苷酸靶標(biāo)

在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品，其中富集該樣品包括聚集樣品中感興趣的細(xì)胞；分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息，其中該一種或多種多核苷酸包括rna或mrna。在一些實(shí)施例中，序列信息包括至少10個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄物計(jì)數(shù)。rna可以獲自外來體。

多核苷酸靶標(biāo)(例如，基因靶標(biāo)和mrna靶標(biāo))的非限制性實(shí)例包括cd4、fox01、cd45ro、myc、il1r2、prf1、gzmk、lgals1、il17f、il23r、lynx1、prdm1、sell、smad4、icos、ikzf5、rorc、ahrr、ctla4、itgb7、entpd1、ccr8、tshr、tgfb2、il12a、il7r、hla-dma、ccr5、tiaf1、bcl6、bhlhe40、cxcr4以及cd307c。多核苷酸靶標(biāo)的其他非限制性實(shí)例包括cd3d、gstp1、tcf7、cd3e、rnb6、rb1、myb、cd3g、krt8、cdh1、erbb3、erbb2、tctn1、esr1、cdkn1a以及tff3。多核苷酸靶標(biāo)的其他非限制性實(shí)例包括abcb1、abcg2、adam23、aktl、apc、ar、atm、bad、bcl2、birc5、brca1、brca2、c4a、ca12、ccna1、ccnd1、ccnd2、ccne1、cdh1、cdh13、cdk2、cd326、cdkn1a、cdkn1c、cdkn2a、csf1、cst6、ctnnbl、ctsd、egf、egfr、emap-2、erbb2、erbb3、esr1、esr2、foxa1、gata3、gli1、gpi、grb7、gstp1、hic1、hprtl、id1、igf1、igf1r、igfbp3、il6、jun、krt18、krt19、krt5、krt8、lampl、mapk1、mapk3、mapk8、mgmt、mki67、mlh1、mmp2、mmp9、muc1、myb、myc、nme1、notch1、nr3c1、pgr、plau、prdm2、psmb2、psmb4、pten、ptgs2、pycard、rab7a、rara、rarb、rassf1、rb1、reep5、rnb6、serpine1、sfn、sfrp1、slc39a6、slit2、snai2、src、tbc1d9、tctn1、tff3、tgfb1、thbs1、tp73、twist1、vegfa、xbp1、cd3e、cd3g、cd3g、tcf7、alcam、cd25、itga6、thy1、prom1以及cxcr4。多核苷酸靶標(biāo)的其他非限制性實(shí)例包括brca1、brca2、tp53、pten、msh2、mlh1、msh6、pms2、epcam、apc、rb1、men1、ret以及vhl。

多核苷酸靶標(biāo)可能與以下各項(xiàng)相關(guān)：血液和淋巴疾??；癌癥；消化系統(tǒng)；耳、鼻和喉；眼睛疾病；雌性特殊病；雄性特殊病；腺體和激素類；心臟和血管；免疫系統(tǒng)疾?。恍坌蕴厥獠。患∪夂凸趋?；新生兒疾?。簧窠?jīng)系統(tǒng)；營(yíng)養(yǎng)和代謝病；呼吸性疾?。缓?或皮膚和結(jié)締組織。

樣品和感興趣的細(xì)胞

在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品，其中富集該樣品包括聚集樣品中感興趣的細(xì)胞；分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息。樣品的類型不受限制。例如，樣品可以是或者可以包括臨床樣品、生物樣品、環(huán)境樣品或其組合。例如，該樣品可以包括來自患者的生物流體、組織和細(xì)胞中的一種或多種。在一些實(shí)施例中，該樣品可以包括血液、尿液、腦脊液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髓、活檢樣品或其組合。在一些實(shí)施例中，感興趣的細(xì)胞包括干細(xì)胞、癌細(xì)胞、血細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)、乳腺癌細(xì)胞、處于預(yù)期細(xì)胞周期階段的細(xì)胞或其組合。在一些實(shí)施例中，樣品中感興趣的細(xì)胞是或者是約樣品中細(xì)胞總數(shù)目的0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、10％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。在一些實(shí)施例中，少于1000、500、250、100、50、25、10、5或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的感興趣的細(xì)胞可以從富集的細(xì)胞樣品中分離。

如在此所用，術(shù)語“感興趣的細(xì)胞”是指正在研究的細(xì)胞。因?yàn)楦信d趣的細(xì)胞可以是稀少的并且樣品中感興趣的細(xì)胞的濃度可能是低的，所以為了加速使用例如細(xì)胞分選對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行的分離，富集感興趣的細(xì)胞可以是有利的。感興趣的細(xì)胞可以使用聚焦諸如聲聚焦并磁力消除不感興趣的細(xì)胞以及干擾細(xì)胞和碎片來富集。樣品中感興趣的細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括表達(dá)惡性腫瘤表型的細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞，諸如已從腫瘤中流出到血液或其他體液或骨髓中的腫瘤細(xì)胞；良性腫瘤細(xì)胞；癌細(xì)胞；外周血液中的癌細(xì)胞；甲狀腺癌細(xì)胞；乳腺癌細(xì)胞；循環(huán)腫瘤細(xì)胞(“ctc”)；白血病細(xì)胞；癌干細(xì)胞；來自不同細(xì)胞周期階段(g0/g1、s、g2)的單細(xì)胞；攜帶x染色體和y染色體的精子；干細(xì)胞；胎兒或成人干細(xì)胞；多能干細(xì)胞；地中海貧血患者中的有核紅細(xì)胞(“nrbc”)；胎兒細(xì)胞，諸如母體外周血液中的胎兒細(xì)胞；母體循環(huán)中的胎兒有核紅細(xì)胞(“fnrbc”)；以及由cd71、cd8、cd34或cd133表征的細(xì)胞。樣品可以包含來自混合癌細(xì)胞樣品的細(xì)胞。

感興趣的細(xì)胞的其他實(shí)例包括但不限于以下細(xì)胞：循環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞；感染有病毒的細(xì)胞，諸如被hiv感染的細(xì)胞、用感興趣的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；以及存在于罹患自身免疫或自身反應(yīng)病癥的受試者的外周血液中的t-細(xì)胞或b-細(xì)胞的異常亞型；激活淋巴細(xì)胞；抗原遞呈細(xì)胞，諸如單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞；致病性或寄生性生物體、含有細(xì)胞內(nèi)寄生物的細(xì)胞；以及稀流體如尿液中的細(xì)胞或微生物。

細(xì)胞系的非限制性實(shí)例包括：jurkat細(xì)胞，它是t-白血病細(xì)胞系；skbr3，它是已知過度表達(dá)her2/neu的腺癌衍生的乳腺癌細(xì)胞系；t47d，它是證明低至中等her2/neu表達(dá)的導(dǎo)管癌衍生的乳腺癌細(xì)胞系；以及hela。

在此披露的方法可以適用于具有低濃度感興趣的細(xì)胞的樣品，例如具有感興趣的細(xì)胞的樣品。感興趣的細(xì)胞可能是稀少的。在一些實(shí)施例中，樣品中感興趣的細(xì)胞是占樣品中細(xì)胞總數(shù)目的小于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，樣品是每毫升樣品具有不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500、1000個(gè)或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的感興趣的細(xì)胞的流體樣品。流體樣品可以包括或者可以是血液(例如，全血、血清或血漿)、尿液、唾液、腦脊液、胸膜液、羊水、精液或其任何組合。在一些實(shí)施例中，感興趣的細(xì)胞是或者是約樣品中或每毫升流體樣品中10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁵、10²⁰個(gè)或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的總細(xì)胞中的1個(gè)。感興趣的細(xì)胞的大小可以發(fā)生改變。例如，感興趣的細(xì)胞的直徑可以是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100微米或者在這些值中的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。

根據(jù)一些實(shí)施例，去除不感興趣的細(xì)胞(例如，在圖1b的108b處)去除了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍的樣品中最初存在的不感興趣的細(xì)胞和/或碎片。在一些實(shí)施例中，聚集感興趣的細(xì)胞(例如，在圖1b的112b處的聲聚焦)將樣品中感興趣的細(xì)胞的濃度增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、10²％、10³％、10⁴％、10⁵％、10⁶％、10⁷％、10⁸％、10⁹％、10¹⁰％、10¹¹％、10¹²％、10¹³％、10¹⁵％、10²⁰％或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的數(shù)值或范圍。例如，聚集感興趣的細(xì)胞(例如，經(jīng)由在圖1b的112b處的聲聚焦)可以將細(xì)胞分選速度(例如，在圖1b的112b處)增加了至少10-倍、20-倍、30-倍、40-倍、50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、10²-倍、10³-倍、10⁴-倍、10⁵-倍、10⁶-倍、10⁷-倍、10⁸-倍、10⁹-倍、10¹⁰-倍、10¹¹-倍、10¹²-倍、10¹³-倍、10¹⁵-倍、10²⁰-倍或者在這些值的任何兩個(gè)值之間的范圍或數(shù)值。

測(cè)序儀

許多方法、裝置和系統(tǒng)可用于對(duì)多核苷酸進(jìn)行測(cè)序，并且可以用于獲得來自在此所披露的方法中分離的細(xì)胞的多核苷酸的序列信息。例如，測(cè)序儀器的非限制性實(shí)例包括gsflx鈦、gsjunior和gsflx+系統(tǒng)(454生命科學(xué)公司，康乃狄克州布蘭福德)；solexa系統(tǒng)、基因組分析器(genomeanalyzer)iix、miseq、hiseq和hiscansq(依諾米那有限公司，加利福尼亞州圣地亞哥)；solid^tm(通過寡核苷酸連接和檢測(cè)進(jìn)行測(cè)序)系統(tǒng)和基于桑格的dna測(cè)序儀諸如3500遺傳分析儀(geneticanalyzer)；以及離子半導(dǎo)體測(cè)序系統(tǒng)諸如個(gè)人染色體檢測(cè)儀或質(zhì)子測(cè)序儀(賽默飛世爾科技公司，馬薩諸塞州沃爾瑟姆)；以及以及納米孔測(cè)序系統(tǒng)(牛津納米孔技術(shù)公司，英國(guó)牛津)。

數(shù)據(jù)分析

在一些實(shí)施例中，這些方法包括將包含感興趣的細(xì)胞的多個(gè)細(xì)胞的樣品富集以產(chǎn)生富集的細(xì)胞樣品，其中富集該樣品包括聚集樣品中感興趣的細(xì)胞；分離富集的細(xì)胞樣品中的一種或多種感興趣的細(xì)胞；并且通過對(duì)分子索引的多核苷酸文庫進(jìn)行測(cè)序，獲得來自該一種或多種分離的細(xì)胞中每一種的一種或多種多核苷酸的序列信息。在一些實(shí)施例中，對(duì)分子索引的多核苷酸文庫進(jìn)行測(cè)序包括可能使用軟件即服務(wù)平臺(tái)對(duì)由文庫測(cè)序獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去卷積。

圖10是示出以供例如在圖1b的124b處使用的數(shù)據(jù)分析1000的非限制性示例性步驟的流程圖。數(shù)據(jù)分析可以被提供在安全的在線云環(huán)境中。在一些實(shí)施例中，數(shù)據(jù)分析可以使用軟件即服務(wù)平臺(tái)來進(jìn)行。安全的在線云環(huán)境的非限制性實(shí)例包括七橋基因組(sevenbridgesgenomics)平臺(tái)。七橋基因組平臺(tái)是軟件即服務(wù)平臺(tái)的非限制性實(shí)例。

如圖10所示，數(shù)據(jù)分析1000在1004處開始。在1008處，從例如圖1b的122b接收測(cè)序結(jié)果。從圖1b的122b接收的測(cè)序結(jié)果的格式的非限制性實(shí)例包括embl、fasta和fastq格式。測(cè)序結(jié)果可以包括分子索引的多核苷酸文庫的序列讀取。分子索引的多核苷酸文庫可以包括多種單細(xì)胞的序列信息。多種單細(xì)胞的序列信息可以通過以下步驟進(jìn)行去卷積。在1012處，確定用于在122b處進(jìn)行測(cè)序的銜接子的序列，對(duì)其進(jìn)行分析并且將其丟棄以進(jìn)行隨后的分析。一種或多種銜接子可以包括圖2中的銜接子234和236。

在1016處，對(duì)分子索引的多核苷酸文庫的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多路解析。多路解析可以包括將序列讀取分類為屬于多種單細(xì)胞之一。將序列讀取分類為屬于多種單細(xì)胞之一可以是基于標(biāo)記區(qū)214，例如樣品標(biāo)記220。屬于一種mrna的序列讀取可以與屬于另一種mrna的序列讀取區(qū)分，這是基于標(biāo)記區(qū)214，例如分子標(biāo)記218。在1020處，序列讀取可以使用比對(duì)器來與mrna序列比對(duì)。在1020處使用的比對(duì)器的非限制性實(shí)例包括bowtie比對(duì)器、clustalw、blast、expasy以及t-coffee。在1024處，每個(gè)細(xì)胞的數(shù)字基因表達(dá)譜通過對(duì)每個(gè)mrna序列計(jì)數(shù)與細(xì)胞的mrna序列相締合的不同分子標(biāo)記218的數(shù)目來重構(gòu)。因此，實(shí)現(xiàn)mrna在單細(xì)胞中的數(shù)字計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)分析1000的輸出可以包括讀取比對(duì)總結(jié)和每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)基因的分子標(biāo)記計(jì)數(shù)的電子表格。數(shù)據(jù)分析1000在1028處結(jié)束。

實(shí)例

上文所討論的實(shí)施例的一些方面在以下實(shí)例中進(jìn)一步詳細(xì)地披露，這些實(shí)例不以任何方式旨在限制本披露的范圍。

實(shí)例1

結(jié)合蛋白質(zhì)組信息和基因組信息的綜合性高通量

單細(xì)胞分析：流動(dòng)分選、細(xì)胞和mrna索引以及測(cè)序分析

此實(shí)例證明了結(jié)合蛋白質(zhì)組信息和基因組信息的綜合性高通量單細(xì)胞分析。

將外周血細(xì)胞用細(xì)胞表面標(biāo)志物染色，以鑒定少見的調(diào)節(jié)t細(xì)胞亞群，包括原初調(diào)節(jié)t細(xì)胞、效應(yīng)調(diào)節(jié)t細(xì)胞和非抑制性調(diào)節(jié)t細(xì)胞。在使用bdimag^tm磁力分離進(jìn)行樣品富集之后，使用bdfacsjazz^tm細(xì)胞分選儀將在不同時(shí)間點(diǎn)取樣的細(xì)胞單獨(dú)分選到96-孔precise^tm編碼板中，從而增加分選速度和品質(zhì)。將每個(gè)細(xì)胞裂解，并且在逆轉(zhuǎn)錄步驟過程中對(duì)mrna內(nèi)容物使用獨(dú)特樣品和分子索引進(jìn)行分子索引。查詢針對(duì)鑒定細(xì)胞組成所小心選擇的大約100個(gè)基因。在合并來自八個(gè)96-孔precise^tm編碼板的產(chǎn)物之后，生成三個(gè)測(cè)序文庫并且在miseq儀器上運(yùn)行。形成層流計(jì)算管線，并且在sevenbridges^tm基因組平臺(tái)上進(jìn)行自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析。這些結(jié)果證明了使用高通量單細(xì)胞基因組測(cè)序方法與bdfacs分析儀器裝備的強(qiáng)力單細(xì)胞分選能力相結(jié)合對(duì)細(xì)胞亞型進(jìn)行的簡(jiǎn)單且明確的去卷積。

圖11a-圖11f是示出用于下一代測(cè)序的單細(xì)胞的門控的圖。通過cpt管(目錄號(hào)362761)收集外周血單核細(xì)胞(“pbmc”)。將pbmc用含有以下白血病白細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體混合物連同bdimag^tmcd4t淋巴細(xì)胞富集試劑盒(目錄號(hào)557939)染色：cd127bv421、cd25bb515、cd161pe、cd45rapercp-cy^tm5.5、cd15saf647、cd4apc-h(bd)。通過cd4+cd25+cd127-染色鑒定調(diào)節(jié)t細(xì)胞。將調(diào)節(jié)t細(xì)胞細(xì)胞通過兩種細(xì)胞表面標(biāo)志物cd45ra和cd15s進(jìn)一步細(xì)分為原初調(diào)節(jié)t細(xì)胞(ntregcd45ra+cd15s-)、效應(yīng)調(diào)節(jié)t細(xì)胞(etregcd45-cd15s+)和非抑制性調(diào)節(jié)t細(xì)胞(cd45ra-cd15s-)。將非抑制性調(diào)節(jié)t細(xì)胞進(jìn)一步分為cd161+和cd161-亞群。將非-調(diào)節(jié)t細(xì)胞細(xì)胞也收集到cd45ra+和cd45ra-亞群中。

圖12a-圖12b是示出從單細(xì)胞獲得的讀取和轉(zhuǎn)錄物數(shù)目的柱狀圖。圖12a是示出從分選到precise^tm板中的個(gè)別細(xì)胞開始的高測(cè)序成功的圖。灰色條指示基于顯著更低的總讀取計(jì)數(shù)的可能的失敗。如果需要的話，板索引允許多個(gè)板(高達(dá)4,000個(gè)細(xì)胞)合并到單次miseq運(yùn)行中。圖12b是示出在對(duì)讀取去卷積之后來自與圖a所示相同的板的96個(gè)單細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)錄物計(jì)數(shù)的圖。數(shù)據(jù)顯示在大測(cè)量范圍的單細(xì)胞內(nèi)的絕對(duì)mrna定量。分選的單細(xì)胞測(cè)序的成功大于95％。在對(duì)樣品染色之后，在一個(gè)范圍的時(shí)間內(nèi)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分選。示出1小時(shí)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

圖13是顯示precise^tm測(cè)定校正了pcr偏移的計(jì)數(shù)讀取相對(duì)于分子的圖。precise^tm測(cè)定校正了pcr擴(kuò)增偏移并且允許對(duì)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)。對(duì)分子的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)顯著降低了與計(jì)數(shù)讀取相關(guān)聯(lián)的噪聲水平。

圖14a-圖14b是調(diào)節(jié)t細(xì)胞相對(duì)于非調(diào)節(jié)t細(xì)胞和初生調(diào)節(jié)t細(xì)胞相對(duì)于效應(yīng)調(diào)節(jié)t細(xì)胞的主要組分分析(“pca”)圖，這些圖顯示表面標(biāo)記物表型與分子譜相關(guān)。使用主要組分分析，使用在基因的組上表達(dá)的細(xì)胞的分子計(jì)數(shù)，使個(gè)別細(xì)胞成群集。通過在bdfacsjazz上進(jìn)行的索引分選記錄每個(gè)細(xì)胞的身份，這由每個(gè)著色的點(diǎn)表示。

圖15a-圖15c是cd45ra^-cd15s⁺、cd161^-非抑制性調(diào)節(jié)t細(xì)胞和cd45ra⁺cd15s^-效應(yīng)調(diào)節(jié)t細(xì)胞穿過時(shí)間點(diǎn)的pca單細(xì)胞圖。

在流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分選之前利用聲聚焦裝置能夠聚集感興趣的細(xì)胞(小于樣品中起始細(xì)胞群的1％)。這提供分選時(shí)間從數(shù)小時(shí)至數(shù)分鐘的減少。這有利地提高了可以在其生命周期的同一點(diǎn)進(jìn)行分析的活細(xì)胞群和更大的活細(xì)胞群。

此實(shí)例證明了使用bdfacsjazz^tm細(xì)胞分選儀器與細(xì)胞研究公司precise^tm工作流程相結(jié)合進(jìn)行的低成本、高通量、單細(xì)胞基因組測(cè)序。該測(cè)定具有高成功率，對(duì)于單細(xì)胞分選和測(cè)序而言大于95％。它是迅速的，單細(xì)胞的一個(gè)96孔板可以在15分鐘內(nèi)分選同時(shí)富集，這使得在樣品制備之后不希望的基因表達(dá)改變最小化。

總之，這些數(shù)據(jù)表明流動(dòng)單細(xì)胞分選與單細(xì)胞條形編碼的結(jié)合提供了用于將細(xì)胞表型與分子轉(zhuǎn)錄物分布相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)力工具。

實(shí)例2

用于高通量、高精確性、定量的、單細(xì)胞基因表達(dá)譜繪制的新型bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀

此實(shí)例證明了細(xì)胞分選儀用于高通量、高精確性、定量的單細(xì)胞基因表達(dá)譜繪制的用途。具體地，此實(shí)例顯示了使用高通量單細(xì)胞基因組測(cè)序方法例如細(xì)胞研究公司precise^tm測(cè)定與單細(xì)胞分選儀例如bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀結(jié)合對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行的簡(jiǎn)單且明確的去卷積。

在此實(shí)例中，披露了用于細(xì)胞周期分析和細(xì)胞表面標(biāo)志物染色應(yīng)用的單細(xì)胞分選的完整工作流程。具體地，此實(shí)例證明：1)通過碘化丙錠(pi)染色從集合體中去除死細(xì)胞；2)使用赫斯特(hoechst)染料染色分離來自不同細(xì)胞周期階段(g0/g1、s、g2)的單細(xì)胞；3)通過將每孔不同數(shù)目的細(xì)胞(1個(gè)細(xì)胞、5個(gè)細(xì)胞、10個(gè)細(xì)胞、20個(gè)細(xì)胞以及50個(gè)細(xì)胞)沉積在96-孔板中來分選細(xì)胞的準(zhǔn)確性；以及4)基于其特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物染色從混合的癌細(xì)胞樣品中分離單細(xì)胞。使用precise^tm測(cè)定分析分選的細(xì)胞并使用下一代測(cè)序生成這些細(xì)胞的基因表達(dá)譜。

圖16a-圖16c是示出單細(xì)胞的細(xì)胞周期分析的圖。將jurkat細(xì)胞(t-白血病細(xì)胞系)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期并且用赫斯特34580染料(5mg/ml)染色半小時(shí)，并且在室溫下用pi(目錄號(hào)556463，5mg/ml)染色10分鐘。使用bdfacsseq^tm分選儀分析培養(yǎng)的jurkat細(xì)胞。圖16a是示出單細(xì)胞基于其復(fù)合散射而鑒定的觸發(fā)脈沖寬度相對(duì)于散射高度的圖。碘化丙啶(pi)染料是可以由紫色激光激發(fā)的膜滲透性dna結(jié)合染料。圖16b是pi中等熒光強(qiáng)度(“mfi”)相對(duì)于散射高度的圖，其示出用pi陽性染色的細(xì)胞是死的或垂死的并且可以從集合體中排除。排除死細(xì)胞確保了僅活的、健康的代表性細(xì)胞進(jìn)入基因組工作流程以進(jìn)行分析。圖16c是計(jì)數(shù)相對(duì)于赫斯特34580mfi的直方圖，其示出活細(xì)胞的赫斯特染色信號(hào)。圖16c示出基于其不同赫斯特染料熒光染色強(qiáng)度的g0/g1、s和g2/m細(xì)胞周期階段的分布。

圖17a-圖17b是示出單細(xì)胞和少量細(xì)胞的準(zhǔn)確遞送的圖。bdfacsseq^tm分選儀可以準(zhǔn)確地遞送單細(xì)胞或者少量感興趣的細(xì)胞。并且通過bdfacsseq^tm分選儀的索引分選特性記錄分選的細(xì)胞的表型信息。將單個(gè)或者少量(5、10、20以及50)的用4',6-二脒-2-苯基吲哚(“dapi”)染色的固定的jurkat細(xì)胞重復(fù)地分選到96-孔板中。圖17a是如在熒光顯微鏡上可視化的代表性孔的圖像，并且圖17b是示出由索引分選記錄的分選的細(xì)胞的表型信息的dapimfi相對(duì)于散射高度的圖。

圖18a-圖18b是示出通過bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀進(jìn)行的單細(xì)胞分離的圖。使用epcambv421和cd3bv650對(duì)具有以80％:20％比率混合的jurkat細(xì)胞和t47d細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞系)的癌細(xì)胞樣品進(jìn)行染色并且在bdfacsseq分選儀上運(yùn)行。圖18a是示出單細(xì)胞被復(fù)合散射門控的觸發(fā)脈沖寬度相對(duì)于散射高度的圖。圖18b是示出通過其特異性表面標(biāo)志物染色對(duì)兩種類型的細(xì)胞進(jìn)行的分離的cd3bv650相對(duì)于epcambv421的圖。jurkat細(xì)胞僅被cd3陽性染色，而t47d僅被epcam染色。將混合的細(xì)胞隨機(jī)分選到96-孔細(xì)胞研究公司precise^tm編碼板的每個(gè)孔中，其中每個(gè)孔中一個(gè)單細(xì)胞。

圖19a-圖19c示出通過bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀分離的圖18a-圖18b所示的jurkat細(xì)胞和t47d細(xì)胞的pca群集和基因表達(dá)譜。圖19a是示出jurkat細(xì)胞和t47d細(xì)胞到兩個(gè)簇的群集的pca圖。圖19b-圖19c是示出jurkat細(xì)胞簇1和t47d細(xì)胞簇2中的基因表達(dá)譜的柱狀圖。圖19b-圖19c示出這些基因在具有jurkat細(xì)胞(簇1)和t47d細(xì)胞(簇2)的兩個(gè)簇對(duì)應(yīng)的孔中高度表達(dá)。

總之，這些數(shù)據(jù)證明了使用新的、容易使用的分選儀選擇并分離單細(xì)胞以用于高分辨率基因組研究(包括下一代測(cè)序、qpcr和微陣列分析)的簡(jiǎn)單、快速的方法。分選儀提供了用于研究在個(gè)別細(xì)胞水平下的復(fù)雜樣品的強(qiáng)力工具。

實(shí)例3

使用分子索引技術(shù)對(duì)her2/neu-表達(dá)癌細(xì)胞獲得的單細(xì)胞基因表達(dá)譜

此實(shí)例證明使用分子索引技術(shù)確定her2/neu-表達(dá)癌細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)譜。

乳腺癌中her2/neu(cerb-b2)的表達(dá)水平是診斷過程中的基本分類。此癌基因的過度表達(dá)與存活的減少相關(guān)聯(lián)并且可以是治療的驅(qū)動(dòng)決定簇。然而，與her2/neu過度表達(dá)相關(guān)聯(lián)的侵入性乳腺癌中的作用機(jī)制尚不清楚。利用大塊組織的常規(guī)基因譜研究可能受到差的信噪比的阻礙，從而使得難以了解基因表達(dá)中的變化。單細(xì)胞分析方法可以克服這些問題并且揭示更全面的數(shù)據(jù)集。此實(shí)例的目標(biāo)是鑒定在過度表達(dá)her2/neu的個(gè)別細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)的基因。

使用bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀，將來自已知表達(dá)不同水平的her2/neu的多種細(xì)胞系的單細(xì)胞分選到96-孔板中。所使用的細(xì)胞系包括skbr3，它是已知過度表達(dá)her2/neu的腺癌衍生的乳腺癌細(xì)胞系；以及t47d，它是證明低至中等her2/neu表達(dá)的導(dǎo)管癌衍生的乳腺癌細(xì)胞系。在篩選中也包括陰性對(duì)照細(xì)胞系(hela和jurkat)。對(duì)于乳腺癌特定基因，使用分子索引技術(shù)處理這些分選的單細(xì)胞。此基因表達(dá)圖包括與乳腺癌相關(guān)聯(lián)的100個(gè)基因。然后將所得基因譜與單個(gè)細(xì)胞上的her2/neu表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。

細(xì)胞培養(yǎng).使用極限必需培養(yǎng)基(“mem”)培養(yǎng)hela細(xì)胞(皮下腺癌細(xì)胞系)。使用洛斯維公園紀(jì)念所(roswellparkmemorialinstitute)培養(yǎng)基(“rpmi”)1640培養(yǎng)基培養(yǎng)jurkat細(xì)胞(t-白細(xì)胞的細(xì)胞系)。使用杜氏(dulbecco's)極限必需培養(yǎng)基(“dmem”)培養(yǎng)skbr3細(xì)胞(轉(zhuǎn)移性乳腺腺癌細(xì)胞系)和t47d細(xì)胞(導(dǎo)管乳腺癌細(xì)胞系)二者。用10％熱滅活胎牛血清(“fbs”)和1％青霉素/鏈霉素溶液補(bǔ)充所有的培養(yǎng)基。另外，在染色之前使用吉畢科公司(gibco)收獲所有細(xì)胞系。

流式細(xì)胞術(shù).將hela、jurkat、skbr3以及t47d人類癌細(xì)胞系培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收獲并計(jì)數(shù)。將每種細(xì)胞系的1×106個(gè)細(xì)胞用bdhorizon^tmbv421her-2/neu(bd定制抗體)和bdhorizon^tmbv786cd44(bd生物科學(xué)公司(bdbiosciences)，目錄號(hào)564942)染色30分鐘，將其洗滌，接著用細(xì)胞活性染料碘化丙啶(bd生物科學(xué)公司，目錄號(hào)51-66211e)在室溫下染色10分鐘。然后分析樣品并且使用bdfacsseq細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選?；趆er2/neu蛋白質(zhì)表達(dá)，將活的單細(xì)胞直接分選到預(yù)先填充的細(xì)胞研究公司precise^tm乳腺癌96-孔測(cè)定板中。

測(cè)序文庫生成和數(shù)據(jù)分析.用基于洗滌劑的細(xì)胞裂解緩沖液連同rna穩(wěn)定劑、分子索引和樣品特異性條形碼預(yù)先裝載細(xì)胞研究公司precise^tm板。在將細(xì)胞分選到板中之后，將裂解的細(xì)胞保持冷凍在-80℃下，之后進(jìn)一步處理。然后根據(jù)細(xì)胞研究公司precise^tm測(cè)定方案處理這些樣品，以將樣品合并，擴(kuò)增靶基因并生成測(cè)序文庫。然后在miseq儀器上對(duì)文庫進(jìn)行測(cè)序。形成層流計(jì)算管線，并且在七橋基因組平臺(tái)上進(jìn)行自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析。然后使用qlucore軟件包分析來自七橋的數(shù)據(jù)輸出。

圖20a-圖20b和圖21a-圖21d示出cd44和her2/neu的相對(duì)表達(dá)。圖20a-圖20b是cd44bv786相對(duì)于her2/neubv421和計(jì)數(shù)相對(duì)于her2/neubv421的圖，這些圖示出每個(gè)細(xì)胞類型jurkat、t47d、hela以及skbr3由cd44和her2/neu的相對(duì)表達(dá)明確限定。

圖21a-圖21d是示出圖21a中的jurkat細(xì)胞、圖21b中的hela細(xì)胞、圖21c中的t47d細(xì)胞以及圖21d中的skbr3細(xì)胞基于her2/neu表達(dá)來分選的圖。收集每種細(xì)胞類型內(nèi)的三個(gè)群體：低her2/neu、中等her2/neu和高h(yuǎn)er2/neu。將單細(xì)胞直接分選到bdprecise^tm乳腺癌96-孔測(cè)定板的每個(gè)孔中。每個(gè)象限示出用于確保分選的細(xì)胞是具有所希望的her2/neu表達(dá)譜的活單細(xì)胞的門控策略。

圖22是示出使用細(xì)胞研究公司precise^tm測(cè)定分析的乳腺癌基因的表格。使用作為基礎(chǔ)的細(xì)胞研究公司precise^tm基因文庫(99個(gè)基因)加上11個(gè)另外的基因，此實(shí)例查詢了110個(gè)靶基因。淺灰色陰影的基因指示最終數(shù)據(jù)分析中包括的靶標(biāo)。無陰影的基因未檢測(cè)超過閾值并且因此從最終數(shù)據(jù)分析中排除。將來自四個(gè)96-孔bdprecise測(cè)定板(4×96個(gè)樣品)的產(chǎn)物合并，并且生成一個(gè)測(cè)序文庫。

圖23、圖24a-圖24b和圖25a-圖25g示出使用七橋基因組平臺(tái)進(jìn)行自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析。在110個(gè)靶基因中，57個(gè)靶基因的表達(dá)水平是可檢測(cè)的。圖23是示出所表達(dá)的靶基因的分析的熱圖，該熱圖證明了四種不同細(xì)胞類型之間的明顯不同。在每種細(xì)胞類型內(nèi)，由her2/neu蛋白質(zhì)表達(dá)水平限定的亞群并未顯示基因表達(dá)模式的顯著差異。

圖24a-圖24b是示出由具有支持熱圖結(jié)果的隨機(jī)her2/neu表達(dá)的細(xì)胞類型進(jìn)行的群集的pca圖。圖24a是示出由細(xì)胞類型進(jìn)行的群集分析的pca圖。群集分析顯示四種細(xì)胞類型清楚地分離成四個(gè)不同的簇。圖24b是示出her2/neu表達(dá)在每種細(xì)胞類型簇內(nèi)不具有可辨別模式的pca圖。

圖25a-圖25g是示出erbb2、brca1、cdk2、muc1、cdh1、ctsd以及ctsd的逐步增加的表達(dá)圖。圖25a示出erbb2(her2/neu的mrna前體)在skbr3中具有極度的過度表達(dá)，在t47d中具有相對(duì)低的表達(dá)，并且在hela和jurkat細(xì)胞中幾乎不具有或不具有表達(dá)。t47d中的erbb2表達(dá)的進(jìn)一步檢查顯示通過流式細(xì)胞術(shù)獲得的與her2/neu蛋白質(zhì)表達(dá)很好地相關(guān)聯(lián)的逐步增加。在圖25b所示的腫瘤抑制因子brca1、圖25c所示的激酶cdk2、圖25d所示的粘蛋白muc1、圖25e所示的鈣粘素cdh1、圖25f所示的蛋白酶ctsd以及圖25g所示的轉(zhuǎn)錄因子xbp1中檢測(cè)到似乎與her2/neu表達(dá)相關(guān)聯(lián)的其他基因產(chǎn)物中類似的逐步增加。

這些數(shù)據(jù)顯示在不同癌細(xì)胞系內(nèi)her2/neu的不同表達(dá)可以在蛋白質(zhì)水平和mrna水平下檢測(cè)到。t47d細(xì)胞顯示erbb2的mrna水平的增加，這表明與在低her2/neu、中等her2/neu和高h(yuǎn)er2/neu表達(dá)細(xì)胞的分選群體之間her2/neu的蛋白質(zhì)水平的同時(shí)增加的適度相關(guān)性。brca1、cdk2、muc1、cdh1、ctsd以及xbp1的mrna水平類似的同時(shí)增加也顯示了與her2/neu蛋白質(zhì)表達(dá)水平的適度相關(guān)性。與細(xì)胞研究公司precise^tm測(cè)定耦合的bdfacsseq^tm細(xì)胞分選儀提供了從單細(xì)胞選擇和分離到下游定量mrna分析的耐用且成本有效的工作流程。此工作流程是結(jié)合用于研究單細(xì)胞水平下的復(fù)雜生物樣品的表型表達(dá)譜和基因表達(dá)譜的強(qiáng)力工具。

鑒定與單細(xì)胞水平的her2/neu過度表達(dá)相關(guān)聯(lián)的基因闡明了在這些侵入性癌癥中起作用的機(jī)制，這些侵入性癌癥已知包括全部乳腺癌中的多達(dá)30％?？傊?，通過結(jié)合單細(xì)胞分選和分子分選所生成的這些數(shù)據(jù)闡明了在這些侵入性癌癥中起作用的機(jī)制，這些侵入性癌癥已知包括全部乳腺癌中的多達(dá)30％。

在至少一些先前描述的實(shí)施例中，在一個(gè)實(shí)施例中使用的一個(gè)或多個(gè)元件可以在另一個(gè)實(shí)施例中互換地使用，除非這種置換是技術(shù)上不可行的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，可以在不背離所要求保護(hù)的主題的范圍的情況下對(duì)以上所述的方法和結(jié)構(gòu)做出各種其他省略、添加和修改。所有這樣的修改和改變預(yù)期屬于如所附權(quán)利要求書所限定的主題的范圍之內(nèi)。

關(guān)于在此使用基本上任何復(fù)數(shù)和/或單數(shù)術(shù)語，那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)上下文和/或應(yīng)用的需要將復(fù)數(shù)翻譯成單數(shù)和/或?qū)螖?shù)翻譯成復(fù)數(shù)。為了清晰起見，可以在此清晰地列出各種單數(shù)/復(fù)數(shù)的轉(zhuǎn)換。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，一般而言，在此所使用的術(shù)語，尤其是在所附權(quán)利要求書中的術(shù)語(例如，所附權(quán)利要求書的主體)通常意指“開放性的”術(shù)語(例如，術(shù)語“包含(including)”應(yīng)當(dāng)被解釋為“包含但不局限于”，術(shù)語“具有”應(yīng)當(dāng)被解釋為“具有至少”，術(shù)語“包括(includes)”應(yīng)當(dāng)被解釋為“包括但不限于”等等)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將進(jìn)一步理解的是，如果意指特定數(shù)目的所介紹的權(quán)利要求陳述，那么將在該權(quán)利要求中明確陳述這種意圖，并且在缺乏這類陳述的情況下，不呈現(xiàn)這種意圖。例如，為了有助于理解，以下所附權(quán)利要求書可以包含介紹性短語“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多個(gè)”的使用，以用來介紹權(quán)利要求陳述。然而，此類短語的使用不應(yīng)當(dāng)解釋為意指經(jīng)由不定冠詞“一個(gè)”或“一種”介紹權(quán)利要求陳述將任何含有此類介紹的權(quán)利要求陳述的具體權(quán)利要求限制于僅含有一個(gè)這種陳述的實(shí)施例，即使在相同的權(quán)利要求包括介紹性短語“一個(gè)或多個(gè)”或“至少一個(gè)”以及不定冠詞例如“一個(gè)”或“一種”(例如，“一個(gè)”和/或“一種”，也應(yīng)當(dāng)解釋為表示“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”)的時(shí)候也是如此；這對(duì)于使用定冠詞來介紹權(quán)利要求陳述同樣適用。另外，即使明確地陳述一個(gè)介紹的權(quán)利要求陳述的特定數(shù)目，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到此陳述物也應(yīng)當(dāng)解釋為意味著至少該陳述的數(shù)目(例如，僅陳述“兩個(gè)陳述”而無其他修飾語意指至少兩個(gè)陳述，或兩個(gè)或者多個(gè)陳述)。此外，在使用類似于“a、b以及c等中的至少一個(gè)”的慣例的情況下，通常這樣的句法結(jié)構(gòu)意指在一定意義上本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該慣例(例如，“具有a、b以及c中的至少一個(gè)的系統(tǒng)”將包括但不局限于僅具有a、僅具有b、僅具有c、同時(shí)具有a和b、同時(shí)具有a和c、同時(shí)具有b和c、和/或同時(shí)具有a、b以及c等的系統(tǒng))。在使用類似于“a、b以及c等中的至少一個(gè)”的慣例的情況下，通常這樣的句法結(jié)構(gòu)意指在一定意義上本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該慣例(例如，“具有a、b或c中的至少一個(gè)的系統(tǒng)”將包括但不局限于僅具有a、僅具有b、僅具有c、同時(shí)具有a和b、同時(shí)具有a和c、同時(shí)具有b和c、和/或同時(shí)具有a、b以及c等的系統(tǒng))。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將進(jìn)一步理解地是，無論是在說明、權(quán)利要求書還是在附圖中，實(shí)際上呈現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)選擇性術(shù)語的任何轉(zhuǎn)折性詞語和/或短語都應(yīng)當(dāng)理解為考慮到了包含這些術(shù)語之一、這些術(shù)語中的任一者或這兩個(gè)術(shù)語的可能性。例如，短語“a或b”將理解為包含“a”或“b”或“a和b”的可能性。

此外，當(dāng)以馬庫什(markush)組的方式描述本披露的多個(gè)特征或方面時(shí)，在本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到還以該馬庫什組中任一個(gè)單獨(dú)的成員或多個(gè)成員的子組的方式來對(duì)本披露進(jìn)行描述。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，出于諸如就提供書面說明而言的任何和所有目的，在此披露的所有范圍也包括任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。任何列出的范圍都可以容易被認(rèn)為已經(jīng)充分描述并使得同一范圍分成至少相等的二等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，在此討論的每個(gè)范圍可以容易分為下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解的是，所有諸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等語言包括所提數(shù)值，并且是指可以接著分成如上所討論的子范圍的范圍。最后，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，一個(gè)范圍包括每個(gè)獨(dú)立成員。因此例如，具有1-3個(gè)物品的組是指具有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)物品的組。類似地，具有1-5個(gè)物品的組是指具有1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)物品的組，等等。

雖然在此已披露了各個(gè)方面和實(shí)施例，其他方法和實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是清楚的。在此所披露的各個(gè)方面和實(shí)施例是出于數(shù)目的目的并且不預(yù)期是限制性的，其中真實(shí)的范圍和精神是由以下權(quán)利要求書所指示的。