相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求ericnadeau于2015年2月11日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)62/114,829的權(quán)益。上述引用文件的內(nèi)容通過引用整體并入本文。本申請(qǐng)一般地涉及用于包埋活大腸桿菌(e.coli)的經(jīng)改進(jìn)干基質(zhì)、其制備方法及其用途的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌芽胞是可以以干燥和脫水狀態(tài)無限期存在的休眠生命形式。對(duì)于人，細(xì)菌芽孢可以用作用于輕度胃腸病癥(例如腹瀉)的非處方預(yù)防劑或者用作健康食品或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。在農(nóng)業(yè)中，細(xì)菌芽孢作為抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的潛在替代品也受到越來越多的關(guān)注(hong等，femsmicrobiologyreviews，2005，29：813-835)。然而，大腸桿菌(escherichiacoli，e.coli)不形成芽孢并且因此與形成芽孢的細(xì)菌相比對(duì)干燥和/或脫水條件的抗性較低。在很多應(yīng)用中，出于給定目的仍然需要以提供足夠生存力和/或足夠細(xì)菌生物活性的形式保存和儲(chǔ)存大腸桿菌細(xì)菌。在此方面，先前已提出了用于細(xì)菌的多種實(shí)際保存和儲(chǔ)存條件。冷凍干燥(還稱為凍干)由于在干燥期間的低溫暴露而常常用于細(xì)菌的保存和儲(chǔ)存(rhodes，e.xploitationofmicroorganisms編輯jones，dg，1993，第411-439頁，london：chapman&hall)。然而，其具有顯著降低生存力以及時(shí)間和能量密集的不期望特征。已提出保護(hù)劑，但是在冷凍干燥期間由給定添加劑提供的保護(hù)隨微生物的物種而變化(fontdevaldez等，cryobiology，1983，20：560-566)?？諝飧稍?例如與干燥一起)已用于細(xì)菌的保存和儲(chǔ)存。盡管真空干燥是一種與冷凍干燥類似的方法，但是其發(fā)生在0℃至40℃下持續(xù)30分鐘至數(shù)小時(shí)。這種方法的優(yōu)勢(shì)是產(chǎn)品不經(jīng)冷凍，因此能量消耗及相關(guān)經(jīng)濟(jì)影響降低。從產(chǎn)品角度考慮，避免冷凍損害。然而，在低溫或環(huán)境溫度下的干燥緩慢，需要額外的預(yù)防措施以避免污染并且常常產(chǎn)生不令人滿意的生存力(lievense等，advbiochemengbiotechnol.，1994，51：71-89)。將細(xì)菌包封在形成水膠體之多糖基質(zhì)(例如藻酸鈣(ca-藻酸)珠)中已在廣泛且增大范圍的不同應(yīng)用中用于細(xì)菌的保存和儲(chǔ)存(islam等，j.microbiol.biotechnol.，2010，20：1367-1377)。為了使細(xì)菌維持在代謝上和生理上具有活性的狀態(tài)并由此獲得期望的益處，已提出向這樣的基質(zhì)中添加合適的保存制劑。保存制劑通常含有在合適載體中的活性成分和幫助在儲(chǔ)存、運(yùn)輸期間和在目標(biāo)區(qū)域穩(wěn)定化和保護(hù)微生物細(xì)胞的添加劑。甘露醇已被描述為ca-藻酸包封細(xì)菌在冷凍干燥期間的有效保存制劑組分，因?yàn)槠涮峁┦覝叵露嘀?0周的高細(xì)菌生存力和小于0.2的水活度(wateractivity，aw)(efiuvwevwere等，appl.microbiol.biotechnol.，1999，51：100-104)。海藻糖和糖醇的協(xié)同混合物已被描述為用于經(jīng)空氣干燥的ca-藻酸包封細(xì)菌的有效保存制劑，其中由于海藻糖具有顯著更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度而使用海藻糖代替蔗糖(即分別為110℃相對(duì)于僅65℃)(u.s.8,097,245)。羧酸鹽和水解蛋白的協(xié)同混合物也已被描述為經(jīng)冷凍干燥ca-藻酸包封細(xì)菌的有效保存制劑組分(u.s.2013/0,296,165)。在這兩種情況下，協(xié)同混合物均提供增強(qiáng)的玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)而無需起泡或在真空下煮沸以有利于有效干燥。然而，開發(fā)新的制劑是一項(xiàng)有挑戰(zhàn)的任務(wù)，并且不是所有的制劑對(duì)給定細(xì)菌都有效(youg等，biotechnolbioeng.，2006年9月5日；95(1)：76-83)。鑒于上述內(nèi)容，需要提供用于大腸桿菌細(xì)菌的經(jīng)改進(jìn)的保存和儲(chǔ)存條件。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開內(nèi)容廣泛地涉及包埋在基質(zhì)中的活大腸桿菌(e.coli)，其中所述基質(zhì)的水活度(aw)≤0.3，并且其中所述基質(zhì)包含作為形成水膠體之多糖的第一多糖、不同于第一多糖的第二多糖和包含蔗糖、海藻糖或其組合的二糖。本公開內(nèi)容還廣泛地涉及用于形成基質(zhì)的組合物，所述組合物包含作為形成水膠體之多糖的第一多糖、不同于第一多糖的第二多糖和包含蔗糖、海藻糖或其組合的二糖，以及大腸桿菌(e.coli)。本公開內(nèi)容還廣泛地涉及用于提供包含活大腸桿菌(e.coli)的顆粒的方法。本公開內(nèi)容還廣泛地涉及包含活大腸桿菌(e.coli)的基質(zhì)，其中所述基質(zhì)的水活度(aw)≤0.3，并且其中所述基質(zhì)包含作為形成水膠體之多糖的第一多糖、不同于第一多糖的第二多糖和包含蔗糖、海藻糖或其組合的二糖。本公開內(nèi)容中描述的并且不相互排斥的實(shí)施方案的所有特征均可彼此組合。一個(gè)實(shí)施方案的要素?zé)o需進(jìn)一步提及即可用于其他實(shí)施方案。在結(jié)合附圖閱讀具體實(shí)施方案的以下描述之后，本發(fā)明的其他方面和特征對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得明顯。附圖說明在下文中參照附圖提供了一些具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，在附圖中：圖1示出了根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案用于制備細(xì)菌培養(yǎng)物的非限制性流程圖。圖2示出了根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案用于干燥具有經(jīng)包埋大腸桿菌的珠的非限制性流程圖。圖3示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液(preservationsolution)s1、s2、s3和s4對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖4示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液s1、s5、s6和s7對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖5示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液s1、s0、s8和s9對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖6示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液s1、s10、s11和s12對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖7示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液s1、s13、s14和s15對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖8示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液s1、s16、s17和s18對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖9示出了顯示根據(jù)本公開內(nèi)容一個(gè)實(shí)施方案在空氣干燥之后保存溶液s1和s19對(duì)細(xì)菌生存力的作用的非限制性條形圖。圖10示出了關(guān)于圖3至圖9的原始數(shù)據(jù)。在附圖中，通過實(shí)例對(duì)一些實(shí)施方案進(jìn)行舉例說明。應(yīng)清楚地理解，說明書和附圖僅用于舉例說明某些實(shí)施方案的目的并且有助于理解。權(quán)利要求書的范圍不應(yīng)受本公開內(nèi)容中所示的實(shí)施方案的限制，而應(yīng)賦予與說明書整體一致的最寬解釋。具體實(shí)施方式現(xiàn)在將對(duì)一些具體實(shí)例進(jìn)行描述以舉例說明本公開內(nèi)容的原理付諸實(shí)踐的方式。本文中所述的大腸桿菌細(xì)菌是活細(xì)菌，換言之，盡管包埋在干基質(zhì)中的細(xì)菌可被認(rèn)為處于非活性狀態(tài)，但是在使基質(zhì)暴露于潮濕之后，這些細(xì)菌可恢復(fù)至活性狀態(tài)。本文中所述的大腸桿菌細(xì)菌包含任何重組或野生的大腸桿菌菌株，或者其任意混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，大腸桿菌是非致病性菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，非致病性大腸桿菌菌株是于2005年1月21日以登記號(hào)idac210105-01保藏在加拿大國(guó)際保藏單位(internationaldepositoryauthorityofcanada，idac)的菌株或于2013年6月20日保藏在加拿大國(guó)際保藏單位(idac)并且歸于登記號(hào)200613-01的菌株，或者其組合。本文中所述的基質(zhì)包含形成水膠體之多糖。數(shù)種多糖單獨(dú)地或以其任意組合適合如本文中所述使用。高直鏈淀粉淀粉是能夠在沸水中使淀粉顆粒水合，在高剪切混合器的幫助之下使顆粒分散并隨后將溶液冷卻至約0℃至10℃之后形成堅(jiān)固凝膠的多糖。凝膠的堅(jiān)固度和強(qiáng)度取決于溶液中淀粉的濃度，其中最大可工作濃度為多至10％w/v。經(jīng)切片的淀粉凝膠基質(zhì)還能夠使活細(xì)菌保持在保存混合物中，并且由于其大部分不易被腸液或胃液消化，因此細(xì)菌在淀粉基質(zhì)中的同時(shí)被保護(hù)免受胃破壞。受控的釋放機(jī)理由以下事實(shí)提供：高直鏈淀粉淀粉容易被腸微生物群落消化，此時(shí)遞送的活細(xì)菌隨后以其完整形式釋放。果膠是另一種合適的多糖，其以與高直鏈淀粉淀粉非常類似的方式起作用。果膠由于可通過添加在糖聚合物的羧基之間形成橋接的二價(jià)陽離子(例如ca2+)進(jìn)一步提高果膠凝膠基質(zhì)的強(qiáng)度而具有額外的優(yōu)勢(shì)。藻酸類(alginate)是另一種合適的多糖，其可通過與二價(jià)陽離子交聯(lián)而形成堅(jiān)固的凝膠基質(zhì)。藻酸類可通過使藻酸類多糖與雙陽離子(例如ca2+)內(nèi)部交聯(lián)，例如通過將藻酸類以細(xì)線狀物、串或基本上球形的珠的形式擠出到ca2+浴中而被硬化成堅(jiān)固的凝膠基質(zhì)。藻酸類在與ca2+相互作用之后硬化。制備基質(zhì)的替選方法是將混合物噴霧霧化到包含ca2+的浴中。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成水膠體之多糖以按總干基質(zhì)的重量計(jì)的0.1％至20％的百分比值存在于基質(zhì)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成水膠體之多糖以按總干基質(zhì)的重量計(jì)的以下百分比值存在于基質(zhì)中：0.1％至19％、或0.1％至18％、或0.1％至17％、或0.1％至16％、或0.1％至15％、或0.1％至14％、或0.1％至13％、或0.1％至12％、或1％至12％，包括其中的任意值。本文中所述的基質(zhì)還包含二糖和多糖。本公開內(nèi)容公開了適于包含在基質(zhì)中的數(shù)個(gè)濃度和比例。在一個(gè)實(shí)施方案中，二糖/多糖的重量％/重量％的合適比值小于10，或者更優(yōu)選地小于5。在一個(gè)實(shí)施方案中，二糖/多糖的重量％/重量％的比值為約1。在一個(gè)實(shí)施方案中，二糖以按總干基質(zhì)的重量計(jì)的以下百分比值存在于基質(zhì)中：0.1％至90％、或0.1％至75％、或0.1％至50％、或0.1％至35％、或0.1％至20％、或0.1％至15％、或0.1％至10％，包括其中的任意值。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，二糖包含蔗糖。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，二糖包含海藻糖。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，多糖包含麥芽糖糊精(maltodextrine)。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，多糖包含右旋糖酐。在另一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，右旋糖酐的分子量為20kda至70kda。在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)還包含l-谷氨酸的鹽。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述鹽是l-谷氨酸的鈉鹽。本文中所述的基質(zhì)的水活度(“aw”)為0.04≤aw≤0.3，例如0.04≤aw≤2.5、0.04≤aw≤2.0、0.04≤aw≤1.5等。在本公開內(nèi)容的上下文中，“水活度”或“aw”是指水的可利用度并且表示水在系統(tǒng)中的能量狀態(tài)。水活度可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的材料和操作，例如使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)來測(cè)量。還提供了用于形成基質(zhì)的組合物，所述組合物包含第一形成水膠體之多糖、不同于第一多糖的第二多糖和包含蔗糖、海藻糖或其組合的二糖以及大腸桿菌(e.coli)。還提供了用于提供包含活大腸桿菌(e.coli)的顆粒的方法，所述方法包括提供包含第一形成水膠體之多糖、不同于第一多糖的第二多糖和包含蔗糖、海藻糖或其組合的二糖以及大腸桿菌的顆粒，以及將所述顆粒干燥至水活度(aw)≤0.3。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，活大腸桿菌在顆粒中維持至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.7的aw倍數(shù)減小。實(shí)施例在以下每個(gè)實(shí)施例中，與保存溶液s1一起測(cè)試了三種保存溶液。測(cè)試一式三份地進(jìn)行并且一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差根據(jù)下式計(jì)算：其中n：樣品的數(shù)量，且樣品群體的平均值。在以下每個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌生存力通過根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方案測(cè)量菌落形成單位(colony-formingunit，cfu)的數(shù)量來評(píng)估。以下實(shí)施例中使用的保存溶液示于表1中。表11x意指不存在2n/a意指不適用1.實(shí)施例1a.大腸桿菌培養(yǎng)參照?qǐng)D1，在第一步驟100中將大腸桿菌菌株在非動(dòng)物來源的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)。然后，將六(6)個(gè)分離的菌落用于在第二步驟200中在30ml非動(dòng)物來源的胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(trypticsoybroth，tsb)(對(duì)于1ltsb：20g大豆蛋白胨a3sc-(organotechnie)、2.5g無水右旋糖usp-(j.t.baker)、5g氯化鈉usp-(j.t.baker)和2.5g磷酸氫二鉀usp-(fisherchemical))中在37℃和200rpm攪拌下培養(yǎng)大腸桿菌菌株2小時(shí)。將所得培養(yǎng)物1在tsb中稀釋10倍并隨后用于在第三步驟300中在100ml非動(dòng)物來源tsb中在37℃和200rpm攪拌下培養(yǎng)大腸桿菌菌株2小時(shí)。將所得培養(yǎng)物2在tsb中稀釋10倍并隨后用于在第四步驟400中在1l非動(dòng)物來源tsb中在37℃和200rpm攪拌下培養(yǎng)大腸桿菌菌株5小時(shí)。然后，將所得培養(yǎng)物3用于將大腸桿菌包埋在基質(zhì)中?？蓪?duì)本文中所述的培養(yǎng)方案作出變化和改進(jìn)并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。例如，還可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方案在厭氧條件下培養(yǎng)非致病性大腸桿菌(son和taylor，curr.protoc.microbiol.，2012，27：5a.4.1-5a.4.9)。在制備后續(xù)實(shí)施例的珠中，可選擇于2005年1月21日以登記號(hào)idac210105-01保藏在加拿大國(guó)際保藏單位(idac)的非致病性大腸桿菌菌株。b.基質(zhì)制備將bactotm蛋白胨(1.5g，bd，mississauga，canada)與1.5l的經(jīng)加熱的水混合以獲得混合物。在用磁棒以360rpm混合的同時(shí)向混合物中緩慢添加藻酸類(30gduponttmmississauga，canada)。在約3小時(shí)內(nèi)獲得藻酸類的完全溶解以獲得2％藻酸類(m/v)溶液。然后，包括磁棒在內(nèi)將溶液在標(biāo)準(zhǔn)條件下高壓滅菌?？蓪?duì)本文中所述的基質(zhì)制備方案作出變化和改進(jìn)并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。c.將大腸桿菌包埋在基質(zhì)中按順序并且在用磁棒混合的同時(shí)向經(jīng)高壓滅菌的基質(zhì)溶液中添加以下以獲得漿料：1l非動(dòng)物來源tsb，并且參照?qǐng)D1，在1l非動(dòng)物來源tsb中的大腸桿菌的0.5l所得培養(yǎng)物3。使用由thermoscientifictmreacti-vaptm蒸發(fā)器改造的9出口注射器系統(tǒng)將漿料擠出到聚合浴(在水中的300mmcacl2、0.1重量/體積％bactotm胰蛋白胨、0.1重量/體積％bactotm蛋白胨和0.05重量/體積％gbactotm酵母提取物)中形成珠。在注射漿料的同時(shí)輕輕攪拌浴。使基質(zhì)珠交聯(lián)約30分鐘，并隨后收獲所得的硬化珠?？蓪?duì)本文中所述的包埋方案作出變化和改進(jìn)并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。d.經(jīng)包埋大腸桿菌的干燥和測(cè)試對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將在基質(zhì)中具有經(jīng)包埋大腸桿菌的珠在保存溶液s1、保存溶液s2、保存溶液s3或保存溶液s4中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；和步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥的珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減小：在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖3中。保存溶液s4顯示出0.32的經(jīng)歸一化平均生存力損失，同時(shí)維持0.142±0.004的水活度。實(shí)施例1的結(jié)果的匯編示于表2和3中。這些結(jié)果表明保存溶液s4的成分對(duì)包埋在經(jīng)干燥基質(zhì)中的大腸桿菌的生存力提供顯著作用以及其針對(duì)干燥過程700的抗性。表2表3e.將經(jīng)干燥的包埋大腸桿菌摻入飼料中(“?；?用于將經(jīng)干燥的基質(zhì)摻入飼料中(例如以飼料添加劑的形式)摻入飼料中的方案是本領(lǐng)域中已知的。這樣做的一個(gè)舉例說明性實(shí)例可例如通過向一噸飼料中摻入500g至1000g經(jīng)干燥的基質(zhì)珠來進(jìn)行。如果期望的話，飼料還可包含適量的滅活酵母產(chǎn)品。例如，將經(jīng)干燥的包含經(jīng)包埋大腸桿菌的基質(zhì)珠與所有其他成分一起在均化罐中混合。優(yōu)選地，在?；^程期間持續(xù)地混合混合物。然后，將混合的材料泵向擠出機(jī)。然后向即將進(jìn)入擠出機(jī)的混合材料施加蒸氣(即，因此混合物的溫度在該階段升高)。然后，在混合物通入擠出機(jī)內(nèi)期間向混合物施加合適的壓力(壓力和溫度升高，最高溫度達(dá)到約75℃的點(diǎn))。然后，將形成粒料從擠出機(jī)排出到冷卻罐中(溫度快速降低至30℃至40℃，之后再次冷卻以達(dá)到環(huán)境溫度)。然后，可將包含飼料添加劑(包含經(jīng)包埋大腸桿菌的基質(zhì))的經(jīng)?；暳蟽?chǔ)存在例如袋/容器中?？蓪?duì)本文中所述的?；桨缸鞒龈淖兒透倪M(jìn)并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。2.實(shí)施例2對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s5、保存溶液s6或保存溶液s7中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；和步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥的珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減?。涸诿糠N情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖4中。保存溶液s7顯示出0.38的經(jīng)歸一化平均生存力損失，同時(shí)維持0.298±0.013的水活度。實(shí)施例2的結(jié)果的匯編示于表4和5中。這些結(jié)果表明保存溶液s7的成分對(duì)包埋在經(jīng)干燥基質(zhì)中的大腸桿菌的生存力提供顯著的保護(hù)作用以及其針對(duì)干燥過程700的抗性。表4表53.實(shí)施例3對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s0、保存溶液s8或保存溶液s9中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；以及步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減小：在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖5中。實(shí)施例3的結(jié)果的匯編示于表6和7中。表6表74.實(shí)施例4對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s10、保存溶液s11或保存溶液s12中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；以及步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥的珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減?。涸诿糠N情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖6中。保存溶液s7顯示出0.58的經(jīng)歸一化平均生存力損失。實(shí)施例4的結(jié)果的匯編示于表8和9中。表8表95.實(shí)施例5對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s13、保存溶液s14或保存溶液s15中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；以及步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥的珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減?。涸诿糠N情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖7中。保存溶液s7顯示出0.35的經(jīng)歸一化平均生存力損失。實(shí)施例5的結(jié)果的匯編示于表10和11中。表10表116.實(shí)施例6對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s16、保存溶液s17或保存溶液s18中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；以及步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥的珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減小：在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖8中。實(shí)施例6的結(jié)果的匯編示于表12和13中。表12表137.實(shí)施例7對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。參照?qǐng)D2，在第一步驟500中，在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1或保存溶液s19中放置約20分鐘。在每種情況下，在浸泡在保存溶液中之后進(jìn)行總cfu550的確定。隨后在第二步驟600中，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。在每種情況下，使用aqualab水活度計(jì)4te(decagondevices，inc.，u.s.a.)對(duì)半干珠進(jìn)行水活度aw650的測(cè)量。隨后在第三步驟700中，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，干燥過程800包括至少兩個(gè)步驟：步驟600，其包括將珠在室溫下在空氣干燥器中放置24小時(shí)以獲得半干珠；以及步驟700，其包括將半干珠在干燥器中放置64小時(shí)以獲得干燥的珠。在每種情況下，對(duì)干燥珠進(jìn)行總cfu750的確定和水a(chǎn)w760的測(cè)量。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算aw倍數(shù)減?。涸诿糠N情況下并且參照?qǐng)D2，根據(jù)以下計(jì)算生存力損失：cfu損失＝log10(550)-log10(750)。在每種情況下，計(jì)算平均生存力損失和相對(duì)于用保存溶液s1獲得的結(jié)果的經(jīng)歸一化平均生存力損失。結(jié)果示于圖9中。實(shí)施例7的結(jié)果的匯編示于表14和15中。表14表158.實(shí)施例8對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s2、保存溶液s3和保存溶液s4中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例8的結(jié)果示于表16中，其中當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表16保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10.2s20.1s30.1s409.實(shí)施例9對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s5、保存溶液s6和保存溶液s7中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例9的結(jié)果示于表17中，并且當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表17保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10.2s50.1s60s70.110.實(shí)施例10對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s0、保存溶液s8和保存溶液s9中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例10的結(jié)果示于表18中，并且當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表18保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10s02.4s80.1s9011.實(shí)施例11對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s10、保存溶液s11和保存溶液s12中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例11的結(jié)果示于表19中，并且當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表19保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10.1s100.1s110.4s120.212.實(shí)施例12對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s13、保存溶液s14和保存溶液s15中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例12的結(jié)果示于表20中，并且當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表20保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10s130s140.1s150.113.實(shí)施例13對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1、保存溶液s16、保存溶液s17和保存溶液s18中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)施例13的結(jié)果示于表21中，并且當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表21保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10s160s170s180.114.實(shí)施例14對(duì)于每種保存溶液，至少一式三份地進(jìn)行干燥和測(cè)試。在輕輕攪拌下將實(shí)施例1中制備的珠在保存溶液s1和保存溶液s19中放置約20分鐘。隨后，將珠在室溫下在空氣干燥器中的盤式干燥器上放置約24小時(shí)以獲得半干珠。隨后，將半干珠在其中吹入干燥的經(jīng)過濾空氣的干燥器中放置約64小時(shí)。獲得水活度aw≤0.3的干燥珠。在每種情況下，在4℃的儲(chǔ)存條件下在四(4)周的時(shí)間內(nèi)通過測(cè)量經(jīng)干燥珠的cfu/g來測(cè)試菌株生存力。至少一式三份地進(jìn)行測(cè)試并且計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果示于表22中，并且當(dāng)儲(chǔ)存在4℃下時(shí)，所有的受試保存溶液在4周期間均提供飼料添加劑菌株穩(wěn)定性。表22保存溶液4周后的cfu/g差(log)s10.1s190.1簡(jiǎn)言之，本發(fā)明的發(fā)明人已令人吃驚且出乎意料地觀察到，如本文中所述包含經(jīng)包埋活大腸桿菌的基質(zhì)能夠在給定時(shí)間(例如4周)內(nèi)保存足夠細(xì)菌cfu的生存力用于其商業(yè)用途。例如，基質(zhì)成功地?fù)饺虢?jīng)?；膭?dòng)物飼料中使得動(dòng)物飼料可儲(chǔ)存/運(yùn)輸/處理并最終施用于動(dòng)物，同時(shí)保留足夠的活cfu/g動(dòng)物飼料以提供與細(xì)菌正常相關(guān)的有益效果。注意，為了方便讀者，可在本公開內(nèi)容通篇使用標(biāo)題或小標(biāo)題，但是這些不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍。此外，本文中可提出和公開某些理論；然而，其不管正確還是錯(cuò)誤均不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍，只要本發(fā)明是根據(jù)本公開內(nèi)容實(shí)施的即可，不考慮任何特定理論或作用方案。本說明書通篇引用的所有參考文獻(xiàn)出于所有目的均在此通過引用整體并入。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在本說明書通篇，沒有數(shù)量詞修飾的名詞涵蓋包含一個(gè)/種或更多個(gè)/種的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，在本說明書通篇，與“包括”、“含有”或“以...為特征”同義的術(shù)語“包含”是包括性的或開放式的，并且不排除另外的未記載的要素或方法步驟。除非另外限定，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。如有沖突，以包含定義的本發(fā)明文件為準(zhǔn)。本公開內(nèi)容中使用的術(shù)語“約”、“大約”或“近似”應(yīng)通常意指在本領(lǐng)域中普遍接受的誤差容限內(nèi)。因此，本文中提供的數(shù)量通常包括這樣的誤差容限，使得術(shù)語“約”、“大約”或“近似”即使沒有明確說明也可推斷出。雖然已經(jīng)在相當(dāng)詳細(xì)的某些實(shí)施方案中對(duì)本公開內(nèi)容進(jìn)行了描述，但是變化和改進(jìn)是可能的并且根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。當(dāng)前第1頁12